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Oct 22, 2023

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Genetica della natura, volume 55,

Nature Genetics volume 55、pages 268–279 (2023)この記事を引用

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217 オルトメトリック

メトリクスの詳細

遺伝子発現プロファイリングにより、加齢によって変化する多数のプロセスが特定されていますが、これらの変化がどのようにして起こるのかはほとんどわかっていません。 今回我々は、初期のRNAシークエンシングとRNAポリメラーゼIIクロマチン免疫沈降を組み合わせ、その後シーケンシングを行って、野生型高齢マウスにおける遺伝子発現変化を引き起こす根本的なメカニズムを解明した。 われわれは、2歳の肝臓では伸長中のRNAポリメラーゼの40％が停止し、生産的な転写を低下させ、遺伝子の長さに依存して転写出力を歪めていることを発見した。 我々は、この転写ストレスが内因性DNA損傷によって引き起こされることを実証し、主に有糸分裂終了器官における加齢に伴う大部分の遺伝子発現変化を説明し、特に栄養感知、オートファジー、プロテオスタシス、エネルギー代謝、免疫機能、細胞ストレスなどの老化の特徴的な経路に影響を与えることを説明します。回復力。 加齢に伴う転写ストレスは、線虫からヒトに至るまで進化的に保存されています。 したがって、老化中の確率的内因性 DNA 損傷の蓄積は基礎転写を悪化させ、これにより加齢に関連するトランスクリプトームが確立され、重要な老化の特徴である経路の機能不全が引き起こされ、DNA 損傷が正常な老化の主要な側面の機能の基礎をどのように支えているかが明らかになりました。

老化は、分子的、細胞的、生理学的に進行性の衰えを特徴とし、その結果、活力の低下、加齢に関連した病気、死亡率の増加をもたらします。 多くのプロセスは年齢とともに低下するか変化するため 1、老化における基礎転写プロセスの機能状態については驚くべきことにほとんど知られていません。 高齢のラットやショウジョウバエの脳では、メッセンジャー RNA の産生が少なく 2,3、いくつかの組織では転写における細胞間の変動が増加しています 4,5,6 が、老化すると遺伝子間の転写調整が減少します 7。 ただし、老化における転写は主に遺伝子発現の変化に関連して研究されています。 トランスクリプトミクスは、老化に影響を受ける多数の細胞経路およびプロセスの同定に大きく貢献しました8、9、10。 加齢に関連した臓器特異的な遺伝子発現変化の一部は、転写因子、マイクロRNA11,12、細胞型組成の変化8,13、エピジェネティックな変化14,15によって説明できるが、最近のトランスクリプトミクスメタ分析では、ほとんどの遺伝子発現の類似性が高齢者間で示されている。マウスの臓器は、これらの既知の調節機構に起因するものではありません 8。

DNA 損傷の蓄積は、通常の老化 16,17 および前述の転写表現型 6,7,18,19 の根本的な原因として想定されており、これは主に DNA 損傷物質またはコケイン症候群などの早期老化 DNA 修復障害に曝露された細胞との類似性に基づいています。トリコチオジストロフィー。 これらの状態では転写共役修復（TCR）に欠陥があり、DNA損傷上のRNAポリメラーゼの停止につながり20、転写を阻害するDNA損傷が正常な老化にも関与している可能性があることが示唆されています。 内因性転写阻害 DNA 損傷は正常な老化で蓄積します 21,22,23,24,25 が、それらが重大な転写応答を誘発するかどうかは現時点では明らかではありません。 この研究では、RNA ポリメラーゼ II (RNAPII) クロマチン免疫沈降とその後のシーケンス (ChIP–seq) を組み合わせた in vivo 初期 RNA シーケンス法を使用して、正常な野生型 (WT) 高齢マウスの遺伝子発現変化の基礎となる基礎転写を分析しました。共焦点イメージング。 われわれは、一般的な老化表現型としてDNA損傷が蓄積することで、加齢に伴う強力な転写低下と転写出力の歪みが生じ、一般的に加齢に伴う転写変化を引き起こし、特に寿命を決定する老化の特徴的な経路に影響を与えることを明らかにした。

正常な老化における転写のプロセスを調査するために、成体 (15 週齢) および老齢 (2 歳) の WT 雄マウス (各グループ n = 3) に、ウリジン類似体であるエチニルウリジン (EU) を 1 回腹腔内注射しました。生体内で新たに合成された RNA に組み込まれます26。 注射の 5 時間後、EU の蛍光染色により、古い肝臓では EU シグナルが 1.5 分の 1 に減少していることが明らかになりました (図 1a)。 この減少は肝臓全体に及び、ほぼすべての肝細胞に影響を及ぼし、加齢に伴う倍数化に限定されませんでした（図1b）。 EUシグナルの減少は核小体を除いて全核的であり（図1a）、RNAPII依存性転写の減少を示しているため、RNAPIIレベルの低下が転写の減少を説明できるかどうかをテストしました。 驚くべきことに、同じ肝臓サンプルを使用したRNAPIIの免疫蛍光染色では、老化肝臓では減少ではなく1.4倍の増加が示されました（図1cおよび拡張データ図1a）。 C末端ドメイン（CTD）のセリン5残基（ser5p）のリン酸化によって特徴付けられるRNAPIIの開始とプロモーター近位の停止には大きな違いはなく（図1dおよび拡張データ図1b）、これはゲノム全体のRNAPIIプロモーター活性を示唆しています経年変化してもほとんど変化しません。 しかし、セリン2 CTDリン酸化（ser2p）によってマークされる伸長RNAPIIは、1.5倍の増加を示しました（図1eおよび拡張データ図1c）。 これらのデータは、老化した肝臓では基礎転写が変化していることを示しています。

a、成体マウス肝臓（青）および老マウス肝臓（赤）の肝細胞核（DAPI対比染色、青）内のEU標識された新生RNA（緑）。 右、箱ひげ図で定量化された蛍光強度。 中心線は中央値を示し、ボックスの限界は IQR を示し、ひげは最小値と最大値を示します。 P = 2.1129 × 10−129 (対応のない両側 t 検定)。 カウントされた核: 成人 n = 506; 古い n = 500; n = 1 グループあたり 3 匹のマウス。 b、EU標識された新生RNAの蛍光強度（任意単位（au））と、WT成人肝臓（青）および老年肝臓（赤）の個々の肝細胞で測定された対応する核サイズのXY散布図。 c〜e、総RNAPII（c）、ser5pでリン酸化されたRNAPII（d）およびser2pでリン酸化されたRNAPII（e）成人および老肝臓の肝細胞の免疫蛍光染色（赤）（DAPIで対比染色、青）。 蛍光強度の箱ひげ図。 中心線は中央値を示し、ボックスの限界は IQR を示し、ひげは最小値と最大値を示します。 P 値は両側対応のない t 検定、1 グループあたり n = 3 匹のマウス。 計数された核および P 値: c、成人: n = 206。 古い: n = 155、P = 6.64186 × 10−21; d、成人 n = 2,926; 古い n = 2,643、P = 0.323195587; e、成人 n = 2,697; 古い n = 2,708。 P = 0。スケールバー、50 μm。 f、EU標識された新生RNAシーケンスの実験手順のフローチャート。 g、異なる RNA ポリメラーゼによって合成された EU-seq リードの割合 (%)。 RNAPI-II と mtRNAP (左) および RNAPIII (右)。成人と老人の総配列読み取りは 100% に正規化されています。 データは、平均±標準偏差、n = 1 グループあたり 3 匹のマウスです。 P = 0.012868073 (対応のない両側 t 検定)。 h、イントロンおよびエキソン領域からのRNAPIIによるEU-seq読み取りの割合(%)。 データは、平均±標準偏差、n = 1 グループあたり 3 匹のマウスです。 P = 0.013520897 (対応のない両側 t 検定)。

ソースデータ

転写の減少とRNAPII存在量の増加という一見矛盾する観察結果を調べるために、我々はin vivoでEU標識された新生RNA（EU-seq）を選択的に単離して配列決定した。その結果、全RNA配列決定と比較してイントロンリードの割合が大幅に高かった（図1）。 1f および拡張データ図 2a ～ c​​)。 対照実験では、成人肝臓と老齢肝臓での EU 取り込み密度が同一であることが示され（拡張データ図 2d–g）、老齢肝臓での EU シグナルの低下の説明としての EU 取り込みの低下は除外されました。 次に、異なるポリメラーゼのそれぞれによって転写された RNA 種にリードを割り当てることにより、細胞の初期 RNA プールに対する各 RNA ポリメラーゼの寄与を決定しました。 予想どおり、EU標識RNAの大部分はRNAPIIに由来しており（図1gおよび拡張データ図2h）、RNA合成の有意な加齢に伴う低下を示す唯一のRNAポリメラーゼは、RNA合成の約1.5倍の減少からも明らかです。イントロン由来の配列読み取り（図1h）。 スプライシングイベントは大幅に変化しなかったため（拡張データ図2i、j）、de novo RNA合成の減少と伸長RNAPIIの増加との間の不一致は、加齢におけるRNAPII生産性の特定の低下を示唆しています。

RNAPII の存在量と転写の間の矛盾をさらに調べるために、上記と同じ肝臓からの total、ser5p、ser2p RNAPII に対する抗体を使用して ChIP-seq を実行しました。 我々はまず、ゲノム全体にわたるプロモーターのサイレンシングが転写の減少を説明できるかどうかを調査した。 免疫蛍光の結果（図1）と一致して、すべての遺伝子にわたる転写開始部位（TSS）におけるゲノム全体の総RNAPII占有率およびser5p RNAPII占有率は、老化において有意な差はありませんでした（図2a、b）。 また、プロモーターから生産的伸長へのRNAPIIの移行は変化していませんでした（図2c）。 初期伸長に進む転写を評価するために、イントロン領域の最初のキロベース（図2d）またはTSS（図2e）から測定した最初のキロベースでゲノム全体の初期RNA産生を測定しました。 我々は、すべての遺伝子にわたる転写の最初のキロベースでほぼ 1:1 の相関関係を観察しました。これは、効果的に転写に進む全体的なプロモーター活性がほとんど変化していないことを示しています。 ゲノム全体でのプロモーター活性の低下は転写表現型の低下を説明できませんでしたが、プロモーター活性の上昇または低下によって転写が変化することが予想されました。 RNAPII 依存性の初期 RNA 生成の >90% に相当するすべての発現遺伝子 (n = 3,970) を、その TSS から転写終結部位 (TTS) までの 3 つの等しいビンに分割し、初期 RNA および RNAPII ChIP–seq からの対応するリードをマッピングしました。各ビン内の肝臓と成人の肝臓を比較しました。 クラスタリング分析を使用して、新生RNAとRNAPII ChIP-seqの両方のすべてのビンで、老化により転写的に上方制御または下方制御される遺伝子を特定しました（図2fおよび拡張データ図3a-c）。これはプロモーター制御を反映しています。 同定された転写上方制御遺伝子 (n = 778) または下方制御遺伝子 (n = 394) が老化に生物学的に関連しているかどうかを分析するために、遺伝子セット濃縮分析 (GSEA) 用の Enrichr ツールを使用して、これらの遺伝子サインを公開されている遺伝子サインと比較しました。 34 個のマウス肝臓および 15 個のラット肝臓 mRNA 発現プロファイルを含む老化摂動データベース。 転写的に上方制御および下方制御された遺伝子サインは、公表されているげっ歯類の肝臓の老化プロファイル（図2g、h）とよく似ており、老化中のプロモーター制御プログラムがトランスクリプトミクス研究全体で保存されていることを示しています。 要約すると、古い肝臓における初期の RNA 合成が約 1.5 倍低いのは、プロモーター活性の低下や RNAPII の伸長への移行によるものではありません。

a、b、平均総RNAPIIおよびRNAPII ser5p ChIP-seqは、成人（青）肝臓と老年（赤）肝臓のすべての遺伝子のTSS周囲（TSS±750 bp領域）の存在量を読み取ります。 灰色の線は、入力 DNA コントロール ChIP-seq を表します。 c、総RNAPII ChIP-seqデータにおける成人肝臓（x軸）および老年肝臓（y軸）からの発現されたすべての遺伝子のRNAPII移動率のXY散布図。 各ドットは遺伝子を表します。 各遺伝子は、1 グループあたり n = 3 匹のマウスの平均です。 d、e、成人肝臓（y軸）および老肝臓（x軸）のTSSからのイントロンの最初の1kb（d）、またはTSSから1kbの下流（e）までの全遺伝子の初期RNA合成を示すXY散布図。 各ドットは遺伝子を表し、シグナルは n = 3 匹のマウスの平均を表します。 f、プロモーターによって上方制御されたクラスター遺伝子と下方制御されたクラスター遺伝子の遺伝子本体上の新生RNA（左）と総RNAPII（右）のlog2倍率変化（古い/成人）の3ビンヒートマップ。 各行は 1 つの遺伝子を表します。 g、h、マウス (g) またはラット (h) からのすべての GSEA 老化データセットと転写上方制御および下方制御されたクラスター間の重複を示す棒図。 各重複の有意性と FDR は、フィッシャーの直接検定と Benjamini-Hochberg 法による多重検定補正によって計算されました。 FDR < 0.05 は有意と定義されます。

ソースデータ

3ビンのヒートマップを詳しく検査すると、転写上方制御された遺伝子の遺伝子本体上のビン全体で初期転写が徐々に低下する一貫したパターンが明らかになりましたが、RNAPIIレベルは反対の傾向を示しました（図2f）。 この現象の一般性を評価するために、転写低下の程度に従って分類されたすべての発現遺伝子に 3 ビン ヒートマップを拡張しました。 興味深いことに、ほとんどすべての遺伝子は老化した肝臓で転写が徐々に低下し、それに付随して遺伝子本体全体のRNAPII占有率が増加し、これがゲノム全体の現象であることが明らかになりました（図3a）。 加齢によりプロモーターによって上方制御される遺伝子も、プロモーター制御とは独立してこの転写低下を示しました（図2fおよび拡張データ図3b、c）。 新生 RNA および伸長中の RNAPII 挙動をより適切に定量化するために、発現したすべての遺伝子を TSS から TTS までの 20 のビンに分割しました。 TSS および TTS にマッピングされているリードを除外するために、伸長を表すビン 2 ～ 19 のみを分析しました。 予想通り、転写の方向性の性質と、RNAPIIフットプリントだけでなく完全な（成長している）新生RNA分子の配列決定により、発現したすべての遺伝子本体にわたって新生RNAが年齢に依存せず一般的に徐々に減少することが観察されました（図3b）。 遺伝子本体の最初のキロベースでの転写は同様ですが（図2d、e）、遺伝子全体の低下は古い肝臓で著しく強かったです（図3b）。 我々は、この加齢に伴う転写の過剰な低下を「生産的転写の漸進的喪失」(GLPT)と名付けました。 対照的に、老化中に遺伝子本体の総RNAPIIレベルとser2p RNAPIIレベルは徐々に増加しました（図3c、d）。これは図1と一致しています。伸長中の転写損失は転写減少の説明を提供し、逆説的にレベルの増加と一致します。 RNAPII の伸長。

a、発現したすべての遺伝子の転写低下のレベルによって分類された、新生RNAのlog2倍率変化（古い/成人）および遺伝子本体上の総RNAPIIのChIP-seqの3ビンヒートマップ。 b〜d、TSSとTTSの間の転写伸長相の相対配列密度。 b、成人肝臓（青）および老化肝臓（赤）における発生期のRNA配列。 c、成人肝臓（青）および老化肝臓（赤）の総RNAPII ChIP-seq。 d、成人肝臓（青）および老化肝臓（赤）のRNAPII-ser2p ChIP-seq。 発現されたすべての遺伝子。 n = 1 グループあたり 3 匹のマウス。 P 値: 32 df による対応のない両側 t 検定 データは平均 ± sem e,f として表示されます。ゲノム遺伝子長に基づく遺伝子カテゴリーの TSS と TTS の間の老化における転写伸長相におけるシーケンシングリード密度の変化の割合: EU-seq（e）およびtotal RNAPII ChIP-seq（f）。 g、図2eに見られるように、EU-seqにおけるパーセンテージシーケンシングリード密度変化（老人/成人）。ここで、x軸は各カテゴリーの平均遺伝子長です。 h、すべての発現遺伝子長 > 20 kb (x 軸) と、TSS から 20 kb 下流までの EU-seq 密度における高齢者と成人の間の変化率 (y 軸) を示す散布図 (n = 3,308)。 i、遺伝子本体内のRNAPIIを停止させたパーセンテージ。 図2eのように、色は遺伝子の長さのクラスを示しています。 データは平均±標準偏差（10 ～ 22 kb: n = 662; 22 ～ 30 kb: n = 644; 30 ～ 50 kb: n = 788; 50 ～ 70 kb: n = 587; 70 ～ 110 kb: n = 643; および >110 kb: n = 646)。

ソースデータ

以前、我々は老化した齧歯動物の肝臓とヒトの海馬における長い遺伝子のmRNA発現の優先的な喪失を報告し29、その後ショウジョウバエの光受容体30や脳の老化においても注目された31,32。 したがって、遺伝子の長さが GLPT に関係しているかどうかをテストしました。 まず、加齢に伴う転写低下が最も大きい遺伝子を図3bから選択しました。 これらのGLPThigh遺伝子（n = 914）は実際、すべての発現遺伝子または転写的に上方制御または下方制御された遺伝子と比較して、平均して有意に長かった（拡張データ図3d）。 次に、発現したすべての遺伝子を、それぞれ同数の遺伝子を含む 6 つの遺伝子長クラスにグループ化し、老化による遺伝子本体全体にわたる新生 RNA と RNAPII の変化の割合を決定しました。 この分析により、遺伝子長に依存する明らかな反対の傾向、つまり転写の低下とRNAPII占有の増加が明らかになりました（図3e、f）。 興味深いことに、各遺伝子クラスの平均遺伝子長を遺伝子本体全体の転写減少の割合に対してプロットすると、すべてのクラスが同様の線形転写回帰を示し（図3g）、古い肝臓では平均してキロベースあたり約0.35％の損失でした。 確認として、TSSからの最初の20 kbの転写低下は、すべての遺伝子長にわたって同様でした（図3h）。 70 kbを超える遺伝子はすでにRNAPII依存性の初期RNAプールの約60％を構成していたので（拡張データ図3e）、長い遺伝子は初期RNAレベルの低下に不均衡に寄与した。 de novo RNA 合成の減少と遺伝子本体内の RNAPII 存在量の増加により、滞留時間が長くなり、RNAPII の転写出力が低下します。 初期のRNAレベルと総RNAPII占有率の間の不一致を定量化することにより（拡張データ図3f）、2歳の肝臓の遺伝子本体における非生産性RNAPII全体の約40％を遺伝子長に依存して推定しました（図3f）。 3i)、これは停止していることを意味します。 マウス肝細胞の細胞あたりのRNAPII分子数が培養ヒト線維芽細胞と同数であると仮定すると33、平均的な2歳のマウス肝細胞には伸長中に常に18,000個を超える停止したRNAPII複合体が含まれていると考えられます（拡張データ図3g）。 要約すると、肝臓の老化は、遺伝子長に依存した、ゲノム全体にわたる転写伸長の喪失とRNAPII失速の増加によって特徴付けられます。

続いて、RNAPII の停止を説明するメカニズムを特定するために、さまざまな潜在的なパラメーターが GLPT の程度と相関しているかどうかを評価しました。 GLPThigh 遺伝子と他の遺伝子カテゴリー（転写上方制御および下方制御、残り）との間で、遺伝子本体全体のヌクレオチド含有量、転写エラー率、選択的スプライシング、クロマチンへのアクセス可能性、ユークロマチンまたは DNA メチル化パターンに関連するヒストン修飾において有意な差は見つかりませんでした。エピジェネティックな変化が原因であることを指摘しています (拡張データ図 4 ～ 6)。 これらの因子は、加齢に関連した GLPT の程度とは相関せず、このような因子が因果的に関与している場合に予想されるため、観察された転写低下の説明にはなりません。

遺伝子の長さに依存する転写停止を考慮すると、長い遺伝子は確率的損傷を獲得する可能性が高いため、転写を阻害する DNA 損傷が蓄積することがもっともらしい説明になります 26,29。 したがって、我々はXpg-/-マウスの肝臓におけるde novo RNA合成をモニタリングした。Xpg-/-マウスは、DNA修復経路TCRおよび全体的なゲノムヌクレオチド切除修復の欠陥により、広範な早期老化と20週間の寿命の多くの特徴を示す。転写停止病変を除去することはできません 34。 7週齢および14週齢でのEU染色とEU-seqの両方（図4a〜c）は、年齢依存的で進行性の汎核転写の低下を明らかにしました。 早老の全体的なゲノムヌクレオチド切除修復および鎖間架橋修復のさらなる欠損により、より重篤な肝老化病態を示すTCR欠損Ercc1Δ/-マウスにおけるEU-seqは、4およびそれ以上ですでに高い転写損失を示した10週目で（図4d）、転写低下の程度、DNA修復欠損、および肝臓病理の重症度が相関していることを示しています。

a、7週齢のWTマウスと比較した、7週齢および14週齢のXpg-/-マウスの肝核におけるEU標識された新生RNA（緑色）。 b、図4aの箱ひげ図の定量化。 中心線は中央値を示し、ボックスの限界は IQR を示し、ひげは最小値と最大値を示します。 P 値: 7 週齢 Xpg−/− 対 WT P = 2.4688 × 10−285。 14週齢Xpg-/-対WT P = 0。 両側対応のない t 検定、1 グループあたり 3 匹のマウス。 7週齢および14週齢のWT、Xpg-/-の核数n = 916、864、および738。 c、d、WT肝臓老化（104週間、黒線）と比較した、Xpg-/-（c）およびErcc1Δ/-マウス（d）におけるTSSとTTSの間のEU-seqリード密度変化の割合。 e、低酸素（3％）および正常酸素（20％）条件下での1、2および4週間の培養後のXpg-/-、Ercc1Δ/-およびWT静止MDFにおける初期RNA産生の減少率。 データは平均±sd P 値 (両側対応のない t 検定) は次のとおりです。 2 週目: Ercc1Δ/- 対 WT: P = 0.002353336; 4週目、Xpg−/−対WT：P = 6.13324 × 10−9。 Ercc1Δ/− 対 WT: P = 1.21727 × 10−9。 核の数: 3% O2​​、第 1 週: 14 Xpg-/- および 14 WT。 17 Ercc1Δ/- および 14 WT。 2週目：15Xpg-/-および16WT。 17 Ercc1Δ/- および 13 WT。 4週目：29Xpg-/-および27WT。 34 Ercc1Δ/- と 28 WT。 f、UVC照射から24時間後のErcc1Δ/- MDFにおける蛍光EU標識新生RNAの箱ひげ図。 中心線は中央値を示し、ボックスの限界は IQR を示し、ひげは最小値と最大値を示します。 P 値 (対応のない両側 t 検定): 2 J m−2 対 0 J m−2 = 5.66445 × 10−8。 4 J m−2 対 0 J m−2 = 2.92531 × 10−28; 6 J m−2 対 0 J m−2 = 5.59594 × 10−52。 計数された核: 0 J m−2、n = 146。 2 J m−2、n = 118; 4 J m−2、n = 132; 0 J m−2、n = 137.g、非照射細胞と比較した、UVC 照射 24 時間後の Ercc1Δ/- MDF における TSS から 110 kb を超える遺伝子の EU-seq リード密度のパーセンテージ。 黒線: 正常な肝臓の老化データからの > 110 kb の遺伝子クラス。 h、すべての遺伝子（n = 3,809）、短い（10〜22 kb、n = 512）および最長の総RNAPIIおよびRNAPII-ser2p ChIP–seqデータからのWT老化中にコード鎖にマッピングされるシーケンシングリードのバイアス（割合）遺伝子 (>110 kb、n = 779)。 P < 0.0001、遺伝子長 1 ～ 10 kb の遺伝子と比較した両側対応のない t 検定、1 グループあたり 3 匹のマウス。 データは、すべての遺伝子および最長遺伝子の遺伝子本体 (3 ビン) を通じた総 RNAPII および RNAPII-ser2p ChIP-seq データからの、WT 老化中にコーディング鎖にマッピングされたシーケンシングリードの平均 ± 誤差 (割合) のバイアス (割合) です (> 110 kb、n = 779)。 データは、平均±標準誤差、EU-seq からの Ghr 遺伝子のシーケンシングリード密度プロファイル、総 RNAPII (すべてのリードを集約)、および WT 成人肝臓 (青) および老化肝臓 (赤) におけるコード鎖とテンプレート鎖で分割された総 RNAPII です。 k、成体および高齢マウスの肝臓におけるリン酸化ATM（赤）およびγH2A.X（緑）。 右、蛍光強度は箱ひげ図として示されています。 中心線は中央値を示し、ボックスの限界は IQR を示し、ひげは最小値と最大値を示します。 P = 7.19752 × 10−27 (対応のない両側 t 検定)。 計数された核: 成人 n = 313; 古い n = 315; n = 1 グループあたり 3 匹のマウス。 スケールバー、50μm。

ソースデータ

転写低下の誘発因子としての自然発生的な内因性 DNA 損傷をさらに調べるために、Xpg-/-、Ercc1Δ/-、および WT マウスの静止マウス皮膚線維芽細胞 (MDF) を 1、2、および 4 週間培養して、内因性 DNA 損傷を蓄積させました。 静止は、細胞が増殖するときに起こる病変の希釈を回避します。 興味深いことに、Xpg-/-およびErcc1Δ/- MDFは、20％酸素で培養された新生RNA合成の時間依存性の低下を示しました（図4e）。 3% 酸素で培養した MDF では転写の大幅な低下は見られず、酸化による DNA 損傷が転写損失の原因であることが示唆されました。 次に、老化した肝臓で観察されたのと同程度の転写低下を引き起こす DNA 損傷のレベルを評価しました。 静止状態の Ercc1Δ/- MDF は、増加する用量の紫外線 C (UVC) 光に曝露され、既知の量の転写阻害 DNA 損傷を誘発します 37。 EU 染色と EU-seq は用量依存的な転写低下を示し、DNA 100 kb あたり約 1.6 個の転写阻害病変に相当する 2 J m-2 UVC が、ヒトの肝臓と同様に UV 曝露後 24 時間で転写レベルを誘導した。 WT 2 歳マウス (図 4f、g)。 これらの損傷レベルと 1 キロベースあたり 0.35% の転写減少を組み合わせると、RNAPI、RNAPIII、およびミトコンドリア RNAP (mtRNAP) が、標的 RNA 種が非常に小さいため顕著な低下を示さない理由も説明されます。

加齢に伴って伸長する RNAPII のかなりの部分が内因性の転写阻害損傷によって停止している場合、RNAPII ChIP-seq ライブラリー プロトコールの鎖特異的 DNA 増幅ステップ中に、実際に RNAPII を停止させるテンプレート鎖の損傷により、RNAPII の伸長が阻害されることが予想されます。また、損傷を受けていない (コーディング) 鎖とは対照的に、その鎖の DNA 増幅も損なわれます。 これは、UV 誘導性の転写遮断病変で示されているように、鎖特異的な ChIP-seq によって視覚化できるコード鎖に有利な鎖増幅バイアスをもたらすはずです 38。 まず、UV誘発性のDNA損傷がChIP-seqプロトコルのコーディング鎖バイアスを引き起こし、修復時間が経つと解消されることを確認しました（拡張データ図7a）。 重要なことに、古い肝臓では、総データセットとRNAPII-ser2p ChIP-seqデータセットで、年齢に関連した遺伝子長依存のコード鎖バイアスが見つかりました（図4h）。 コーディング鎖バイアスが高い領域では、局所的な DNA メチル化状態またはヌクレオチド含有量の両方が変化していませんでした (拡張データ図 7b-f)。これは、老化した肝臓から単離精製された DNA にポリメラーゼを遮断する摂動が存在し、それらが損傷を受けた DNA であることを示していることを示しています。 。 さらに、年齢に関連したコード鎖の偏りは、特に長い遺伝子で遺伝子の末端に向かって増加し（図4i）、これは遺伝子本体でのRNAPIIの停滞（図3）と遺伝子の先頭でTCRがより活性化することと相関している39。 一例は成長ホルモン受容体 (Ghr) 遺伝子で、これは長さ 265 kb を超える遺伝子で、多数の独立した研究 40、Xpg-/- および Ercc1Δ/- 変異マウス 18,34、および UV 光に曝露された細胞培養物 41 で頻繁にダウンレギュレートされます。 。 Ghr は、明確な GLPT と遺伝子本体全体にわたる RNAPII 存在量の増加を示します。 また、老化した肝臓では、コード鎖への読み取りの20％のシフトにも気づきました（図4j）。これは、Ghrの下方制御が転写遮断病変の直接の結果であることを示しています。 DNA損傷誘発性RNAPII失速は、二本鎖DNA切断の非存在下で非標準的なDNA損傷チェックポイントATMリン酸化を引き起こします42。これは老化肝臓でも観察され（図4k）、それによって老化における頻繁な転写ストレスがさらに実証されています。 コード鎖バイアスの程度は、UV処理した細胞から外挿した場合の予想レベルと一致するため 38 、我々のデータは、内因性転写阻害損傷が遺伝子長依存的にRNAPII失速を引き起こすことを明らかにしており、これを加齢関連転写ストレスと名付けた。

転写ストレスの機能的重要性を評価するために、最も関連性の高いレベルである成熟 mRNA での影響を定量化しました。 Igf1 遺伝子 (図 5a、b) は、健康と寿命の決定に関与する栄養素感知の重要な調節因子であり 43,44 であり、その発現は年齢とともに低下します 45,46。 予想通り、RNAPII は 79 kb Igf1 遺伝子本体に蓄積しました。 興味深いことに、コード鎖のバイアスは、正常またはさらに高い初期の RNA および RNAPII レベルによっても特徴付けられる遺伝子本体の最初の 3 分の 1 には存在せず、転写の低下がコード鎖のバイアスと相関していることを示しています。 したがって、プロモーターのサイレンシングではなく、DNA損傷によって誘発される転写ストレスが、老化肝臓におけるIGF1発現低下の原動力である。 ゲノム全体のエクソンに対する転写ストレスの影響を定量化するために、新生RNAにおける最初から最後までのエクソンの損失を計算しました。これは、発現したすべての遺伝子にわたって老化により約1.5倍増加し、遺伝子長に依存していました（図1）。 5c)。 これは、加齢によるmRNA産生の低下と一致し（図5d）、以前に観察された加齢による細胞mRNA含有量の減少のメカニズムを提供しました2、3。 これは、加齢により転写出力が低下し、遺伝子発現が小さな遺伝子に偏ることを意味します。

a、b、成人（青）および高齢者（赤）の EU-seq からの RNAPII コード鎖バイアス（a）およびエクソンのみ（b）を含む、Igf1 遺伝子全体の配列密度プロファイル（mm10、chr10:87,858,265–87,937,047）。 WTマウスの肝臓。 エクソン 1a および 1b は代替開始部位です。 c、すべての発現遺伝子（P = 5.06731 × 10−9）、短い遺伝子（10〜22 kb）および長い遺伝子（>110 kb、P = 0.000482946）の最後のエクソンと最初のエクソン間のEU-seq密度比。 データは平均±標準誤差です。P 値は両側対応のない t 検定（高齢者対成人）からのものです。 d、すべての発現遺伝子（P = 0.048761825）、短い遺伝子（10〜22 kb）、および長い遺伝子（> 110 kb、P = 1.78654 × 10−6）。 データは平均±標準誤差、P 値は両側対応のない t 検定からのものです。 e, 主要なプロセス カテゴリごとに分類された、IPA、KEGG、Reactome、および GSEA ホールマークによる TShigh 遺伝子における有意に過剰発現された経路 (太字)。 集計された P 値は、フィッシャーの直接確率検定から得られました。 詳細な経路情報については、補足表 2 を参照してください。

ソースデータ

転写ストレスは転写出力を低下させ、歪ませるため、どの細胞プロセスおよび経路が最も影響を受けやすいかを分析しました。 機能検査のために、老化による最初から最後のエクソンの転写損失が 1.5 倍を超える遺伝子 (n = 830) を選択しました。これは、高い転写ストレスレベル (TShigh) を持つ遺伝子を表します。 注目すべきことに、UVC誘発性のDNA損傷後のmRNAの下方制御を表す6つの独立した研究の全体的なプロファイルとの非常に重要な重複を発見し（補足表1）、転写遮断DNA損傷と加齢に関連する転写ストレスとの関連性をさらに裏付けています。 機能検査により、これまで老化の特徴として分類されていたいくつかの顕著に過剰発現した細胞経路1（図5eおよび補足表2）、たとえば、寿命に影響を与えることが知られている栄養感知経路IGF1、インスリン、成長ホルモン、mTORシグナル伝達などのいくつかの細胞経路が特定された1,44。 。 転写ストレスとタンパク質恒常性の喪失との関連性を示す、オートファジー、折り畳まれていないタンパク質応答、および小胞体ストレス経路も同定された。 さらに、我々は、Ercc1Δ/- マウスの肝臓における転写ストレスによって機能的に低下する、酸化的リン酸化やピルビン酸代謝などの重要なエネルギー代謝プロセスを発見した26。 さらに特定されたプロセスには、免疫因子、脂肪酸代謝、NRF2抗酸化経路が含まれており、これらはすべて寿命および/または加齢関連疾患に原因として関与しています47、48、49、50。 結論として、転写ストレスは、WT 老化マウスにおける老化の特徴的な経路およびプロセスの調節解除の重大な原因であると考えられます。

最後に、転写ストレスが肝臓に限定されているのか、それとも他の臓器や種でも発生するのかについて検討しました。 プロモーターによって上方制御された遺伝子セットには、転写ストレスも示す加齢に関連したB細胞浸潤8を示すB細胞サインが含まれていました（図2f）。 2歳マウスの腎臓のEU-seqも、老化マウスの肝臓と同様のGLPTを示しました（図6a）。 次に、初期の RNA を表すイントロンにマッピングされる十分なリードを含む、公開されているトータル RNA シーケンスの経年変化データセットを検索して再解析しました。 2 つの適切で広範なデータセット、高齢ヒト腱 51 と線虫線虫 52 において、WT 高齢マウス肝臓と同様の GLPT を発見しました (図 6a)。 ほとんどの公開データセットは mRNA シーケンスに由来しているため、GSEA 用 Enrichr ツールを使用して、TShigh 遺伝子セットも使用して、老化摂動ライブラリー内の選択されたすべての年齢関連遺伝子セット (n = 198) と一致しました。 比較のために、転写的に上方制御された遺伝子セットと下方制御された遺伝子セットも含めました。 すべての老化データセットの65％にTShigh遺伝子が顕著に存在することがわかりました（図6b）。 転写上方制御または下方制御されたサインのスコアははるかに低かったが（図6b）、6つの同様のサイズのランダム遺伝子セットとの重複は見つからず、転写ストレスが老化臓器全体の転写変化の主な要因であることを示しています。

a、WT老化マウス肝臓（黒、この研究、グループあたりn = 3、n = 3,970）からのEU-seqデータにおける発現遺伝子（5ビン分布）のTSSとTTSの間の転写伸長のEU-seqリード密度変化のパーセンテージ遺伝子）、高齢マウス腎臓（各グループ n = 2、n = 2,135 遺伝子、7.5 週間対 104 週間、青色）およびヒト腱の全 RNA 配列（グループ当たり n = 4、n = 773 遺伝子、69.5 ± 7.3 年）対 19 ± 5.8 歳、茶色）および C. エレガンス（各グループあたり n = 3、n = 2,872 遺伝子、若年成人期後 10 日目と 1 日目、緑色）。 データは平均値±標準誤差であり、GSEA の老化データセットと TShigh、我々の研究で特定されたプロモーターによって上方制御される遺伝子クラスと下方制御される遺伝子クラスの間の重複を示す棒グラフです。 有意性と FDR は、フィッシャーの直接確率検定と Benjamini-Hochberg 法によって計算されました。 c、3種の特定された遺伝子グループとGSEA老化データセット間の遺伝子濃縮率（x軸）：マウス（上）、ラット（中央）、およびヒト（下）。 TShigh (左)、プロモーターで下方制御されたもの (中央)、およびプロモーターで上方制御されたもの (右)。 ドット サイズは GEO 経年変化データセットの数を表します。 組織のデータセットが 1 つを超える場合、平均 ± SD および集計された P 値 (フィッシャーの直接確率検定) が表示されます。

ソースデータ

次に、どの臓器や組織が大幅に濃縮されているかを視覚化しました。 データベースに複数のエントリがある臓器については、平均オーバーラップおよび誤検出率 (FDR) 補正された集計 P 値を計算しました。 予想通り、マウスおよびラットの加齢に伴う肝臓 mRNA プロファイルは、TShigh 遺伝子セットと最も高い類似性を共有していました（図 6c）。 実際、転写ストレスは、プロモーター活性による転写制御よりも、肝臓の老化トランスクリプトームを形成するより支配的なメカニズムでした。 さらに、腎臓、心臓、脂肪組織、網膜、筋肉、肺、新皮質、脊髄などの他の多くの臓器でも、RNAPII が失速しやすい遺伝子が大幅に豊富であることが示され、多くの臓器が加齢に関連した転写ストレスを示していることが明らかになり、これが重複を説明しています。遺伝子発現パターンに影響を与え、加齢に伴うプロモーター制御よりも遺伝子発現に大きな影響を与えます。 すべての臓器が mRNA 転写ストレスの兆候を示したわけではありません。 これは、転写ストレス クエリ遺伝子リストが肝臓特異的遺伝子に偏っていること、および/または一部の臓器が転写停止になりにくいことが原因である可能性があります。 後者は、TCR 症候群および対応する変異マウスにおける早老表現型の部分的な性質と一致しています 34,36。 増殖組織、たとえば、造血幹細胞、皮膚、腸などはそれほど脆弱ではないようですが、これは、DNA損傷によって停止したRNAPIIを解決するDNA複製の能力によって説明され、他のメカニズムによる損傷の修復から保護されます20。 さらに、細胞分裂は DNA 損傷を軽減し、修復も可能にする可能性があります。 したがって、我々は、転写ストレスが、加齢に関連するトランスクリプトームを形成する主要な因子であり、多くの組織および種にわたる一般的な老化表現型であることを特定した。

この研究は、正常な老化における転写を阻害するDNA損傷がゲノム全体にわたる頻繁な伸長RNAPII失速を引き起こし、その結果、遺伝子長に依存した転写出力の低下をもたらし、その結果、老化に影響を与えることが知られている多くの経路の調節不全を引き起こすという証拠を提供する（図7）。 UV 処理した細胞における転写停止の類似性に基づいて 38、病変上で停止した最初の RNAPII がキューイングを引き起こす後続の約 3 つの RNAPII 複合体をブロックすると推定します。 加齢に関連した遺伝子発現変化の原因となる根本的なメカニズムはほとんど解明されておらず、DNA 修復変異体早老マウスモデルでもプロモーター制御などの能動的な制御メカニズムに起因すると考えられることがよくあります 8。 しかし、我々は、DNA損傷による受動的転写ストレスと遺伝子構造、つまり遺伝子長の組み合わせが、これらの変化のかなりの部分を占めることを示唆しています。

DNA 損傷による RNAPII の停止と老化におけるその影響を説明するモデル。

各細胞は 1 日あたり最大 100,000 個の DNA 損傷を受ける可能性があります 53 が、そのほとんどは専用の修復プロセスによって迅速に修復されます。 老化の原因としての DNA 損傷は、TCR 欠損コケイン症候群やトリコチオジストロフィーなど、ゲノム不安定性を根底に持つ早老症候群に大きく基づいており、これらは主に有糸分裂後の組織で寿命が短く、多くの早老特徴を示します。 対応するマウスモデル 34、35、54 は、老齢 WT マウスと著しく重複する mRNA トランスクリプトームを示します 18、19。 今回我々は、能動的な遺伝子制御ではなく、受動的な転写ストレスが老化トランスクリプトームの形成に関与していることを示す。 観察された転写ストレス表現型を説明するすべての推定上の理由を除外したわけではありませんが、WT老化肝臓からのRNAPII ChIP-seqデータにおいて非転写鎖への偏りを特定し、テンプレート鎖の転写阻害DNA損傷が最も可能性の高い原因であることを示しました。 RNAPII が停止しています。 DNA 損傷は老化中に蓄積しますが、これらのレベルが WT 生物の老化反応を誘発するのに十分であるかどうかはこれまで不明でした。 内因性転写阻害病変の候補であるアルデヒド 21、高度糖化最終産物 22、およびシクロプリン 23、24、25 は、観察された転写ストレスを説明するのに十分なレベルまで老化した臓器に蓄積する可能性があります。 したがって、早老性コケイン症候群やトリコチオジストロフィーと同様に、自然発生的な内因性 DNA 損傷の蓄積は、正常な老化において転写ストレスを引き起こします。

私たちのデータは、DNA 損傷が転写ストレスを介してどのように老化を引き起こすかを示しています。 転写ストレスは、臓器機能に影響を与える複数の臓器の老化発現プロファイルを主に決定し、特に多くの老化の特徴的な経路の機能不全を引き起こします。 さらに、DNA 損傷の確率的性質は、加齢とともに増加する転写ノイズを説明できる可能性があります 4,5,6。 転写ストレスは、高齢のメダカ 55 や C. エレガンス 56 に見られる表現型であるタンパク質複合体の化学量論の喪失を促進することにより、細胞機能にさらに影響を与える可能性があります。 また、細胞培養における転写阻害損傷による大小の遺伝子の不均衡な発現は細胞死を誘発する可能性があり、コケイン症候群における早期老化シグナルであると提案されています57。 最後に、RNAPII の失速自体も老化の直接的なきっかけとなります。 TCR および対応する遺伝性症候群の遺伝的解剖は、TCR 変異の分子的影響が早期老化の重症度に相関していることを示しています 20。 DNA 病変上の RNAPII を永続的に停止させる TCR 欠損は、他の修復経路が病変にアクセスできる修復欠損よりも深刻な老化の促進をもたらします 20。 このことは、DNA損傷から停止したRNAPIIを除去するのに必要なDNA損傷誘発ユビキチン化を無効にするRNAPIIの点突然変異を有する突然変異マウスでもさらに証明され、寿命の短縮と早期老化が見られた38。 DNA 損傷上で停止した RNAPII は、R ループの形成と DNA 損傷チェックポイント ATM42 の活性化を引き起こし、細胞死または老化を誘導する可能性があります 58。これにより、RNAPII の停止がどのように老化につながるかについてのメカニズムが提供されます。 老化したショウジョウバエの眼では、主に長い遺伝子で R ループが増加しており 59、このシナリオのさらなる証拠となっています。 我々は、WTの老化肝臓では、伸長するすべてのRNAPII複合体の約40％がDNA損傷によって停止していることを示した。 したがって、早老症症候群を引き起こす同じ老化信号は、通常の老化でも発生します。 興味深いことに、アルツハイマー病患者の脳でも、同年齢の対照と比較して長い遺伝子の発現低下が見られ60、転写ストレスの大きさが加齢に関連した疾患の病因に関与していることが示唆された。 逆に、長寿を促進する介入による食事制限は、長寿遺伝子発現の損失を回復させます 29 。これは、長寿介入が転写ストレスを軽減できることを示しています。 結論として、加齢に伴う内因性 DNA 損傷の蓄積は、多くの器官や組織で加齢に関連した遺伝子発現プロファイルを形成する転写ストレスを引き起こし、これは幅広い進化距離にわたって存在し、DNA 損傷の蓄積がどのように機能低下を引き起こし、それによって一次的機能を強化するかを説明できると提案します。老化プロセスにおける DNA 損傷の役割 16,17。

マウスの飼育と実験は、オランダ政府の動物福祉法に従い、実験動物の管理と使用に関するガイドに従い、欧州の法律に完全に従ってオランダ倫理委員会によって承認されたガイドラインに従って実施されました。 動物の管理と使用に関する施設内倫理委員会は、すべての動物プロトコルを承認しました。 F1 C57BL6J/FVB (1:1) ハイブリッド バックグラウンドの WT 雄マウス (Mus musculus) を、15 週齢と 104 週齢で安楽死させました。 WT C57BL6J および FVB 株は、標準的な遺伝的背景を維持するために、Jackson Laboratories から頻繁に入手されます。 屋内で作製された DNA 修復欠損早老マウスモデルと、F1 C57BL6J/FVB (1:1) ハイブリッド バックグラウンドの WT 同腹子は、Ercc1Δ/- 変異体については 4 週目と 10 週目に安楽死させられました 35。 Xpg-/- 変異体では 7 週間と 14 週間。 すべての動物は、AIN93G 合成ペレット (Research Diet Services; 総エネルギー含量 4.9 kcal g-1 乾燥質量、可消化エネルギー 3.97 kcal g-1) で飼育および維持されました。 動物は管理された環境（20〜22℃、12時間明期：12時間暗期サイクル）で維持され、動物資源センター（エラスムス大学医療センター）の特定の病原体のない条件下で換気された個別のケージに個別に収容されました。 サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されていませんが、サンプルサイズは以前の出版物で報告されているものと同様です8、18、26、29、38、41。 データの収集と分析は実験条件を無視して行われたわけではなく、実験グループへの動物の無作為化は適用されませんでした。 どの分析でも実験グループから動物を除外しませんでした。

内因性 DNA 損傷誘発性の de novo RNA 合成を評価するために、Ercc1Δ/-、Xpg-/-、および WT (すべて C57BL6J/FVB F1 ハイブリッド遺伝的背景にある) MDF を対応するマウス モデルの尾から単離し、DMEM を添加した中で培養しました。 10% FCS と 1% PS、5% CO2 と 3% O2​​。

マウスに、体重１グラム当たり０．０８８ｍｇの５－ＥＵ（ＡＸＸＯＲＡ）を腹腔内注射した。 腹腔内注射の5時間後、マウスを安楽死させた。 組織サンプルは、蛍光染色のためにホルマリン固定されるか、RNA 単離および ChIP 実験のために瞬間凍結されました。

パラフィン包埋、ホルマリン固定肝臓片から 3 ～ 5 μm の切片を切り出しました。 スライスを顕微鏡スライド (Superfrost Ultra Plus Adhesion Slides、Thermo Fisher Scientific) にマウントしました。 RNAPII 染色では、サンプルをキシレンで脱パラフィンし、アルコール勾配で再水和し、抗原回復前に Milli-Q 水で洗浄しました (クエン酸緩衝液、pH 6 で 30 分)。 使用した抗体は次のとおりです。 Alexa Fluor 594-RPB1 抗体 (1:250 希釈)、CTD のリン酸化状態とは無関係にすべての形態の RNAPII を認識します (カタログ番号 664908、BioLegend)。 RNAPII-ser2p (カタログ番号 ab5095、アブカム); RNAPII-ser5p (カタログ番号 ab5131、アブカム); phospho-ATM (Ser1981、カタログ番号 4526、Cell Signaling Technology); およびホスホヒストン H2A.X (Ser139、カタログ番号 9718; Cell Signaling Technology) をすべて 1:500 希釈で使用します。 バックグラウンドの蛍光レベルを下げるために、マウスオンマウス検出キット（カタログ番号 BMK-2202、Vector Laboratories）を使用しました。 切片は、DAPI または Hoechst 33342 を使用して対比染色されました。

キシレンベースのパラフィン除去および再水和ステップ（EU 染色では抗原回復ステップは省略されました）の後、標準免疫蛍光プロトコルに従って Click-iT RNA Alexa Fluor 488 イメージング キット（カタログ番号 c10329; Thermo Fisher Scientific）を使用しました。 。 画像は ZEISS LSM 700 システムで撮影されました。 初期の RNA 染色強度は、Fiji ソフトウェア 61 を使用して各核染色の統合密度値を計算することによって定量化されました。 統計的有意性は、Prism バージョン 7.04 (GraphPad Software) で対応のない Student の t 検定を使用して正規化された蛍光強度値から計算されました。 EU 標識された新生 RNA の in vitro 染色では、細胞をカバースリップ上で増殖させました。 コンフルエントな増殖ディッシュでは、培地を 1% FCS を補充した新鮮な培地と交換し、(指示されている場合) 指示された時間 20% O2 に移しました。 培地は週に２回更新した。 UVC処理後のde novo RNA合成を測定するために、Ercc1Δ/-およびWT MDF（両方ともC57BL6J/FVB F1ハイブリッドバックグラウンド）をコンフルエントまで培養し、上記のように維持した後、UVC照射（0、2、4および6J m- 2 UVC) 254 nm 殺菌灯 (Philips) を使用。 アッセイは 24 時間後に実行され、MDF がトランスでの即時転写効果から回復できるようにしました。 転写レベルを評価するために、全 RNA 抽出のために細胞を収集するか、蛍光染色のために固定する前に、1 mM EU を 1 時間培地に添加しました。 細胞を氷冷したトリス緩衝生理食塩水(TBS)で洗浄し、4%ホルマリン中で氷上で20分間固定した。 続いて、細胞をTBS中の3%ウシ血清アルブミン(BSA)で洗浄し、TBS中の0.5% Triton X-100を使用して室温で20分間透過処理した。 次いで、カバーガラスを３％ＢＳＡを含むＴＢＳで２回洗浄し、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ反応混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに３０分間インキュベートした。 Click-iT 反応後、細胞を 3% BSA を含む TBS で 1 回洗浄し、TBS で 1 回洗浄した後、1:1,000 Hoechst 33342 を含む TBS 中で 30 分間インキュベートしました。 サンプルは、Prolong Diamond (Invitrogen) を使用してマウントされました。 画像はLSM700 ZEISS顕微鏡で取得し、核のEU染色強度をフィジーで定量化しました（画像J 1.53q）。

オンカラム DNase ステップ (RNase-Free DNase Set、QIAGEN) を含む miRNeasy キット (QIAGEN) を使用して、瞬間冷凍した肝臓および腎臓のスライスまたは掻き取った細胞から全 RNA を単離しました。 RNA の質と量は Bioanalyzer (Agilent Technologies) で推定され、高品質 RNA (RNA 完全性数 > 8) のみがさらなる分析に使用されました。 全RNA配列決定は、他の場所で説明されているように実行されました62。 EU 標識新生 RNA を選択的に単離するために、Click-iT 新生 RNA キャプチャ キット (カタログ番号 c10365、Thermo Fisher Scientific) を使用しました。Click-iT 化学を使用して、ビオチンアジドを EU 標識 RNA のエチレン基に結合しました。 。 EU 標識された新生 RNA は、MyOne Streptavidin T1 磁気ビーズを使用して精製されました。 ストレプトアビジンビーズに結合した捕捉された EU-RNA を、変更を加えた製造元のプロトコールに従って、TruSeq mRNA サンプル調製キット v2 (Illumina) を使用して、ビーズ上シーケンシング ライブラリーの生成に直ちに供しました。 プロトコルの最初のステップはスキップされました。 ランダムヘキサマープライマーを使用して、逆転写酵素 (Super-Script II) によってビーズ上に直接相補 DNA (cDNA) を合成しました。 次に、cDNA 断片を末端修復反応によって平滑末端化し、続いて dA テーリングを行いました。 続いて、特定の二本鎖バーコードアダプターをライゲーションし、15 サイクルのライブラリー増幅を実行しました。 PCR ライブラリーをクリーンアップし、DNA1000 アッセイを使用して Agilent Bioanalyzer で測定し、等しい濃度でプールし、HiSeq 2500 の 1 つのレーンで 3 つずつシーケンスしました。

瞬間冷凍した肝臓を氷冷PBS中で細かく刻み、Dounceホモジナイザーでホモジナイズし、セルストレーナー(Falcon)で濾過した。 ホルムアルデヒド (合計 1%) を添加した後、ホモジネートを氷上で 10 分間振盪し、グリシンでクエンチしました。 ペレット状のホモジネートを氷冷 PBS で洗浄し、細胞溶解バッファー (0.25% Triton X-100、10 mM EDTA、0.5 mM EGTA、20 mM HEPES、pH 8.0、cOmplete EDTA-free および PhosSTOP、Sigma-Aldrich) に再懸濁しました。氷上で10分間インキュベートした。 サンプルを遠心分離し、核溶解緩衝液（0.15M NaCl、1mM EDTA、20mM HEPES、pH8.0、cOmplete EDTA-freeおよびPhosSTOP）に再懸濁した。 サンプルをダウンスホモジナイザーでさらにホモジナイズし、氷上で 10 分間インキュベートしました。 核画分を超音波処理緩衝液（50 mM HEPES、pH 7.8、140 mM NaCl、1 mM EDTA、1% Triton X-100、0.1% デオキシコール酸ナトリウム、1% ドデシル硫酸ナトリウム、cOmplete EDTA-free、および PhosSTOP）に再懸濁しました。 Bioruptor (Diagenode) ソニケーターを使用してクロマチンを超音波処理して 100 ～ 500 bp の断片にし、遠心分離して残っている細胞破片を除去しました。 上清から 15 μg のクロマチンを 1 回の免疫沈降に使用しました。 ChIP-seq では、5 つのサンプルがプールされました。 Dynabeads M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG ビーズを免疫沈降ステップに使用しました。 クロマチンサンプルはビーズを使用して 4 °C で 2 時間事前に除去されました。 事前に除去したクロマチンサンプルを、RNAPII 抗体 (RNAPII-ser2p、RNAPII-ser5p、または RNAPII RPB1-NTD 特異的抗体 (クローン D8L4Y、Cell Signaling Technology)) とともに 4 °C で一晩回転させました。 Dynabeads をサンプルに 2 時間添加して、タンパク質 – DNA 複合体をプルダウンしました。 免疫沈降後、サンプルを以下の緩衝液で 2 回洗浄しました:超音波処理緩衝液、緩衝液 A (50 mM HEPES、pH 7.8、500 mM NaCl、1 mM EDTA、1% Triton X-100、0.1% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS) で 2 回洗浄しました。 、cOmplete EDTA-free および PhosSTOP)、バッファー B (20 mM Tris、pH 8、1 mM EDTA、250 mM LiCl、0.5% NP-40、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、cOmplete EDTA-free および PhosSTOP) で 2 回、最後に 2 回Tris-EDTA 緩衝液 (10 mM Tris、pH 8、1 mM EDTA) を使用。 クロマチンの結合画分は、ChIP Kit (Diagenode) 用の IPURE DNA 回収を使用して単離されました。 シーケンシング ライブラリは、Illumina TruSeq ChIP ライブラリ準備キットを使用して生成されました。 サンプルは HiSeq 4000 プラットフォームで配列決定されました。

EU-seq リードは、品質管理ソフトウェア FastQC v.0.11.9、FastQScreen v.0.14.0、および Trimmomatic v.0.35 (参考文献 63) でパラメータを使用して前処理されました: SLIDINGWINDOW:4:15 LEADING:3 TRAILING:3 ILLUMINACLIP :adapter.fa:2:30:10 リーディング:3 トレーリング:3 ミンレン:36。 残りのリードは、Tophat2 v.2.0.9 (ref. 64) を使用して、マウスのリボソーム DNA (BK000964.3)、ミトコンドリア配列 (UCSC、mm10)、およびマウス参照ゲノム (GRCm38/mm10) と連続的にアラインメントされました。 -g 1 オプション。 ChIP-seq リードは、Bowtie65 v.2.1.0 を使用して mm10 マウス参照ゲノムにアライメントされました。 公開されている total RNA-seq データセットは、対応する参照ゲノム (hg19 および ce10) を使用して EU-seq と同じマッピング アルゴリズムを適用し、種間の老化における初期の RNA 動態を研究しました。 ChIP-seq で使用されたのと同じマッピング アルゴリズムが他の公開データに適用されました。

すべての RefSeq (リリース: 95) 遺伝子、エクソン、およびイントロンは UCSC Genome Browser66 から抽出され、遺伝子リストは各遺伝子の最長の転写産物にまとめられました。 別のコード遺伝子または非コード遺伝子と重複する領域を持つ遺伝子は削除されました。 そこで、特定のRefSeq遺伝子に特有の領域のみを有する遺伝子をさらなる解析に使用した。 この研究で示されたいくつかの実験では、特定のゲノム領域（TSSから1 kb下流まで、イントロン領域のみ、TSSから20 kb下流まで、3'UTR、発現遺伝子の最初と最後のエクソン、TSS領域周辺（-0.75 kb））遺伝子ごとの生産的伸長プロセスを調査するために、遺伝子の TSS および TTS 周囲のゲノム領域を k 個の比例ビンに分割しました (デフォルトでは k = 20)。 ; 異なるデータセットのデータ品質により、ビンの数は異なります (詳細は後述))。遺伝子比例伸長解析でビンと重複する短い遺伝子にマッピングされるリードが多すぎることを避けるために、長さが 10 kb 未満の遺伝子は研究から削除されました。 。

Python パイプライン (K_bining.py) が作成され、BAM/BW 形式でアライメントされた RNA/EU/ChIP–seq リードを入力として受け取り、遺伝子の転写伸長領域のリードを定量化し、HTSeq を実行して前述のゲノム領域のリードを定量化しました。 。 さらなる研究における技術的な変動（特にシーケンシングの深さ）を排除するために、100 万あたりの読み取り数（RPM）を適用してさまざまなシーケンシング ライブラリを正規化しました。 「全遺伝子」遺伝子セットには、最初のキロベースに少なくとも 1 つのリード マッピングを持つすべての遺伝子が含まれます。 20 個のビンのそれぞれに少なくとも 1 RPM を持つ遺伝子を含む遺伝子セットを構築し、「全発現遺伝子」と名付けました。 遺伝子本体全体にわたるリード分布を研究するため、また配列の深さとデータ品質に起因して、各 EU-seq および公開トータル RNA データセットコレクションに対して異なるビン数 (k) と発現したすべての遺伝子の数 (n) が選択されました。 したがって、WT エイジングで設定された「すべての発現遺伝子」には、n = 3,970 の遺伝子が含まれ、k = 20 のビンに分割されました (すべての EU-seq リードの >90% がこれらの遺伝子にマッピングされます)。 Ercc1Δ/- マウス (k = 20、n = 2,430)。 Xpg-/- マウス (k = 20、n = 3,842)。 UV 処理した Ercc1Δ/- MDF (k = 10、n = 1974)。 WT 老化腎臓 (k = 20、n = 2,135); 人間の腱 (k = 5、n = 773); C. エレガンス (k = 5、n = 2,872)。 WT 老化 EU-seq データを対応する RNAPII ChIP-seq データ（同じ肝臓から生成）と照合するために、「すべての発現遺伝子」遺伝子セットから対応する遺伝子も RNAPII ChIP-seq データセットで選択されました。 サンプル内特異的バックグラウンドは、遺伝子間領域の読み取り値を計算することによって決定され、比例的に除去されました。 DNA インプットサンプルを使用して、全体的なバックグラウンドシグナルを差し引いた。 WT老化における「すべての発現遺伝子」（n = 3,970）を生物学的に定義するために、成人サンプルと高齢サンプル間のEU-seqおよび総ChIP-seqリードと組み合わせたk平均クラスタリング分析を実行しました。 拡張データ図 3a で説明されている基準に基づいて、k 平均クラスター分析で見つかった 4 つの主要なパターンを 4 つの生物学的グループとして定義しました: プロモーターで上方制御される遺伝子、n = 778 (EU-seq および RNAPII ChIP-seq レベルは 3 つのグループ間で増加)ビン）; プロモーターによって下方制御された遺伝子、n = 394 (EU-seq および RNAPII ChIP-seq レベルは 3 つのビン全体で減少)。 GLPThigh 遺伝子、n = 914 (3 つのビン全体で急激な EU-seq レベルの漸進的減少、急激な RNAPII ChIP-seq レベルの増加)。 残りの遺伝子、n = 1,884 (3 つのビン全体で軽度の EU-seq レベルの漸進的減少、軽度の RNAPII ChIP-seq 増加)。 遺伝子の長さと転写ストレス表現型の関係を研究するために、WT マウスで発現した遺伝子 (n = 3,970) をその長さに応じて 6 つのグループに分けました。各グループには同様の数の遺伝子が含まれています: 10 ～ 22 kb (n = 662、n = 662)平均 = 16.47 kb、中央値 = 16.75 kb); 22～30 kb (n = 644、平均 = 26.87 kb、中央値 = 26.94 kb)。 30～50 kb (n = 788、平均 = 40.19 kb、中央値 = 39.68 kb)。 50〜70 kb (n = 587、平均 = 59.18 kb、中央値 = 59.02 kb)。 70 ～ 110 kb (n = 643、平均 = 87.93 kb、中央値 = 86.75 kb)、および >110 kb (n = 646、平均 = 199.47 kb、中央値 = 160 kb)。 遺伝子クラスの行動を測定する図では、最初に n = 3 匹のマウスからの遺伝子ごとの平均シグナルを計算し、続いて遺伝子クラス内のすべての遺伝子のシグナルを平均しました。

TShigh 遺伝子の遺伝子オントロジーおよび機能クラスタリング分析は、複数のデータベースとソフトウェアを使用して実行されました: Ingenuity Pathway Analysis、GSEA v.4.2.2 (京都遺伝子およびゲノム百科事典 (KEGG)、リアクトーム パスウェイ データベース、GEO の老化摂動も含まれています) Enrichr27、28、67、68 からのダウン データセット。 GEO からの老化摂動のデータセットと Enrichr からの下位データセットは、若年/成人が 8 週間を超え、老齢が 14 か月を超え、若年/成人と高齢者の臓器間の年齢差が 6 か月を超える場合にのみ含まれていました (マウス、ラット)。 人間の年齢は 56 歳以上で、年齢差は少なくとも 12 歳以上です。 閾値 FDR < 0.05 を採用しました。 同定された主な生物学的プロセスの集計 P 値は、フィッシャーの直接確率検定を使用して、対応する検出されたサブ経路の P 値を組み合わせることによって計算されました。

RNAPII 移動率は、TSS 上の RNAPII と老人および成人の最初の 1 kb 遺伝子本体内の RNAPII 間の比率です。 TSS 周囲の総 RNAPII 密度値 (±300 bp) を、各遺伝子の TSS の 300 bp 下流から測定した最初の 1 kb 遺伝子本体の総 RNAPII 密度値で割りました。 最初のイントロンの最初の 1 kb 領域、または TSS からすべての遺伝子の 1 kb 下流までの初期 RNA 合成を成体マウスと老マウスの肝臓で比較するために、すべてのデータセットはシーケンシングの読み取り深さに基づいてのみ正規化され、およその補正は行われませんでした。老化した肝臓ではイントロン配列の数が 1.5 分の 1 に減少。 生産的な転写伸長を測定するために、発現したすべての遺伝子を k 個の比例ビンに分割し、EU-seq および RNAPII ChIP-seq データセットからの平均リード数を計算しました。 その後、カウントを最初のビンに対して正規化し、プロットしました。 ビンごとの密度変化のパーセンテージは、old(readcount) / Adult(readcount) × 100% によって計算されました。 最初と最後のビンには、RNAPII プロモーターの近位停止が存在する TSS と RNAPII が蓄積する TTS のシグナルが含まれるため、中央の 18 ビンを転写伸長期と定義しました。 3 ビンのヒートマップは、後続の 6 つのビンを集計し、EU-seq リードとトータル RNAPII ChIP-seq リードの両方について、古いサンプルと成人サンプルの間のすべての遺伝子の log2 倍変化を計算することにより、18 ビン データから導出されます。 老化肝臓におけるRNAPII失速または非生産性RNAPIIの増加率を決定するために（拡張データ図3f）、伸長期（18ビン）の初期総RNAレベルが総RNAPIIの結果である成人肝臓のベースラインを仮定しました。伸長段階のレベル (18 ビン)。 n = 3 匹のマウスにわたる平均関係をベースラインとして設定します。 老化した肝臓では遺伝子本体全体で RNAPII レベルが増加し、初期の RNA レベルが低下するため、成人肝臓のベースラインに基づいてこれらの初期の RNA レベルを裏付けるはずの合計 RNAPII ChIP-seq リードの予想数が計算されました。これは、伸長フェーズ (18 ビン) における EU-seq リード数と総 RNAPII ChIP-seq リード数の比率です。 続いて、各老化肝臓サンプルにおいて、サンプルごとに観察された合計 RNAPII ChIP-seq リード数が決定されました。 次に、観察された総 RNAPII ChIP-seq リード数から予想される総 RNAPII ChIP-seq リード数を引き、これを老化肝臓の予想されるリード数で割りました。 老化による RNAPII 失速 (%) = (観察された RNAPII リード数 − 予想されるRNAPII 読み取り数) / 予想される RNAPII 読み取り数 × 100%。 ヌクレオチド組成を分析するために、GLPThigh の上位 50 遺伝子と残りの遺伝子の下位 50 を 70 ～ 110 kb の長さの範囲内で選択し、TSS から TSS + 70 kb までの 35 のビンに分割しました (ビンあたり 2 kb)。 ヌクレオチド組成パーセンテージ (シチジン、チミン、アデニン、およびグアニン) は、Qualimap v.2.21 によって決定されました (参考文献 69)。 EU-seq データセットの転写エラー率は、BioConductor seqTools (R v.1.2.0. および IRanges パッケージ) を使用して計算されました 70。 合計エラー率は、アライメントステップ中の各読み取り位置で不一致塩基を含む合計読み取りのパーセンテージとして計算されました。 スプライシングドナー部位およびアクセプター部位における EU-seq リード量の分析は、カスタム作成スクリプト Splicingdonor&acceptorfinder.py を使用して実行されました。このスクリプトでは、選択されたすべての遺伝子のスプライシングドナー部位およびアクセプター部位周囲の ±49 bp の発現値がHTSeq v.0.6.0。 選択的スプライシング イベントは、デフォルト設定の Astalavista v.4.0 (ref. 71) によって検出されました。 DNA メチル化状態は、Qualimap v.2.21 および deepTools v.2.0 によって検出されました (参考文献 72)。 プロモーターでの平均 RNAPII プロファイル (TSS 周囲の ±750 bp) と、TSS および遺伝子本体での平均ヒストン修飾プロファイル (H3K27ac、H3K4me3、および DNA メチル化) を、HOMER v.4.11 ソフトウェア (annotatePeak.pl コマンド) を使用してプロットしました 73。

最初に停止した RNAPII の背後でキューイングされているものと比較して、病変上で停止している RNAPII の数を計算するために、最初に発現遺伝子データセット (全長 280,010,046 bp) 内の DNA 損傷の数を推定しました。 二倍体ゲノムの病変密度が 100,000 bp あたり 1.6 である場合、約 8,960 個の DNA 病変が予想されます。 DNA 損傷はコード鎖とテンプレート鎖の両方で同様に発生し、後者は RNAPII の停止にのみ重要であるため、選択した遺伝子セットのテンプレート鎖には 4,480 個の DNA 損傷が存在します。 すべての DNA 損傷が RNAPII 複合体を妨害しており、1 細胞あたり推定 18,000 個の停止した RNAPII 複合体があると仮定すると、DNA 損傷で停止した RNAPII ごとに 3 つの RNAPII 複合体が待機していると推定されます。 RNAPII ChIP-seq データの鎖バイアス解析は、他の場所で説明されているように行われました 38。これは、テンプレートに転写をブロックする DNA 損傷がある場合、RNAPII ChIP-seq ライブラリの PCR 増幅がコード鎖に偏るという観察に基づいています。 RNAPII が停止している鎖にいくつかの修飾が加えられています。 まず、当社の特定の ChIP-seq プロトコルが鎖バイアスを検出できるかどうかをモニタリングし、UVB 処理後に以前に公開された RNAPII ChIP-seq データを使用して分析を最適化しました 74。 つまり、RNAPII ChIP-seq からのフォワードリードとリバースリードは SAMtools v.1.9 (参考文献 75) によって分離および処理され、BEDtools v.2.27.1 (参考文献 76) によってカウントされました。 遺伝子は順鎖と逆鎖の両方に位置するため、選択した遺伝子セット内の各遺伝子について、まずテンプレート鎖 (順鎖/逆鎖) の方向を補正しました。 次に、データセット内の各遺伝子についてコード鎖への偏りの割合を計算し、その後、遺伝子セット内のすべての発現遺伝子にわたって鎖の偏りを計算しました。

インビトロ実験は、別段の指示がない限り、独立した実験の３回の反復に基づいており、プロットは平均値として示されている。 この研究で使用された統計的テストと定量化の詳細は、本文、図の凡例、または方法の対応する部分に記載されています。 データ分布は正常であると想定されていましたが、これは正式にテストされていませんでした。 すべての統計テストは、GSEA、Enrichr、および Ingenuity Pathway Analysis によるエンリッチメント分析を除き、Prism または R で実装されたパッケージまたは関数 (edgeRpackage および Fisher.test 関数) を使用して実行されました。GSEA、Enrichr、および Ingenuity Pathway Analysis は、Web アプリケーションによって実行され、その Web アプリケーションで詳細に説明されました。

EU 分子間の距離の範囲に対する EU の組み込み、および EU の組み込み距離の差の範囲に対する 1.5 倍の減少の場合の統計的および確率的な枠組みが生成されました。 少なくとも 1 つの EU が新生 RNA に組み込まれる確率は、取り込みまたはプロセシングの低下または遅延により、老齢マウスの肝臓で EU の組み込みが 1.5 倍減少する状況でモデル化されました。 仮定は次のとおりです。(1) Click-iT 反応では、初期の RNA に組み込まれた EU ごとにビオチンが少なくとも 400 倍以上余剰であるため、反応は飽和するか、同じ漸近線に従います。 (2) RNA 分子あたり 1 つの EU の組み込みだけで、その特定の分子を単離するのに十分です。 (3) EU の取り込みは、全ヌクレオチド プール内の利用可能な EU の濃度が、新生 RNA 内の EU 分子間の距離と直線的に相関する確率的プロセスです。 成体マウスと老マウスの間に EU の利用可能性に差がある場合、短い RNA 種 (≤300 ヌクレオチド) では少なくとも 1 つの EU が組み込まれる確率が大幅に低いことが予想されるため、経験的に、老化した肝臓にはこのような小さなRNA種が存在します。 EU の組み込みプロセスは、ポアソン過程によって初期の RNA 種にモデル化されました。 具体的には、初期の RNA への EU の組み込みの数は、一般に使用されるような時間ではなく、ヌクレオチドで測定される長さによるポアソン過程として考えることができます。 数学的には、X(t) がポアソン過程である場合、時間間隔 (0,t) 内にイベントが存在しない確率は exp(-λt) となります。ここで、λ はポアソン過程の強度です。 同様に、時間間隔 (0,t) 内に少なくとも 1 つのイベントが存在する確率は、1 − exp(-λt) となります。 EU-seq データセットで特定された特定の RNA 長クラスの各 RNA 種について、少なくとも 1 つの EU が組み込まれている確率が、上記の式を使用して計算されました。 明らかに、 \(1 - {\mathrm{e}}^{ - {\textstyle{1 \over x}}} > 1 - {\mathrm{e}}^{ - {\textstyle{1 \over y} なので、 }}\) すべての x < y について、より高い強度のポアソン プロセスは、より低い強度のポアソン プロセスよりも少なくとも 1 つの EU が組み込まれている確率が必然的に高くなります。 RNA 種の 3 つのグループが検査されました: (1) ≤300 ヌクレオチド (RNA 種の数 n = 7,932)。 (2) 1,000 ～ 3,000 ヌクレオチド (RNA 種の数、n = 1983)。 (3) 2,000 ～ 4,000 ヌクレオチド (種の数、n = 1,802)。 RNA 種の数は、ハツカネズミのゲノム データベース (Ensembl) に存在する総数を反映しています。 後の 2 つのクラスは依然として短い RNA 種を表しますが、利用可能な EU が 1.5 倍少ない場合には差異が予想されないポジティブコントロールとして組み込まれています。 すべての場合において、確率ベクトルはコルモゴロフ・スミルノフ検定によって計算されたガウス分布ではありませんでした。 したがって、基礎となるポアソン過程の固定強度ごとに、少なくとも 1 つの EU が組み込まれる確率の中央値と四分位範囲 (IQR) が計算されます。 1.5 倍離れた強度間の有意性は、マンホイットニー U 検定によって計算されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

EU-seq および ChIP-seq データは NCBI Sequence Read Archive Web サイトに寄託されており、一般に公開されています (アクセッション番号 PRJNA603447)。 この論文で報告されている顕微鏡画像は、合理的な要求に応じて主任担当者によって共有されます。 ヒト腱からの全 RNA 配列データ 51 (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-2449/) および Caenorhabditis elegans 52 (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA357503)、図 6a、DNA メチル化 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE95361)77 、拡張データ図のヒストン H3K27ac および H3K4me3 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA281127)。 図 5 および 6、MNase-seq (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE58005)78 および UVB 照射細胞からの RNAPII ChIP-seq データ (https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA230028) 拡張データについては図 7a。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

この研究で使用されたすべてのソフトウェアは公開されており、本文またはメソッドのいずれかで引用されています。 すべての元のコードは、https://github.com/Pothof-Lab/Transcriptional-Stress に保管されています。 公開されたソフトウェア パッケージを使用したデータ分析アプローチについては、「方法」で説明されています。

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試薬とプロトコルを提供してくださった M. Tresini、G. Garinis、P. Mastroberardino、および C. Milanese に感謝します。 マウス実験に関する全般的な支援をしていただいた Y. van Loon と W. Vermeij に感謝します。 RNA シーケンスのサポートについては P. van Arp に感謝します。 RNA シーケンシングは、AG Uitterlinden と J. van Meurs が運営する ErasmusMC HuGeF 施設と、W. van Ijcken が運営する ErasmusMC Biomics 施設で行われました。 RNAPII ChIP–seq は、「France Génomique」コンソーシアム (ANR-10-INBS-0009) のメンバーである GenomEast プラットフォームによって実行されました。 私たちは、国立衛生研究所/国立老化研究所 (P01 AG017242; DNA 修復、突然変異および細胞老化) から JHJH および JP への財政的支援、JHJH への欧州研究評議会先進助成 Dam2Age、欧州委員会 EU ITN 演説 (GA- 316390) オランダの研究機関 ZonMW Memorabel プロジェクト番号 JHJH に送信。 733050810 JP および JHJH、Deutsche Forschungsgemeinschaft (ドイツ研究財団) プロジェクト番号 733050810 JHJH への 73111208-SFB829 および JHJH への欧州希少疾患共同プログラム (EJPRD TC-NER) 資金提供者は、研究計画、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備において何の役割も果たしていませんでした。

これらの著者は同様に貢献しました: Akos Gyenis、Jiang Chang。

エラスムス大学医療センター、エラスムス MC 癌研究所、分子遺伝学部門、ロッテルダム、オランダ

Akos Gyenis、Jiang Chang、Joris JPG Demmers、Serena T. Bruens、Sander Barnhoorn、Renata MC Brandt、Marjolein P. Baar、Marko Raseta、Kasper WJ Derks、Jan HJ Hoeijmakers & Joris Pothof

ケルン大学医学部、老化研究クラスター・オブ・エクセレンス、老化と疾患におけるゲノム安定性研究所、ケルン、ドイツ

アコス・ギエニス & ヤン・HJ・ホーエイメーカーズ

分子医学センター、ユトレヒト大学医療センター、ユトレヒト、オランダ

マージョリン・P・バール

オランダ、マーストリヒトのマーストリヒト大学医療センター、臨床遺伝学科および腫瘍学および発生生物学学部

カスパー WJ ダークス

プリンセス・マキシマ小児腫瘍学センター、オンコード研究所、ユトレヒト、オランダ

ヤン・H・J・ホーエイメーカーズ

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JP がこのプロジェクトを発案し、監督しました。 JP、AG、JC が実験を計画しました。 JP、AG、JC、JHJH がデータを解釈しました。 JP、AG、JC が原稿を書き、図を作成しました。 JHJH は加齢に伴う長い遺伝子の喪失という概念を批判的に読み、導入し、原稿を編集しました。 RMCBとSBはマウス実験とEU注射を実施した。 AG は、WT マウスで EU および RNAPII 染色を実行および分析しました。 SBはXpg-/-マウスでEU染色を実施し、分析した。 AG は EU-seq を開発し、すべての配列決定サンプルを準備しました。 JC、AG、および KWJD は EU-seq 解析パイプラインを設計しました。 JC と KWJD は、EU-seq マッピングおよび正規化パイプラインを作成しました。 JC はアルゴリズムを設計し、データ分析用のスクリプトを作成しました。 JC と AG はバイオインフォマティクス分析を実行しました。 JJPGD は、in vitro 転写ストレス蓄積アッセイを実施しました。 MR は統計分析を実行しました。 STB および MPB は、UV に曝露された細胞培養物で EU 染色を実行し、細胞老化を分析しました。

ジョリス・ポトホフへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Genetics は、この研究の査読に貢献してくれた Evgeny Nudler、George Garinis、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a〜c、（a）総RNAPII、（b）RNAPII-ser5p、および（c）RNAPII-ser2pのXY散布図。 AU: 任意の単位。 青: 野生型の成体肝臓。 赤＝古い肝臓。 n = 3 匹のマウス/グループ。 カウントされた核の総数: a、成人: n = 206、老人: n = 155。b、成人、n = 748。 高齢者 n = 701.c、成人: n = 984; 古い、n = 674。

ソースデータ

a、EU 標識新生 RNA シーケンス (EU-seq) 解析のフローチャート。 b、c、EU-seq の配列リード分布、およびイントロンおよびエクソンのトータル RNA シークエンシング (b) および遺伝子上にマッピングされたもの (c)。EU-seq のイントロンリード数の増加を示し、初期の RNA 濃縮を示しています。 d、EU-seqライブラリーを生成するためのオンビーズ合成cDNAのバイオアナライザープロット。 逆転写酵素はDNAに共有結合したビオチンを介してcDNAを合成できないため、cDNAは共有結合したEU結合ビオチン間、またはEU結合ビオチンからRNA末端までのみ生成されます。 成体と古い cDNA はほぼ同一であり、同様の EU 組み込み率を示しています。 e、ポアソン過程でモデル化したEU分子間の距離範囲に対するEUの組み込みを示す表。 RNA 種の 3 つのグループを調べました: 1) ≤300 ヌクレオチド (n = 7932)、2) 1000 ～ 3000 ヌクレオチド (n = 1983)、および 3) 2000 ～ 4000 ヌクレオチド (n = 1802)。 中央値と四分位範囲 (IQR) が表示されます。 f、EU編入距離の差の範囲に対する1.5倍の縮小を示す統計的および確率的フレームワーク表。 EU の組み込みが成人と高齢者で異なる場合、ヌクレオチドが 300 以下の RNA 種では、少なくとも 1 つの EU 組み込みの確率が大幅に低いことが予想されます。 指定された 1.5 倍離れた強度のペアごとに、老化肝臓の予想倍数変化が計算され、対応する 7932 次元の確率ベクトルがマンホイットニー U 検定によって比較されました。 高齢肝臓で EU の取り込みが 1.5 分の 1 に減少する場合、成人と高齢者の間に差が観察される可能性が非常に高く、有意にあります (p < 2.2 × 10−16、列 3)。 g、RNA 種の長さカテゴリーにマッピングされた EU-seq データセット内の配列リードのパーセンテージ i) ≤300 ヌクレオチド、ii) 1000 ～ 3000 ヌクレオチド、および iii) 2000 ～ 4000 ヌクレオチド。 ヌクレオチド長が 300 以下のカテゴリーでは、老化肝臓では有意ではない (p 値 = 0.061093、両側対応のない t 検定) 1.2 倍の増加が示されており、成人肝臓と老化肝臓の間で EU の利用可能性が異なる可能性は低いことが示されています。 データは平均値 ± SEM です。 h、さまざまな RNA ポリメラーゼ (RNAPI-II-III、およびミトコンドリア RNAP (RNAP-MT)) によって合成された EU 標識された新生 RNA リードのパーセンテージ。 調整された古い値（オレンジ色）は、図1aで観察されたように、初期の転写減少の比例補償によって計算されました。 n = 3 匹のマウス/グループ。 データは平均値 ± SEM です。 i、EU-seq データにおける選択的スプライシング。 n = 3 匹のマウス/グループ。 データは平均値 ± SEM です。 ｊ、ＥＵ配列におけるスプライスドナー部位とアクセプター部位の比率。 n = 3 匹のマウス/グループ。 データは平均値 ± SEM です。

ソースデータ

a、加齢に関連した遺伝子発現変化の背後にある推定上の調節機構をk-meansクラスタリングに基づいて同定した概略図。 b、c、（b）「プロモーターで上方制御された」遺伝子（n = 778）および（c）の遺伝子本体（3ビン）全体の老化肝臓におけるEU-seqおよび総RNAPII ChIP-seqリードの平均Log2倍変化。 ) 「プロモーターが下方制御した」遺伝子 (n = 394)。 メインの図2 fから計算。 データは平均値 ± SEM です。 d、図2aに見られるように、発現したすべての遺伝子、プロモーターによって上方制御される遺伝子、プロモーターによって下方制御される遺伝子、および生産的転写の高度に段階的な損失（GLPThigh）を伴う遺伝子の平均遺伝子長（左パネル）。遺伝子長によって分類されます（右パネル）。パネル) グループ: 10 ～ 22 kb (青; n = 662); 22～32 kb (黒、n = 644)。 32 ～ 50 kb (ピンク、n = 788)、50 ～ 70 kb (黄色、n = 587)、70 ～ 110 kb (オレンジ、n = 643)、および >110 kb (赤色、n = 646)。 データは平均値 ± SEM です。 P 値 = 7.84163*10−22、対応のない両側 t 検定。 e. 成人サンプルの全初期 RNA プールに対する各遺伝子長クラスの寄与 (%)。 f、老化した肝臓における非生産的なRNAPII複合体の割合の計算。 g、老化した肝臓における失速したRNAPII複合体の数の推定。

ソースデータ

同定された機能的遺伝子クラスターの転写パラメーター（拡大図3aに記載）：a〜d、上位50のGLPThigh遺伝子70〜80 kbのTSSから最初の70 kbのテンプレート鎖の遺伝子長1 kbあたりの平均ヌクレオチド組成（黒線）、低い GLPT レベルを含む 70 ～ 80 kb の残りの 50 個の遺伝子（赤線）と比較。 データは平均値 ± SEM です。 e、4つの異なる遺伝子セットにおける野生型成人肝臓（青）および老年肝臓（赤）のEU-seqデータにおける転写エラー率：「プロモーターで上方制御された」（n = 778）、「プロモーターで下方制御された」（n = 394）、 GLPThigh (n = 914)、残り (n = 1884)。 データは平均値 ± SEM です。 f、eの各機能遺伝子クラスター内の遺伝子のスプライスドナー部位とアクセプター部位にマッピングされたEU-seqリード間の比率を示す棒図。 n = 3 / グループの平均を示します。 データは平均値±SD。

ソースデータ

機能的遺伝子クラスター: プロモーターによって上方制御される遺伝子、プロモーターによって下方制御される遺伝子、生産的転写の高度に段階的な損失 (GLPThigh) および残りを伴う遺伝子。 データは平均±標準偏差です。青線は成人肝臓を表し、赤線は古い肝臓を表します。 n = 3 / グループの平均を示します: a、総 RNAPII。 b、セリン 5 リン酸化 (ser5p) RNAPII。 c、ヒストン 3 リジン 27 アセチル化 (H3K27Ac; オープンクロマチン)。 d、ヒストン 3 リジン 4 のトリメチル化 (H3K4Me3; オープンクロマチン)。 e、MNase はヌクレオソームを含むタンパク質に結合していない DNA のみを消化するため、アクセスできないクロマチン。

ソースデータ

機能的遺伝子クラスター: プロモーターによって上方制御される遺伝子、プロモーターによって下方制御される遺伝子、生産的転写の高度に段階的な損失 (GLPThigh) および残りを伴う遺伝子。 青い線は成人肝臓を表し、赤い線は古い肝臓を表します。 n = 3 / グループの平均は、TSS + 750 bp から TTS + 4 kb までのシーケンシングリード密度を示します。 a、ヒストン 3 リジン 27 アセチル化 (H3K27Ac; オープンクロマチン)。 b、ヒストン 3 リジン 4 トリメチル化 (H3K4Me3; オープンクロマチン)。 c、MNaseはヌクレオソームを含むタンパク質に結合していないDNAのみを消化するため、アクセスできないクロマチン。 d、DNAメチル化状態。

ソースデータ

a、MCF7細胞に55 J/m2 UVBを照射した1時間後および6時間後の総RNAPII ChIP-seqデータにおけるコード鎖バイアスを表す棒図（データ76）。 すべての遺伝子 (n = 18224)、短い遺伝子 (10 ～ 22 kb) および長い遺伝子 (> 110 kb)。 データは平均値 ± SEM です。 鎖バイアスは、RNAPII がまだ DNA 損傷上で停止しており、DNA 修復が進行中の UVB 処理後 1 時間の MCF7 細胞にのみ存在することに注意してください。 6 時間後、停止した RNAPII の大部分が DNA 損傷から除去されます。 これは、i) 使用されたプロトコルはコーディング鎖に対するバイアスを検出できるため、老化サンプルの分析に使用できること、ii) コーディング鎖のバイアスは UVB 後の一時的な表現型であることを示しています。 既知の UVC 誘発 DNA 損傷密度 38 後のコーディング鎖バイアスの公表量に基づいて、野生型高齢マウスの肝臓は 0.05 ～ 0.10 の範囲のコーディング鎖バイアス率を示すと推定されます。 b〜f、平均局所DNAメチル化カバレッジ（b）および（c〜f）50遺伝子のテンプレート鎖における局所ヌクレオチド組成状態。一般に最も高いコーディング鎖バイアスを示します。 遺伝子内イントロン領域は、最も高いコーディング鎖バイアス (高鎖バイアス遺伝子座) で選択されます。 この遺伝子座遺伝子セットは、ti) 同様のサイズのランダムに選択された遺伝子内遺伝子座、つまり鋳型鎖内の 50 個のランダムなイントロン位置の 6 倍、および ii) 完全なイントロン トランスクリプトームと比較されます。 トランスクリプトームからのすべてのイントロン (高鎖バイアス位置を含む)。 n = 50 / グループの平均を示します。 データは平均値±SD。

ソースデータ

補足表 1. TShigh 遺伝子と、UV 損傷によってダウンレギュレートされた遺伝子に関する 6 つの独立したトランスクリプトミクス研究との重複。 図 5 に関連する表。補足表 2。TShigh カテゴリーで大幅に過剰に表示される細胞経路およびプロセス。 図5に関連する表。

統計ソースデータ。

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転載と許可

Gyenis, A.、Chang, J.、Demmers、JJPG et al. ゲノム全体の RNA ポリメラーゼの失速は、老化中にトランスクリプトームを形成します。 Nat Genet 55、268–279 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41588-022-01279-6

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受信日: 2021 年 12 月 17 日

受理日: 2022 年 12 月 7 日

公開日: 2023 年 1 月 19 日

発行日：2023年2月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-022-01279-6

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細胞研究 (2023)