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Oct 24, 2023

分泌物の免疫原性、C

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 296 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ウシウイルス性下痢ウイルス（BVDV）に対する現在の生ワクチン、弱毒化ワクチン、および不活化ウイルスワクチンにはいずれも限界があります。 今回我々は、(i) BHK21 細胞を用いた分泌型組換え E2 糖タンパク質の発現、および (ii) マウスにおける免疫応答の測定による BVDV サブユニット ワクチンの開発を報告します。 E2 糖タンパク質は、C 末端膜貫通アンカー ドメインの欠失と V5 エピトープ タグへの融合によって修飾されました。 これにより、抗 V5 モノクローナル抗体を使用した検出と、細胞培地から発現、分泌された E2 形態の簡単な精製が可能になりました。 さらに、我々は、テセアシグナウイルス 2A (T2A) リボソームスキッピング配列を介して E2 にリンクされた緑色蛍光タンパク質 (GFP) を遺伝的に融合させ、それによって自己プロセシングポリタンパク質 [GFP-T2A-BVDV-E2trunk-V5] を作成し、個別の [GFP- T2A] および [E2trunk-V5] 翻訳産物: GFP 蛍光が作用するため、E2 発現の代理マーカーとして BALB/c マウスに細胞培地から精製した [E2trunk-V5] を接種したところ、体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方が観察されました。 。 したがって、当社の抗原発現システムは、(i) 単純な抗原精製プロトコールと、(ii) ワクチンをさらに大規模に生産するための実行可能な戦略の両方を提供します。

ウシウイルス性下痢ウイルス（BVDV）は、ウシ、ブタ、その他の反芻動物の主要な感染因子です。 ウシウイルス性の下痢や粘膜疾患を引き起こし、軽度の疾患から急性で生命を脅かす重篤な疾患に至るまで、さまざまな臨床転帰を引き起こします1。 BVDV 感染の臨床兆候には、発熱、うつ病、食欲不振、粘膜びらん、化膿性の目や鼻汁、咳、第一胃アトニー、下痢、流産、乳量の減少などがあります2。 BVDV 感染は免疫抑制も引き起こすため、細菌性またはウイルス性肺炎への感受性が高まります 3。 BVDV 誘発免疫抑制のある動物では、他の病原体への曝露により罹患率と死亡率が大幅に増加し、それに対応して牛肉および乳製品産業に経済的悪影響が及ぶ可能性があります4,5。

BVDV ゲノムは、約 12.3 kb の一本鎖プラスセンス RNA です。 BVDV は、境界病ウイルス (羊に影響を与える) および古典的豚コレラ ウイルスとともに、フラビウイルス科のペスチウイルス属に属します6。 BVDV は 2 つの主要な遺伝子型で構成されます。BVDV-1 (ペスチウイルス A、BVDV-1a から BVDV-1v までの 22 のサブタイプに分割) と BVDV-2 (ペスチウイルス B、BVDV-2a から BVDV-2d の 4 つのサブタイプに分割) です。 HoBi 様ウイルスとして知られる別の非定型ペスチウイルスは、暫定的に BVDV-3 として同定され、これには 4 つのサブタイプがあります 7。 各 BVDV には、培養細胞上で増殖したウイルスの影響に応じて、細胞変性性と非細胞変性性の 2 つのバイオタイプがあります。 非細胞変性株は感染細胞に損傷を与えません8。 妊娠初期に牛がウイルスに曝露されると、発育中の胎児に感染する可能性があります。 さらに、BVDV は持続感染 (PI) 子牛の生産を通じて群れ内で存続します9。これは、子牛がウイルスに対して免疫寛容になり、生涯を通じて大量のウイルスを排出するためです。 したがって、PI 動物は BVDV10 を広める主要な感染源とみなされます。 BVDV 予防プログラムにおける最も効果的な対策には、バイオセキュリティ対策、PI 牛の根絶、およびワクチン接種が含まれます5,11。

BVDV に対する現在のワクチンは、多価修飾生ウイルス ワクチンと不活化ウイルス ワクチンです11、12、13、14。 市販の生ワクチン、弱毒化ワクチン、および不活化ワクチンには安全性と有効性が限られています。改変生ウイルスワクチンは病原性に戻り、子牛のPIを引き起こす可能性がありますが、不活化ウイルスワクチンは防御期間が短く、細胞性免疫応答を刺激できません15。 したがって、BVDV から牛を長期的に保護するには、安全で有効なサブユニット BVDV ワクチンが必要です。

膜貫通タンパク質 E2 は BVDV 構造タンパク質の 1 つであり、C 末端ドメインを介してウイルス膜に固定されています。 E2 は主要な免疫原性糖タンパク質として、ウイルスと宿主細胞の融合に関与しており、BVDV 感染中に中和抗体を誘発できる主要な抗原部位を含んでいます 16,17。 したがって、E2 はサブユニット ワクチン設計の主な候補です。 この研究では、膜貫通アンカードメインが欠失してクローン化された組換えE2糖タンパク質を発現する真核生物発現システムを開発しました。これにより、このE2切断型糖タンパク質が哺乳動物細胞のトランスフェクション後に組織培養培地に分泌されることが可能になります。 組換え E2 糖タンパク質は、正しい翻訳後修飾を確実にするために哺乳動物細胞で生成され、マウスでは正しいグリコシル化パターンが免疫原性であることが観察されました。 E2 の膜貫通ドメイン欠失型をコードする配列は、(i) ウェスタンブロッティングによるタンパク質検出、および (ii) 細胞培地からの発現された短縮型 E2 の精製のために、V5 エピトープ タグに遺伝子的に融合されました。 さらに、我々は、テセア アシグナ ウイルス 2A (T2A) 自己切断配列を使用して、切断された E2 遺伝子と緑色蛍光タンパク質 (GFP) を結合しました。 2A ペプチドは小さく、複数の遺伝子の同時発現のために効率的に切断を媒介できます 18,19。 GFP は E2 タンパク質発現の代理マーカーとして使用され、このマーカーはベビーハムスター腎臓 (BHK)-21 細胞のトランスフェクション後の非侵襲性生細胞蛍光顕微鏡によって容易に視覚化できます。 また、さまざまな免疫応答、つまり血清中の抗原特異的抗体の力価、リンパ球の増殖、脾細胞の亜集団、およびさまざまなサイトカインの濃度を通じて、マウスにおける分泌されたC末端切断型E2糖タンパク質の免疫原性を評価しました。

合成された BVDV E2 遺伝子の C 末端切断型 (図 1A および B) は、最初に pGEM-T Easy Vector システムにクローン化され、自動サンガー配列決定によって検証されてから、このベクターから (ApaI および PstI を使用して) 切り出され、 pJC3 発現ベクターに転写されます (図 1C)。 NetNGlyc-1.0 プログラム (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)20 を使用して、全長 BVDV E2 糖タンパク質から N-グリコシル化部位を予測しました。 このプログラムは、全長 BVDV E2 糖タンパク質には 5 つの潜在的な N-グリコシル化部位 (N115、N184、N228、N259、296) があると予測します (図 1D)。

BVDV のゲノム構造と E2 糖タンパク質をコードする領域の合成。 BVDV ゲノム構成 (縮尺は一定ではありません) とポリタンパク質プロセシング (A)。 C末端が切断された（膜貫通アンカードメインが欠失した）形態のE2糖タンパク質（四角で囲った部分）をコードする遺伝子のクローニング戦略と合成を、シグナルペプチド（水平の斜線部分）およびC末端のV5エピトープタグ（斜線）とともに示します。エリア）（B）。 E2 糖タンパク質の切断型の pJC3 発現ベクターへのクローニング。 プラスミド pJC3 は、単一のオープン リーディング フレームによってコードされる [GFP-T2A-mCherry] ポリタンパク質をコードします。 転写は、ヒトサイトメガロウイルスのエンハンサー/プロモーターと、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルによってポリアデニル化されたmRNAによって駆動されます。 E2 糖タンパク質の切断型をコードする配列を、ApaI および PstI による制限によって pGEM-T Easy Vector から切り出し、同様に制限した pJC3 に挿入して、mCherry FP を除去し、プラスミド [GFP-T2A-BVDV-E2 トランク] ( C)。 NetNGlyc-1.0 サーバー (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0) を使用して、全長 E2 糖タンパク質から N-グリコシル化部位を予測しました。 > 0.5 の N-グリコシル化ポテンシャルが配列のカットオフ値でした (D)。

BVDV E2 糖タンパク質の C 末端切断型が細胞培養培地に分泌されたかどうかを確認するために、V5 エピトープ タグに対するモノクローナル抗体または異なる位置に存在するマウス抗 BVDV 抗血清を使用して、培地上でイムノドット ブロット アッセイを使用しました。トランスフェクション後の時間。 トランスフェクトされたBHK-21細胞抽出物のウェスタンブロット分析は、48時間で短縮型E2糖タンパク質の最大発現を示した。 ～ 55 kDa で観察されるタンパク質のバンドはやや拡散しており、タンパク質のグリコシル化から生じる分子量の不均一性の程度と一致しています (図 2A)。 免疫ドットブロットは、切断型 E2 糖タンパク質が培地に分泌され、V5 エピトープタグと BVDV 抗血清によって認識されることを示しました (図 2B)。 この分泌型は実験中 (96 時間) 細胞培地中で安定であり、ウェスタンブロットデータと一致しました。

短縮型 E2 糖タンパク質発現の評価。 (A) トランスフェクトされた細胞抽出物のウェスタンブロット分析。 方法で説明されているように、細胞抽出物のサンプルを調製し、移入前に分析しました (12% SDS-PAGE)。 (B) 細胞培地の免疫ドットブロット分析。 示された時点で切断型 E2 糖タンパク質をトランスフェクトした BHK-21 細胞からの組織培養培地。 膜は、一次抗体としてマウス抗 V5 モノクローナル抗体 (1:8000) またはマウス抗 BVDV 抗血清 (1:4000) でプローブされました。 レーン M: 染色済みタンパク質マーカー、レーンモック: トランスフェクトされていない BHK-21 細胞。

異なるサブタイプ (IgG、IgG1、および IgG2a) の BVDV 特異的抗体の血清濃度は、ELISA を使用して測定されました。 最初のワクチン接種後、8週目までは、高用量グループの総IgG抗体力価は、低用量グループよりも有意に（P < 0.05）高かった（図3A）。 さらに、短縮型 E2 糖タンパク質は、IgG1 (図 3B) および IgG2a (図 3C) 抗体の同時産生を刺激しました。 対照群と比較して、IgG1 レベルは約 3.5 倍、IgG2a レベルは約 2.5 倍増加しており、T 細胞依存性免疫に関連する IgG サブタイプの上方制御が示されています。

短縮型 E2 糖タンパク質によって誘導される BVDV 特異的抗体応答の ELISA 分析: (A) 総 IgG、(B) IgG1、および (C) IgG2a。 マウスにおける抗体反応は、5 または 35 μg の切断型 E2 糖タンパク質または PBS を腹腔内に免疫してから 0、2、4、6、および 8 週間後に評価されました。 マウスには０週目と２週目に２回注射した。データは平均吸光度値±標準偏差として表す。 バー上の異なる文字 (a、b、c) は、ダンカン検定を使用した同じ時点でのグループ間の有意な (P < 0.05) 差を示します。 () グループ I: 5 μg の切断型 E2 糖タンパク質。 () グループ II: 35 μg の切断型 E2 糖タンパク質。 () グループ III: PBS。

細胞性免疫応答を評価するために、マウス脾細胞を単離し、5 μg の切断型 E2 糖タンパク質で in vitro で再刺激しました。 リンパ球の増殖は、刺激指数 (SI) を表すために評価されました。 図４が示すように、高用量群におけるＴリンパ球増殖活性は、低用量群および対照群よりも有意に（Ｐ＜０．０５）高かった。 対照群ではリンパ球の増殖に対する影響は認められず、切断型E2糖タンパク質がin vivoで細胞性免疫応答を誘導できることが示された。

短縮型 E2 糖タンパク質によるマウスのリンパ球増殖の刺激。 刺激指数 (SI) は、刺激されたウェルの平均 OD 値を対照ウェル (培地のみ) の平均 OD 値で割ることによって計算されました。 データは、3 回の個別の実験の平均 ± 標準偏差として表示されます。 バー上の異なる文字 (a、b、c) を持つ治療は、有意な (P < 0.05) 差を示します。 () グループ I: 5 μg の切断型 E2 糖タンパク質;() グループ II: 35 μg の切断型 E2 糖タンパク質;() グループ III: PBS;() ポジティブ コントロール: ConA。

脾臓リンパ球における T 細胞部分集団の表現型を決定するために、異なる部分集団を定義するための単一標識を使用してフローサイトメトリーを実施しました。 免疫化の 4 週間後、脾臓における CD4+ T リンパ球の増加の割合は、高用量グループで他のグループよりも有意に高かった (24.6% ± 1.6%、P < 0.05)。脾臓内のCD8+ Tリンパ球は、低用量群（5μg）よりも高用量群で有意に高かった（10.7％±1.0％対7.7％±1.9％、P<0.05；図5）。

脾臓における CD4+ および CD8+ T リンパ球の割合のフローサイトメトリー分析。 マウスを、0週目と2週目に2回、短縮型E2糖タンパク質で腹腔内に免疫し、対照群のマウスをPBSで免疫した。 マウス脾細胞を免疫後4週間で単離し、抗マウスCD4+およびCD8+モノクローナル抗体で染色した。 データは、同じ治療を受けたマウスの平均±標準偏差として表示されます (n = 4)。 バー上の異なる文字 (a、b、c) は、同じ時点でのグループ間の有意な (P < 0.05) 差を示します。() グループ I: 5 μg の切断型 E2 糖タンパク質;() グループ II: 35 μg の切断型 E2 糖タンパク質E2 糖タンパク質;() グループ III: PBS。

免疫応答の極性をさらに特徴付けるために、血清中の Th1 サイトカイン、IL-12 (図 6A) および IFN-γ (図 6B)、または Th2 サイトカイン、IL-4 (図 6C) の濃度を調べます。免疫マウスの測定は第 0、2、および 4 週目に行われました。対照グループの血清とは異なり、両方の研究グループのマウスの血清には IL-12、IFN-γ、および IL-4 が含まれていました。 これらの結果は、短縮型 E2 糖タンパク質が特異的な Th1 応答と Th2 応答の両方を効果的に誘発できることを示しています。

5 μg または 35 μg の切断型 E2 糖タンパク質または PBS で免疫したマウスにおけるサイトカイン (A) IL-12、(B) IFN-γ、および (C) IL-4 の濃度。 データは、市販のELISAキットを使用して測定された各サイトカインの血清濃度の平均±標準偏差として表示されます。 バー上の異なる文字 (a、b、c) は、同じ時点でのグループ間の有意な (P < 0.05) 差を示します。() グループ I: 5 μg の切断型 E2 糖タンパク質;() グループ II: 35 μg の切断型 E2 糖タンパク質E2 糖タンパク質;() グループ III: PBS。

牛における BVDV 感染の制御は、バイオセキュリティ対策、PI 牛の特定と除去、およびワクチン接種に依存しています。 PI の子牛はウイルスに対して免疫寛容になり、生涯を通じて大量のウイルスを排出するため、BVDV の主な伝達者です。 したがって、ワクチン接種は現在、免疫集団を提供するのに役立ちます。 免疫は、群れの中で繁殖する雌にとって特に重要です1。 近年、より効果的な BVDV ワクチンの開発を目的とした多くの研究が試みられています。 弱毒化生ワクチンは、BVDV に対して広く使用されており、強力な胎児保護機能を備えた強力な体液性免疫応答と細胞性免疫応答を誘導します 21,22。 非細胞変性株に基づく弱毒化生ワクチンは、この株が胎盤を通過して胎児に感染する可能性があるため、妊娠している動物のワクチン接種には一般に推奨されません。 研究では、Npro 遺伝子を欠失させ、構造糖タンパク質 Erns のエンドリボヌクレアーゼ活性を不活性化することで、変異ウイルスの開発に伴う安全性の問題を克服しようと試みられてきました 22,23 が、ワクチンウイルスは依然として胎盤を通過する可能性があります 24。 不活化ワクチンは妊娠中も安全です 25,26,27 が、細胞性免疫反応を誘導しないため、その有効性は限られています 28,29。 さまざまなウイルス株に対する有意な交差防御は報告されていません 30,31。 したがって、サブユニットワクチンの開発は有効なアプローチです。 さらに、さまざまなウイルス株で発現される抗原がワクチン候補となる可能性があります。 これらのワクチンは、さまざまな BVDV 株に対する交差防御を引き起こす可能性があります。 本研究では、切断型 E2 糖タンパク質をクローニングして発現させました。 E2 糖タンパク質は、BVDV 1 型および 2 型と HoBi 様ペスチウイルスの間で最も多様な抗原であり、中和抗体を誘発することができます 16,17。

本研究の主な目的は、(i) 分泌切断型 BVDV E2 糖タンパク質をクローン化すること、(ii) 抗原発現プラットフォームとして哺乳類細胞培養を使用すること、および (iii) マウスにおけるワクチンの免疫効果を評価することでした。 。 この研究で適用した構築戦略は、C 末端切断型 (膜貫通アンカー欠失) E2 糖タンパク質と、T2A リボソームスキッピング配列を介して結合した GFP との遺伝子融合を生成し、自己プロセシング ポリタンパク質 (GFP-T2A-BVDV-E2) を作成することでした。トランク）。 この戦略は、T2A18、19、32 の下流の各タンパク質の機能には影響を与えません。 さらに、この戦略の利点は、(i) アッセイを使用した GFP 蛍光生細胞シグナル強度の同定と定量の容易さ、および (ii) その後の安定にトランスフェクトされた細胞の蛍光活性化セルソーティングであることです。 サブユニット ワクチンは、ワクチン接種された宿主内で効果的な免疫応答を生成するために単一のタンパク質に依存することがよくあります。 したがって、組換えタンパク質の量と抗原の信頼性の両方が重要です33。 したがって、当社の短縮型 E2 糖タンパク質は哺乳動物細胞株で発現され、よりウイルス型の本物のタンパク質のフォールディングと複雑なグリコシル化を生成し、フォールディング、安定性、活性、本物の抗原性、輸送、免疫応答などのさまざまなタンパク質の機能に影響を与えます。 我々のデータは、短縮型 E2 糖タンパク質が組織培養培地に正常に分泌され (図 2B)、細胞内で進行中の発現が検出される (図 2A) ことを示しており、これは我々が以前に報告した所見と一致しています 32。 短縮型 E2 糖タンパク質のトランスフェクション後の細胞抽出物のウェスタンブロット分析により、グリコシル化の特徴である予測分子量 (55 kDa) の個別のバンドではなく拡散したバンドが明らかになりました (図 2A)。 さらに、マウス抗BVDV抗血清を用いた免疫ブロッティングで実証されたように、切断型E2糖タンパク質は抗原性を示しました（図2）。

免疫応答の質はワクチンの有効性にとって重要であるため、短縮型 E2 糖タンパク質ワクチンによる免疫後の免疫応答を調査しました。 全ウイルスBVDVをELISAコーティング抗原として使用した場合、免疫後の総IgGの力価は、ワクチン接種グループ（切断型E2糖タンパク質）の方が対照グループと比較して有意に高かった（図3A）。 さらに、切断型 E2 糖タンパク質は、BVDV 特異的 IgG1 (Th2) (図 3B) および IgG2a (Th1) (図 3C) の両方の抗体応答を媒介しました。 さらに、ワクチンで免疫化したマウスは、Th2 シフト応答に関連する IgG1 優位性を示しました。 同時に、ワクチン接種グループのIL-4レベルは対照グループよりも有意に高かった(図6C)。 IL-4 は、B 細胞の増殖、分化、成熟に関連し、抗体産生を制御する Th2 タイプの代表的なサイトカインです 34。 総合すると、これらの結果は、短縮型 E2 糖タンパク質が特異的な体液性免疫応答の誘導に効果的であることを明らかにしています。

Th1 細胞は細胞性免疫に関与し、エフェクター Th1 型サイトカインを分泌します。 したがって、Th1 サイトカイン レベルと T リンパ球の増殖活性は、細胞性免疫の基本的な状態を反映している可能性があります 35。 我々のデータは、免疫後のワクチン接種グループのTh1型サイトカインレベル（IL-12およびIFN-γ）が対照グループよりも有意に高いことを示しました（図6AおよびB）。 しかし、低用量群と高用量群の間には有意差は観察されなかった。 注目すべきことに、切断型E2糖タンパク質で免疫したマウスの再刺激された脾臓Tリンパ球において、顕著に増強されたSIが観察された(図4)。 さらに、免疫マウスの脾臓における CD4+ および CD8+ T 細胞の割合は両方とも大幅に増加しましたが、CD4+ は CD8+ よりわずかに高く (図 5)、T 細胞の強力な活性化を示しています。 CD4+ T 細胞はさまざまなサイトカインを分泌し、体液性免疫と細胞性免疫の両方の活性化に重要ですが、CD8+ T 細胞は細胞内病原体を除去するための T リンパ球のサイトカイン活性と関連しています 36。これらの所見は、短縮型 E2 糖タンパク質が細胞性免疫の活性化を誘導できることを示唆しています。マウスにおける細胞性免疫応答。

この研究では、我々の抗原発現戦略により分泌型ウイルス型の本物の組換えタンパク質が得られ、ワクチンの大規模生産に実現可能な戦略が提供されました。 V5 エピトープタグを使用すると、さらに簡単な精製が可能になります。 さらに、短縮型 E2 糖タンパク質は、体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を誘導することが判明しました。 特に、ワ​​クチン製剤に追加のアジュバントを適用しなかったことは、短縮型 E2 糖タンパク質の好ましい免疫原性を強調しています。 私たちの構築戦略により、高品質の抗原発現を得ることができ、評価によりワクチンの有効性が確認されました。 これらの有望な結果は、さらなる研究の基礎として役立つ可能性があります。 今後、牛を用いた圃場試験を実施し、有効性をより詳細に調査し、BVDVに対するこのサブユニットワクチンの可能性を総合的に評価していきます。

BVDV E2 糖タンパク質の膜貫通ドメインは、TMHMM-2.0 プログラム (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?DeepTMHMM) を使用して予測されました。 私たちの知る限り、台湾の牛群では BVDV 2 型株のみが報告されています。 したがって、BVDV E2 遺伝子の C 末端切断型 (位置 2462 ～ 3481 の核酸) は、中国の牛から単離された配列 (XJ-04 株、GenBank ヌクレオチド配列アクセッション番号 FJ527854) を使用して合成されました。 ) (ii) 短いリンカー配列 (-GSDQTENSG-) と (iii) V5 エピトープ タグ (-GKPIPNPLLGLDST-COOH) の両方を除去するために使用できるタバコ エッチ ウイルス プロテアーゼ切断部位 (-ENLYFQG-) (図 1A)およびB）。 合成された BVDV E2 遺伝子 (Eurofins Genomics、Ebersberg、ドイツ) を、メーカーの指示に従って、pGEM-T Easy Vector (Promega、米国ウィスコンシン州マディソン) にクローン化しました。 すべてのクローンは自動サンガー配列決定 (GATC Biotech、ケンブリッジ、英国) によって検証されました。

BVDV E2遺伝子のコード配列をApaIおよびPstI（New England Biolabs、ヒッチン、英国）で消化し、同様に制限してpJC3発現ベクターにクローニングした（図1C）。 pJC3 発現ベクターは pcDNA3.1 ベースで、T2A 連結 GFP および単量体チェリー蛍光タンパク質 (mCherry FP) 遺伝子を備えていました 37,38。 これにより、E2 糖タンパク質の切断型 (GFP-T2A-BVDV-E2 トランク) をコードするクローンが得られました。

BHK-21 細胞 (BCRC no. 60041) および Madin-Darby ウシ腎臓 (MDBK) 細胞 (BCRC no. 60126) は、台湾の Bioresource Collection and Research Center から入手し、Eagle の最小必須培地 (Invitrogen、NY、米国）、37℃、5% CO2中で熱不活化10%ウシ胎児血清（FBS; Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）を補充しました。

この研究では、台湾の国立屏東科学技術大学（NPUST）大型動物病院から入手した BVDV タイプ 2 株 BVDV/TW 2014 を使用しました39。 ウイルスはMDBK細胞で培養されました。 BVDV 力価は、Reed and Muench40 法を使用して決定され、蛍光抗体感染量 FAID50/mL として表されました39,41。 簡単に説明すると、ウイルスサンプル (100 μL) と MDBK 細胞 (1 × 105 細胞/mL の 100 μL) を 96 ウェルプレートで 6 日間、37 °C、5% CO2 雰囲気で共培養しました。 緩衝ホルムアルデヒドフレッシュ溶液 (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して細胞を固定し、抗 BVDV 蛍光結合ポリクローナル抗血清 (VMRD、プルマン、ワシントン州、米国) の 1:5 希釈液を使用しました。ウイルスの検出。 蛍光ウェルは、蛍光顕微鏡（Olympus CKX41、オリンパス株式会社、東京、日本）を使用して観察されました。

分泌タンパク質を検出するために、PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent (SignaGen Laboratories、Ijamsville、MD、米国）メーカーの指示に従ってください。 培地および細胞抽出物を、BHK-21 細胞へのトランスフェクション後 24、48、72、および 96 時間で収集しました。 細胞培養培地を収集し、遠心分離（2000×g、4℃で15分間）によって清澄化し、上清を新しいチューブにデカントしてから-20℃で保存しました。 上清を氷上で解凍した後、ニトロセルロース膜 (0.2 μm; Bio-Rad、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国) にスポットし、V5 エピトープタグに対するモノクローナル抗体 (1:8000; MBL) を用いたドットブロットアッセイを使用して分析しました。 International、名古屋、日本）またはマウス抗 BVDV 抗血清（1:4000）39 を一次抗体として使用し、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）標識ヤギ抗マウス IgG を二次抗体として使用します（1:8000; KPL、ゲイサーズバーグ、メリーランド州、アメリカ合衆国）。 シグナルは、Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad) を使用して生成されました。

トランスフェクションの 24、48、72、および 96 時間後に、BHK-21 細胞を洗浄し、EDTA フリーのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む RIPA 溶解および抽出バッファー (Thermo Fisher Scientific、米国イリノイ州ロックフォード) を使用して細胞を溶解しました。 (cOmplete; Roche Diagnostics、英国バージェスヒル)、製造元の指示に従ってください。 次に、細胞溶解物を SDS-PAGE を使用して分析し、ポリ二フッ化ビニリデン転写膜 (Immobilen-P; Merck Millipore、アイルランド、タラグリーン) 上にエレクトロブロットしました。 5% Difco Skim Milk (w/v, BD, Le Pont de Claix, France) でブロッキングした後、V5 エピトープタグを認識する一次抗体 (1:8000; MBL International) を使用して膜を 4 °C で一晩プローブしました。またはマウス抗BVDV抗血清（1:4000）39。 Tween 20 を含む Tris 緩衝生理食塩水で 3 回洗浄した後、メンブレンを二次抗体としてヤギ抗マウス IgG-HRP (1:8000; KPL) とともに室温で 1 時間インキュベートし、G:BOX イメージング システムを使用してイメージングしました。および分析ソフトウェア（Syngene、米国メリーランド州フレデリック）。

短縮型 E2 糖タンパク質を定量するために、BHK-21 細胞のトランスフェクションの 48 時間後に培地を収集しました。 清澄化した上清を、製造業者のプロトコールに従って、Ｖ５タグ付きタンパク質精製キットバージョン２（ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に適用した。 切断型 E2 糖タンパク質を含む溶出タンパク質画分をプールし、孔径 30 kDa の Amicon 超遠心フィルター (Merck Millipore、米国マサチューセッツ州バーリントン) を使用して濃縮しました。 タンパク質の推定は、Pierce BCA タンパク質アッセイ キット (Thermo Fisher Scientific、ロックフォード、イリノイ州、米国) を使用して実行されました。

この研究で使用されたワクチンは、用量あたり低濃度 (5 μg) と高濃度 (35 μg) に分割された精製切断型 E2 糖タンパク質を含む非アジュバント ワクチンでした。 ワクチン抗原濃度は、以前の用量依存実験に基づいています 32。 無菌試験の結果によると、ワクチンには生存可能な微生物は含まれていなかった。

マウス実験は、NPUST の動物管理使用委員会によって承認され、大学の倫理規則および法律 (IACUC 承認番号 110-046) に従って実施されました。 この研究で使用されたマウスは、日和見感染から保護するために無菌環境で飼育および飼育されました。 マウスは、12:12 時間の明暗サイクル、一定温度 (22 ± 1 °C)、相対湿度 50% ± 10% で維持されました。 すべての動物には食物と水を自由に摂取させた。 動物の苦痛を最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われ、研究期間の終わりには動物は人道的に安楽死させられました。 研究はARRIVEガイドラインに従って実施されました。

27 匹の 4 週齢 BALB/c マウス (LASCO、台湾、台北) を次の 3 つのグループに分けました。グループ I (ワクチン接種、n = 9) には 5 μg の切断型 E2 糖タンパク質を投与しました。 グループ II (ワクチン接種、n = 9)、35 μg の切断型 E2 糖タンパク質を投与。 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を投与されたグループ III (コントロール、n = 9)。 5 μg および 35 μg の切断型 E2 糖タンパク質で免疫したマウスは、それぞれ低用量および高用量グループとして機能しました。 マウスに、第０週と第２週に２回、２００μＬのワクチンを腹腔内注射した。 さらなる測定のために、0、2、4、6、および8週目に各マウスから血清を取得しました。

BVDV に対する抗体の特異的な血清力価は、間接 ELISA によって検出されました。 ポリスチレン平底マイクロタイタープレート (ExtraGENE、台中、台湾) を、コーティングバッファー (15 mM Na2CO3、35 mM NaHCO3、および 3 mM NaN3; pH 9.6) 中の 1.25 μg/mL 全ウイルス抗原 (BVDV/TW 2014) でコーティングしました。 4℃で一晩放置しました。 最適なコーティング濃度と血清希釈はチェッカーボード滴定によって決定されました。 プレートをTween 20を含むPBS (PBST)で3回洗浄し、PBST中の1% BSA (KPL)で37℃で1時間ブロックし、PBSTで3回洗浄した。 続いて、適切に希釈したマウス抗血清 50 μL を一次抗体としてウェルに添加し、プレートを 37 °C で 1.5 時間インキュベートしました。 その後、プレートを PBST で 4 回洗浄し、適切に希釈した HRP 標識ヤギ抗マウス IgG (KPL)、抗マウス IgG1 (ポリクローン、Betic Laboratories、米国テキサス州モンゴメリー)、または抗マウス 100 μL で洗浄しました。 ＩｇＧ２ａ（ポリクローン、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を二次抗体として添加した。 次にプレートを 37 °C で 1 時間インキュベートし、PBST で 4 回洗浄しました。 その後、100μLのTMB 2コンポーネントマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（KPL）を添加し、TMB停止溶液（KPL）を添加して反応を停止する前に、呈色反応を10分間実施した。 マイクロプレートリーダー（Anthos 2020; Anthos、ケンブリッジ、英国）を使用して、450 nmで吸光度を測定しました。

免疫化の 4 週間後、Cell Titer 96 AQueous One Solution 細胞増殖アッセイ (MTS; Promega) を使用してリンパ球増殖アッセイを実施しました。 グループあたりランダムに選択した 4 匹のマウスからの脾細胞を 96 ウェル平底プレート (ウェルあたり 1 × 106 細胞) に播種し、10% FBS を添加した RPMI-1640 中で切断型 E2 糖タンパク質 (5 μg/mL) と共培養しました。 、加湿した 5% CO2 雰囲気中で 37 °C で 72 時間維持しました。 さらに、完全なRPMI-1640を含む無細胞培地を試験と並行して実行しました。 細胞のみをネガティブコントロールとして使用し、強力なマイトジェンであるコンカナバリン A (ConA; Sigma-Aldrich, MO, USA) を最終濃度 2 μg/mL のポジティブコントロールとして使用しました。 各脾細胞サンプルを 3 回繰り返して評価しました。 MTS (3-(4,5-ジメチルチアゾール-2イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム)を各ウェルに加え、37℃で4時間インキュベートしました。 CO2 5%以下。 490nmにおける吸光度を測定した。 刺激指数は次のように決定されました: (治療の光回折 [OD] - バックグラウンドの OD)/(ネガティブ コントロールの OD - バックグラウンドの OD)。

4匹のマウスを使用して、免疫付与後4週間の各試験グループのCD4+およびCD8+ T細胞の頻度を決定した。 簡単に言うと、RPMI-1640 (Gibco、米国ニューヨーク州グランドアイランド) 内の 3 mL シリンジバレルを使用して脾臓を破壊することにより、各グループのマウスから脾細胞を単離しました。 脾臓ホモジネートを 100 μm セルストレーナーに通し、ACK 溶解バッファー (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) で処理して赤血球を溶解した後、細胞を 2 回洗浄し、ウシ血清由来の 1% アルブミンを含む PBS に再懸濁しました。 (1 × 107 細胞/mL)。 単離した脾細胞 (106 細胞) を、FITC 結合ラット抗マウス CD4+ および PE 結合ラット抗マウス CD8+ (BD Pharmingen、カリフォルニア州サンノゼ) と 4 °C で 30 分間、暗所でインキュベートしました。 続いて、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の割合に従って５０，０００個の細胞を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するフローサイトメトリーによって特徴付けた。

それぞれ 0、2、4 週目に免疫マウスから採取した血清中のサイトカイン レベルを、市販のインターロイキン (IL)-12 p70 (ab119531)、インターフェロン ガンマ (IFN-γ; ab100689)、および IL-4 を使用して検出しました ( ab100710) ELISA キット (Abcam、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国)、製造元のプロトコルに従って。 プロットされた標準曲線を使用して、各サイトカインの濃度を計算しました。

すべてのデータは、SAS 統計ソフトウェア (v. 9.0、Cary、NC、USA) を使用して分析されました。 マウス実験では、分散分析とダンカンの多重比較を使用して、各時点での治療間の差異を分析しました。 バー上の異なる文字 (a、b、c) は、同じ時点でのグループ間の有意な差 (P < 0.05) を示します。

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、Uniprot リポジトリ (アクセッション番号 C4NF75) で入手できます。

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著者らは、資金を獲得し科学的アドバイスを提供したChunyen Chu教授（NPUST、台湾）と、抗V5抗体に関してRE Randall教授（セントアンドリュース大学、英国）に感謝したい。

この研究は、台湾科学技術省 [MOST-106-2911-I-020-501; MOST-107-2313-B-020-011-MY3] および英国バイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会 [BB/P025080/1]。

動物ワクチン技術国際学位プログラム、国立屏東科学技術大学国際大学、No. 1, Shuefu Rd.、Neipu、Pingtung、91201、台湾

イー・ティン・ロー、ワン・チェン・チャン、シン・チー・ウー

英国、スコットランド、セント アンドリュース、セント アンドリュース大学生物学部生物医科学研究複合体

マーティン・D・ライアン＆ギャリー・A・ルーク

国立屏東科学技術大学獣医学部動物ワクチン技術大学院大学、台湾屏東市内浦

呉興傑

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YTL は実験作業を実施し、原稿を作成しました。 MDR は資金を獲得し、切り詰められたフォームをデザインしました。 GAL はコンストラクトのクローニングを実行しました。 WCC はイミュニティ試験に関する技術支援を提供しました。 HCW は構築物のクローニング、データ分析を実施し、原稿を作成しました。 著者全員が原稿をレビューし、編集しました。

呉興傑氏への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

ロー、YT、ライアン、医学博士、ルーク、ジョージア 他サブユニットワクチン開発における潜在的候補としての、分泌型の C 末端切断型ウシウイルス下痢ウイルス E2 糖タンパク質の免疫原性。 Sci Rep 13、296 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-26766-y

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受信日: 2022 年 8 月 9 日

受理日: 2022 年 12 月 20 日

公開日: 2023 年 1 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26766-y

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