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Aug 19, 2023

のための分子検査装置

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 4245 (2023) この記事を引用

1293 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

大腸菌（E. coli）細胞は糞便中に存在し、水中の病原体の主な供給源となる可能性があります。 そのため、水質指標として大腸菌が推奨されています。 当社は、紙ベースのサンプル調製と核酸等温増幅を統合することにより、現場で水質をモニタリングするための大腸菌を検出する革新的なプラットフォームを開発しました。 このプラットフォームは、液体制御用のボールベースのバルブを介して紙パッド上で細菌の溶解と DNA 濃縮を実行します。実験室の機器は必要ありません。その後、電池駆動のコーヒーマグでループ媒介等温増幅 (LAMP) が行われ、比色検出が行われます。 。 このプラットフォームを使用して、環境水サンプル中の大腸菌を約 1 時間で検出しました。定量限界は 0.2 CFU/mL、反応あたり 3 コピーです。 このプラットフォームは、複数の大腸菌株と、異なる塩濃度の水サンプルを検出できることが確認されました。 私たちは、大西洋近くで採取された、さまざまな濃度の塩分と細菌を含むレクリエーション水のサンプルを分析することで、プラットフォームの機能を検証しました。

世界中の水資源は、生物学的または非生物学的を問わず、さまざまな汚染物質にさらされており、それらの汚染物質が一定のレベルを超えると、人間に有害となる可能性があります1。 公衆衛生を良好にするには、人々が病気にかかるのを防ぐために水質を定期的に監視する必要があります。 世界中で毎年約 160 万人が生物学的汚染物質によって引き起こされる水系感染症により死亡しており 1、あらゆる経済レベルの国に影響を及ぼしています 2。 病原体は水中の主要な生物学的汚染物質であるため、レクリエーション水源や飲料水源におけるこれらの存在を監視することが重要です。 これらの病原体の一部には、サルモネラ菌、ブドウ球菌、コレラビブリオ、レジオネラ菌、赤癬菌、大腸菌（大腸菌）、およびその他の大腸菌群が含まれます3。 これらの病原体は水源に侵入し、飲料水によって直接、または入浴やその他のレクリエーション水遊び中に間接的に人体に侵入する可能性があります。 このため、これらの病原体の一部については、世界保健機関 (WHO)、米国環境保護庁 (EPA)、欧州連合などのさまざまな組織によって、許容限度が法律で定義されています4。

糞便汚染は、人間や温血動物の排泄物に含まれる細菌など、水中の病原体の主な発生源です1,4。 大腸菌は温血動物の腸内に通常生息する細菌の一種ですが、一部の有毒株（大腸菌 O157:H7 など）は腹痛、嘔吐、下痢を引き起こす可能性があります。 これらの有毒菌株が含まれる汚染水は少量でも病気を引き起こす可能性があります5。 人間と温血動物の腸内には大腸菌が存在し、これらの細菌は糞便を通じて放出されるため、大腸菌は淡水の糞便汚染の指標として機能する可能性があります4,6。

EPA は 2012 年に、レクリエーション用水の淡水および海水の水質に関する推奨事項を含む最新の基準を報告しました7。 彼らは2つの基準を報告した。1つは推定疾病率（NGI、またはNEEAR-GI疾患、NEEARは国家疫学環境評価の略で、GIは胃腸の略）で、主要接触者1000人あたり36人、もう1つは1000人当たり32人である。 1000人の一次接触再現者。 淡水中の大腸菌について、30 日間隔で一次接触者 1,000 人あたり 32 の NGI を示す推奨基準は、100 mL あたり 100 コロニー形成単位 (CFU) の幾何平均と統計的閾値 (STV) です。 100 mL あたり 320 CFU7. 結果として、水質モニタリング用に開発されたメソッドの定量限界 (LoQ) は 100 CFU/100 mL または 1 CFU/mL 未満である必要があります。

水中の病原体を検出する従来の方法は、ほとんどが培養ベースのアプローチと実験室での分離/濾過技術です8。 これらの従来の実験室アッセイは、精度と感度の点で標準的な方法ですが、大型で高価な機器、熟練した人材、および長い納期が必要です。 広く使用されている検査システムは IDEXX Colilert で、1 回の検査で大腸菌群と大腸菌の総数を定量化できます。 IDEXX Colilert システムは人気があり、比較的使いやすいですが、培養器などの大型で高価な機器が必要であり、細菌培養のため結果が得られるまでに長い時間 (24 時間) かかります9。 したがって、より迅速な結果1を得るために、現場での方法に適した、小型で使いやすく、コスト効率の高いデバイスを開発する傾向が高まっています1。これにより、即時の行動が可能になり、潜在的に人々の病気の感染を防ぐことができます。 低コストのオンサイト手法の開発は、研究室の環境が利用できない、または簡単にアクセスできない、資源が限られた国や地域にも利益をもたらします。

オンサイトのポータブルプラットフォームには、酵素アッセイ 10、11、12、マイクロ流体工学 13、14、15、ラテラルフローストリップ 16、17、紙ベースの分析装置 11、18 に基づくアプローチと、蛍光 19、比色分析 20、または電気化学 21 検出を組み合わせた、迅速かつ簡単な解釈が含まれます。結果の。 これらのアプローチの限界としてよく挙げられるのは、処理サンプル量が少ないこと（マイクロ流体デバイスなど）、増幅がないため感度が比較的低いこと（ラテラルフローストリップや核酸ハイブリダイゼーション技術など）、インキュベーション時間が長いこと（酵素アッセイなど）などです。 。 一方、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) などの核酸増幅検査 (NAAT) は、培養法よりも感度が高く、結果が得られるまでの時間が短いため、多くの場合好まれます 22、23、24。 それにもかかわらず、PCR アプローチにはサンプル前処理、高度な機器、訓練を受けた人員が必要ですが、ループ媒介等温増幅 (LAMP) などの等温増幅技術は、温度サイクル要件がないため実装が容易です 25、26、27。 たとえば、リーら。 DNA を抽出するためにシリンジ フィルターと磁気ビーズを使用し、その後ポータブル機器で LAMP を使用しました 27。

この研究では、水中の大腸菌検出のためのオンサイト試験プラットフォームの開発について報告します。 このプラットフォームは、(1) バルブ対応の紙ベースのサンプル前処理方法を使用して大量のサンプル (1 ～ 10 mL) を処理し、(2) LAMP を使用して DNA を増幅し、(3) 色の変化に基づいてアンプリコンを検出できます。 細胞溶解、DNA濃縮、精製に必要な試薬を連続的に供給するために3Dプリントデバイスとボールベースのバルブを使用し、得られたDNAをクロマトグラフィーペーパー上に濃縮しました。 その後、LAMP は、一定の温度を提供するウォーターバスとして機能するバッテリー駆動のスマート コーヒー マグによって実現されました。 SYBR Green 色素を比色検出に使用しました。 当社は、この試験プラットフォームを使用して、環境水サンプル中の大腸菌の検出を約 1 時間 (約 30 分のサンプル調製と約 45 分の LAMP) で実証しました。

図1に示すように、装置はバッファーユニット、混合ユニット、検出ユニット、廃棄物容器から構成されます。 検出ユニットは、ポリカーボネートのウェル層、両面粘着テープ、2層の熱可塑性フィルム、およびクロマトグラフィーペーパーで構成されました。 容器は、CNC フライス盤 (Sherline Products、Vista、California) を使用して、厚さ 3 mm のポリカーボネート シート (McMaster-Carr、イリノイ州エルムハースト) から 2 cm × 2 cm の正方形に成形されました。中心に直径 mm (または 6 mm) が作成されました。 Whatman™ 1 クロマトグラフィー紙 (Fisher Scientific) 1 枚と厚さ 75 μm のポリエステル熱接着ラミネートフィルム 2 枚 (Lamination Plus、米国ユタ州ケイズビル) を、カッターを使用して直径 3.5 mm または (5.5 mm) の円に切断しました。 Graphtec Craft Robo-S カッティングプロッター (グラフテック株式会社、横浜、日本)。 次に、紙を 2 枚の熱可塑性フィルムの間に挟み、回転速度「1」、温度 220°F に設定したラミネーター GBC® Catena 65 Roll Laminator (GBC、Lake Zurich、IL、USA) に通しました。前述したとおりです28、29。 次に、この積層紙パッドを両面接着テープ（３Ｍ ９０８７白色接着テープ、Ｒ．Ｓ．ヒューズ、サニーベール、カリフォルニア州）を使用してポリカーボネートウェル層に取り付けて、検出ユニットを形成した。

デバイスコンポーネントの分解図。 上部のバッファー ユニットには 4 つのリザーバーと開口部が含まれています。 これら 4 つのリザーバーは、溶解バッファー、結合バッファー、および 2 つの洗浄バッファー用です。 各ウェルの底の開口部はステンレス鋼のボールで塞がれており、試薬が必要になるまで流れ落ちるのを防ぎます。 中央の混合部は漏斗状になっており、混合を促進し、混合部下部の突起（→）によって検出部の紙の中を試薬や検体が通過します。 混合ユニットにはボールを押し上げるピンがあり、バッファユニットを回転させてピンをボールに合わせるとバルブが開き、試薬が下降します。 最後に、底部の廃棄物コンテナには 2 つの目的があります。(1) 廃棄物を収集すること、および (2) 必要に応じて真空または吸引機構を接続して濾過プロセスを加速することです。

市販の 3D プリンター、Ultimaker 3 (Ultimaker、オランダ、ゲルダーマルゼン) を使用して、バッファー ユニット、混合ユニット、および廃棄物コンテナーを製造しました。 デバイスは、アクリロニトリル ブタジエン スチレン (ABS) を使用して印刷され、印刷層の高さは 0.1 mm、充填密度は 100% に設定されました。 各ウェルのバルブ調整に使用したボールは、直径 4.0 mm の耐​​食性 316 ステンレス鋼ボール (McMaster-Carr、エルムハースト、イリノイ州) でした。 バルブの概念を図 2 に示します。このバルブ機構はボールペンに似ており、筆記中にペンの先端にある金属ボールを押すとインクが紙に塗布されます。

ボールベースのバルブ機構。 (左) ボールが試薬の流下を妨げると、バルブが閉じます。 (右) バッファーユニットが回転し、ピンがボールと位置合わせされた後、バルブが開き、ボールが持ち上げられ、試薬が混合ユニットに流れ込みます。

バッファユニットは、直径 7.1 cm、高さ 1 cm の円筒形で、上部直径 2 cm のリザーバーが 3 つ、上部直径が 2.4 cm のリザーバーが 1 つあり、すべて深さ 1 cm、底部直径 0.38 です。 cm。 最大のウェル (図 1) は、より大量のサンプルと試薬を収容するためのものです。 これらのリザーバーは、それぞれ最大 1.28 mL および 1.78 mL の容量を保持できます。 上部の開口部は 2 つの目的のために設計されています: (1) 試薬が紙を完全に通過して次のステップに進むことを視覚化する、(2) 必要に応じて 1 mL を超える (最大 10 mL まで) サンプルを追加できるようにする）。 混合ユニットは、高さ４．５ｃｍ、上部外径６．５ｃｍ、上部内径５．５ｃｍ、底部外径８ｃｍ、内径６ｃｍを有する。 上部の壁の厚さは 1 cm、下部では 2 cm で、3D プリントされた材料の壁に空気が漏れることなくデバイス上で真空を実現するのに役立ちます。 混合ユニットの底部にある突起 (図 1 の部品 #8) により、混合ユニットが検出ユニットのウェルにぴったりとフィットします。 混合ユニットから検出ユニットへの液体通路は、直径 6 mm の検出ユニットと統合するために直径 5 mm で、混合ウェルの上部から 3 cm の位置にあります。 廃棄物容器の外径は 10 cm、高さは 3 cm ですが、真空を使用しない場合、または別の製造技術を使用してデバイスを製造した場合、これらの寸法および混合ユニットの寸法は小さくなる可能性があります。 デバイスを組み立てたときの全体の高さは 7.5 cm です。

この装置のサンプル前処理プロセスは、ボールベースのバルブの作動により、DNA 溶解、結合、洗浄用の緩衝液を緩衝液ユニットから混合ユニットに順次放出することで構成されます。 次に、これらの溶液は、DNA 濃縮および精製のために検出ユニットを通過してクロマトグラフィー紙上に送られます。 まず、200 μL の AL 溶解バッファー (QIAGEN)、200 μL のエタノール、500 μL の AW1 (QIAGEN)、および 500 μL の AW2 (QIAGEN) を含むすべてのバッファー溶液をバッファーユニットのそれぞれのリザーバーにロードします。 次に、溶解溶液を含む最初のリザーバーに 1 mL の水サンプルを加えてサンプルを 10 分間溶解します。その後、バッファー ユニットを回転させてバルブを作動させ、混合物を混合ユニットに排出します。 この後、すぐにバッファーユニットを再度回転させてリザーバー#2から結合バッファーを排出し、サンプル/溶解混合物と混合しました。 これらの溶液が混合ユニットを完全に通過し、検出ユニットのペーパーパッドに入った後、バッファユニットが再び回転して洗浄バッファ、リザーバー #3 からの AW1、およびリザーバー #4 からの AW2 を一度に 1 つずつ排出します。採取したDNAを紙上で精製します。

DNA 精製後、検出ユニットは混合ユニットから取り外され、次のステップである DNA 増幅の準備が整います。 取り外し後、検出ユニットの底面を PCR テープでシールし、使い捨てピペットを使用して 50 µL の LAMP ミックスを添加します。 別の PCR テープを検出ユニットの上部に貼り付けて検出ユニットを密閉し、蒸発や漏れの可能性を防ぎます。 次に、検出ユニットを 62.5 °C のコーヒーマグに入った水に 45 分間浸します。 増幅後、検出ユニットをマグカップから取り出し、上部のテープ片を取り除き、比色検出のために 1 μL の SYBR Green を加えます。 全体的なプロセスとプラットフォームのステップの概略図を補足図S1に示します。 補足ビデオ S1 は、デバイスの準備からアンプリコンの比色検出までのデバイスのプロセス全体を示しています。

液体制御バルブを使用して、基本的な実験室機器を必要とせずに、バッファーユニットから混合ユニットへ試薬を順次放出することによりサンプル前処理を実行します。 各バルブは、バッファーウェルの底に置かれたステンレス鋼のボールで構成されており、試薬が必要になるまで流れ落ちるのを防ぎます。 ボールはバッファーユニットの底から 1.5 mm 突き出ており、図 2 に示すように、混合ユニットのピンがボールを持ち上げ、ピンがボールと整列すると試薬が下に流れるようになります。は、以前に報告したものと本質的に同じです 28,29 が、この研究では回転ではなく、前の研究では水平方向のスライドを使用していました。 輸送中のボールのズレや漏れを防ぐために、ボールとリザーバーの間に壊れやすいワックスベースの結合が形成されています。 まず、ワックス (Akrowax™ 130、米国オハイオ州アクロン) を小さなビーカーの中で加熱して溶かし、続いて溶けたワックスにボールを浸します。 ワックスの薄い層を含むボールをすぐにリザーバーに置き、ワックスを凝固させ、望ましくない動きを防ぐために壊れやすい結合を作成します。

各 25 μL の LAMP ミックスには、2.5 μL の 10 倍等温増幅バッファー、8 U Bst 2.0 WarmStart® DNA ポリメラーゼ、2.5 μL の 10 倍濃縮プライマー ミックス、および最終濃度 1.4 mM dNTP および 6 mM MgSO4 が含まれています。 25 μL の容量をヌクレアーゼフリーの水 (ジエチルピロカーボネートまたは DEPC で処理されていない) で満たしました。 ThermoFisher Scientific (米国マサチューセッツ州) からのヌクレアーゼフリー水と dNTP を除き、LAMP ミックス内の他の試薬は New England Biolabs (NEB) (米国マサチューセッツ州イプスウィッチ) から入手しました。 10× プライマー ミックスには、16 μM フォワード インナー プライマー (FIP) およびバックワード インナー プライマー (BIP)、2 μM フォワード アウター プライマー (多くの場合 F3 と呼ばれます) およびバックワード アウター プライマー (多くの場合 B3 と呼ばれます)、および 8 μM ループ プライマー フォワード (LF) が含まれています。 ）およびループプライマーバックワード（LB）; それらの配列は補足表S1に示されています。 プライマーは Integrated DNA Technologies (米国アイオワ州コーラルビル) から購入し、その配列は文献 30 に従って選択しました。 25 μL ミックスの代わりに 50 μL LAMP ミックスを使用した場合、すべての試薬の量は同じ最終濃度を維持しながら 2 倍になりました。 非特異的増幅と偽陽性結果の可能性を防ぐために、ウラシル DNA グリコシラーゼ (UDG) と dUTP を LAMP 反応に添加し、キャリーオーバー汚染を排除しました。 UDG は、LAMP およびその他の核酸増幅アッセイにおいて、感度を損なうことなくキャリーオーバー汚染を防止するために広く使用されています 31、32、33。

電源コンセントに接続する必要なく LAMP を実現するために、以前に報告したように、市販のバッテリー駆動のコーヒーマグ (Ember™ Travel Mug、Ember Technologies, Inc.、カリフォルニア州ウェストレイクビレッジ) をウォーターバスとして選択しました 28,29 。 62.5 °C の水を入れた Ember™ マグカップに入れる前に、検出ユニットを 2 枚のテープ (Fellows®) で密閉し、漏れや蒸発を防ぐために底部と上部を覆いました。 ４５分間のインキュベーション後、比色検出のために検出ユニットを取り出し、ジメチルスルホキシド中の１０，０００倍濃縮ＳＹＢＲグリーンＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１．０μＬを各検出ユニットに添加することによって実施した。 アンプリコンの比色検出には蛍光色素である SYBR グリーンを使用しました。 色の変化は肉眼で視覚化することも、スマートフォンのカメラを使用して記録することもできます。 視覚化を助けるために、単三電池 1 個で駆動される ULAKO 青色 LED (発光ダイオード) 懐中電灯 (米国ワシントン州アマゾン) を使用して、大腸菌が存在する場合の緑色蛍光を観察しました。 必要に応じて、結果はゲル電気泳動によって検証することもできます。 LAMP はさまざまなサイズのアンプリコンを生成することに注意してください。 したがって、PCR34 のような 1 つの特定のゲル バンドはありません。 SYBR グリーンはアンプリコンを直接検出するのに対し、カルセイン 35、ヒドロキシ ナフトール ブルー 36 (HNB)、フェノール レッド 37 などの他の色素は LAMP 増幅の副産物を検出するため、SYBR グリーンを選択します。 SYTO-9 などの他の色素は、LAMP 反応を阻害しない低濃度では肉眼で視覚化するのが困難ですが、機器を使用したリアルタイム検出に使用できます 38。

LAMP アッセイに必要なインキュベーション時間を研究するために、25 μL の LAMP 反応混合物に 0.5 μL の 10 倍濃縮 SYBR グリーン I (ThermoFisher Scientific) を加えてリアルタイム LAMP 実験を実行しました。 LAMP 反応からの蛍光シグナルは、QuantStudio 3 リアルタイム PCR システム (ThermoFisher Scientific) を通じて読み取られました。 異なる量の大腸菌 DNA (8 × 104、8 × 103、8 × 102、および 8 × 101 コピー) をテストし、それぞれを 25 μL の反応溶液にスパイクしました。 3 つのテンプレートなしコントロール (NTC) を含む、各濃度の 3 つの複製をテストしました。

大腸菌検出のための LAMP アッセイの定量限界 (LoQ) を評価するために、QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) を使用して DNA を大腸菌 DH5-α 細胞から抽出しました。 紫外可視分光光度計を使用して、精製した DNA の濃度を 160 ng/μL と測定しました。 抽出された DNA のコピー/μL を計算したところ、大腸菌ゲノムの分子量を使用して約 3 × 107 コピー/μL であることが判明しました。 このストック溶液の段階希釈は、ヌクレアーゼフリー水 (Fisher Scientific) を使用して作成されました。 さまざまな濃度の精製 DNA 1 μL を NTC とともに 25 μL LAMP 反応に添加しました。

コピー数は、NCBI GenBank (CP026085.1) から決定された、4,833,062 塩基対を含む配列内の塩基対の数に基づいて計算されました。 次に、式を使用します。 (1) 以下 39 では、精製された DNA のコピー数を計算しました。

環境水サンプルは、フロリダ州北東部のペリサー クリーク (地図上の位置: 29.66260 N 81.26837 W)、ペリサー クリーク河口 (29.66431 N 81.22892 W)、およびホイットニー ラボ ドックス (29.669249 N 81.216506 W) で収集されました。 ペリサー クリークは住宅地とつながっており、その水は大西洋に隣接するホイットニー ラボ ドックとの間で（潮汐に応じて）流れます。 サンプル #1 は 2019 年 8 月 30 日にホイットニー研究所の埠頭から収集され、サンプル #2 は 2019 年 9 月 6 日にペリサー クリーク河口から収集されました。サンプル #1 はハリケーン ドリアンがその地域を襲う前に収集されたことに注意してください。 2はハリケーンの後に収集されました。 両方とも、ワットマン グラスファイバー フィルターと蠕動ポンプを使用して濾過されました。 サンプル #3 と #4 (各サンプルにつき 3 つの複製) は、2021 年 5 月 26 日にそれぞれペリサー クリークとホイットニー研究所のドックで収集されました。環境サンプルの情報の概要は補足表 S2 に示されています。 サンプル #3 と #4 は、プラットフォームを検証するために実験を行った研究者によってフィルタリングされず、盲検化されていない状態で受け取られました。 サンプル #3 と #4 の一部は、Whatman グラスファイバーフィルター (0.7 μm) と 50 mL シリンジを使用して濾過され、濾過されたサンプルと濾過されていないサンプルの間でアッセイ性能が比較されました。 すべての水サンプルは、図 1 の装置を使用して処理されました。

サンプル調製と LAMP アッセイに対する海水中の塩の考えられる影響を研究し、さまざまな水サンプルを処理できる能力を実証するために、大腸菌 DH5-α 細胞を脱イオン水にスパイクして調製したサンプルを使用してプラットフォームをテストしました ( DI) 3.5%、2.0%、0.5%、および 0.0% (重量パーセント) の塩化ナトリウム (NaCl) を含む水。 これらの濃度は、海洋 (3.5%) から淡水 (~ 0%) までの水中の塩分濃度をシミュレートするために選択されました。 それらの間の濃度は、河口のさまざまな地点の水中に存在する可能性があります。 各塩濃度について 5 つの反復試験を行いました。 これらのサンプルを調製するために、懸濁培地中の大腸菌 DH5-α 細胞を 2 mL チューブに加え、遠心分離して細胞ペレットを形成しました。 上清培地を除去した後、細胞ペレットを0.4 mLの脱イオン水に再懸濁し、パルスボルテックスによって混合しました。 次に、サンプルを 4 つの 2 mL チューブに分割しました。 各チューブを再度遠心分離し、脱イオン水を捨て、1 種類の塩濃度を含む水を 1 mL 加えました。

図 1 は、環境水サンプル中の DNA 抽出、濃縮、精製、および大腸菌の検出のためのデバイスの設計を示しています。 装置は上部のバッファーユニット、中央の混合ユニット、混合ユニットの下側に挿入された検出ユニット、および廃棄物容器で構成されます。 バッファーユニットにはサンプル調製に必要な試薬が含まれています。 各溶液は、混合ユニット上でバッファーユニットを回転させてボールベースのバルブを作動させることによって排出されます。 これらの流体制御バルブは、混合ユニット内のピンによってボールが持ち上げられるまで試薬が下降するのを防ぎます。 次に、これらの試薬が混合され、検出ユニットを通過して精製 DNA がクロマトグラフィー紙上に収集され、続いて LAMP による DNA 増幅が行われます。 試薬は、ウェルを密閉したまま保管および輸送するためにバッファーユニットに事前にパッケージ化できます。また、ボールベースのバルブは、前に示したようにワックスを使用してボールを固定しても漏れがないことが示されています28。

当社のデバイスには、溶解、DNA 濃縮と精製、増幅、検出など、核酸アッセイに必要なすべてのステップが統合されています。 その結果、当社のプラットフォームにより、サンプリング場所から研究室までサンプルを輸送する必要がなくなりました。 また、培養ベースのアプローチよりもアッセイ時間もはるかに短くなります。 固体抽出カラムに基づく従来のサンプル前処理方法と比較して、紙パッド上での DNA 濃縮により、チューブ間の DNA の移送などのステップがさらに削減され、起こり得る汚染や分解の問題が回避され、固体カラムから DNA を抽出するための溶出ステップが不要になります。 当社の装置の紙パッド内の DNA は LAMP に直接使用でき、すべての DNA をカラムから溶出できるわけではなく、溶出ステップを省略しても希釈が不要なため、抽出カラム法に比べて大きな利点があります。 市販の FTA カードおよびガラスマイクロファイバー紙と比較した後、未処理のセルロースクロマトグラフィー紙が DNA 濃縮用に選択され、インフルエンザウイルスからの核酸濃縮がわずかに優れていることが示されました 40。

検出部の用紙サイズを最適化するために、以下の解析を実施しました。 式を使用してサンプル準備時間を計算しました。 (2)。 サンプルの容量は 1 mL ですが、溶解/結合/洗浄バッファーの試薬の総容量は 1.4 mL です。 クロマトグラフィー用紙のメーカーによれば、流速は 4.33 mm/min です。 紙の円の表面積が大きいほど、サンプルの準備時間が短くなることが理解できます。 紙の直径の関数として計算された時間を補足図S2aに示します。 結果は、紙の直径が 4 mm から 6 mm に増加すると、理論的な準備時間が 44 分から 19 分に短縮されることを示しています。 また、特定の紙サイズ (> 7 mm) を超えると、サンプル準備時間の短縮が顕著ではないことも観察されました。 同時に、紙の円の直径が増加すると、領域全体をカバーするのに必要な LAMP ミックスの量は、表面積 (または直径の 2 乗) に比例して増加します。 以前に報告したように、LAMP ミックスの量は 4 mm ウェルで 25 μL であるため 28,29、他の紙の円サイズに必要な LAMP ミックスの量は、式 1 を使用して計算できます。 (3)。 結果は補足図S2bにプロットされており、量、およびそれに応じてLAMPミックスのコストが大幅に増加することを示しています。 結果として、実験比較のために、紙サイズは直径 6 mm、LAMP 混合量は 50 μL を選択しました。

水サンプル #1 と #2 (両方ともサンプル提供時にろ過済み) を使用して、直径 4 mm と 6 mm の紙パッドの間でサンプルの準備時間を比較しました。 補足表 S3 にまとめられているように、大きな違いが見られました。 サンプルには 131 分以上かかりました。 直径4mmの紙を使用した場合、処理には23分かかりました。 直径6mmの用紙用。 これらの結果により、デバイスでは用紙サイズが大きくなるとパフォーマンスが大幅に向上することが確認されました。 直径 6 mm の紙を使用する場合の欠点の 1 つは、前述したように LAMP ミックスの量が増加し、結果として試薬コストが増加することです。 また、直径 6 mm の紙を使用した追加の 2 種類のサンプル（ろ過されていない水サンプルと、塩分濃度実験用に塩を添加した蒸留水サンプル）のサンプル調製時間を比較しました。 時間が約 8 分短縮されたことが観察されました。 濾過されていないサンプル（31 分）から濾過されたサンプル（23 分）まで、さらに濾過されたサンプルからスパイクされたサンプル（19 分）までそれぞれ約 4 分短縮されました。 結果は補足表S3にもまとめられています。

リアルタイム PCR 装置を使用して、LAMP アッセイに必要な最小時間を特定しました。 図 3a は、各曲線に対して 3 つの複製を使用した、4 つの異なる DNA 濃度の平均蛍光増幅曲線を示しています。 すべてのサンプルは 35 分以内にしきい値ライン (ベースラインを上回るバックグラウンド ノイズの標準偏差の 10 倍として定義) を超え、45 分以内にプラトーに達しました。 結果として、LAMP 反応時間として 45 分を選択しました。 図 3 のすべての反応は 60 分間インキュベートされましたが、NTC のすべての複製で非特異的増幅は観察されませんでした。 LAMP には多くの複雑なステップが含まれるため、蛍光シグナルは開始時の細菌の量と相関しません。 ただし、PCR41 のように、閾値時間を使用して細菌の初期量と相関させることができます。 図 3b は、閾値時間 (機器によって提供される) と細菌量の間の検量線を示しており、半定量的な大腸菌検出が可能であることを示しています。

精製された大腸菌 DH5-α DNA を使用したリアルタイム LAMP 増幅。 (a) 時間の関数としての、反応あたり 8 × 104、8 × 103、8 × 102、および 8 × 101 の細菌コピーの蛍光シグナル。 NTC、テンプレートなし制御。 (b) 各反応におけるコピー数の関数として閾値時間 (Ct) を示す検量線 (対数スケール)。 結果は、各濃度の DNA サンプルの 3 つの複製から生成されました。 エラーバーは 1 つの標準偏差を示します。

大腸菌 DH5-α DNA の 300、30、3、および 1 コピーを使用して LAMP アッセイの定量限界を研究し、図に示すように、300、30、および 3 コピーの 5 つの複製すべてで陽性シグナルを観察しました。 4. ただし、1 コピーのサンプルでは、​​3 回の反復のうち 1 回のみで陽性シグナルが観察されました。これは、アッセイの LoQ が 3 ～ 30 コピーの間であり、以前に報告された 1 反応あたり 10 コピーの検出限界と同様であることを示しています 30。 結果はゲル電気泳動を使用して確認されました。 図4に含まれていない反復実験の結果は、補足図S3に示されています。

(a) 62.5 °C で 45 分間 LAMP アッセイを行った後、室内照明の下で撮影した反応チューブの写真。 大腸菌 DNA の量はポジティブ コントロール (P) で 300 コピー、その他は 30、3 コピー、1 コピー、およびネガティブ コントロール (N) とチューブにマークされています。 (b) (a) と同じチューブを青色 LED 懐中電灯の下に置きます。 (c) (a) のサンプルのゲル電気泳動。

まず、ろ過水サンプル #1 と #2 をテストしました。IDEXX Colilert システムを使用して、総大腸菌群の測定値は 517.2 CFU/100 mL と 270 CFU/100 mL でした。 全大腸菌群は、大腸菌やその他多くの細菌を含む、さまざまな種類の細菌の集合体であることに注意してください。 各サンプルを 5 回テストした後、サンプル #1 については 5 回のテストすべてで陽性の結果が得られ、サンプル #2 については 5 回のテストのうち 4 回で陽性の結果が得られました。 補足図 S4 は、各サンプルの 3 つの反復の結果を示しています。

これら 2 つのサンプル (#1 と #2) に含まれる大腸菌の量は入手できないため (その時点では全大腸菌群のみが測定されました)、さらに多くのサンプルを収集しました。ペリサー クリークからの 3 つのサンプルの複製 (サンプル #3) とWhitney Lab Docks からの 3 つのサンプル (サンプル #4)。 IDEXX Colilert システムを使用して総大腸菌群と大腸菌を測定した後、これらの複製はブラインド サンプルとして研究者に与えられ、研究者はこの研究で説明されている装置を使用して以下の実験を実行しました。 まず、各サンプルの反復を 2 回テストし、サンプル #4 の 3 つの反復では 6 つのテストすべてで陽性の結果が得られましたが、サンプル #3 の 3 つの反復では 6 つのテストのうち 2 つだけ、反復 #1 と #2 では 1/2 でした。 、レプリケート #3 の場合は 0/2。 結果を確認するために、サンプル #3 をもう一度テストしたところ、反復 #1 と #2 では陽性の結果が得られ、反復 #3 では陰性の結果が得られました。

これらの検査結果はブラインドサンプルを提供した人々と共有され、IDEXX Colilert システムで測定された大腸菌群および大腸菌の総数と比較されました。 表 1 に示すように、2 つのデータ セットは互いに正確に相関しませんでした。 IDEXX Colilert システムに基づくと、サンプル #3 はサンプル #4 よりも大腸菌濃度が高かったのに対し、当社のデバイスはサンプル #4 をサンプル #3 よりもうまく検出しました。 これらの実験中に、すべてのサンプル #3 の複製、特に複製 #3 が検出ユニットの紙上に多数の暗い粒子を残したことがわかりました。 したがって、サンプル #3 の一部の汚染物質が LAMP 反応を阻害したのではないかと考えられました。 検証するために、処理した (つまり、以前に濾過した) サンプル #1 と #2 と同様に、0.7 μm ワットマン グラスファイバー フィルターを使用してサンプル #3 と #4 を濾過し、粒子状物質を除去しました。 次に、濾過したサンプルと濾過していないサンプルを比較のためにテストしました。 これらの結果を表 1 にまとめ、検出ユニットのいくつかの写真を図 5 に示します。

ペリサークリークで収集されたサンプル #3 (a、b) (3 つのサンプル複製の P1、P2、P3) とホイットニー研究所の埠頭 (W1、W2、W3) で収集されたサンプル #4 (c および d) の検出ユニットの写真、および濾過されていないサンプル（上の列）と濾過されたサンプル（fでラベル付けされた、下の列）のサンプルと、陽性対照（左、チューブ内）およびテンプレートなしの対照（右）との比較。 (a) と (c) の写真は室内光の下で撮影され、(b) と (d) の写真は黄色のプラスチック フィルターを備えた青色 LED 懐中電灯の下で撮影されました。

サンプル #3 では、フィルター処理されたサンプルの成功率が 100% であったのに対し、フィルター処理されていないサンプルの成功率は 50% でした。 これらの結果により、サンプル #3 から濾別された粒子が LAMP 反応を阻害することが確認されました。 サンプル #4 では、フィルター処理されたサンプルとフィルター処理されていないサンプルの成功率は同様です。 サンプル #3 とサンプル #4 の考えられる違いは、サンプル #3 は住宅地に隣接するペリサー クリークから収集されたのに対し、サンプル #4 は大西洋に隣接するホイットニー ラボ ドックスから収集されたことです。 結果として、この懸念を解消するには、サンプル #1 および #2 の場合と同様に、サンプリング中に濾過をデバイスのテスト プロトコルに採用する必要があります。 また、サンプル #4 に示されているように、濾過は検出に影響せず、濾過したものと濾過していないものの両方で、同様のテスト成功率であったことにも注意してください。

LAMP アッセイに対する海水の影響の可能性に関する懸念に対処するために、さまざまな塩濃度と同量の大腸菌細胞を添加した水サンプルを使用して実験を実行しました。 塩分濃度は0～3.5%で、淡水と海水に相当します。 各塩濃度について、5 回の繰り返し実験を実施しました。 表 2 にまとめたように、すべての塩濃度について、5 つのテストのうち 4 つまたは 5 つで肯定的な結果が得られました。補足図 S5 は、1 つの代表的なテスト結果の写真を示しています。 これらの結果は、海水レベル以下の塩濃度がサンプル前処理や LAMP 反応に大きな影響を与えないことを示唆しています。 表 2 の 3 つの否定的な結果は、最初の 2 つの実験で、大腸菌細胞を分割して塩水に添加する前に十分に混合していなかったため発生したことに注意してください。 問題に対処した後、すべてのレプリケートが正常に検出されました。

サンプル前処理と LAMP を備えた当社のプラットフォームは、IDEXX Colilert システムで測定した 20 CFU/100 mL を含むサンプル #4 (複製 #3) 中の大腸菌の一貫した検出によって示されるように、高感度です。 これは、1 mL のサンプルを使用したため、プラットフォームの定量限界 (LoQ) が少なくとも 0.2 CFU/mL であることを示唆しています。 したがって、当社のプラットフォームの LoQ は、EPA が推奨する閾値制限 (100 CFU/100 mL7) より少なくとも 5 倍低いことになります。 図 4 に示すように、LAMP アッセイ自体の LoQ は、大腸菌をスパイクした水サンプルを使用して 3 コピーであったことに注意してください。

当社は、環境水サンプル中の大腸菌検出のためのオンサイト検査プラットフォームを開発しました。 文献にあるほとんどのデバイスと比較して、当社のプラットフォームのユニークな特徴の 1 つは、サンプル前処理です。これは 3 つの簡単なステップで構成されます。(1) バッファー ユニットを回転する、(2) 試薬が混合して紙パッドを通過するのを待つ、および（３）次の増幅ステップのために紙ベースの検出ユニットを取り除く。 濃縮された DNA の増幅は、一定温度に維持された電池駆動のコーヒーマグの中に検出ユニットを浸すことによって行われます。 テスト結果は色の変化で示され、肉眼で観察したり、スマートフォンのカメラで記録したりできます。 当社のプラットフォームは使いやすく、現場でのテストに持ち運びが可能で、検出限界が低いです。 さらに、このプラットフォームは、LAMP アッセイでプライマー配列を変更するだけで、他の病原体を検出するように簡単に適合させることができます。

この製品のプラットフォームは、以前に開発された VLEAD28 または 2 プレックス VLEAD29 と同様のバルブ概念に従っていますが、表 3 にまとめられているように、現在のアプリケーション向けに大幅な変更が加えられています。主な違いは、(1) 操作機構がスライド式から変更されたことです。 (2) 処理されるサンプルの量と種類、(3) 標的病原体、(4) 標的となる病原体/サンプルの違いによるサンプル調製プロセスに使用されるキットと試薬の量。 VLEAD が RNA ウイルスをターゲットにしてその RNA を捕捉するのに対し、この研究のデバイスは DNA バクテリアをターゲットにしてその DNA を捕捉します。 サンプルの性質上、レクリエーション用水中に存在する大腸菌の濃度は人間のサンプル中のウイルスよりもはるかに低いため、この研究の装置でははるかに大量のサンプルが必要です。 これは、テスト時に吸引機構 (注射器など) が利用できる場合に、結果が得られるまでの時間を短縮できるように、この装置にオプションの真空を追加した理由の 1 つでもあります。 このプラットフォームは、地域社会における重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) の有病率と伝播を推定する研究など、下水ベースの研究に適応することが予想されます 42。

当社のオンサイトポータブル検査プラットフォームは、(1) NAAT を使用して 100 CFU/100 mL の閾値以下の大腸菌を検出することができ、(2) サンプル調製、DNA 増幅、検出を含む必要なすべてのステップをシステムに統合することができます。かさばる、または高度な実験装置を必要としない単一のプラットフォームで、(3) 約 1 時間で結果が得られます。 当社のプラットフォーム内の試薬は、現場でのテスト用に保管および輸送できるようにバッファーユニットに事前にパッケージ化できます。また、ボールベースのバルブは、ボールを各リザーバーに固定するためにワックスを使用した場合、数週間にわたって漏れがありませんでした。 LAMP ミックスは、使い捨てピペットに事前にロードし、アイスパックと一緒に保存することもできます。 冷蔵保存の代替案は、他の場所で報告されているように、室温で保存できる凍結乾燥 RT-LAMP 試薬を使用することです 43,44。 したがって、当社のプラットフォームは現場で使用でき、現場で水質を監視できます。

水サンプル中の大腸菌検出用の他のポータブル プラットフォームと比較して、当社のプラットフォームは、結果が得られるまでの時間、LoQ、シンプルさの点で最高のプラットフォームの 1 つであり、これらはオンサイト試験プラットフォームの 3 つの重要なパラメーターです。 この研究と水中の大腸菌検出のための他のプラットフォームの比較を表 4 に示します。

このプラットフォームの LoQ が低い根本的な理由の 1 つは、大量の水サンプル (1 mL) を使用することです。 このサンプル量は、他のプラットフォーム、特に数マイクロリットルしか処理できないマイクロ流体工学に基づいたプラットフォームと比較して優れています 45,46。 たとえデバイスが単一細胞を検出できたとしても、100 CFU/100 mL より低い濃度を検出するにはまだ十分ではありません (最初に濃縮手順を実行しない限り、1 μL の水には細胞がまったく存在しないため)。 さらに、当社のプラットフォームは紙ベースのイムノアッセイよりも高い感度を提供しますが、紙ベースのイムノアッセイでは、米国 EPA が推奨する閾値限界である 100 CFU/100 mL 未満の濃度を検出するには不十分です。 紙ベースのイムノアッセイの検出限界は、ほとんどの場合 50 CFU/mL より高くなります 47,48。

酵素基質に基づくアプローチなど、他のアプローチは高感度を提供し、大量のサンプルを処理できます。 ただし、サンプルの濃度に応じて、培養時間は 4 ～ 12 時間と長くなります 10、11、12。 核酸増幅アッセイは、迅速な分析と高感度を両立します。 リンら。 らは、最大 10 mL の水サンプルを処理する非対称膜を開発し、膜の微細孔内のデジタル LAMP と組み合わせて、1 時間 25 以内に 0.3 細胞/mL という低量の大腸菌を検出できるようにしました。 それにもかかわらず、蛍光顕微鏡などの増幅と検出のための実験室設備が必要です25。

現在の研究中に使用されたデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手可能になります。

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リファレンスをダウンロードする

この研究は、ムーンショット イニシアチブを通じてフロリダ大学によって支援され、米国国立衛生研究所 (R01AI155735) によって部分的に支援されました。 David Kaplan、Thomas Bianchi、Peter Ifju、およびその他の iCoast グループの協力と支援に感謝します。

フロリダ大学機械航空宇宙工学部、学際的マイクロシステム グループ、私書箱 116250、ゲインズビル、フロリダ州、32611、米国

チャールズ・アップルズ、モーティス・アリパナ、ジョージ・アデドクン、Z.ヒュー・ファン

フロリダ大学環境工学科学部、私書箱 116580、ゲインズビル、フロリダ州、32611、米国

エリーズ・モリソン

分子遺伝学および微生物学部、フロリダ大学、私書箱 100266、ゲインズビル、フロリダ州、32610、米国

ヨン・S・キム＆シューグアン・ジン

ホイットニー海洋生物科学研究所、フロリダ大学、私書箱 116580、セント オーガスティン、フロリダ州、32080、米国

トッド・Z・オズボーン

土壌、水、生態系科学部、フロリダ大学、私書箱 110290、ゲインズビル、フロリダ州、32611、米国

トッド・Z・オズボーン

J. Crayton Pruitt Family フロリダ大学生物医工学部、私書箱 116131、ゲインズビル、フロリダ州、32611、米国

Z.ヒュー・ファン

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CM は調査を実施し、手法を開発し、データを収集し、図を作成し、論文の草稿を作成しました。 MA と GA が研究の実施を支援しました。 YSKとSJは細菌サンプルを調製し、DNA濃度を測定した。 EM はサンプルを提供し、メソッドを開発し、リソースを提供しました。 TZO は資金を獲得し、サンプルを提供し、リソースを提供し、作業を監督しました。 ZHF はコンセプトを開発し、資金を獲得し、手法を開発し、リソースを提供し、作業を監督し、論文の草稿を作成しました。 著者全員が最終原稿を審査し、出版することを承認しました。

エリーズ・モリソン、トッド・Z・オズボーン、またはZ・ヒュー・ファンとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

補足ビデオ1.

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転載と許可

マンザナス、C.、モリソン、E.、キム、YS 他。 水サンプル中の大腸菌を現場で検出するための分子検査装置。 Sci Rep 13、4245 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-31208-4

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受信日: 2022 年 12 月 9 日

受理日: 2023 年 3 月 8 日

公開日: 2023 年 3 月 14 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31208-4

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