3D コラーゲン足場内の細胞数を推定するための新しい立体学的方法

May 07, 2023

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May 19, 2023

Jul 08, 2023

HDPEパイプ市場2030年の主要企業の最大の利益と成長の可能性：FTTxセクターには、業界のトッププレーヤーに関する詳細な情報が含まれています。 Dutron グループ、Miraj Pipes & Fittings Pvt. Ltd.、Gamson India Private Limited、Nagarjuna Polymers、Apollo Pipes、mangalam Pipes Pvt. 株式会社

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Scientific Reports volume 13、記事番号: 7959 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

3D 足場内の細胞増殖を評価する現在の方法は、代謝活性または総 DNA の変化に依存していますが、3D 足場内の細胞数を直接定量化することは依然として課題です。この問題に対処するために、我々は系統的ランダムサンプリングと足場の薄い焦点面光学的切片を使用し、その後総細胞数 (StereoCount) を推定する不偏ステレオロジーアプローチを開発しました。このアプローチは、総 DNA (DNA 含有量) を測定する間接的な方法に対して検証されました。細胞数を定量化するための現在の参照方法である Bürker 計数室。細胞播種密度 (単位体積あたりの細胞数) の総細胞数を 4 つの値で評価し、精度、使いやすさ、所要時間の観点から方法を比較しました。 StereoCount の精度は、足場あたり細胞数が約 10,000 個および約 125,000 個の場合の DNA 含有量を著しく上回りました。足場当たり約 250,000 個および約 375,000 個の細胞の場合、StereoCount と DNA 含有量の両方が Bürker よりも低い精度を示しましたが、相互に違いはありませんでした。使いやすさの点では、細胞分布の概要と将来のハイスループット分析のための自動化の使用の可能性とともに絶対細胞数に関する出力により、StereoCount には大きな利点がありました。これらを総合すると、StereoCount メソッドは、3D コラーゲン足場における細胞を直接定量化するための効率的なアプローチです。その主な利点は、自動化された StereoCount が、さまざまなヒト疾患の創薬に焦点を当てた 3D スキャフォールドを使用した研究を加速できることです。

定義された体積内の細胞数の定量化は、生物科学者および前臨床研究者の世界的なコミュニティにとって不可欠な指標です。 3D コラーゲン足場などの 3D ボリュームへの細胞の分散を伴う分野では、実験の開始、つまり細胞の播種と経時的な細胞死と増殖の評価に信頼性の高い細胞の推定値が必要です。このような場合の細胞数の計数は、2 つの主要なアプローチに限定されます。1 つは均質な細胞懸濁液 (液相) から直接細胞を計数するための Bürker チャンバーです。および総 DNA 推定のための蛍光ベースのアプローチ (CyQuant® 1、2 など)。トータル DNA アプローチの欠点は、コラゲナーゼによる足場消化などのサンプルの前処理による細胞溶解と、正確な読み取り値と細胞数に対するシグナル強度の直線性間の相関を保証するために各実験の検量線が必要であることです。したがって、3D 足場内の細胞数を推定するための直接的な定量的方法はありません。

この問題に対処するために、3D コラーゲン足場内の絶対細胞数を直接定量化するための新しい立体学ベースの方法である StereoCount™ を紹介します (図 1)。

細胞を播種し、細胞数の定量化に使用する 3D コラーゲン足場。

材料と方法および図 2 で詳しく説明されているように、蛍光顕微鏡を使用したアプローチを示し、続いて光学切片作成と画像解析を行います。次に、手動計数によってもたらされるバイアスを回避し、スループットを向上させるために、FIJI-ImageJ3 を使用した自動ワークフローを導入します。 2 つのマクロスクリプトと中間の浅い機械学習 (NL) ベースのステップを使用します。この方法の利点としては、足場の消化やミクロトームによる切片作成が必要ないこと、顕微鏡ベースのアプローチとして、追加情報として足場内の細胞分布の概要が得られることが挙げられます。ここでは、StereoCount と全 DNA の蛍光検出に基づく DNA 含有量法を比較対照します。一般に信頼できる細胞定量法である計数室法 (Bürker) を使用した細胞数。

顕微鏡検査中の StereoCount サンプリング手順。三次元 (3D) コラーゲン足場は、9 つの XY 視野と 30 の Z スタックにサンプリングされます。細胞数は、薄い焦点面の光学走査 (光学ディセクター法) を使用して各列ごとに決定されます。カラムからの細胞数は、コラーゲン足場の全体積に対して再計算されます。

検証を目的として、StereoCount、DNA という 3 つの方法で推定された 4 つの値にわたって、細胞播種密度 (単位体積あたりの細胞数) の細胞数のサンプル前処理の精度、使いやすさ、機器要件および所要時間を比較します。内容および Bürker (参照標準)。メソッドの精度は次の指標によって評価されます (図 3): (i) バイアス (Bürker 法の平均に対する細胞数の体系的な過小評価または過大評価)、(ii) 推定値の分散 (絶対/二乗偏差) (iii) 全体の精度 (理論値からの絶対/二乗偏差 [つまり、Bürker 法からの平均推定値]、言い換えれば、バイアスと分散)相互に考慮されます）。

メソッドの精度の指標。これらには、バイアス (Bürker 法の平均に対する細胞数の系統的な過小評価または過大評価)、平均値周辺のばらつきを反映する指標 (特定の方法の平均推定値からの絶対/二乗偏差)、そして最後に全体の精度の指標 (絶対/二乗偏差) が含まれます。理論値 [tv] から）バイアスと分散の両方を反映しています (a)。高い分散とバイアスの両方が集合的に方法 (b) の精度を低下させます。

Bürker 法では、3D コラーゲン足場に注入する前に、細胞懸濁液中の総細胞数を評価しました。 4 つの濃度の細胞懸濁液 (10,000、125,000、250,000、および 375,000 細胞) を 3D 足場に分散させました。 2 つの方法 (StereoCount および DNA 含有量) を使用して、別個の足場から細胞を播種して 1 日後の総細胞数を推定しました。

StereoCount の精度と 3D コラーゲン足場の DNA 含有量を、Bürker 法による細胞懸濁液のカウントと比較しました (補足表 S1)。比較は、図 4 および表 1 に示すように、一般化最小二乗法 (GLS) を使用して行われました。現在の研究中に生成されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

4 つの値 (a) 10,000、(b) 125,000、(c) 250,000、および (d) 375,000 細胞/足場 (上部) および理論値からの偏差 (tv、定義) にわたる細胞播種密度による 3D 足場内の細胞数の決定Bürker 法の平均値; 赤い破線で示されています)、両方とも数千のセルで示されています。黒い水平線は平均値を示します。

参照値は、Bürker 法による平均推定値に基づいています。バーカー数は、10,000 細胞/足場の濃度に対して 13,450 ± 2477 細胞 (平均 ± SD) でした (図 4a、表 1a)。 StereoCount による推定では、推定の精度やばらつき (変動) の点で Bürker との違いは見られませんでした。対照的に、DNA 含有量法には、この低い細胞密度での推定感度がありませんでした。

約 125,000 個の細胞が注入された足場について、Bürker は 125,400 ± 18,536 細胞と推定しました (図 4b、表 1b)。StereoCount も DNA 含有量も Bürker との差異を示さなかった。ただし、StereoCount メソッドは、全体的な精度と分散の点で参照メソッド (Bürker) とほぼ一致していました。対照的に、DNA 含有量は、StereoCount と比較して、参照法の平均推定値から約 30,400 細胞 (95% CI [20,200; 40,700]、p < 0.001) という統計的に大きな差があり、理論値からの偏差が 32,200 細胞も大きかった ( CI [24,300; 40,100]、p = 0.001)。興味深いことに、StereoCount の結果は、平均からの偏差が 7200 細胞 (CI [1700; 12,600]、p = 0.021) 小さいため、Bürker (参照方法) よりもさらに小さい分散を示しました。つまり、播種された細胞の初期数に近かったためです ( 125,000 細胞/足場)。

250,000 個の細胞の足場について、Bürker は 253,200 ± 6197 個の細胞と推定しました (図 4c、表 1c)。 StereoCount メソッドと DNA コンテンツメソッドの両方で、全体的な精度と分散の点でこれらの基準値との差が示されました。具体的には、StereoCount では Bürker からの偏差が 31,600 セル高かった [CI 14,900; 48,300] および 51,000 細胞の DNA 含有量 [CI 32,200; 69,900]。 DNA 含有量のみが細胞数を 38,000 個過小評価しているにもかかわらず [CI -72,200; -3800]、p = 0.044)、StereoCount と DNA 含有量の両方の分散と全体的な精度は、互いに違いはありませんでした (p > 0.05)。

最後に、足場内の最高密度の細胞数 (375,000 細胞) について、Bürker は 349,200 ± 37,542 細胞と推定しました (図 4d、表 1d)。 StereoCount と DNA 含有量は両方ともこれらの基準値とは異なりますが、全体的な精度の点では互いに違いはありませんでした。ただし、DNA 含有量は、StereoCount よりも推定値の分散が低い傾向がありました。一方、平均からの偏差は、StereoCount の方が 77,500 セル [29,100; 29,100; Bürker (p = 0.005) と比較して、DNA 含有量は Bürker と同等の平均値からの偏差を示しました (2,300 細胞の差 [-11,200; 15,700] p = 0.743)。 DNA 含有量は -86,000 細胞という偏り (過小評価) を示しましたが [CI -123,400; -49,100] (p = 0.003)、この方法は StereoCount よりも推定値の分散が低い傾向がありました (平均からの DNA 含有量の偏差は、StereoCount と比較して 79,800 細胞 [32,200; 127,300] 小さかった (p = 0.005)。補足表 S2 はさらに提供します。平均値からの二乗偏差と理論値からの二乗偏差の分析結果。

参照メソッドと比較した精度に加えて、考慮すべきその他の要素には、使いやすさ、コスト、機器要件、各メソッドの所要時間が含まれます。

DNA 含有量は、迅速かつ簡単に実行できる、広く使用されている蛍光ベースの方法です。蛍光シグナル検出機能を備えたマイクロプレートリーダーが必要です。このアプローチはマルチウェル形式に適していますが、より多くのスキャフォールドでは単一スキャフォールドの細胞推定と同様の処理時間が必要になります。たとえば、1 つまたは 10 つの足場の分析には約 3 時間かかります (図 5)。ただし、足場消化が必要なため、細胞分布に関する情報が失われ、それ以上の処理や分析はできなくなります。もう1つの欠点は、出力が細胞数ではなく、ウェルあたりの総DNAの相対蛍光単位であることです(表2)。これには、サンプルの蛍光値を細胞数に変換するための参照標準曲線が必要です。

DNA コンテンツ (上のパネル) と StereoCount (下のパネル) のスキームは、各アプローチの時間要求に応じて段階的に処理されます。プロセス期間はサンプルサイズに依存しません (青)。 1 つの足場解析のプロセス時間 (オレンジ色)。 10 件の足場解析のプロセス期間 (緑色)。データ処理に自動化 (スクリプト) が使用された場合の処理時間 (黄色)。各メソッドの 1 つまたは 10 個のサンプルに必要な合計時間が赤枠で示されています。

ここで提案される新しい StereoCount アプローチは、3D コラーゲン足場における細胞数推定のための不偏ステレオロジー原理に基づいています。画像取得には蛍光顕微鏡が必要です。 StereoCount の利点には、(i) 足場ごとの細胞の絶対数が得られる (表 2) というアプローチがあります。 (ii) 足場の消化を必要としないため、3D での細胞分布に関する情報が保存されます。時間に関して言えば、1 つの足場と 10 つの足場の StereoCount 分析には、それぞれ約 3 時間と 10 時間かかります。自動化により、コンピュータのスペックにもよりますが、データ処理時間は10分程度以下に短縮されることが期待されます（図5）。高スループット分析のスクリプトは補足マクロ S1 にあります。

ここでは、3D 足場における細胞増殖を評価するためのいくつかの方法をレビューします。細胞増殖を推定するための一般的な戦略の 1 つは、細胞酵素によるさまざまな基質の高蛍光産物への変換に基づいています (例: MTT4,5、WST-16、WST-8/CCK-8、CCK-87、および AlamarBlue アッセイ 8)。これらの方法はミトコンドリア酵素の活性に依存するため、結果は単一細胞数そのものではなく、細胞の代謝活性を反映します。さらに、老化細胞やゆっくりと成長する細胞の場合など、代謝活動が変化すると、このプロセスは感度を失います9。

DNA 内容の標識に基づく方法 (CyQuant1,2 など) は、細胞の代謝活性とは独立しています。ただし、これらのアプローチは相対蛍光単位を推定するだけであり、細胞あたりの DNA 含量に変換するための DNA 標準曲線、つまりプレート上に播種された既知数の細胞の DNA 含量から生成される標準曲線が必要です。別の複雑な点は、通常の 2D 培養と比較して、3D 足場での推定では、標識された細胞 DNA からの蛍光シグナルを検出する前にコラーゲンハイドロゲルの消化が必要であることです。この戦略は一般的ですが、このアプローチでは存在する DNA の量に関する情報のみが提供され、絶対細胞数や 3D 足場全体の細胞分布に関する情報は提供されません。

このニーズに対処するために、実験ごとに消化や検量線を必要とせずに 3D 足場内の細胞数を定量化するための、新しい立体学ベースの戦略 StereoCount を開発しました。現在一般的に使用されている方法である DNA 含有量と比較して、StereoCount を評価しました。基準方法として計数チャンバー (Bürker) を使用しました。最後に、拡張として、手動によるカウントによる主観的エラーの導入を回避するための自動化されたワークフロー (パイプライン) を開発しました。自動化されたワークフローの効率は、マクロスクリプトを変更することで改善される可能性があり、すべてのステップを 1 つのマクロに結合するか、ステップごとに異なるプラットフォームに切り替えることでさらに自動化できます。当社の簡単に適用できるワークフローは、各画像に同一のエラーを適用して信頼性の高い結果を提供し、異なる調査者が各タスクを手動で実行することによって引き起こされる評価者間エラーを回避します。

私たちのデータは、細胞数が少ない場合 (足場あたり 10,000 細胞)、バックグラウンドの蛍光シグナルが蛍光染色された DNA からのシグナルを超えるため、DNA 含有量が使用できないことを示しています。したがって、細胞密度が低い場合は、StereoCount が推奨される選択肢です。これは、このアプローチが総体積の既知の部分に含まれる細胞の単純なカウントに基づいているためです。より高い細胞数 (足場あたり 125,000 および 250,000 細胞) では、StereoCount と DNA 含有量の両方が有用な結果を提供しますが、StereoCount は参照 Bürker 法を使用した細胞のローディング数をより正確に反映します。より高い細胞密度 (250,000 細胞/足場以上) では、DNA 含有量と StereoCount の両方が同様に効果的です。 StereoCount の制限は、セル密度が増加するにつれてセルの重なりを避けるために余分な時間と注意が必要になることです。この問題に注意を怠ると、セル密度が増加するにつれて過少カウントが好まれる系統誤差 (バイアス) が発生する可能性があります。同様に、我々の結果は、細胞密度の増加の直接的な関数としての DNA 含有量による細胞数の過小評価を示しており、このアプローチにもバイアス補正が必要である可能性があることを示唆しています。違いは、StereoCount の場合、細胞密度が高い場合には細心の注意を払うことでこれらのアンダーカウントを回避できるのに対し、この戦略は DNA 含有量法では利用できないことです。

最後に、StereoCount メソッドと DNA コンテンツメソッドの実現可能性、材料、マシン要件、および所要時間を考慮します。 DNA コンテンツの大きな利点は、StereoCount と比較して時間のかからない方法であるマルチウェルフォーマットオプションです。ただし、StereoCount の自動ワークフローの使用によりデータ処理 (特に複数サンプル分析) が大幅に短縮されます。ただし、DNA 含有量のデータ分析を高速化しても、実験ごとに相対的な蛍光単位から細胞数を推定するための検量線を作成する必要があるため、相殺されます。 StereoCount の最大の利点は、足場の消化やミクロトーム切片作成を必要とせずに、単純な顕微鏡画像を使用して直接細胞数を計測し、細胞分布を 3D で視覚化できることです。ここでは、蛍光染色された細胞を使用して StereoCount アプローチを説明していますが、DAPI と Calcein-AM 染色を組み合わせると、同じアプローチが生細胞と死細胞の区別に適用でき、また 3D 足場内の細胞の免疫組織化学的染色を使用するアプローチにも適用できます。

ヒドロゲル足場は今日では一般的なタイプの 3D 細胞培養ですが、さまざまな実験操作後の細胞増殖やその他のパラメーターを評価するための定量的ツールのニーズは依然として大きく高まっています。当社の新しい立体学ベースのフリーウェアアプローチである StereoCount は、提供される自動ワークフローを使用した高速スループットで、未消化コラーゲンハイドロゲル内の染色細胞の光学的切片化を使用します。我々は、StereoCount がより低い細胞密度 (足場あたり約 10,000 および約 125,000 細胞) に適していることを報告します。この場合、DNA 含有量法ではそのような低い細胞密度を推定する感度が不足していましたが、蛍光ベースの間接法による DNA 含有量は、より高い細胞密度（足場あたり約 250,000 および約 375,000 細胞）の場合に好ましい。

正常ヒト真皮線維芽細胞 (NHDF) は、2015 年 11 月 5 日の決定、E. Benese 13, 305 99 Pilsen, Czech Republic にある大学病院の地元倫理委員会による承認後、形成外科介入後の皮膚から単離されました。ヘルシンキ宣言に従った。すべてのドナーは介入前に書面によるインフォームドコンセントを与えました。サンプルは、ペニシリン (100 U/ml)/ストレプトマイシン (0.1 mg/ml) (Biochrom、ケンブリッジ、英国) およびゲンタマイシン (50 μg/ml) を含むハンクス平衡塩類溶液 (HBSS) (Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ) によって洗浄されました。）（バイオクロム）。サンプルを切断し、コラゲナーゼ I 型 (100 U/ml、Merck KGaA) を含む HBSS 中で 37 °C で一晩消化しました。翌日、懸濁液を激しく振盪し、１００μｍナイロンセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ（商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を通して濾過した。次いで、細胞懸濁液を、低グルコースダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（Merck KGaA）、10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS）（Merck KGaA）、ペニシリン（100 U/ml）を含む培養フラスコ（TPP）に移した。）／ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）、０．５％Ｌ－グルタミン（Ｂｉｏｓｅｒａ、ヌアイユ、フランス）および１．０％非必須アミノ酸（Ｂｉｏｓｅｒａ）。 NHDF を 37 °C、5% CO2 で 80% コンフルエンスまで培養し、継代しました。実験では 2 ～ 5 継代の NHDF のみを使用しました。

3D コラーゲン足場の調製に使用した I 型コラーゲンはラットの尾から単離されました。コラーゲン単離のためのラットの尾の収集は、チェコ共和国教育・青少年・スポーツ省の動物福祉諮問委員会によって承認され（承認 ID MSMT-249/2017-2）、動物福祉諮問委員会の監督の下で実施されました。ピルゼンにあるカレル大学医学部の委員会。指令 2010/63/EU および FELASA ガイドラインおよび推奨事項 (職場認定番号 4891/2015-MZE-17214) によって与えられた技術的、衛生的、福祉および倫理的基準に準拠しています。ラットの系統は Wistar で、性別は雄、年齢は 6 ～ 7 か月でした。ラットは尾に影響を与えることなく別の独立した研究に使用されました。したがって、上記のプロトコル (承認 ID MSMT-249/2017-2) によって承認された動物の屠殺後に尾を収集しました。研究はARRIVEガイドラインに従って実施されました。腱をラットの尾から取り出し、室温で実験室用シェーカー上のPBS中で3×24時間維持した。 PBSは毎日交換しました。その後、クエン酸緩衝液（０．０８Ｍ、ｐＨ３．７）を用いてこの手順を繰り返した。続いて、腱を 0.1 M 酢酸中で 4 °C で 48 時間消化しました。酢酸で消化したコラーゲンをブレンダーでホモジナイズし、懸濁液を最大速度（約46,000×g）で1時間超遠心分離して、組織残骸を除去しました。 I 型コラーゲンを含む上清を凍結乾燥し、-20 °C で保存しました。 3D コラーゲン足場の調製のためのコラーゲン溶液は、凍結乾燥したコラーゲンを 0.02 M 酢酸に 4 °C で少なくとも 5 日間溶解して 5 mg/ml の濃度になるように調製し、保存溶液として 4 °C で保存しました。最長1ヶ月。

細胞を含む 3D コラーゲン足場を次のように調製しました。 600μlのコラーゲン原液（5mg/ml）を、290μlの培養培地、10μlの重炭酸ナトリウム（Merck KGaA）および氷上の培地中の100μlの細胞懸濁液と適切に混合した。細胞を含むコラーゲン懸濁液0.5mlを24ウェルプレートに播種した。最終コラーゲン濃度は 3 mg/ml で、播種された最終細胞数は 10,000 でした。 125,000; 0.5 ml あたり 250,000 個および 375,000 個の細胞。均一に分布した細胞を含むコラーゲン懸濁液0.5mlを24ウェルプレートに播種した。重合は、37 °C、5% CO2、加湿雰囲気下で 20 分後に起こりました。 pH が酸性から中性に変化し、37 °C になると、コラーゲンが重合して自己集合してゲルになります。コラーゲン重合後、0.5mlの培地をヒドロゲルの上部に注意深く加えた。培地は週に 2 ～ 3 回交換しました。

調製の翌日、細胞を播種したコラーゲン足場（10,000 細胞/足場の場合は N = 25、125,000 細胞/足場の場合は N = 19、250,000 細胞/足場の場合は N = 17、375,000 細胞/足場の場合は N = 7）を固定しました。 4% パラホルムアルデヒド (Merck KGaA) で 30 分間。ＰＢＳで洗浄した後、コラーゲン足場を０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ＭｅｒｃｋＫＧａＡ）中で３０分間、続いて５％ＢＳＡ（ＭｅｒｃｋＫＧａＡ）中で３０分間維持した。コラーゲン足場内のNHDFの核をDAPI (1:1000)により暗所、室温で10分間染色した。細胞を播種したコラーゲン足場の光学的切片化のプロセスは次のとおりです。 9 本の Z 軸カラムは、各コラーゲン足場の XYZ 軸を通って配置されました (図 2)。カラムには、各スタック間の距離が 0.02 mm の 30 個の分離された Z スタックが含まれており、各カラムの総体積は 1.4 mm3 = 1.4 μl でした。したがって、9 本のカラムすべての総体積は 12.6 mm3 でした。 9 つのカラムのサンプリングの平均分散係数 (CV) は 9 ～ 20% の範囲であり、DNA 含有量の CV および Bürker 法 (補足表 S1) および他の研究と同等です 10,11。各セクションの 2D 画像は Olympus UPlanFL N 10x/0.30 対物レンズで撮影し、列の写真は VisiView® ソフトウェアで画像シーケンス (*.stk ファイル) として保存しました。細胞数は、コラーゲン足場全体の体積に対して再計算されました。

FIJI-ImageJ ソフトウェア (米国ベセスダの国立衛生研究所) を使用してカラム内の細胞数をカウントし、光ディセクター原理 12 を使用してコラーゲン足場の総体積中の細胞数を各カラムから推定しました。スキーマの詳細については、補足図 S1 を参照してください。

取得後、まず画像をバッチ処理して、作業しやすくします。最初に提供される短いマクロ（補足マクロ S1）は、取得した画像を 8 ビット画像と最大強度 Z 投影に自動的に変換します（図 6a）。次の中間ステップでは、最初にかなりのユーザー入力が必要です (図 6b)。ここでは、トレーニングに基づいて画像をセグメント化する浅い機械学習アプローチを使用する FIJI の LABKIT13 プラグインを使用しました。トレーニングデータセットを生成するために、異なる細胞播種密度からの 6 つのサンプル画像 (ワークフローのステップ A で前処理) を連結しました。その後、ユーザーによるトレーニングが適用されて分類器が生成されました。この分類器は、ステップ A からの前処理されたすべての画像をバッチ処理し、セグメンテーションを生成するために使用されました。これらのセグメンテーションは、ワークフローのステップ C (図 6c) で分析されました。追加の短いマクロ (補足マクロ S2) を適用して、マスクをバッチ分析し、画像ごとに検出されたオブジェクトの数を報告しました。マクロは無償で適用し、一切の保証・保守を行っておりません。

2 つのマクロスクリプト (a、c) と中間 (b) の浅い機械学習ベースのステップで構成される自動ワークフローのスキーム。

コラーゲン足場の体積はアルキメデスの原理に従って推定されました。 0.1 mlの印を付けた5 mlメスシリンダーに、正確に3 mlのPBSを充填しました。各コラーゲン足場をＰＢＳとともにシリンダーに入れ、ＰＢＳの浮遊体積をシリンダースケールで読み取った。シリンダー内の増加した体積は、コラーゲン足場の体積に相当しました。

取得した画像シーケンス (XYZ 列) の細胞数を、細胞を播種したコラーゲン足場全体に対して再計算しました。つまり、1 つのコラーゲン足場内の細胞数を推定するために、9 つの画像シーケンス (つまり 9 列) からの細胞数を総コラーゲンに対して再計算しました。足場のボリューム。この計算は 9 つの列から実行され、値の平均が 1 つのコラーゲン足場の結果 (総細胞数) とみなされました。

NHDF を播種した培養皿をトリプシン処理し、新鮮な培地に再懸濁しました。細胞数の推定のために、懸濁液の一部をトリパンブルー (Merck KGaA) で希釈しました (5 回繰り返し)。細胞数の平均推定値は、さらなる希釈の初期細胞数として機能しました。

最初の細胞懸濁液から 5 × 0.5 ml (10,000、125,000、250,000、および 375,000 個の細胞を含む) を調製しました。これらの 0.5 ml の懸濁液から、その一部をトリパンブルーで希釈し、細胞数を推定しました。この計数は、2 人の独立した観察者によって 10 回繰り返して実行されました (各細胞播種密度の N = 10)。

細胞負荷コラーゲン足場（10,000 細胞/足場の場合は N = 4、125,000 細胞/足場の場合は N = 8、250,000 細胞/足場の場合は N = 9、375,000 細胞/足場の場合は N = 5）を 5.3 に従って調製しました。翌日、足場を PBS で洗浄し、-80 °C に置きました。分析当日、コラーゲン足場を解凍しました。

まず、リン酸緩衝ＥＤＴＡ（ＰＢＥ）中のプロテイナーゼＫ（０．２ｍｇ／ｍｌ；２．５ＤＭＣ－Ｕ／ｍｌ、Ｓｅｒｖａ、ハイデルベルク、ドイツ）を、細胞を含む足場に１：１の比率で添加した。次に、サンプルを 50 °C で 90 分間インキュベートしました。その後、消化されたサンプル流体をピペッティングによって均質化し、ボルテックスしました。 462 μl のサンプル液 (サンプル容量の半分) を新しいチューブに移し、17.6 μl の RNase A (1 mg/ml、Serva)、1 μl の EDTA (0.5 M、Thermo Fisher Scientific)、および 20 μl の NaCl を加えました。 -Tris-EDTA (TE) 緩衝液 (50 × TE 緩衝液で希釈したサンプルあたり 10.5 mg NaCl) を加え、室温で 1 時間インキュベートしました。 RNAse 処理したサンプル流体を黒色の 96 ウェルプレート (100 μl/ウェル) に移し、TE バッファー中の CyQuant 溶液 (Thermo Fisher Scientific) 50 μl を添加しました (TE バッファーの最終濃度 1 ×、CyQuant:TE バッファー 1:200) ）。サンプルを室温でインキュベートし、10分間遮光し、時々振とうしました。蛍光シグナルをマイクロプレートリーダー（Synergy HT、Biotek、Winooski、バーモント州）により520 nm/480 nmで測定し、CyQuant製造パンフレットに従って調製されたDNA標準と相関させた。

細胞を播種したコラーゲン足場中の DNA 含有量を、通常プレート上に播種した細胞から作成した細胞数検量線に従って細胞数に再計算しました。

データは R 統計ソフトウェア 14 を使用して分析されました。データ視覚化には R パッケージ「beeswarm」15 および「vioplot」16 が使用されました。

精度は以下を使用して比較されました: (i) 理論値からのバイアス。StereoCount および DNA 含有量推定器からの平均推定値が Bürker の参照方法とどの程度異なるかを示します。次に、分散を反映する 2 つの測定値を使用し、潜在的なバイアスを無視して、Bürker 法と他の方法の有意義な比較を可能にしました。これらは、(ii) [グループ固有の] 平均からの偏差、および (iii) 平均からの二乗偏差です。最後に、他の 2 つの測定値は、方法の全体的な精度を示し、偏りと分散の両方を反映しています：（iv）理論値からの偏差と（v）理論値からの二乗偏差（図 3）。

これら 5 つの精度の尺度はすべて、当初、一般化最小二乗 (GLS) を使用し、推定器固有の分散を可能にする分散関数を「nlme」パッケージを使用して比較されました17。二乗偏差のモデルは標準化残差の非正規分布を示したので（ヒストグラムと QQ プロットを使用し、シャピロ・ウィルク検定によって視覚的に確認）、ガンマ分布と対数リンク（ガンマ GLM）を備えた一般化線形モデルを使用して再解析されました。

各モデルでは、上記の 5 つの尺度の 1 つが結果 (応答変数) を表し、方法のタイプが予測子 (説明変数) を表します。 P 値 (両側) は、5000 個のモンテカルロランダム化を使用した、以前に示したスクリプト 18 に従って、順列 t 検定 (バイアスおよび絶対偏差) または順列ガンマ GLM (二乗偏差) に基づいていました。順列アプローチが選択されたのは、たとえサンプルサイズが小さく、完全なパラメトリック手法（残差の正規分布を含む）の仮定が満たされない場合でも、統計的有意性を確実に推定できるためです19。特に単一比較 (StereoCount 対 DNA 含有量) に重点を置いたため、多重比較では P 値は補正されませんでした。また、エフェクトサイズの 95% 信頼区間は GLS モデルとガンマ GLM モデルから導出されました。

現在の研究中に生成されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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