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May 22, 2023

ウロテンシンの活性化

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 6、記事番号: 511 (2023) この記事を引用

1070 アクセス

20 オルトメトリック

メトリクスの詳細

レムデシビルは、世界中で新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の治療に使用されている抗ウイルス薬です。 レムデシビルには心血管系の副作用が関係している。 しかし、根底にある分子機構は依然として不明です。 今回我々は、構造モデリングと組み合わせて大規模なGタンパク質共役型受容体スクリーニングを実施し、レムデシビルがGαi/o依存性AKT/ERK軸を介したウロテンシンII受容体（UTS2R）の選択的部分アゴニストであることを見出した。 機能的には、レムデシビル治療は、ヒト人工多能性幹細胞（iPS）由来心筋細胞において電場電位の延長とAPD90を誘導し、新生児心筋細胞と成人心筋細胞の両方において収縮性の障害を引き起こしたが、これらはすべて臨床病理を反映している。 重要なのは、レムデシビル媒介の心臓機能不全は、UTS2Rシグナル伝達を拮抗することによって効果的に軽減されたことである。 最後に、ゲノムデータベースに報告されているUTS2R遺伝子の110個の一塩基変異体の影響を特徴付け、レムデシビルに対する受容体感受性において機能獲得効果を示す4つのミスセンス変異体を発見した。 まとめると、我々の研究は、レムデシビル関連の心血管イベントの根底にあるこれまで知られていなかったメカニズムを明らかにし、UTS2R遺伝子の遺伝的変異がレムデシビル治療中の心血管イベントの潜在的な危険因子である可能性があることを明らかにしており、これにより集合的に心血管イベントを予防する治療の機会への道が開かれることになる。未来。

ヌクレオシド類似体は、ウイルス複製中の DNA および RNA 合成の構成要素として使用されるため、抗ウイルス治療の薬剤設計の分野で長い歴史があります 1。 ヌクレオシド類似体の抗ウイルス活性の主なメカニズムは、ウイルスの RNA 依存性 RNA ポリメラーゼの阻害に起因すると考えられています2。 新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の世界的なパンデミックに対応して、この病気を治療するためにレムデシビル、モルヌピラビル、ファビピラビルなどのいくつかのヌクレオシド類似体が開発されました。

レムデシビル (GS-5734; Veklury) は、親油性と細胞透過性を高めるフェノールおよび l-アラニン エチルブチル エステルを含むマクギガン プロドラッグ部分を含む修飾アデノシン アナログです 3。 静脈内投与後、レムデシビルは急速にモノヌクレオシド型 (GS-441524) に変換され、複数の宿主酵素によって細胞内で薬理学的に活性な三リン酸型に代謝され、その結果、RNA の強力かつ選択的な阻害剤として作用します。複数のウイルスの依存性 RNA ポリメラーゼ4,5。 レムデシビルは当初、エボラウイルスの治療に使用されていました6が、世界的なパンデミックのさなか、2019年コロナウイルス感染症（COVID-19）の治療に承認されました。 レムデシビルは、新型コロナウイルス感染症で入院し、下気道感染症の証拠があった成人の回復までの時間を短縮しました7。 より最近のデータでは、レムデシビルの 3 日間の静脈内投与により入院が大幅に減少することが実証されました8。 レムデシビルは一般にほとんどの人に忍容性が良好ですが、発疹、頭痛、吐き気、下痢、トランスアミナーゼの上昇など、レムデシビルに関する一般的な有害事象が報告されています7。 レムデシビルの現在のガイドラインでは、治療中に肝機能を注意深くモニタリングすることが推奨されており、腎機能障害のある患者にはレムデシビルを使用しないことが推奨されています9。 さらに、低血圧、徐脈、QT延長、T波異常などの心血管イベントも報告されています10、11、12、13。 レムデシビルを静脈内投与すると、心臓を含む広範な組織分布が示されますが 14、レムデシビルの心血管副作用の根底にある正確な分子機構は不明のままです。

モルヌピラビル（EIDD-2801/MK-4482; ラジェヴリオ）は、重症に進行するリスクが高い軽度から中等度の新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の治療に対する緊急使用許可に基づき、FDAにより緊急使用が許可された。 COVID-19（新型コロナウイルス感染症。 モルヌピラビルは、β-d-N4-ヒドロキシシチジン (NHC) のイソプロピルエステル プロドラッグを含む経口シトシン類似体です。 活性型の NHC はウイルスの RNA 依存性 RNA ポリメラーゼの基質であり、SARS-CoV-2 複製の忠実性を損ない、エラーによる大惨事を引き起こします 15。 入院していない成人を対象とした臨床試験では、モルヌピラビルによる早期治療により、リスクのあるワクチン接種を受けていない新型コロナウイルス感染症（COVID-1916）成人の入院または死亡のリスクが効果的に低下することが示された。 モルヌピラビルに加えて、抗インフルエンザ薬であるファビピラビル（T-705; アビガン）も、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の治療薬として臨床試験中である。 ファビピラビルは、ピラジンカルボキサミド (6-フルオロ-3-ヒドロキシ-2-ピラジンカルボキサミド) に由来する核酸塩基類似体です17。 ファビピラビルの推奨される作用機序は、連鎖停止イベントとミューテーター イベントの両方の組み合わせで構成されます 18。 モルヌピラビルとファビピラビルの使用中に、モルヌピラビルでは下痢、めまい、吐き気19、ファビピラビルでは高尿酸血症とアラニンアミノトランスフェラーゼの増加など、いくつかの有害事象が報告されています20。 重要なのは、レムデシビルとは異なり、モルヌピラビルまたはファビピラビルの使用による心血管系の副作用は報告されていないことです。

ヌクレオチド/ヌクレオシドは、DNA/RNA 合成の構成要素としての機能に加えて、G タンパク質共役受容体 (GPCR) の内因性リガンドとして作用し、多様な病態生理学的反応を誘導する可能性があります 21、22、23、24、25。 レムデシビル、モルヌピラビル、ファビピラビルにはヌクレオシド模倣構造が存在するため、これらの薬剤が GPCR を直接活性化することで副作用を引き起こす可能性があると仮説を立てました。 今回我々は、モルヌピラビルやファビピラビルではなく、レムデシビルがウロテンシンII受容体（UTS2R）の選択的リガンドであり、心機能不全を引き起こすことを報告する。

われわれは、アルカリホスファターゼタグ付きトランスフォーミング成長因子α（AP-TGFα）シェディングアッセイを用いて、レムデシビル、モルヌピラビル、ファビピラビルなどの抗COVID-19薬を348個のGPCRに対してスクリーニングした26。 関与する Gα サブユニットの種類に関係なく、受容体活性化を効率的に検出するために、最初のスクリーニングにキメラ Gα サブユニットタンパク質を使用しました 26。 3つの薬剤のうち、レムデシビルがウロテンシンII受容体（UTS2R）の選択的活性化剤であることを発見しました（図1a、補足図1a、補足データ1）。 レムデシビルはキメラ Gα タンパク質なしでも UTS2R 応答を強力に誘導したため、その後の UTS2R 分析はキメラ Gα タンパク質を外因的に添加することなく実行されました。 濃度反応分析により、レムデシビルの最大有効濃度の半分（pEC50）は 4.89 ± 0.03 であることが明らかになりました（EC50 = 13 ± 0.9 μM、図 1b 左）。 UTS2Rに対するレムデシビルの効力と有効性（Emax = 47 ± 1.4 % AP-TGFα放出）は、内因性ペプチドリガンドであるウロテンシン-II（UT2、pEC50 = 10.72 ± 0.04; EC50 = 21 ± 2.1 fM、Emax = 59 ± 0.70 % AP-TGFα 放出、図 1b 右)。 それにもかかわらず、健康な成人における静脈内注射後のレムデシビルの最大血漿濃度は9.03μMに達するため、臨床用量でのレムデシビル投与はアゴニスト効果の作動範囲内であると考えられている27。 興味深いことに、UT2とは異なり、レムデシビルはβ-アレスチン動員反応を誘導できませんでした（図1c、補足図1b）。

a 試験した化合物の化学構造と、TGFα シェディングアッセイで測定した GPCR 活性化の相対レベルを示すヒートマップ。 カラースケールは、GPCRとは無関係に最大のTGFα放出反応を誘導するTPA(12-O-テトラデカノイルホルボール13-アセテート)媒介受容体活性化と比較したGPCR活性化%を表します。 黄色のセルは、レムデシビルによる UTS2R の活性化を表します。 試験化合物の濃度は、レムデシビル、モルヌピラビル、GS-441524、およびソホスブビルについては 10 μM、ファビピラビルについては 100 μM でした (n = 3)。 b UTS2Rアンタゴニストであるウランチドの存在下または非存在下でのレムデシビル（左）およびウロテンシン-II（UT2、右）によるUTS2RのTGFα放出応答曲線（データは平均値±SEM、n = 3として示されています）。 レムデシビルの半最大有効濃度 (pEC50) は 4.89 ± 0.03 (EC50 = 13 μM、Emax = 47 ± 1.4 % AP-TGFα 放出) でした。 UT2 の最大半値有効濃度 (pEC50) は 10.72 ± 0.04 (EC50 = 21 fM、Emax = 59 ± 0.70 % AP-TGFα 放出) でした。 c レムデシビル (左) またはウロテンシン II (UT2、右) を介した UTS2R の β-アレスチン 1 リクルートアッセイ。 データは平均値 ± SEM (n = 3) として示されています。 d、e ビオチン-UT2ペプチドを使用した競合結合アッセイ。 FLAG-UTS2R（入力）を発現するHEK293細胞の膜画分を、レムデシビルまたはウランチドの存在下または非存在下でビオチン-UT2とともにインキュベートしました。 FLAG-UTS2Rをストレプトアビジンコート磁性ビーズ(M280)によりプルダウンし、ウェスタンブロットによりFLAG-UTS2Rを検出した。 d 3 つの独立した試験の代表的な画像が示されました。 e バンド濃度測定。 *** p < 0.001 および ** p < 0.01 対ビヒクル + 10 μM UT2 グループ (一元配置 ANOVA とそれに続くダネットの多重比較検定); ±SEMを意味します。

レムデシビルが UTS2R と直接相互作用できるかどうかを評価するために、競合結合アッセイを実施しました。 以前の研究では、N末端ビオチンタグを備えた合成UT2ペプチド（ビオチン-UT2）がUTS2R28と安定した結合を形成できることが示されています。 重要なのは、結合がストレプトアビジン樹脂を使用した UTS2R の生化学的プルダウンに十分安定であることです。 ビオチン-UT2ペプチドの独特の特性を利用して、レムデシビルの存在下または非存在下でUTS2Rを発現するHEK293細胞の膜画分を使用してプルダウンアッセイを実行しました（補足図1c）。 私たちがテストしたさまざまな種類の磁気ビーズの中で、疎水性コーティングを施した磁気ビーズは、非特異的結合が低く、最大のプルダウン効果を示しました（補足図1d）。 最適化されたプロトコルを使用して、レムデシビルとウラン化物がビオチン-UT2媒介UTS2Rプルダウンを著しく損なうことを発見しました（図1d、e、補足図1e）。 これらの結果は、レムデシビルがUTS2Rと直接相互作用し、それによってビオチン-UT2-UTS2Rの結合を妨げることを示唆しています。

さらに、レムデシビルの代謝産物がUTS2Rを活性化するかどうかを調査しました。 レムデシビル6,27の主要代謝物と微量代謝物であるGS-441524とGS-704277は、それぞれUTS2R活性化に影響を与えませんでした（図1a、補足図1a）。 マクギガンプロドラッグ部分がレムデシビルのUTS2R活性化に関与しているかどうかを調べるために、FDA承認のマクギガンクラスプロドラッグ3であるソホスブビル（GS-7977）をUTS2Rに対してテストしました。 ただし、ソホスブビルはUTS2Rを活性化しませんでした（図1a、補足図1a）。 これらの結果は、受容体を活性化するにはレムデシビルのマクギガンプロドラッグ部分とヌクレオシド塩基の両方が必要であることを示唆しています。

UTS2R はクラス A GPCR ファミリー 29 に属し、標準的な 7 つの膜貫通ヘリックス (TM)、C 末端の両親媒性ヘリックス 8 (H8)、細胞外ループ 2 の 2 本の逆平行 β 鎖、比較的短い N 末端で構成されています。 2 つの N-グリコシル化部位と C 末端尾部にパルミトイル化アンカーを備えたドメイン (図 2a 上)。 一方、レムデシビルはアデノシンの類似体であり、マクギガンクラスのホスホルアミデートプロドラッグ（フェノールおよび1-アラニンエチルブチルエステル）であり、レムデシビルのアニオン性リン酸部分をマスクして薬物送達を改善します。 リガンドと受容体の結合の分子基盤をさらに解明するために、レムデシビルの存在下でUTS2Rのインシリコ構造ドッキングを実行しました（図2a下）。 私たちの分析により、レムデシビルへの結合を安定化させる可能性があるオルソステリックポケット内の複数のアミノ酸残基が示されました。 まず、レムデシビルの核糖のシアノ基は、UTS2R 残基 T3047.42×41 と水素結合を形成します (上付き文字は一般的な GPCR 番号付けシステムを示します 30)。 第二に、レムデシビルのマクギガンプロドラッグ部分のフェニル基は、N2977.35×34でキャップされています。 最後に、レムデシビルの核酸塩基のアミノ基は、ポケットの底部で M1343.36 と水素結合を形成します (NH...S 水素結合 31)。

上のパネル、UTS2R の回路図。 下のパネル、UTS2R とレムデシビルのドッキング モデル。 ヒト UTS2R の AlphaFold 構造は緑色のリボンとして示されていますが、明確にするために TM5 は省略されています。 レムデシビルと受容体の選択された側鎖は棒で示され、それぞれ灰色と緑色に色付けされています。 黒い破線は水素結合を示します。 b、c レムデシビル (b) または UT2 (c) 媒介受容体活性化に対する、示された変異の影響。 y 軸 (⊿pEC50 値) は、WT 受容体と比較した各変異体受容体の相対的な活性化能力を表します。 ⊿pEC50 値 = pEC50 変異体 − pEC50 WT。 ⊿pEC50 カットオフ値は、破線で示すように -1 に設定されました。 EC50 値は、TGFα 放出アッセイによって決定されました。 **p < 0.01、***p < 0.001 対 WT (一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定による)。 データは平均値±SEM (n ≥ 3) として表示されます。

ドッキングモデルを検証するために、これらのUTS2R残基（T3047.42×41、N2977.35×34、およびM1343.36）を他のアミノ酸に変異させ、これらの変異がレムデシビル媒介UTS2R活性化に影響を与えるかどうかをテストしました（図2b、c） 、補足図2a、b）。 インシリコシミュレーションと一致して、3残基の変異によりUTS2Rに対するレムデシビルの活性化能力がほぼ完全に消失し、安定した結合を達成するにはレムデシビルが複数の残基でUTS2Rと接触する必要があることが示された。 ヌクレオシドとマクギガン部分は両方とも受容体結合に必須であり、N2977.35×34はマクギガン部分と相互作用し、M1343.36およびT3047.42×41はヌクレオシド部分と相互作用します。 この構造観察は、なぜ単一アミノ酸を変異させると UTS2R に対するレムデシビルの活性が著しく低下するのかを説明します。 この説明は、マクギガン部分が代謝的に除去されたレムデシビル代謝物に UTS2R が応答しないという結果によってさらに裏付けられます。 対照的に、これらの変異は、UT2 を介した UTS2R 活性化を部分的に減少させるだけでした。 一方、これら 3 つの残基とは対照的に、D1303.32 にはレムデシビルと UTS2R の結合に対する阻害効果があることがわかりました。 D1303.32N 変異は、UT2 媒介 UTS2R 活性化を廃止しましたが、レムデシビル媒介受容体活性化を大幅に上方制御しました（図 2b、c、補足図 2a、b）。 ドッキングモデルによれば、D1303.32残基はレムデシビルの核酸塩基部分の近くに局在しています（図2a）。 我々は、D1303.32 残基の負電荷が電子反発効果 32 を誘発し、D1303.32 残基と核酸塩基間の相互作用の不安定化を引き起こす可能性があると推測しています。 これらの結果は、レムデシビル媒介UTS2R活性化が、UTS2Rとそのマクギガンプロドラッグ部分およびヌクレオシド塩基の間の特異的結合によって媒介されることを示しており、これはUTS2Rと内因性リガンドの結合とは異なる。

レムデシビルを介したUTS2R活性化が細胞内シグナル伝達を誘導するかどうかを調べるために、UTS2R発現HEK293細胞をレムデシビルで刺激し、細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）1/2のリン酸化状態を調べた。 レムデシビルを最長 72 時間適用すると、ERK1/2 の長期持続的かつ用量依存的なリン酸化が誘発されました（図 3a、補足図 3a）。 重要なことに、レムデシビル媒介ERKリン酸化はUTS2Rアンタゴニストによって廃止されました（図3a、補足図3a）。 レムデシビルによって誘導されるERK1 / 2の応答は、UT2によって誘導されるものと同様でした（補足図3b）。

a UTS2Rを過剰発現する血清欠乏HEK293細胞を、UTS2Rアンタゴニストであるウランチドの存在下または非存在下で、示された濃度のレムデシビルで5分間刺激し、溶解物をウェスタンブロッティング分析に供した。 ERK1およびERK2活性化比(pERK1/ERK1およびpERK2/ERK2)は、ビヒクルに対して正規化されたデータを使用して計算されました。 Tukey の多重比較検定による *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。 データは平均値 ± SEM (n = 3) として表されます。 b 左、表面 ECG 上の電場電位持続時間と QT 間隔の間の時間相関。 右、多電極アレイ (MEA) プラットフォームの概略図。 c ウランチドの存在下または非存在下で1μMレムデシビルで72時間処理したヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞（hiPSC-CM）の代表的な電場電位波形。 d hiPSC-CMにおける電場電位延長に対するレムデシビルとウランチドの効果。 二元配置分散分析とそれに続くシダックの多重比較検定による *p < 0.05、**p < 0.01。 データは平均値 ± SEM (n = 3) として表されます。 e 電流クランプモデルにおけるhiPS-CMの自発的活動電位を記録するための穴あきパッチクランプ。 hiPSC-CM を 50 μM ウランチドの存在下または非存在下で 10 μM レムデシビルで 72 時間処理しました。 Tukey の多重比較検定による *p < 0.05 および **p < 0.01。 データは平均値 ± SEM (n ≥ 3) として表されます。

UT2 とその受容体 UTS2R は組織で広く発現されており、心血管系では比較的高い発現です 33 (補足図 3c、d)。 レムデシビル 10、11、12、13 の心毒性の可能性に促されて、我々は心筋細胞機能に対するレムデシビルの影響を評価しました。 私たちは、ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞（hiPSC-CM）34を使用して電場電位（FP）に対するレムデシビルの効果を調べました。UTS2Rの発現レベルはヒト心臓の発現レベルに匹敵します（補足図3e）。 ）。 FP 持続時間 (FPD) は、心電図 (ECG) 上の QT 間隔と密接に相関しています 35 (図 3b 左)。 注目すべきことに、QT間隔の延長は、重篤で潜在的に致死的な不整脈の発生と関連しており、QT延長は薬物誘発性心血管毒性の主な原因である36。 FPD の評価では、細胞集団レベルで心筋細胞の電気生理学をモニタリングできる多電極アレイ (MEA) プラットフォームの使用が広く受け入れられています (図 3b 右)35。 MEA分析により、レムデシビルで処理したhiPSC-CMは、それぞれ24時間で1.32±1.38%、48時間で5.60±1.60%、72時間で15.57±3.49%の長期FPDを示したことが明らかになった。 注目すべきことに、延長はUTS2Rアンタゴニストによって有意に抑制された(図3c、d)。 実際、UTS2R アンタゴニストとレムデシビルの併用では、24 時間 (-1.71 ± 1.60%) および 48 時間 (-0.61 ± 0.11%) では FPD 遅延がほとんど示されませんでしたが、逆転効果は依然として顕著でしたが、72 時間では部分的になりました (図.3d）。

FPDに加えて、穴あきパッチクランプによるQT延長を評価し、hiPS-CMの自発的活動電位を記録しました。 APD90（90％再分極時の活動電位持続時間）を測定しました。 レムデシビルはhiPS-CMのAPD90を有意に延長させましたが、この延長はウランチドの投与によって著しく減弱されました（図3e）。 したがって、これらの結果は、少なくとも部分的に UTS2R に依存している、報告されているレムデシビル 11、12、13 の催不整脈リスクのこれまで知られていなかったメカニズムを解明します。 次に、心臓の収縮性に及ぼすレムデシビルの効果を評価しました。 この目的のために、新生児ラット心筋細胞 (NRCM) を使用し、収縮力を評価しました。 一定のペーシングプロトコルの下では、慢性的なレムデシビル治療を受けたNRCMは収縮性の低下を示しましたが、これはUTS2Rアンタゴニストによって大幅に弱められました（図4a）。

a、b 左、ウランチドまたは b 百日咳毒素 (PTX)、Gαi/o 阻害剤、および YM-254890、Gαq/11 の有無にかかわらず、1 μM レムデシビルによる新生児ラット心筋細胞 (NRCM) のペーシング下の収縮性の代表的な波形。阻害剤、48時間。 右は、NRCM のペーシング下の収縮性に及ぼす、ウランチドまたは b PTX および YM-254890 を併用したレムデシビルの効果。 Tukey の多重比較検定による **p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。 データは平均値 ± SEM (n = 3) として表されます。 c、d c ERK1/2およびdプロテインキナーゼB（AKT）のリン酸化に関する代表的なウェスタンブロット。 UTS2Rを過剰発現する血清欠乏HEK293細胞を、示された濃度のレムデシビルで48時間刺激しました。 Gi/o タンパク質阻害の場合、細胞を 150 ng/mL の PTX と少なくとも 18 時間インキュベートしました。 ERK1、ERK2、および AKT 活性化率は、ビヒクルに対して正規化されたデータを使用して計算されました。 Tukey の多重比較検定による *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。 データは平均値 ± SEM (n = 3) として示されています。 e、f 成体マウス心筋細胞の収縮性に及ぼすレムデシビルの効果。 単離された成体マウス心筋細胞をレムデシビル（10μM）で30分間処理し、電気ペーシング中に細胞面積のパーセンタイル変化（e）および心筋細胞短縮率（f）を測定した。 ****対応のない t 検定による p < 0.001。 データは平均値 ± SEM (3 匹のマウスからの合計 54 個の細胞) として示されています。

Gαs、Gαi/o、Gαq/11、および Gα12/13 を含むヘテロ三量体 G タンパク質は、GPCR の下流エフェクターです。 それらの中で、Gαi/o ファミリーは、イオンチャネルの調節を介して心筋の収縮性と心拍数に関与していると考えられています 37。 UTS2R は Gαi/o および Gαq29 に結合しているため、レムデシビルを介した心筋収縮の減少にどの Gα タンパク質が関与しているかを調べようとしました。 Gαi/o阻害剤百日咳毒素（PTX）はレムデシビルの効果を完全に遮断し、NRCMのピーク収縮を回復しましたが、Gαq/11阻害剤YM-254890はそうではありませんでした（図4b）。 以前の研究では、NRCMにおけるGαi/oの活性化がどのようにGβγの遊離につながり、これが細胞内でPI3Kを活性化し、AKTおよびERK1/238の活性化につながるかを実証した。 この観察と一致して、Gαi/o阻害はレムデシビル誘発性のERK1/2およびAKTのリン酸化を減少させた（図4c、d）。 これらの結果は、レムデシビルが Gαi/o 依存性 AKT/ERK シグナル伝達経路を介して心筋細胞の収縮性を低下させることを示唆しています。 まとめると、我々の結果は、レムデシビル自体がUTS2Rの外因性リガンドとして機能できることを示しています。 さらに、我々は、レムデシビルの不整脈促進性および陰性変力作用の可能性を特定しました。これらは両方とも UTS2R 依存性です。

新生児の心筋細胞は最終分化していないため、成体マウスの心臓から単離された成熟心筋細胞に対するレムデシビルの効果をさらに調査しました（補足図3f）。 心筋細胞の収縮はペーシング条件下で記録され、収縮の程度は形態学的分析によって評価されました。 新生児心筋細胞と同様に、レムデシビルは成人心筋細胞の収縮を著しく阻害しました（図4e、f）。

以前の研究では、レムデシビルの活性型は高用量でミトコンドリアRNAポリメラーゼ（mtRNAP）に対する阻害効果を示すため、レムデシビル関連の心毒性はミトコンドリアの機能不全によって引き起こされる可能性があることが示唆されました39。 ただし、ヒトにおけるレムデシビル投与後の最大血漿濃度に等しい10μMのレムデシビルによる治療27は、ミトコンドリア呼吸複合体タンパク質の定常状態レベルに影響を与えなかった（補足図3g、h）。

ヒトにおけるレムデシビル-UTS2Rシグナル伝達に対する感受性に対する遺伝的多様性の影響を理解するために、我々は、大規模な集団ベースのゲノム情報である14KJPNゲノム参照パネルを含むゲノムデータベースから一塩基変異体（SNV）情報を抽出しました。 14,000 人の日本人 41 の DNA 配列からデータベースを構築し、続いて受容体活性化に関する機能アッセイを行った。 UTS2R 遺伝子座では合計 2,178 個の変異体が報告されており、そのうち 139 個の変異体はミスセンス変異体です (補足データ 2)。 14KJPN にリストされているかなりの数のミスセンス SNV が、より広範な民族の SNV を含む gnomAD データベース (https://gnomad.broadinstitute.org) でも報告されています。

したがって、我々は、UTS2R 遺伝子のヒト SNV に対応する 110 個のミスセンス変異体を生成しました。 N 末端の構造予測の信頼度スコアが比較的低かったため、UTS2R の 5' 領域の 29 個のミスセンス変異を除外しました。 110のミスセンスSNVのうち、44のSNVはWT受容体と比較してレムデシビルに対する感受性の低下を示しました（⊿pEC50 <-0.3、これはWT受容体と比較してEC50の2倍を超える増加に相当します;図5a上部パネル）。 一方、47のSNVはWT受容体と比較してUT2に対する感受性の低下を示し、そのうち18のSNVはレムデシビルに対する感受性の低下を示したSNVと重複しました（図5aの下のパネル、補足図4a）。 特に、WT 受容体と比較してレムデシビルに対する受容体感受性を高める可能性がある 4 つのミスセンス SNV (G681.49C、D1303.32G、V15934.54M、および A249ICL3G) が見つかりました (⊿pEC50 > 0.3、これは < 0.5 倍に相当します) WT 受容体と比較して EC50 が減少; 図 5a-c)。 さらに、これら 4 つの機能獲得レムデシビル感受性 UTS2R SNV のうち、G681.48C および D1303.32G 変異体は逆に UT2 に対する感受性の低下を示しましたが、V15934.54M および A249ICL3 変異体は中程度またはわずかな増加を示しました。 UT2感度（⊿pEC50 < 0.3;図5c、補足図4a）。 まとめると、結果は、UTS2R 遺伝子に G681.49C、D1303.32G、V15934.54M、または A249ICL3G 変異を持つ個人はレムデシビルに対して感受性があり、UTS2R 媒介性心毒性に対してより感受性が高い可能性があることを示唆しています。機能利得のバリアントは低いです（補足図4b）。

a TGFαシェディングアッセイで測定した、（上のパネル）レムデシビル媒介受容体活性化および（下のパネル）UT2媒介受容体活性化に対するUTS2R遺伝子由来の110個のミスセンスSNVの影響。 y 軸 (⊿pEC50 値) は、WT 受容体と比較した各変異体受容体の相対的な活性化能力を表します。 ⊿pEC50 カットオフ値は、破線で示すように -1 に設定されました。 水色のバンドは、-0.3 < ⊿pEC50 < 0.3 の範囲を表し、WT 受容体と比較した変異体受容体の EC50 の 0.5 倍から 2 倍 (2 倍未満) の変化の範囲に対応します。 すべての実験は 3 回実行され、データは平均値として表されます。 b 変異の位置とレムデシビルの効力に対するそれらの影響を示すUTS2Rのスネークプロット図（www.gpcdb.orgから改変）。 c (左) レムデシビル媒介受容体活性化および (右) UT2 媒介受容体活性化に対する選択した変異の影響。 EC50 値は、TGFα 放出アッセイによって決定されます。 一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定による WT に対する "ns" p > 0.05、および ****p < 0.0001。 データは平均値±SEM (n ≥ 3) として表示されます。

新型コロナウイルス感染症の入院患者の回復までの時間を改善するというレムデシビルのプラセボに対する優位性が実証された適応型新型コロナウイルス感染症治療試験 1 (ACTT-1)7 の完了後、レムデシビルは入院患者に最も一般的に処方される薬剤の 1 つとなっています。新型コロナウイルス感染症対策に。 重要なのは、ACTT-1の研究者らは、レムデシビルを投与された患者の0.2％が不整脈（心房細動、上室性頻拍、心室頻拍、心室細動以外）を示したものの、これらの心血管への影響は有害とは考えられていなかったと報告したことである。効果。 しかし、初期の臨床試験ではまれな有害事象を検出する能力が不十分であるため、不整脈を経験する患者の割合は過小評価される可能性があります42。 実際、130カ国以上、2,000万人の患者の医療記録を用いた大規模な後ろ向きファーマコビジランスコホート研究では、心停止、徐脈、低血圧がレムデシビルの使用に関連していると報告されている10。 血漿レムデシビル濃度の上昇は、Na+ ピーク振幅と自発拍動数の減少による FP 持続時間の増加と関連しており、QT 間隔の延長とトルサードポイントを誘発する可能性があります 43,44。 重要なのは、心臓への副作用はレムデシビル中止後 24 ～ 48 時間以内に解消すると報告されているため、レムデシビルによって直接引き起こされると考えられることです 45,46。 現在までのところ、レムデシビルの心臓副作用の根底にある正確なメカニズムは不明のままであり、心臓副作用の影響を受けやすい集団を予測する手段も、心臓毒性に対する特別な治療法もありません。 したがって、レムデシビルがどのように心機能不全を誘発するかを理解することが急務となっている。

公平かつ大規模な GPCR スクリーニング戦略を使用して、レムデシビルは選択的に UTS2R を活性化できるが、モルヌピラビルとファビピラビルは活性化できないことを確認しました。 レムデシビルとUTS2Rの間の相互作用は、ビオチン-UT2ペプチドを使用した競合結合アッセイによってさらに裏付けられました。 興味深いことに、UTS2R は心筋細胞を含む心臓組織で高度に発現しています。 UTS2R の内因性リガンドであるウロテンシン II (UT2) による UTS2R の活性化は、心機能不全に関係しています。 例えば、末期うっ血性心不全患者では、血漿 UT2 レベルと心筋細胞の UTS2R 発現レベルが上昇します 47。 これらの以前の研究と一致して、我々は、1μMの濃度のレムデシビルによるUTS2Rの活性化が、培養心筋細胞において電気的異常と収縮力障害を誘発することを発見した。これらはいずれも、ヒトで報告されている心臓副作用と類似している。 さらに、これらの悪影響は、UTS2R に拮抗するか、その下流のシグナル伝達を阻害することによって効果的にブロックされました。 臨床的には、レムデシビルは成人および体重40kg以上の小児に1回200mg、その後毎日100mgを合計5～10日間静脈内投与されます。 レムデシビルの推定ピーク血漿濃度は健康な成人で 9.03 μM ですが、腎臓や胆汁中に排泄されるため、腎臓や肝臓に障害のある患者ではより高くなる可能性があります 48。 我々の結果は、レムデシビルの臨床用量がUTS2Rを活性化するのに十分であり、腎障害または肝臓障害のある患者は、レムデシビルとUTS2Rの軸を介して媒介される有害事象のリスクが高い可能性があることを示唆しています。 特に、我々の GPCR アッセイは、レムデシビルがアデノシン受容体に影響を及ぼさず、その活性化が心臓機能にも影響を与える可能性があることを明確に示しました。 したがって、UTS2R の活性化が心臓の副作用の原因である可能性があります。

この研究の重要な発見は、UTS2R のコード領域内の SNV がレムデシビルに対する応答に大きな影響を与えていることです。 この結果は、GPCR 遺伝子の SNV が CV 疾患を含むさまざまな疾患の病態生理と関連し、治療結果に影響を与えることを示した以前の研究と一致しています 49。 UTS2RのSNVの40％（44/110）は、WT受容体と比較してレムデシビルに対する効力の少なくとも2倍の低下を示し、56％（62/110）は顕著な変化を示さなかった（0.5倍から110分の範囲内） 2 倍の変化）、レムデシビルに応答して 2 倍を超える増加を示した 4 つの機能獲得型 SNV を特定しました。 特に、D1303.32G は、インシリコモデリングを使用して機能獲得変異 (D1303.32N) を特定したのと同じアミノ酸の変異体であり、レムデシビル認識における D1303.32 残基の重要性を示しています。

GPCR の活性化は、多くの場合、β-アレスチンの受容体への動員を誘導し、続いて細胞内コンパートメントへの受容体の内部移行を引き起こします。 この内部移行により GPCR の活性化が終了し、二次シグナル伝達経路が促進されます 50。 興味深いことに、β-アレスチンの動員を効果的に誘導する内因性リガンドUT2とは異なり（図1c）51、レムデシビル媒介UTS2R活性化はβ-アレスチンの動員を誘導しなかった。 したがって、我々の結果は、レムデシビルがGタンパク質に偏ったリガンドであることを示唆しています（図1c、補足図1b）。 レムデシビルによるUTS2Rのこのような偏った活性化は、β-アレスチンを介したシャットダウンを伴わずにUTS2Rの長期活性化を可能にし、それによって下流シグナル伝達の誇張と心毒性効果の増強を可能にするという形で、心機能に重要な影響を与える可能性がある。 しかし、レムデシビルの効力が中程度であるため、β-アレスチン反応の検出が妨げられた可能性も考えられます。 レムデシビルのバイアス効果を評価するには、β-アレスチン反応を高感度に検出するための新しい方法論を使用したさらなる研究が必要です。

リガンドが結合すると、UTS2R を含む GPCR は構造変化を開始し、ヘテロ三量体 G タンパク質の活性化と Gα および Gβγ サブユニット複合体の解離を誘導します。 Gα タンパク質には、下流のシグナル伝達伝達を担う Gαs、Gαi/o、Gαq/11、および Gα12/13 タンパク質が含まれます。 Gαi/o ファミリーのメンバーは心臓系を含めて広く分布しており、そこで高度に発現され、イオンチャネルの調節を介して心筋の収縮性と心拍数を調節するように作用します 37。 たとえば、安静時の心拍数は、ムスカリン性 M2 Gαi 共役受容体を介して媒介されるコリン作動性シグナルによって制御されます。 これらの効果は、アデニリルシクラーゼ (AC) の阻害と、洞房結節におけるカリウム チャネルの Gβγ 阻害によって起こります。 UTS2R の伝達機構は Gαi/o と Gαq29 の結合と活性化であり、UT2-UTS2R 軸が生理学的にも病理学的にも複雑なシグナル伝達経路を介した CV 制御に関与していることと一致しています。 NRCMを使用した我々の結果は、レムデシビルを介した心筋収縮の減少がGαi/oに依存するが、Gαq/11には依存しないことを明らかに示した（図4b）。 NRCM は心房筋細胞の表現型に似ているため 52、レムデシビルによる一定のペーシング下での心筋収縮性の低下は、カルシウム処理の障害を示しています 53。これは、レムデシビルの特徴的な心血管副作用である心拍数の低下と一致しています 10。 さらに、レムデシビルが成人心筋細胞の収縮性を著しく損なうことを示しました（図4e、f）。

レムデシビルがUTS2Rを活性化し、心毒性を引き起こす可能性があるという発見にもかかわらず、臨床証拠の欠如がこの研究の大きな限界となっている。 しかし、機能獲得型変異体の対立遺伝子頻度は低いため（補足図4b）、症状がより軽いOmicron COVID-19変異型の最近の蔓延により、レムデシビルの使用は減少すると予想されます。レムデシビル感受性とゲノム分散との関連性に関する大規模な臨床研究は、実行が困難である。 さらに、レムデシビルのUTS2R依存性不整脈リスクを誘発する正確な分子機構はまだ解明されていない。 考えられる説明は、心臓の電気活動に不可欠な遺伝子発現またはERGカリウムチャネルの輸送の調節障害である54。 あるいは、レムデシビル – UTS2R 軸の慢性的かつ累積的な心毒性効果は、翻訳と転写に対する下流の影響と一致しています。 レムデシビルがUTS2Rシグナル伝達を介してミトコンドリア代謝に影響を与える可能性を排除しませんが（補足図3f）、現在のデータは、レムデシビル-UTS2R軸がレムデシビルの主要なオフターゲットであることを示唆しています。

結論として、我々の知る限り、これはレムデシビルがUTS2Rの選択的アゴニストであり、レムデシビル媒介UTS2R活性化が薬物媒介性心毒性の根底にあることを示す最初の報告である。 さらに、UTS2R の特定の SNV がレムデシビルに対する感受性を高める可能性があることを発見しました。 したがって、この研究は、レムデシビルを介した心臓の副作用に関するメカニズムの洞察と、将来の嫌悪性イベントを防ぐための治療の機会を提供します。

この研究の全体的な目標は、抗 COVID-19 療法におけるレムデシビル関連の心毒性の分子機構を調査することでした。 まず、主要な抗 COVID-19 薬をリガンドとして使用して GPCR スクリーニングを実行しました (GPCR あたり n = 3)。 GPCR スクリーニングの結果を濃度反応分析によって検証し、UTS2R に対するレムデシビルの EC50 および Emax 値を決定しました (n = 16)。 また、AlphaFold を使用したドッキング シミュレーションを実行し、突然変異誘発研究 (n ≥ 3) で実証されたように、レムデシビルと UTS2R の結合に必須の重要なアミノ酸残基を決定しました。 次に、レムデシビルの心毒性の可能性を調べました。 hiPS 由来心筋細胞を使用して、レムデシビルの催不整脈リスクは主に UTS2R によって媒介されることを発見しました (n = 3)。 さらに、NRCMを使用して、レムデシビルによる収縮力の減少がUTS2R-Gαi/o軸によって媒介されることを示しました（n = 3）。 最後に、レムデシビル媒介受容体活性化に対する UTS2R 遺伝子内の SNV の影響を GPCR アッセイを使用して評価しました (SNV あたり n = 3)。

レムデシビル (GS-5734)、GS-441524、およびソホスブビル (GS-7977) は、Selleck Chemicals から購入しました。 ファビピラビルは東京化成工業から購入した。 フィブロネクチンは Sigma-Aldrich から購入しました。 他のすべての試薬は分析グレードのものであり、商業的供給源から入手した。

UTS2R で SNV を検索するために、東北大学の東北メディカル メガバンク機構 (ToMMo、https://jmorp.megabank.tohaku.ac.jp/) が公開している 14KJPN と呼ばれる 14,000 人の健康な日本人の公的データベースを使用しました41。さまざまな周波数データをカバーします。

GPCR の活性化を測定するために、トランスフォーミング成長因子 α (TGFα) シェディング アッセイを実施しました 26。 簡単に説明すると、HEK293A 細胞を 12 ウェル培養プレートに播種しました。 UTS2R構築物を含む、タグなしGPCRをコードする合計348個のpCAGプラスミドを調製しました（補足データ1）。 UTS2R 遺伝子のヒト SNV に対応する 110 個のミスセンス変異体を含む UTS2R 変異体は、KOD-Plus-Mutagenesis キットを使用して単一点変異を導入することによって生成されました。 細胞を、アルカリホスファターゼ（AP）タグ付きTGFα（ AP-TGFα; 250 ng)。 特に明記しない限り、UTS2R 活性化アッセイは内因性 G タンパク質を用いて実施されました。 キメラ Gα サブユニットタンパク質 (Gαq/s、Gαq/i1、Gαq/i3、Gαq/o、Gαq/z、Gαq/12、Gαq/13、および Gα16 の混合物; 各 10 ng) を 348 個の GPCR の初期スクリーニングに使用しました。 (図1a)。 24 時間の培養後、トランスフェクトされた細胞を回収し、遠心分離によって収集しました。 細胞を5 mM HEPES（pH 7.4）を含むハンクス平衡塩類溶液（HBSS）に懸濁し、96ウェルプレートに播種しました。 30分間のインキュベーション後、試験化合物を細胞に添加した。 1時間のインキュベーション後、馴化培地を空の96ウェルプレートに移した。 AP反応溶液（10 mM p-ニトロフェニルリン酸（p-NPP）、120 mM Tris-HCl（pH 9.5）、40 mM NaCl、および10 mM MgCl2の混合物）を、細胞および馴化培地を含むプレートに添加した。 プレートを室温で１時間インキュベートする前後に、マイクロプレートリーダー（Molecular Devices）を使用して、波長４０５nmでの吸光度を測定した。 化合物誘発性 AP-TGFα 放出は、化合物誘発性 AP-TGFα 放出シグナルから自発的 AP-TGFα 放出シグナルを差し引くことで計算し、Prism 9 ソフトウェア (GraphPad Prism) を使用してパーセンテージを 4 パラメーターのシグモイド濃度応答曲線に当てはめました。 、ＥＣ５０およびＥｍａｘ値が得られた。

NanoBiT 酵素相補ベースの β-アレスチン動員アッセイを実施しました 55。 簡単に説明すると、HEK293A 細胞を 6 ウェル培養プレートに播種し、PEI 試薬 (以下、ウェルあたり 1 mg/ml を 5 μl) を使用して、500 ng ssHA-FLAG-UTS2R-SmBiT コンストラクト (N -末端ヘマグルチニンシグナル配列とそれに続くFLAGエピトープタグ、および15アミノ酸の柔軟なリンカーを備えたC末端SmBiT）、100 ngのLgBiT-β-アレスチン構築物（15アミノ酸の柔軟なリンカーを備えたN末端LgBiT）、および400 ngの空のプラスミド。 24時間の培養後、トランスフェクトされた細胞を回収し、2 mlのアッセイバッファー（5 mM HEPES（pH 7.4）および0.01％ウシ血清アルブミンを含むハンクス平衡塩類溶液）に懸濁し、96ウェルプレートに播種した。ウェルあたり 80 μl の容量。 セレンテラジン（アッセイバッファーで希釈した50μMを20μl）を細胞プレートに添加し、続いて暗所で室温で2時間インキュベートした。 Spectra Max Lマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用してベースライン発光を測定した後、レムデシビルまたはUT2(6×濃度の20μl)を添加した。 化合物添加後、20秒ごとに発光を測定しました。 5 ～ 10 分間の平均発光シグナルを初期値に正規化しました。 Prism 9 ソフトウェアを使用して、倍率変化値をビヒクル処理条件の倍率変化値に対してさらに正規化し、4 パラメーターのシグモイド濃度反応曲線に当てはめて EC50 値を取得しました。

UTS2R のアフィニティープルダウンのために、N 末端ビオチンタグと GSSG スペーサーを備えた UT2 ペプチドが合成されました (Peptide Institute, INC)28。 HEK293 細胞に FLAG-UTS2R をコードするプラスミドをトランスフェクトし、実験前に 6 時間血清を枯渇させました。 細胞を氷冷したPBSで2回洗浄した。 低張液（プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む50 mM HEPES、pH 7.5）を細胞プレートに添加し、細胞を掻き取ることによって収集した。 ダウンスホモジナイザー (IKA EUROSTAR 20 デジタル) を使用して 2,000 rpm、20 ストローク、4 °C で細胞をホモジナイズし、組織破断装置 (Qiagen) を使用して 4 °C で 5 秒間さらにホモジナイズしました。 ホモジネートを 800 xg、4 °C で 10 分間遠心分離して、壊れていない細胞と核を除去しました。 上清をさらに３０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した（ＣＰ８０ＮＸ、ｈｉｍａｃ）。 得られたペレットを粗膜画分として使用し、高浸透圧溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、プロテアーゼ阻害剤を含む２ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。

その後、粗膜懸濁液をレムデシビルの存在下または非存在下で 1 時間インキュベートし、続いてビオチン-UT2 と一晩インキュベートしました。 ビオチン-UT2結合UTS2R複合体を、界面活性剤(N-ドデシル-β-D-マルトピラノシド; DDM、5×CMC)を含む高浸透圧緩衝液を使用して可溶化し、ストレプトアビジン磁気ビーズを使用してプルダウンした。 実験に適したビーズは 5 種類 (補足図 1d、Dynabeads Streptavidin Trial Kit、Thermo Fisher、および Streptavidin 磁気ビーズ、NEB) から選択され、SDS バッファーで変性されました。 次いで、溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、続いて抗ＦＬＡＧ抗体を使用してウェスタンブロットを行ってＦＬＡＧ－ＵＴＳ２Ｒ（Ｓｉｇｍａ Ｍ２モノクローナル抗体、１：２０００）を検出した。

ヒト UTS2R 構造は、AlphaFold タンパク質構造データベース 56,57 (AlphaFold Monomer v2.0) から、pLDDT スコアの低い蓋状 N 末端領域 (1 ～ 42) をトリミングすることによって調製されました。 プログラム Reduce58 を使用して、トリミングされた受容体に水素原子が追加されました。 レムデシビルは、50 の遺伝的アルゴリズムの進化と最大 2,500,000 の評価を備えた AutoDockFR59 によって受容体のオルソステリック ポケットにドッキングされました。 ドッキングポーズは2Åのカットオフでクラスター化され、受容体とレムデシビル間の水素結合の基準に基づいて上位5つのクラスターが検査されました。 構造は、CueMol および PyMOL (Schrödinger, Inc.) を使用して視覚化および分析されました。 この研究で使用されたファイルは Zenodo に寄託されました。

pERK、ERK、pAKT、AKT、および β-アクチンのブロットでは、UTS2R トランスフェクトおよび血清飢餓 HEK293A 細胞を 0.1 または 1 μM レムデシビルまたは 10 または 100 nM UT2 で刺激しました。 これらの化合物で刺激する前に、細胞を 100 nM のウランチド (ペプチド研究所) と 30 分間 100 nM (UTS2R 阻害の場合)、または 150 ng/mL 百日咳毒素 (PTX; Wako) と一晩 (Gαi/o 阻害の場合) でインキュベートしました。 ミトコンドリアタンパク質 (Total OXPHOS、MT-COI、TFAM、および VDAC) のブロットでは、1 または 10 μM レムデシビルまたは 1 または 10 μM GS-441524 を UTS2R トランスフェクト HEK293A 細胞に 48 時間添加しました。 全細胞溶解物は、プロテアーゼ阻害剤 (Thermo Fischer Scientific) およびホスファターゼ阻害剤 (Nacalai Tesque) を含む RIPA Lysis Buffer (Thermo Fischer Scientific) で調製しました。 細胞溶解物を超音波処理し、遠心分離によって清澄化しました。 タンパク質濃度はBCAタンパク質アッセイキット(Pierce)を使用して測定し、1 mg/mLに調整し、各実験について10μgのタンパク質をウェスタンブロッティングに供した。 SDS ポリアクリルアミドゲルを使用してサンプルを分離し、ポリ二フッ化ビニリデン (PVDF) 膜に転写しました。 ブロットを、TBS-T (0.1% Tween-20 を含むトリス緩衝生理食塩水) 中の 5% 無脂肪乳で 1 時間ブロックし、その後、さまざまな一次抗体を使用してプローブしました。 使用した一次抗体と使用希釈は次のとおりです:pERK (AB_331646)、1:2000。 ERK (AB_330744)、1:2000; pAKT (AB_329825)、1:1000; AKT (AB_329827)、1:1000; βアクチン (AB_10697039)、1:10000; 合計 OXPHOS (AB_2756818)、1:10000; MTCO1 (AB_2084810)、1:2000; TFAM (AB_10841294)、1:1000; VDAC (AB_2272627)、1:1000。 標的抗原を適切な HRP 結合二次抗体 (Cell Signaling) とともにインキュベートし、ECL 基質 (GE Healthcare) によって視覚化しました。 リン酸化タンパク質レベルは、標的タンパク質の総レベルに対して正規化されました（図3aおよび4c、d、補足図3a、b）。 ミトコンドリアタンパク質を測定するために（補足図3g）、OXPHOSサブユニット、VDAC、MTCO1、およびTFAMが、それぞれ異なるPVDF膜上の特異的抗体によって検出されました。 OXPHOS サブユニット、MTCO1、および TFAM のタンパク質レベルは、VDAC のレベルに正規化されました。

正常な成人ヒト組織におけるヒトUTS2R（hUTS2R）mRNA発現を評価するために、さまざまなヒト組織に由来する市販のcDNAをTaKaRaから購入し（詳細なサンプル情報は補足データ3に示されています）、2 ngのcDNAを定量的PCRに供しました。メーカー推奨の (qPCR) 分析 (Rotor-Gene Q、Qiagen)。 正常成体マウス組織におけるマウス UTS2R (mUTS2R) mRNA 発現を評価するために、C57BL/6J 雄マウスを日本クレアから購入し、複数の組織から RNA を単離しました。 RNA サンプルは cDNA に逆転写され、qPCR 分析に供されました。 相対定量に使用したプライマーを補足データ 4 に示します。hUTS2R および mUTS2R の発現レベルは、それぞれ G3PDH および 18 s rRNA のハウスキーピング遺伝子に対して正規化されました。

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞 (hiPSC-CM) は、Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. (CDI; iCell cardiomyocytes 2.0) から購入しました。 プローブ (MED-PG515A、Alpha MED Sciences) を準備するために、記録領域をフィブロネクチンでコーティングし、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水に溶解して 50 μg/mL 溶液を作成しました。 記録領域を 1 ～ 2 µL のフィブロネクチン溶液で覆い、プローブを 37 °C で少なくとも 1 時間インキュベートしました。 細胞を解凍し、iCell 心筋細胞プレーティング培地 (CDI) に懸濁し、2 μL のプレーティング培地中で 3.5 x 104 細胞の密度でプローブ上にプレーティングしました。 細胞を 37 °C、5% CO2 で 3 ～ 4 時間インキュベートした後、各プローブを 1 mL の iCell 心筋細胞維持培地 (CDI) で満たし、これを培地として使用しました。 培地は 2 ～ 3 日ごとに交換され、細胞はプローブ内で 5 ～ 14 日間培養され、自発的かつ同期的な電気活動を持つ心筋細胞のシートが得られました。

FP記録を実施した35,60。 FP を測定する前に、iCell 心筋細胞シートを、37 °C の 5% CO2 インキュベーターを使用して新鮮な培地中で少なくとも 4 時間平衡化しました。 平衡化後、プローブを多電極アレイ (MEA) システム (MED64、Alpha med Scientific) に移し、加湿 5% CO2 雰囲気中でインキュベートしました。 波形の安定性と恒常性は、信号を少なくとも 30 分間監視することによって確認されました。 FP が安定状態に達したら、ベースラインで 10 分間記録し、薬物治療の 24、48、および 72 時間後に記録しました。 薬物のストック溶液は、ジメチルスルホキシド (DMSO) または蒸留水で 1000 倍の目標濃度に調製されました。 ストック溶液を培地で最終濃度 0.1% DMSO まで希釈しました。

FP期間（FPD）は、FP35の最初のピークから2番目のピークまでの期間として定義されました。 FPD は、フリデリシアの公式 (式 1) を使用して心拍数 (スパイク間間隔 (ISI)) を補正しました。これが、この研究の主な補正方法でした。

ISI および FPD 値は、最後の 30 拍動、または安定した ISI および FPD を示す時点での 30 拍動から平均されました。

EPC-10 パッチクランプ増幅器 (HEKA、ランブレヒト、ドイツ) を使用して、穴あきパッチクランプ技術を使用して、hiPS-CM の電流クランプモデルの自発活動電位を 25 °C で記録しました。 hiPS-CM は通常、通常のタイロード ソリューションで自発的な自動性を生成します。 自発活動電位は、70 mM アスパラギン酸カリウム、50 mM KCl、10 mM KH2PO4、1 mM MgSO4、3 mM アデノシン三リン酸 (ATP) を含むピペット溶液で満たされたファイヤーポリッシュパッチピペット (抵抗、2.0 ～ 4.0 MΩ) を使用して記録されました。 (二ナトリウム塩; Sigma Chemical Company, St Louis)、5 mM EGTA、5 mM HEPES、および 0.1 mM Li2-グアノシン三リン酸 (GTP) (Sigma Chemical Company) (KOH で pH 7.2 に調整)。 アムホテリシンＢ（和光純薬工業）を１００ｍｇ／ｍＬの濃度でピペット溶液に添加した。 35 mm 培養皿にプレーティングされた hiPS-CM を含むカバーガラス (3 × 5 mm2) を、通常のタイロード溶液が入った記録チャンバーに置きました。

新生児ラット心筋細胞 (NRCM) は、生後 1 ～ 362 日目の Sprague-Dawley ラット (日本 SLC Inc.) の子犬から単離されました。 最終麻酔（１．５％セボフルラン吸入）および頚椎脱臼による安楽死の後、子犬の心室を解剖し、氷上で切り刻んだ。 細かく切り刻んだ組織を、0.05% トリプシン-EDTA (Gibco) 中で 4 °C で一晩事前消化し、次にフラスコを振盪 (125 rpm) しながら、PBS 中の 1 mg/mL コラゲナーゼ タイプ 2 (Worthington) で 37 °C で 30 分間消化しました。 ）。 解離した細胞をセルストレーナー(70μm、Falcon)を通して濾過し、180×gで2分間遠心分離した。 上清を除去した後、細胞ペレットを、10% FBS、1% ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地 12 (DMEM) に再懸濁し、10 cm 培養皿にプレーティングしました。 細胞を加湿雰囲気 (5% CO2、95% 空気) 中で 37 °C で 90 分間インキュベートしました。 浮遊 NRCM を収集し、マトリゲルでコーティングされた培養皿にプレーティングしました。 24 時間後、培地を無血清 DMEM に交換し、実験前に 2 日以上インキュベートしました。 すべての動物実験は、自然科学研究機構の倫理委員会または九州大学の動物実験委員会によって審査され、承認されました。 報告されたすべての手順は、実験動物の管理と使用に関する NIH ガイドに準拠しています。

NRCM (4 × 105 細胞/ウェル) を、無血清 DMEM 内の 3.5 cm ガラス底ディッシュに播種しました。 細胞をレムデシビル (1 μM) で 37 °C、5% CO2 で 48 時間処理しました。 ウランチド(100nM)を同時に添加した。 百日咳毒素 (PTX; 150 ng/mL) はレムデシビル添加の 18 時間前に処理し、YM-254890 (1 μM) はレムデシビル添加の 30 分前に処理しました。 NRCM の顕微鏡画像は、ペーシング条件下で 13 秒間記録されました。 NRCM のペーシングは、電気刺激装置 (NIHON KOHDEN、SEN-3301) を使用して、10 ms の周波数で毎秒 4 V で刺激されました。 BZ-X800 顕微鏡 (Keyence) を使用して画像データを 6 フレーム/秒で取得し、Fiji ソフトウェアを使用して分析しました63。

成体マウス心筋細胞の単離用の C57BL/6J マウスは、日本 SLC Inc. (静岡県) から購入しました。 成体マウスの心室心筋細胞の分離を実施した64。 雄マウスをイソフルランの吸入により麻酔した。 心臓をすぐに切除し、大動脈を小さな血管クランプでクランプした。 心臓を、130 mM NaCl、5.4 mM KCl、0.5 mM MgCl2、0.33 mM NaH2PO4、25 mM HEPES、22 mM グルコース、および 50 μU/mL ウシ インスリン (Sigma) を含む分離バッファー (3 mL 未満) で順行的に灌流しました。 pH 7.4、NaOH で調整) 0.4 mM EGTA を添加し、続いて酵素溶液 (10 mL) (1 mg/mL コラゲナーゼ タイプ 2 (Worthington)、0.06 mg/mL トリプシン (Sigma)、0.06 mg を含む分離バッファー) を灌流します。 /mL プロテアーゼ (Sigma)、および 0.3 mM CaCl2)。 その後、ＬＶチャンバーを取り出し、０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．７ｍＭ ＣａＣｌ ２ を含む酵素溶液中で小片に切断した。 組織細胞懸濁液をセルストレーナー（１００μｍ、Ｆａｌｃｏｎ）を通して濾過し、５０×ｇで３分間遠心分離した。 上清を除去した後、細胞ペレットを 0.2% BSA および 1.2 mM CaCl2 を補充した分離バッファーに再懸濁し、37 °C で 7 分間インキュベートしました。 遠心分離（５０×ｇ、３分間）後、細胞をタイロード溶液Ａ（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．３３ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５．０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および５．５ｍＭグルコースを含む）中に再懸濁した。 pH 7.4)) 0.2% BSA を添加。 細胞をマトリゲル (Corning) でコーティングされた 35 mm ガラスベースディッシュ (IWAKI) に播種し、37 °C で 30 分間インキュベートしました。 細胞は単離後 1 ～ 6 時間以内に使用されました。

単離した成体マウス心筋細胞をレムデシビル (10 μM) で 37 °C で 30 分間処理しました。 心筋細胞の顕微鏡画像は、ペーシング条件下で 13 秒間記録されました。 心筋細胞のペーシングは、電気刺激装置（NIHON KOHDEN、SEN-3301）を使用して、10ミリ秒の周波数で毎秒30Vで刺激されました。 画像データは、Fiji ソフトウェアを使用して分析されました。

統計分析は Prism ソフトウェア (GraphPad) を使用して実行され、方法は図の凡例に記載されています。 記号は平均値であり、エラーバーは平均値の標準誤差 (SEM) を示します。 図の凡例に別段の記載がない限り、すべての図について少なくとも 3 つの独立した実験からの代表的な結果が示されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

すべてのデータは本文または補足資料で入手できます。 図の基礎となるソースデータは補足データ 1 に示されています。トリミングされていないブロットは補足図 5 に示されています。分子ドッキング シミュレーション ファイルは Zenodo に寄託されました。

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東北大学モドミクス生物学・医学教室の皆様のご提案と技術支援に感謝いたします。 技術的な支援をしていただいたY.Takahata氏とH.Miyamoto氏、そして批判的な読書と言語編集をしていただいたNatalie D.DeWitt氏に感謝いたします。 本研究は、JSPS 科研費（AO への JP20K18371、JP22H04628、および JP22H02813、MN への JP21H05269 および JP22H02772、AI への JP21H04791 および JP21H051130、FY への JP21H02659 および JP21H05265）によって提供された資金によって支援されました。 W、JP21H02634、Y.Kanda、この著作物AMED（助成金番号：JP21mk0101189 to Y.Kanda、JP22zf0127007 to AI、21he2302008j0002 to FYW、BINDS JP22ama121031 to MN and JP20am0101095 to AI、LEAP JP20gm0010004 to AI）、JSTのFOREST（助成金）によっても支援されました。 No.JPMJFR220K～AO、 JPMJFR215TからAI、JPMJFR205YからFYW）、ムーンショット研究開発 JPMJMS2023（JSTからAI）、CREST JPMJCR2024（20348438）（JSTからMN）、ERATO JPMJER2002（JSTからFYW）、第一三共生命科学財団からAI、武田科学財団からAOとAI 、上原記念財団からAOとAI、稲盛財団からAO、三菱財団からAO、テルモライフサイエンス財団からAO、内藤財団からAO

これらの著者は同様に貢献しました: 小川亜希子、大平誠也。

東北大学加齢医学研究所（IDAC）モドミクス生物学・医学部門、〒980-8575 宮城県仙台市

Akiko Ogawa, Seiya Ohira & Fan-Yan Wei

東北大学大学院医学系研究科、〒980-8575 宮城県仙台市

Seiya Ohira

九州大学大学院薬学研究科生理学教室（〒812-8582 福岡市）

Yuri Kato, Xinya Mi, Yukina Ishii & Motohiro Nishida

東北大学大学院薬学研究科分子細胞生化学研究室〒980-8578 宮城県仙台市青葉区荒牧青葉6-3

Tatsuya Ikuta & Asuka Inoue

国立医薬品食品衛生研究所薬理学部門、〒210-9501、神奈川県

柳田翔太＆神田康成

岡山大学大学院医歯薬学総合研究科薬学教室（〒700-8530 岡山県岡山市）

Shota Yanagida

〒444-8787 岡崎市、自然科学研究機構 生理学研究所および生命・生活システム探索研究センター

Motohiro Nishida

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著者らは、この論文への貢献を次のように確認しています。研究の概念化と設計: AO、MN、AI、FYW。 データ収集：AO、SO、Y.Kato、TI、SY、XM、YI、AI。 結果の分析と解釈：AO、Y.Kato、TI、SY、XM、Y.Kanda、MN、AI、FYW 草案作成：AO、Y.Kato、TI、SY、XM、AI、FYW プロジェクト監督： Y.Kanda、MN、AI、FYW すべての著者が結果をレビューし、論文の最終版を承認しました。

Correspondence to Motohiro Nishida, Asuka Inoue or Fan-Yan Wei.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Dipayan Chaudhuri と他の匿名の査読者に感謝します。 主な取り扱い編集者: George Inglis。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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小川 明、大平 信、加藤 裕他レムデシビルによるウロテンシン II 受容体の活性化は、心筋細胞の機能不全を誘発します。 Commun Biol 6、511 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04888-x

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受信日: 2022 年 11 月 10 日

受理日: 2023 年 4 月 28 日

公開日: 2023 年 5 月 12 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04888-x

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