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Oct 16, 2023

ゲノム

Genetica della natura, volume 55,

Nature Genetics volume 55、pages 54–65 (2023)この記事を引用

9838 アクセス

2 引用

67 オルトメトリック

メトリクスの詳細

複雑な疾患の遺伝的関連シグナルを媒介する遺伝子とプロセスの同定は、大きな課題です。 2 型糖尿病 (T2D) の遺伝シグナルの多くは膵島細胞の機能不全を通じて影響を与えるため、我々はヒト膵臓ベータ細​​胞株でゲノムワイドにプールされた CRISPR 機能喪失スクリーニングを実施しました。 私たちは、ベータ細胞機能の疾患に関連した情報としてインスリン含有量の調節を評価し、この表現型に影響を与える 580 個の遺伝子を同定しました。 遺伝的およびゲノムデータとの統合により、オートファジー受容体 CALCOCO2 を含む 20 個の候補 T2D エフェクター転写物に対する実験的裏付けが提供されました。 CALCOCO2 の損失は、ミトコンドリアの歪み、プロインスリンを含む未熟な顆粒の減少、および後期オートファジー阻害時のオートファゴソームの蓄積と関連していました。 CALCOCO2 遺伝子座における T2D 関連変異体のキャリアは、さらにインスリン分泌の変化を示しました。 私たちの研究は、細胞スクリーニングが既存のマルチオミクスの取り組みをどのように強化して、機構の理解を支援し、ゲノムワイド関連研究遺伝子座における因果効果の証拠を提供できるかを強調しています。

ゲノムワイド関連研究 (GWAS) は、2 型糖尿病 (T2D) および関連形質との何千もの強力な関連性を明らかにしていますが、そのほとんどは、おそらく調節機能を持つ非コード領域にマッピングされています 1。 詳細なマッピングが不完全であるということは、ほとんどの GWAS 遺伝子座が単一の原因となる変異ではなく、信頼できるセット内の複数の変異にマッピングされており、そのそれぞれが異なる細胞状況における遺伝子発現に影響を与える可能性があることを意味します。 詳細なマッピング後の典型的なステップには、シス発現量的形質遺伝子座 (eQTL) の共局在化、単一細胞クロマチンの同時アクセス性、DNA 近接アッセイなどの方法を使用して、原因と推定される変異体と調節要素をそれらが調節する遺伝子に結び付けることが含まれます 2,3 、4、5。 これらのアプローチの限界は、細胞の種類と状況の依存性 (不適切な細胞の種類または状態で行われたアッセイでは、疾患の病因に関係のない変異体と遺伝子の関連が明らかになる可能性がある) と分子の多面発現性 (目的の変異体が細胞内のいくつかの遺伝子の転写を調節する可能性がある) です。 cis、原因となる転写物の正体を不明瞭にする）。 これらのアプローチは、候補エフェクターに関する仮説を生成できますが、通常は決定的な証拠を提供することはできません。

摂動研究は、因果関係のより説得力のある証拠を提供できますが、これは本物のモデルと疾患に関連した表現型を使用した場合に限られます6。 最も強力な証拠は、ヒトにおける遺伝子およびタンパク質の機能の混乱の結果を読み取る疾患関連のコード変異から得られますが、そのような変異のほとんどは頻度が低いため、このアプローチは制限されます2。 ヒト細胞モデルと CRISPR ベースの技術は、遺伝子摂動の表現型への影響についてゲノム規模のプロファイルを生成し、疾患生物学を理解するための魅力的な代替手段を提供します6。 この願望の中心となるのは、ある細胞型の疾患との関連性に対する確信です。 T2D に関しては、生理学的証拠とエピゲノム証拠の両方が、疾患リスクの媒介における膵島、ひいてはインスリン産生ベータ細胞の中心的な役割を強調しています 3,4,5,6,7。 げっ歯類とヒトの膵島またはベータ細胞の間には大きな違いがあるため、ヒトの組織および細胞株を使用することが主張されています8、9、10、11、12、13。 私たちと他の研究者は、この重要なヒト組織において大規模なトランスクリプトームおよびエピゲノムリソースを生成し、T2D GWAS 遺伝子座における候補エフェクター転写物を同定するための遺伝子およびゲノムデータのゲノム規模の統合を可能にしました4,7,14,15。 私たちは現在、これらのリソースを、十分に特徴付けられているヒト膵臓ベータ細​​胞株EndoC-βH1におけるゲノムワイドCRISPR機能喪失（LoF）スクリーニングで補完し、インスリン含有量を調節する遺伝子を同定しています16、17、18。 不死化EndoC-βH1細胞株は、細胞株の胎児由来および形質転換起源を強調する明確な特徴を備えているにもかかわらず、初代ヒトβ細胞と同様のマルチオームサインを示します18、19。 インスリン含有量は初代島に比べて低いですが、EndoC-βH1 細胞は同様の電気生理学的および分泌特性を示し、in vitro でのベータ細胞機能を研究するための生理学的に適切なモデルとなっています 17,20,21,22。

ヒトベータ細胞株におけるこのゲノムワイドCRISPRスクリーニングは、ベータ細胞機能の調節因子としての580個の遺伝子に関する細胞的証拠を提供し、T2D遺伝子座における20個の遺伝子の疾患に関連し、おそらく原因となる役割を裏付け、オートファジー受容体CALCOCO2がベータ細胞機能の調節因子であることを同定した。ヒトのベータ細胞の機能。 我々は、CALCOCO2の糖尿病リスク対立遺伝子の保有者がインスリン分泌を変化させ、ヒトβ細胞におけるCALCOCO2の喪失がオートファジー媒介のインスリン顆粒恒常性の変化を引き起こすことを実証する。

グルコース刺激によるインスリン分泌はベータ細胞機能の主な尺度ですが、分泌されたインスリンはその細胞源と関連付けることができないため、プールされたハイスループットスクリーニングには不適切な表現型の読み取りとなります。 ただし、インスリン分泌とは異なり、細胞内のインスリン含有量は、蛍光活性化セルソーティング (FACS) を使用して定量化できます。 インスリン含量の変化は、T2D リスク対立遺伝子が発現および/または機能の低下を引き起こし、PAM 発現の低下がインスリン含量の低下またはTCF7L2 については、T2D の最も強いリスクを媒介する遺伝子座であり、リスク対立遺伝子の保因者におけるインスリン含量の減少によるインスリン産生のマスター調節因子です 23,24,25。

FACS読み出しを使用して、レンチウイルスゲノムワイドCRISPRライブラリーによる単一遺伝子ノックアウト（KO）の導入に基づいて、ヒト膵臓ベータ細​​胞株EndoC-βH1にプールされたCRISPR LoFスクリーニングパイプラインを設計しました（図1a）。 細胞は、低レベルまたは高レベルの細胞内インスリンを含む集団に分類され、安定して組み込まれた sgRNA が次世代シーケンスによって同定されました。

a、EndoC-βH1 におけるゲノムワイド CRISPR LoF スクリーニングのパイプライン。ウイルス導入 (左) から抗生物質選択 (中央)、最終 FACS 選択、その後の配列決定および組み込まれた sgRNA の濃縮分析 (右) までです。 b、c、個々のプロット（b）またはヒストグラムオーバーレイ（c）としての、INSサイレンシングされたEndoC-βH1（siINS、青色）またはそれぞれの非ターゲティングコントロール（siNT、ピンク）における細胞内インスリンのFACS染色。 d、e、INSの関連mRNA発現（d）およびalphaLISAで測定した細胞内インスリンの対応するレベル（e）。 f、g、ヒト胎児腎臓細胞株 HEK293T のインスリン抗体 (青) またはアイソタイプ コントロール (ピンク) を個々のプロット (f) またはヒストグラム オーバーレイ (g) として使用した FACS 染色。 h. EV コントロール細胞と並行して 3 つの遺伝子 (NMS、INS、および PAM) のみをターゲットとする EndoC-βH1 における小規模 CRISPR スクリーニングのパイプライン。 低インスリンの FACS ソーティング ゲート (破線) は、並行して形質導入されたコントロール細胞に基づいて決定されました。 sgRNA 濃縮は、INShigh と比較して INSlow で評価されました。 i、j、EVコントロール細胞（ピンク）と小規模CRISPRスクリーンからの細胞（青）のインスリン染色を個別のプロット（i）またはオーバーレイ（j）として比較したEndoC-βH1のFACS染色。 それぞれのボックスはソート ゲート INSlow および INShigh を示します。 k、コントロール (灰色) サンプルおよびポジティブコントロール (INS および PAM、紫とピンク) からの INShigh と比較した、INSlow でのすべての個々の sgRNA の sgRNA 濃縮。 箱ひげ図は最小値から最大値までを示し、中心線は中央値を表します。 すべてのデータは 2 回 (i-k) または 3 回の独立した実験からの平均値 ± sem であり、代表的な FACS プロットがそれぞれのサイレンシング効率とともに示されています。 データは 2 サンプル t 検定によって分析されました (e)。 有意性のグラフ表示がない場合は、結果が有意ではないことを示します。 NT、ノンターゲティング。 log2(FC)、log2(倍数変化); EV、空のベクトル。 SSC-A、側方散乱領域。

EndoC-βH1 の FACS ベースのインスリン含有量の読み出しが高度に特異的かつ高感度であることを確認するために、いくつかの相補的な戦略の比較に基づいて抗体とプロトコルを選択しました (拡張データ図 1)。 EndoC-βH1 における INS のほぼ完全な siRNA ベースのノックダウンにより、異なる平均蛍光強度を持つ 2 つの集団が得られ、感度が検証されました（図 1b–d）。 分離レベルは、インスリン含有量の独立した alphaLISA 定量化と一致しており、残留タンパク質が約 46% であることが示されました（図 1e）。 抗体の特異性は、INS非発現ヒト細胞株HEK293Tで確認されました（図1f、g）。 最後に、欠失によりインスリン含有量の減少を誘導することが知られているポジティブコントロール遺伝子 INS および PAM、および EndoC-βH1 では発現されないネガティブコントロールである NMS を含む 3 つの遺伝子を小規模スクリーニングで標的とすることにより、スクリーニング プロトコールが検証されました (参考文献23) (図1h)。 Cas9のみをコードする空のベクター（EV）コントロールと比較して、細胞はINS FACSシグナルの減少と、INSlow集団内のINSおよびPAM sgRNAの濃縮を示しましたが、NMSを標的とするsgRNAには差がありませんでした（図1i〜k）。 以前に示されたインスリン含有量に対する影響が弱いことと一致して、PAM を標的とする sgRNA は、INS を標的とする sgRNA と比較して再現性は高いものの濃縮度が低いことが示され、ゲノムワイドなスクリーニングに対するパイプラインの適合性が確認されました 23。

われわれは、遺伝子ごとに 4 つの sgRNA を備えた 18,053 個のタンパク質コードヒト遺伝子をターゲットとする Toronto KnockOut バージョン 3.0 (TKOv3) CRISPR ライブラリを使用して、ヒト ベータ細胞株 EndoC-βH1 で 2 回の独立したゲノムワイド スクリーニングを実行しました 26。 複製ごとに、最低 6 億 7,000 万個の細胞が、sgRNA あたり約 500 個の細胞をカバーする低感染多重度 (MOI) でレンチウイルス形質導入されました (図 1a)。 対照と比較して、スクリーニング細胞は、FACSにおいて特に低インスリンに向けてより広いインスリンシグナル分布を示し、これはCRISPR KO媒介効果によるインスリン含有量の変化を示しています（図2a、bおよび拡張データ図2）。 インスリン含有量が低い細胞集団 (INSlow) と高い細胞集団 (INShigh) の 2 つの細胞集団を収集し、続いて sgRNA の増幅と配列決定を行いました (拡張データ図 3)。 MAGeCK アルゴリズムを使用して sgRNA の存在量を比較し、INShigh 細胞と比較して INSlow 細胞で sgRNA が豊富であるか枯渇しているかを特定しました 27。 濃縮された sgRNA は、遺伝子 KO 時のインスリン含量の減少につながる正の制御因子遺伝子を特定し、枯渇した sgRNA は、遺伝子 KO 時のインスリン含量の増加に関連する負の制御因子を特定します。 偽陽性ヒットの数を減らすために、sgRNA が反復にわたって一貫した効果を示し、両方の独立したスクリーニング反復で 4 つの sgRNA のうち少なくとも 2 つについて閾値 (FDR < 0.1) を満たした場合にのみ、遺伝子をスクリーニング ヒットとして分類しました。 合計 580 個の遺伝子がこれらの厳しい基準を満たしており、これらを堅牢で再現性のあるスクリーニング ヒットとみなして、さらなる評価のために進めました (補足表 1)。

a、b、CRISPRスクリーニングライブラリで形質導入したEndoC-βH1の細胞内インスリンのFACS染色を、EVウイルスで形質導入した細胞またはアイソタイプ一致抗体で染色した細胞と比較して、個別のプロット（a）およびヒストグラムの重ね合わせ（b）として示します。 c、低インスリン含有量から高インスリン含有量のスクリーニングサンプルへのsgRNA数の変化。各色は、INSおよびNKX2-2の2つのスクリーニング反復にわたる同じsgRNAを表します(それぞれlog2(FC)1.06および1.21)。 黒い破線は、この遺伝子の sgRNA 数の中央値を表します。 d、LacZ、EGFPおよびルシフェラーゼを標的とするコントロールsgRNA（灰色）と比較した、すべてのsgRNA（青色）のlog2（FC）のsgRNA分布。 黒い線は、各グループの中央値を示します。 e、各スクリーニング内の log2(FC) の sgRNA 分布は、目的の特定の sgRNA (遺伝子あたり 4 つ) を遺伝子ごとに個別の色で強調表示して複製され、全体の sgRNA 分布は明るい灰色で示されます。 f、対象となる個々の遺伝子と複製ごとのそれぞれの sgRNA。色の範囲は、FDR に基づいて有意ではない (白) から非常に有意である (濃い青) までの範囲にあり、したがって、INSlow と INShigh の間で有意な sgRNA の濃縮または減少を表します。 上のパネルの INS (+) および NMS (-) は、それぞれポジティブおよびネガティブコントロール遺伝子を表します。 データは 2 つの独立したゲノムワイド CRISPR スクリーニング反復からのもので、スクリーニング FDR 値は MAGeCK (e、f) を使用して、または 2 サンプル t 検定 (d) を通じて決定されました。 log2(FC)、log2(倍数変化); EV、空のベクトル。

これらのヒットの生物学的関連性を評価するために、我々は、インスリン制御とベータ細胞機能に関与することが知られている遺伝子をスクリーニングで特定できるかどうかを調べました。 INSを標的とするsgRNAはINSlow集団に濃縮されており、スクリーニングの感度が確認されました（図2c、e、f）。 4つのsgRNAのうち3つだけが効果を誘導したため、INSの全体的な濃縮は、他の既知のインスリン分泌調節因子よりも低かった（図2c、f）。 NKX2.2、SLC2A2、PPP1R15B、IGF2など、ベータ細胞機能の他の確立された調節因子および単遺伝子性糖尿病またはT2Dリスクに関与する遺伝子がスクリーニングヒットの中で同定されました（図2c、e、f）28、29、30、31。 、32、33、34、35。 非ターゲティング対照sgRNAは、インスリン含有量に影響を与えませんでした（図2d）。 インスリン含有量の直接的な調節因子に加えて、このスクリーニングでは、表現型に間接的な影響を与える転写および翻訳の複数の一般的な調節因子も同定され（図2f）、それらはすべて、より長い培養期間を伴うCRISPRスクリーニングにおいて共通の必須遺伝子として分類された36,37。 38.

次に、スクリーニングヒットが、インスリン含有量の調節に関与する機能分類に関して豊富であるかどうかを検討した。 遺伝子オントロジー（GO）用語と京都遺伝子・ゲノム百科事典（KEGG）経路分析により、総細胞内タンパク質レベルの変更と一致するインスリンおよびベータ細胞の機能関連カテゴリーおよび転写および翻訳関連カテゴリーが強調されました（図3a）39,40。 。 STRINGタンパク質ネットワーク分析は、いくつかの独立した接続を持つ中心ノードとしてのスクリーン内のINSの基本的な役割をさらに強調しました（図3b）41。 スクリーニングヒットは共有タンパク質ネットワークについて大幅に濃縮されており、相互に関連する複合体を同定する感度にさらなる信頼性が得られました（図3cおよび拡張データ図4）。 多くのヒットは、ユビキチン媒介タンパク質分解とオートファジー、ミトコンドリア ATP 合成、小胞輸送とエキソサイトーシス、GPCR シグナル伝達、脂質代謝、MAPK シグナル伝達経路の機能カテゴリーにマッピングされており、それらのすべてに、これまで知られていなかったインスリン含有量の調節因子と既知の調節因子の両方が含まれています。インスリン分泌またはベータ細胞機能における役割。

a、生物学的プロセスの KEGG 経路または GO 用語を評価するパスウェイエンリッチメント分析。 選択された経路が、P 値によってランク付けされて表示されます。 b、c、INSと他のスクリーニングヒットの間の物理的および機能的相互作用を含むタンパク質間相互作用を示すSTRING経路分析（b）、および機能的に関連したグループにクラスター化されたスクリーニングヒットの場合（c）。

次に、我々は細胞スクリーニングを相補的摂動証拠として使用して、T2D 遺伝子座におけるエフェクター遺伝子の割り当てを裏付けることを試みました。 私たちは、T2D の遺伝的関連結果と遺伝的およびゲノムデータの多様な情報源を組み合わせて、T2D に最も影響を与える可能性が最も高い「エフェクター」遺伝子のリストを作成するために開発された 3 つの相補的なアプローチ (https://t2d.hugeamp.org) を適用しました。遺伝的関連を仲介します42、43、44、45。 3 つの方法からのマージされたエフェクター遺伝子の割り当てにより、T2D 遺伝子座における 336 個の候補エフェクター転写物のリストが生成されましたが、3 つの方法すべてで同定された候補はありませんでした。 このリストと一連のスクリーニングヒットとの交差により、我々のスクリーニングにより疾患関連表現型における役割の生物学的証拠が得られた20個の遺伝子(補足表2)が得られた。 これら 20 個の遺伝子のうち、5 個 (25%) の遺伝子が厳選されたヒューリスティック エフェクター遺伝子予測法によって「原因」として割り当てられ、さらに 4 個 (20%) の遺伝子が強力、中程度、および可能性の間に割り当てられます。

エフェクター転写物の優先順位付けに関して一般的に適用される他のアプローチと比較して、我々の摂動スクリーニングがどのように機能したかを比較するために、我々は、420 ​​人のヒト膵島ドナーを対象とした、これまでで最大ではあるが比較的控えめではあるが eQTL 研究を調査しました 15。 この研究では、T2D GWAS と膵島 cis-eQTL シグナル間の共局在が 20 座位で 2 つの方法によってサポートされ、いずれかのアプローチのみで共局在に関する統計的サポートが必要な場合は 39 座位まで増加しました。 両方のアプローチ（CRISPRスクリーンとeQTL）で同様の数の遺伝子が同定されましたが、それらの間に共通する遺伝子はなく、膵島eQTLがインスリン含有量の減少を引き起こす可能性は低く、追加の細胞表現型（たとえば、インスリン分泌）がそれらの影響の根底にある可能性があることを示唆しています。 これらの観察は、最適なエフェクター遺伝子の優先順位付けのための複数のアプローチの包含を裏付けており、さらなるシグナルを検出するための大規模な eQTL 研究と、関連する細胞型にわたる追加の細胞表現型についての標的化および/またはゲノム規模のスクリーニングの拡大の両方を促進します。

我々は、ヒトベータ細胞におけるその役割が調査されていないため、予測された20のエフェクター遺伝子のうちの1つであるCALCOCO2に追跡調査を集中させ、スクリーニングヒットとなった（図4a）14、46、47、48、49。 CALCOCO2 は、分解ターゲットをオートファジー機構に結び付けることで、選択的オートファジーにおいて重要な役割を果たします 50,51。 これまでのところ、侵入した病原体に対するオートファジー（ゼノファジー）と損傷したミトコンドリア（マイトファジー）を開始することが示されています50、51、52。 CALCOCO2 は、通常、遺伝子 TTLL6 にちなんで命名される T2D GWAS 遺伝子座にマッピングされます。この遺伝子座では、詳細なマッピングにより、信頼できるセット内の複数の遺伝子と 118 個の変異体を含む約 177 kb の領域にシグナルが分解されています。 CALCOCO2 内の独立したコード変異シグナル (rs10278、p.Pro347Ala) は、CALCOCO2 がエフェクター転写物として細心の注意を払うに値することを示唆しています 5。 生理学的クラスタリングにより、この遺伝子座がベータ細胞機能の調節を通じて疾患リスクに主な影響を及ぼしている可能性が高いことが明らかになりました5。 この CRISPR スクリーニングでは、CALCOCO2 の KO によりインスリン含有量が減少しました (図 4b)。 この遺伝子座の他の遺伝子はいずれもスクリーニングにおけるインスリン含量に影響を示さず、さらに、CALCOCO2 がエフェクター転写物である可能性が高いことを裏付けています (拡張データ図 5)。

a、スクリーニングヒットとしても同定されている、T2Dエフェクター転写物としての証拠が低い遺伝子を評価する遺伝子優先順位付けアプローチ(統合アプローチで概説したとおり)は、CALCOCO2を強調しました。 b. 低インスリン含量サンプルから高インスリン含量サンプルへの sgRNA カウントの変化。各色は 2 つの画面の複製で同じ sgRNA を表します。 黒い破線は、この遺伝子の sgRNA 数の中央値を表します (log2(FC): 1.08)。 c〜n、すべてのデータは、非ターゲティング対照細胞と比較したsiCALCOCO2処理EndoC-βH1からのものです。 c、CALCOCO2のmRNA発現（P = 0.0002）。 d、CALCOCO2のタンパク質レベルとその負荷制御GAPDH。 e、GAPDHおよびsiNT対照細胞に対して正規化されたCALCOCO2ウェスタンブロットデータの定量化（P = 0.0008）。 f、細胞数の測定。 g、alphaLISAで測定した、20,000細胞あたりのインスリン含有量（pg）（P = 0.0166）。 h、インスリンのタンパク質レベルとその負荷制御GAPDH。 この抗体はインスリン前駆体も検出しますが、成熟インスリンと比較して弱いシグナルしか与えません。 i、インスリンの定量化およびGAPDHおよびsiNT対照細胞に対して正規化されたウェスタンブロットデータ(P = 0.0015)。 j、INSのmRNA発現。 k、m、1 mM、20 mM、1 mM + 100 μM トルブタミドまたは 20 mM グルコース + 100 における siNT (k; P = 0.0051、0.0336、0.0282 および 0.0152)、またはインスリン含量および siNT (m) に対して正規化されたインスリン分泌μM ジアゾキシド。 l、n、siNT (l) またはインスリン含量とsiNT (n) に対して正規化された、1 ～ 20 mM グルコースのインスリン分泌倍率変化。 タンパク質レベルは siNT のパーセンテージとして表示され、100% の点線で強調表示されます。 すべてのデータは、3 回 (c、e、i、j、m、n)、4 回 (f)、6 回 (k、l) または 12 回 (g) の独立した実験からの平均値 ± 標準誤差です。 データは、2 サンプル t 検定 (c)、1 サンプル t 検定 (e、i、)、一元配置 (f、g、j、l、n) または二元配置 (k、m) 分散分析を使用して分析されました。 Sidak の多重比較検定。 有意性のグラフ表示がない場合は、結果が有意ではないことを示します。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。 FC、フォールドチェンジ。 NT、ノンターゲティング。

ソースデータ

我々は、EndoC-βH1 における siRNA ベースのノックダウンによる CALCOCO2 損失の影響について独立した確認を得ました。 CALCOCO2 のサイレンシングは非常に効率的で、平均 mRNA とタンパク質の 78.1% と 80.0% の減少を誘導しました (図 4c-e および拡張データ図 7)。 細胞生存率は影響を受けませんでした (図 4f)。 細胞内のインスリン含有量は、2 つの独立した抗体ベースの検出方法を使用して評価されました。 CRISPRスクリーンの感度を強調すると、alphaLISAとウェスタンブロットで測定した場合、CALCOCO2サイレンシング細胞ではインスリン含有量がそれぞれ24.0％と38.0％大幅に減少しました（図4g-i）。 この効果は、siRNA サイレンシングを防ぐサイレント変異を含む CALCOCO2 の過剰発現によって救済される可能性があります (拡張データ図 5)。 インスリン含有量の減少は、インスリン遺伝子発現の減少によるものではありませんでした（図4j）。

このスクリーニングがベータ細胞機能を調節する T2D 関連遺伝子を正確に同定したことを確認するために、スクリーニングヒットとして同定されなかった、T2D の原因であると予測される追加の遺伝子を調べました (拡張データ図 6)43。 QSER1 および PLCB3 には、T2D における因果的役割と一致するコード変異体が含まれていますが、影響メカニズムまたは作用組織は未解決です 5,53。 我々のネガティブスクリーニング結果と一致して、いずれの遺伝子のsiRNAノックダウンも細胞内のインスリン含量またはインスリン分泌に影響を与えなかった。 併せて、このゲノムワイドな CRISPR スクリーニングにより、膵島細胞の発生 (QSER1) またはインスリン作用 (PLCB3) に関連すると思われる他の表現型を区別しながら、CALCOCO2 のインスリン調節機能を同定することができました。

我々は、インスリン含有量がCALCOCO2の喪失により減少することを示した一方で、グルコース刺激によるインスリン分泌の変化をインスリン含有量の変化に基づいて結論付けることはできない。 したがって、我々は、インスリン分泌に対する CALCOCO2 ノックダウンの影響を独自に評価しました。 平均して、インスリン分泌は、CALCOCO2 のサイレンシングにより 39.3% 大幅に減少しました (図 4k)。 しかしながら、低グルコースから高グルコースまでのグルコース刺激指数は変化せず、グルコース濃度の変化に対する適切な応答を示した(図4l)。 インスリン含量に対する正規化により、CALCOCO2 サイレンシング細胞とコントロール間の差は 30.2% に減少しました。 正規化時にインスリン分泌レベルがベースラインに達しなかったとしても、その効果は統計的に有意ではなく、総インスリン分泌量の減少の根本的な原因としてインスリン含有量の減少が強調されました（図4m、n）。

私たちは研究を拡張して、初代ヒト膵島におけるCALCOCO2機能を評価しました。 ヒト膵臓切片における免疫蛍光研究により、タンパク質の発現とベータ細胞の細胞質への局在が確認されました（図5aおよび拡張データ図7）。 CALCOCO2 損失の影響が in vitro モデルやベータ細胞を超えて再現できるかどうかを確認するために、初代ヒト膵島で shRNA ノックダウンを実行しました。 膵島を分散させ、CALCOCO2（shCALCOCO2）を標的とするshRNAを形質導入し、偽膵島に再凝集させた（図5b）。 偽膵島の形質導入の成功は、緑色蛍光タンパク質（GFP）の共発現を評価することによって確認されました（図5c）。 CALCOCO2発現は、非標的対照shRNA（shNT；図5d）と比較して、平均して54.0％減少した。 EndoC-βH1の結果と一致して、細胞内インスリンは15.7％という控えめだが一貫した減少を示しました（図5e）。 偽膵島における細胞内インスリンの減少はEndoC-βH1よりも低かったが、達成されたサイレンシング効率に正規化すると、細胞株と初代ヒト組織の両方で同程度に減少し、CALCOCO2レベルと機能との関係が裏付けられた。 しかし、偽膵島は、インスリン分泌に大きな影響を与えることを示さなかった（図５ｆ、ｇ）。 高グルコースと分泌増強剤IBMXによる刺激により、shCALCOCO2の含有量が正規化されると、インスリンの分泌が増加しました。 この効果はゲノム DNA への正規化により失われるため、分泌に対するインスリン含有量の変化の影響を反映しています。 同様に、グルカゴンの含有量と分泌を評価して、アルファ細胞におけるCALCOCO2の潜在的な効果を特定しました（図5h–j）。 shCALCOCO2 は、グルカゴン分泌が鈍化する傾向を示しましたが、分泌状態やグルカゴン含有量には大きな変化はありませんでした。 まとめると、我々の発見は、CALCOCO2 がヒトベータ細胞のインスリン含有量の調節に重要な役割を果たしているということを示しています。

a、膵臓切片における初代ヒト島の免疫蛍光染色。 切片は、INS (緑色) と CALCOCO2 (赤色) で二重染色されました。 細胞核を DAPI (青) で対比染色しました。 スケールバーは10μmです。 b – j、すべてのデータは、非ターゲティング対照偽膵島（shNT）と比較したshCALCOCO2偽膵島からのものです。 b、初代ヒト膵島からの偽膵島形質導入および形成。 c、明視野下のshCALCOCO2擬膵島（上）およびGFP陽性擬膵島（下）。 スケールバーは100μmです。 d、CALCOCO2のmRNA発現。 e、h、細胞内インスリン (e) およびグルカゴン (h) 含有量。 f,g,i,j、2.8、5.6、16.7、または 16.7 の内容 (f,i) またはゲノム DNA (gDNA) (g,j) に対して正規化されたインスリン (f,g) またはグルカゴン (i,j) 分泌インスリン分泌には mM グルコース + IBMX、グルカゴン分泌には 7、1、1 mM グルコース + ε-アルギニンまたは KCl。 すべてのデータは、2 人の独立したドナーと 3 つの独立した免疫蛍光染色からの平均 ± SEM です。 ʟ-Arg、ʟ-アルギニン; FC、フォールドチェンジ。 NT、ノンターゲティング。

しかし、ヒトβ細胞におけるCALCOCO2によるインスリン含有量の調節の根底にある機構はまだ調査されていない。 siCALCOCO2 処理 EndoC-βH1 における mRNA 発現変化の公平な評価を行うために、RNA シーケンス (RNA-seq) を実行しました (補足表 5)。 CALCOCO2 のみが有意に差次的に発現していることが確認されており、インスリン含有量に対する主な転写後のメカニズムが示唆されています。 有意性閾値を下回っていますが、差次的に発現される遺伝子のリストにある次の 2 つの遺伝子 (B4GALT5 および GCNT1) はグリコシル化/O-グリカンプロセシングに関与しています (拡張データ図 8)。 グリコシル化はオートファジーの制御に関与しており、CALCOCO2 のオートファジー受容体としての役割が確立されていることから、インスリン含有量に対する CALCOCO2 の効果はオートファジーを介していると仮説を立てました 50,51,54,55,56,57。

免疫蛍光を使用して、EndoC-βH1 における CALCOCO2 の細胞局在を確立しましたが、インスリン小胞との共局在は示されませんでした (拡張データ図 7)。 次に、電子顕微鏡 (EM) を実行して、CALCOCO2 サイレンシング時の潜在的な細胞の超微細構造変化を評価しました。 プールされた測定値における総インスリン含有量の減少と一致して、CALCOCO2 サイレンシングによりインスリン小胞密度が大幅に減少しました（図 6a、b）。 成熟インスリン顆粒の割合は、対照細胞と比較して増加し、未熟で移行中の顆粒の減少が総インスリン含有量に対する影響を促進していることを示しました（図6a、c）。 これは、成熟顆粒密度が変化していないことからさらに確認されました（図6d）。 プールされた測定値は、細胞内プレインスリン/プロインスリン（プロインスリンと呼ばれる）がサイレンシング時に大幅に減少したため、構造EMデータを独立して裏付けました。この効果は、総インスリン含有量への正規化によって失われませんでした（図6e、f）。 酵素活性は評価されなかったが、インスリンプロセシングに関与する遺伝子（PCSK1、CPE、およびPCSK2）の発現は変化しなかったため、このプロインスリンの減少はインスリン成熟の変化によって媒介されなかった可能性が高い（拡張データ図8）。

a-l、siCALCOCO2 処理された EndoC-βH1 と siNT の比較。 a、未熟なインスリン顆粒（短い白い矢頭）、成熟した顆粒（長い白い矢頭）および空胞構造（黒/白の矢頭）を含む代表的な画像。 b、平方マイクロメートルあたりのインスリン顆粒の定量化 (P = 0.0137)。 c、細胞あたりの顆粒の総数に正規化された成熟インスリン顆粒の定量化（P < 0.0001）。 d、平方マイクロメートルに正規化された成熟インスリン顆粒の定量化。 e、プロインスリン (ELISA)、siNT に対して正規化 (P = 0.0033)。 f、総インスリン (ELISA) および siNT に対して正規化されたプロインスリン (P = 0.0081)。 g、拡大した代表的なEM画像（右上）、ミトコンドリア（白い矢印）および空胞構造（黒/白の矢印）。 h、ミトコンドリアの総数に対して正規化された、変化したミトコンドリアの定量化 (P = <0.0001)。 i、マイトファジー誘導剤FCCPの有無にかかわらず、低/高グルコースでインキュベートした後のATP測定。 j、siCALCOCO2 の拡大された空胞構造の代表的な画像。a および g では黒/白の矢印で強調表示されます。 k、バフィロマイシンA1（BafA1）またはDMSOで処理したLC3（左）およびINS（中央）の代表的な染色。 l、示されたLC3領域の高倍率（白いボックス）。 m–p、無傷の非糖尿病性初代ヒト島。 m,n、インスリン含量 (m) およびインスリン分泌 (n) におけるコード変異体 rs10278 (保護対立遺伝子 G) のキャリア (GC) およびコントロール (CC) 膵島。 P = 0.0029。 o、p、インスリン含有量（o）およびインスリン分泌（p）におけるGWASリードバリアントrs35895680（保護対立遺伝子C）に示された遺伝子型を持つ島。 P = 0.0004。 ボックスは、第 1 四分位数と第 3 四分位数の間の四分位範囲、中央値 (水平線)、および 10 パーセンタイルから 90 パーセンタイル (m-p) までのひげを示します。 すべてのデータは、3 回（a、g、i-l）または 4 回（e、f）の独立した実験からの平均±標準誤差です。 3 回の独立した実験と少なくとも 21 人のドナーにわたる 16 (b、d)、13 (c)、および 14 (h) siNT 細胞と 27 (c)、40 (b、d、h) siCALCOCO2 細胞 (補足表 6; m- p)。 サンプルサイズ（m、n）が小さいため、rs10278（GG）のホモ接合個体は分析されませんでした。 スケールバーは1μm（a、g）、0.25μm（j）、20μm（k）および10μm（l）です。 データは、2サンプルのt検定（b〜d、h）、二元配置分散分析シダックの多重比較検定（i、m〜p）、または1サンプルのt検定（e、f）を使用して分析されました。 有意性のグラフ表示がない場合は、結果が有意ではないことを示します。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。 NT、ノンターゲティング。

EM分析により、siCALCOCO2細胞ではミトコンドリア構造が歪んだクリスタと形状で劇的に変化し、オートファジーによる標的化前のミトコンドリアの分離または分裂の増加と一致していることが明らかになりました（図6g、h）58。 しかしながら、予想外なことに、ミトコンドリアATP産生はグルコース刺激による影響を受けなかった(図6i)。 マイトファジーを誘導するためのFCCP媒介ミトコンドリア脱分極の誘導により、siCALCOCO2細胞と対照細胞でATP産生が同等に減少し、機能的なマイトファジーが示されました（図6i）。 マイトファジーメディエーターPINK1およびPARKIN(PARK2)の発現レベルは影響を受けませんでした(拡張データ図8)。 総合すると、ミトコンドリア機能または外部から誘導されたマイトファジーが CALCOCO2 サイレンシングに影響を与える兆候はありませんでした。 さらに、siCALCOCO2でサイレンシングされたEndoC-βH1は、細胞成分の残存物を多く含む空胞化構造の蓄積を示し、分解に基づくメカニズムの変化を強調しました（図6j）。

次に、この未熟顆粒とプロインスリンの減少がオートファジーに対する CALCOCO2 の効果によって媒介されるかどうかを評価しました。 オートファジーは非常に動的であり、オートファジーフラックスの振幅を正確に測定するには人為的にブロックする必要があります59。 オートファゴソームとリソソームの融合とリソソーム分解を防ぐリソソーム阻害剤バフィロマイシン A1 (BafA1) と EndoC-βH1 をインキュベートし、オートファゴソームの代表である LC3 陽性涙点を評価しました。 LC3陽性構造の形成は両方の条件で著しく増加しましたが、蓄積はCALCOCO2サイレンシング細胞でより顕著でした（図6k、l）。 LC3陽性オートファゴソームとインスリン含有顆粒の共局在は、CALCOCO2喪失時のインスリン顆粒のオートファジー媒介減少をさらに裏付けた（図6k）。 さらに、プロテアソーム阻害剤MG132はプロインスリン含有量を回復しなかったため、インスリン顆粒とプロインスリンの減少はユビキチン-プロテアソーム系によって媒介されないことを確認しました（拡張データ図8）。

我々の結果は、CALCOCO2 がインスリン顆粒恒常性の調節因子であり、オートファジーに基づくプロインスリンおよび未熟顆粒の減少を通じて、総インスリン含有量に対する観察された効果を媒介することを示しています。

CALCOCO2がインスリン含量の調節因子であることを同定したので、我々は次に、CALCOCO2遺伝子座におけるT2Dリスク対立遺伝子の保有者が、この遺伝子座におけるエフェクター転写物としてのCALCOCO2をサポートする類似の分泌表現型を示すかどうかを調べた。 CALCOCO2遺伝子座の2つの独立したT2D関連シグナルで、遺伝子型ごとに層別化した非糖尿病臓器提供者からの無傷の初代膵島におけるインスリン含有量と分泌を評価しました（補足表6）。 われわれは、エクソームアレイ研究で同定された原因と思われるコード変異体（rs10278）と、T2D関連遺伝子座（rs35895680）における99％の信頼できる大規模なセット（118個の変異体）から主要なGWAS変異体を選択した。 rs10278 バリアントは、ヒト膵島の主要アイソフォーム (NM_005831) を含む、ほとんどのアイソフォームのコドン 347 でプロリンがアラニンに置換されると予測されています5。 T2Dのリスク低下に関連するその効果である対立遺伝子Gは、グルコース刺激によるインスリン分泌の変化を実証しましたが、一次島のインスリン含有量は変化しませんでした（図6m、n）。 CALCOCO2 の 3'-UTR に位置する信頼できるセットの変異体と強い連鎖不均衡にある GWAS リード変異体 rs35895680 (対立遺伝子 C によりリスクが軽減される) は、インスリン含有量に影響を与えませんでした。 しかし、T2D保護対立遺伝子についてホモ接合性である個体からの島は、1コピーを持つ島と比較して、高グルコース条件下でインスリン分泌の増加を示した(図6o、p)。 まとめると、我々は、CALCOCO2 に関連する T2D 関連リスク変異体が初代ヒト膵島におけるインスリン分泌に影響を与えることを実証しましたが、この変異体とインスリン含有量および CALCOCO2 機能との関係はまだ調査されていません。

GWAS 関連シグナルにおけるエフェクター転写物を同定するための最近の取り組みは、疾患関連のトランスクリプトームおよびエピゲノム データセットの統合、または単一遺伝子座での詳細な機構研究に集中しています4,7,14,15,23,47,60,61,62,63,64。 。 疾患に関連する細胞型におけるゲノム規模の摂動データセットは、エフェクター転写物と疾患生物学の間のギャップを埋め、焦点を当てた翻訳の取り組みを可能にする可能性があります。 ここでは、ヒト ベータ細胞株 EndoC-βH1 におけるインスリン含有量の調節因子の包括的な特性評価を行うための、ゲノムワイドにプールされた CRISPR LoF スクリーニングを紹介します。

当社の CRISPR スクリーニング アプローチは、インスリン遺伝子自体だけでなく、単一遺伝子型の糖尿病に関与する遺伝子やインスリンの転写と分泌の既知の調節因子の検出を通じて示されたように、インスリン含有量の強力なモジュレーターの同定に成功しました。 私たちのスクリーニングヒットと優先順位付けツールの統合により、20 個の遺伝子がベータ細胞の機能不全を通じて機能するエフェクター転写物として同定されました。 私たちのデータは、遺伝的発見と生物学的メカニズムを結び付けるために利用でき、ヒトのベータ細胞だけでなく将来の細胞研究のモデルとして機能するゲノムワイドのマルチオミックデータセットの数を増やしています。 さらに、我々の偏りのないゲノム規模のデータは、1 型糖尿病など、膵臓ベータ細​​胞が関与する他の形質/疾患にも関連すると考えられます。

我々は最初に、T2D リスク関連遺伝子 CALCOCO2 が CRISPR スクリーニングのヒットであり、インスリン含量の正の制御因子であることを特定しました。 我々は、T2D GWASシグナルの根底にある可能性と、ベータ細胞生物学におけるその役割に関する知識が不足しているため、さらなる研究のためにこの遺伝子を選択しました。 私たちの焦点を絞った機能研究により、インスリン含有量に対するその効果が確認され、インスリン含有量を介した間接的なインスリン分泌の減少が示されました。 したがって、我々は、CALCOCO2をベータ細胞機能、つまり疾患の病因および作用組織に対する影響と考えられるものに結び付ける機能データを提供し、T2Dリスクにおける潜在的な因果関係の証拠を拡大する（補足説明）5,53,65。

CALCOCO2 はパーキン媒介マイトファジーにおける必須受容体として報告されており、ミトコンドリアの超微細構造の変化が観察されたにもかかわらず、CALCOCO2 の喪失は EndoC-βH1 におけるミトコンドリア機能の障害や、マイトファジーの人為的誘導時のミトコンドリアのクリアランスの減少をもたらさなかった。 CALCOCO2 によるインスリン含有量の調節におけるミトコンドリア非依存性機構 52,66,67,68。 むしろ、我々の結果は、プロインスリンを含む未成熟インスリン顆粒の分解によるインスリン含有量への影響を裏付けています。 CALCOCO2 のコーディング T2D リスクバリアントが発現と機能に及ぼす影響はまだ確立されていないが、観察されたインスリン分泌の減少は、顆粒の変化を補うためのインスリン発現と顆粒生合成の適応によるインスリン顆粒の恒常性の変化の長期的な影響を表している可能性がある。分解され、成熟した分泌可能な顆粒のプールが影響を受けます。

このゲノムワイドな CRISPR スクリーニングは、ベータ細胞の機能に関与する遺伝子を同定し、将来の統合と詳細な研究のためのリソースを提供しますが、1 つの状態で 1 つの疾患に関連する細胞表現型のみを捕捉します。 このスクリーニングでは、基礎グルコース条件下でのインスリン含量の変化が評価されたため、インスリン含量を調節せずにインスリン分泌に影響を与える遺伝子や、グルコース飢餓または刺激時にのみ生じる細胞内含量の変化は捕捉されませんでした。

これは、T2Dの疾患関連ヒト細胞株における機能の喪失と獲得の両方を含むゲノムワイドなスクリーニングの取り組みを加速するための重要なステップであり、細胞スクリーニングが変異体と調節要素および転写産物を結び付けるゲノムの取り組みを強化できるという概念の証明を表す。遺伝子発現と疾患関連の細胞生物学の間のギャップを埋める。 要約すると、我々はヒトベータ細胞のモデルでゲノムワイドにプールされたCRISPRスクリーニングを開発して実行し、目的の遺伝子を効果の方向、作用組織、機能機構と関連付ける包括的な摂動データセットを提供しました。 我々は、ゲノム全体の摂動セットをT2D GWAS遺伝子座の原因遺伝子の優先順位付けツールとしてどのように使用できるかを実証し、T2Dにおける原因となる可能性のあるインスリン顆粒恒常性およびベータ細胞機能のモジュレーターとしてCALCOCO2を強調しました。

ヒト膵島および膵臓組織は、アルバータ大学のヒト研究倫理委員会 (Pro00013094、Pro00001754) の倫理的承認の下、死亡したドナーから単離され、NIDDK が資金提供する統合膵島分布プログラム (IIDP) (RRID:SCR _014387) から入手されました。および国立糖尿病研究所 (NDRI; https://ndriresource.org/)。 すべてのドナーの家族は、研究における膵臓組織の使用についてインフォームドコンセントを与えたが、金銭的な補償は受けなかった。 HEK293T と EndoC-βH1 は、それぞれ Sigma (12022001) と EndoCells (現在 https://www.humancelldesign.com として知られています) から入手しました 19。

HEK293T 細胞を、10% ウシ胎児血清 (FCS)、100 U ml-1 ペニシリンおよび 100 μg ml-1 ストレプトマイシンを含む DMEM 6429 (Sigma-Aldrich) 中で日常的に継代しました。 EndoC-βH1 は、補足方法に記載されているように日常的に継代されました。 すべての細胞はマイコプラズマフリー (Lonza) で、37 °C、5% CO2 で増殖させました。 指示があれば、EndoC-βH1 細胞を 10 nM BafA1、1 μM MG132 または DMSO で 7 時間処理しました (すべて Sigma-Aldrich)。

免疫染色および機能的 shRNA 実験用の匿名化されたヒト膵島および膵臓サンプルは、IIDP およびアルバータ糖尿病研究所 Islet Core69 を通じて調達された 4 人の非糖尿病臓器ドナーから入手されました。 T2D リスク対立遺伝子研究用のヒト膵島は、194 人の非糖尿病臓器提供者 (ヘモグロビン A1C (HbA1C) < 6) から入手し、前述のようにアルバータ糖尿病研究所 IsletCore で単離および評価し、10% FCS および 100 U ml-1 ペニシリンを含む DMEM で培養しました。 /ストレプトマイシン (すべて Thermo Fisher Scientific)、37 °C、5% CO2 (参考文献 69、70)。 ヒト膵臓組織は NDRI を通じて入手されました。 研究で使用されたドナーの詳細を補足表 3 および 6 に示します。グループ間で年齢、性別、BMI、または HbA1c に有意差はありませんでした。 DNeasy Blood & Tissue キット (Qiagen) を使用して、消化された膵外分泌組織から DNA を抽出し、Infinium Omni2.5Exome-8 BeadChip アレイ (Illumina) で遺伝子型決定を実行しました。

補足方法に記載されているように、単一の CRISPR sgRNA を plentiCRISPRv2 (Addgene、52961) にクローニングしました。 簡単に説明すると、BsmBI 互換テールを相補的 sgRNA オリゴヌクレオチドに追加し、アニーリングしました (補足表 4)。 PlentiCRISPRv2 を消化し、アニーリングした sgRNA オリゴヌクレオチドとライゲーションし、続いてコンピテント セルで形質転換および増幅しました。 正しい sgRNA の組み込みがサンガー配列決定によって検証され、さらにプラスミドを使用してレンチウイルスが生成されました。

lentiCRISPRv2 バックボーンに基づく 71,090 の sgRNA を含むトロント ヒト ノックアウト プール ライブラリー (TKOv3) は、トロント大学の Jason Moffat から寄贈されました (Addgene、90294)26。 補足方法 26 に記載されているように、ライブラリーを Endura Competent Cells (Lucigen) で形質転換し、増幅しました。 sgRNA の発現を確実にするために段階希釈によって形質転換効率を決定し、続いて Plasmid Mega kits (Qiagen) を使用してプラスミドを抽出しました。 配列決定ライブラリーを下記のように調製し、75 bp のシングルエンドリードを使用した NextSeq500 (Illumina) での配列決定を通じてライブラリーの表現を確認しました。

補足方法に記載されているように、個別にクローン化された sgRNA およびプールされたライブラリー用のレンチウイルスを生成し、力価測定しました。 簡単に説明すると、CRISPR プラスミドを、jetPRIME トランスフェクション試薬 (Polyplus トランスフェクション) を使用して、パッケージング ベクター pMD2.G (Addgene、12259) および psPAX2 (Addgene、12260) とともに 60% コンフルエントの HEK293T でコトランスフェクトしました。 ウイルス上清をトランスフェクション後 48 時間および 72 時間で収集し、超遠心分離を使用して濃縮しました。 機能的ウイルス力価は、EndoC-βH1 において、さまざまなウイルス希釈と抗生物質の選択による形質導入後の生存率を測定することによって決定されました。 細胞生存率は、CyQUANT Direct Cell Proliferation アッセイ (Invitrogen) を使用して評価しました。 0.3のMOIを表す26%の生存率を達成するために必要なレンチウイルスの量を計算し、その後の小規模またはゲノムワイドのスクリーニング形質導入に使用した。 EndoC-βH1細胞を6時間播種した48時間後に形質導入し、必要に応じて培地を交換しながら4μg ml-1ピューロマイシン中で7日間選択した。

2 つの独立したゲノムワイド CRISPR スクリーニングを、独立したレンチウイルス CRISPR ライブラリー形質導入、FACS および sgRNA-seq を使用して EndoC-βH1 で連続的に実行しました。 各スクリーニングは、sgRNA あたり 500 細胞の適用範囲および 0.3 の MOI で実行されました。 合計 6 億 7,000 万個と 7 億 4,400 万個の細胞が、反復 1 と反復 2 でそれぞれ形質導入されました。 細胞を記載のように形質導入し、必要に応じて培地を交換しながら4μg ml-1のピューロマイシン中で7日間インキュベートし、その後、収集、染色およびFACS分析を行った。

EndoC-βH1細胞を収集し、LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain (Thermo Fisher Scientific)とともに室温で30分間インキュベートし、PBS中の1% BSAで洗浄しました。 BD Cytofix/Cytoperm キット (BD Biosciences) を使用して細胞を 4 °C で 20 分間固定および透過処理し、Perm/Wash Buffer (BD Biosciences) を使用して洗浄しました。 一次抗体による染色は 4 °C で一晩実施し、その後 Perm/Wash Buffer で希釈した適切な二次抗体とインキュベートしました (補足表 4)。 いくつかの INS ターゲティング抗体をテストする際に、Cell Signaling (3014) のウサギ モノクローナル抗 INS 抗体をゲノムワイド スクリーニングに使用しました。 サンプルを70μmのセルストレーナーで濾過し、100μmのノズルを使用してFACSAria III (BD Biosciences)上で選別した。 各抗体単独で染色したアイソタイプおよび形質導入コントロールをサンプルと並行して分析しました。 INS レベル評価の前に、サンプルは生細胞と単一細胞に基づいてゲートされました。 INS レベルが低下した細胞 (INSlow) のゲートはアイソタイプ コントロールに基づいて設定され、INS 発現細胞の上位 10% が INShigh として分類されました。 選別された細胞サンプルは、DNA 抽出まで -80 °C で保存されました。 フローサイトメトリーデータは、Flowjo 10.6 (BD Biosciences) を使用して分析されました。

QIAamp Blood Maxi/Mini Kit (Qiagen) を使用して、FACS で分類された凍結サンプルから DNA を抽出し、2 ステップ PCR アプローチで配列決定のために処理しました。 組み込まれた sgRNA は、Q5 ポリメラーゼ (NEB) を使用し、反応あたり 2.5 μg の DNA インプットとサンプルあたり最適化されたサイクル数で増幅されました。 最適化されたサイクル数で Q5 ポリメラーゼ (NEB) を使用して、特定の Illumina TruSeq アダプターを各サンプルに結合しました (補足表 4)。 PCR産物を2%ゲル上で実行し、QIAquick Gel抽出キット(Qiagen)を使用して精製した。 各イルミナ ライブラリ サンプルは、プールする前に KAPA ライブラリ定量キット (Roche) を使用して qPCR ベースで定量され、標準イルミナ シーケンシング プライマーと PhiX を使用して 75 bp リードとして NEXTSeq500 (イルミナ) で多重シークエンシングを約 20% スパイクインまで実行されました。

生の fastq シーケンス読み取りファイルは、「cat」コマンドを使用してサンプルごとにマージされました。 この CRISPR スクリーニングで濃縮された sgRNA と枯渇した sgRNA を識別するために、MAGeCK (v0.5.9.2) アルゴリズム 27 を使用しました。 簡単に説明すると、「count」コマンドを使用して、TKOv3 ライブラリ入力に基づいて生の fastq ファイルから sgRNA 配列を抽出してカウントし、sgRNA あたり 981 個のアライメントされたリードの平均リード数が得られました (拡張データ図 3)。 リード数が 10 未満の低い sgRNA および EndoC-βH1 で発現されない遺伝子にマッピングされた sgRNA は除外されました。 「test」コマンドをペアのモジュールとともに使用して、INSlow 集団と INShigh 集団間の sgRNA の濃縮または減少を評価および分析しました。 分析中央値は、さまざまなリードカウント深度を考慮してサンプル全体のリードカウントを正規化し、平均分散モデルを適用して有意な sgRNA の濃縮または枯渇を特定します。 MAGeCK の複数のテストで調整された sgRNA レベルの濃縮スコアが、遺伝子レベルのヒット選択の基礎となりました。 両方の独立した複製において 4 つの sgRNA のうち少なくとも 2 つについて FDR < 0.1 を持つ遺伝子を必要とする、両方の複製にわたって非常に一貫した効果を持つヒットのみを優先する追加の厳格な基準を適用しました。 CRISPR 画面分析は Python 3.8 および R 3.5 で実行されました。

スクリーニング ヒット内の強化された GO および KEGG 経路は、ホモ サピエンスをリストおよびバックグラウンド入力として使用して、アノテーション、視覚化および統合ディスカバリー データベース 6.8 を使用して決定されました39。 物理的および機能的相互作用に基づくタンパク質接続ネットワークは、STRING v11 を使用してスクリーニング ヒット間で特定されました (参考文献 41)。 0.9 以上の高い信頼スコアを持つ相互作用のみが選択されました。

EndoC-βH1 における順方向 siRNA ベースのサイレンシングは、最終濃度 15 nM の ON-TARGET プラス SMARTpool siRNA または非ターゲティング コントロール (Dharmacon; 補足表 4) を使用して、プレーティングの 24 時間後に実行されました。 siRNAを、培養物に滴下する前に、Opti-MEM低減無血清培地(Gibco)中で0.4%リポフェクタミンRNAiMAX(Invitrogen)とともに室温で15分間プレインキュベートした。 トランスフェクションの72時間後に細胞をアッセイまたは収集しました。 図６に示す実験におけるＣＡＬＣＯＣＯ２サイレンシングは、最終濃度５０ｎＭのｓｉＲＮＡで実施し、９６時間後に評価した。

ヒトCALCOCO2を標的とするshRNAをコードするレンチウイルス構築物をDharmaconから入手し(補足表4)、ウイルスを上記のように産生した。 初代膵島を酵素消化 (Accumax、Invitrogen) によって単一細胞に分散し、1 × 106 細胞に 1 mL あたり 1 × 109 ウイルスユニットを導入しました。 形質導入された膵島細胞は、さらなる分析の前に超低接着ウェルプレートで5日間培養されました。

ON-TARGET plus SMARTpool CALCOCO2 siRNA の標的領域に基づいて、ヒト CALCOCO2 の CDS の 4 つの標的部位にサイレント変異が導入されました。 EcoRI および BamHI モチーフと Kozak 配列を含む制限部位を CDS の 5' および 3' 末端に追加しました。 遺伝子断片を合成し(IDT)、プラスミドpCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPにクローニングした。 空のプラスミドは、その後の実験の対照として機能しました。 レンチウイルスを上記のように作製し、EndoC-βH1細胞をMOI 0.5で形質導入した。

EndoC-βH1 からの遺伝子発現解析用の RNA を TRIzol 試薬 (Invitrogen) を使用して抽出し、GoScript Reverse Transcriptase System (Promega) を使用して相補 DNA に合成しました。 メーカーの指示に従って、初代ヒト偽膵島からの遺伝子発現分析用の RNA を、PicoPure RNA 単離キット (Life Technologies) を使用して抽出し、Maxima 第一鎖 cDNA 合成キット (Thermo Fisher Scientific) を使用して cDNA を合成しました。 定量的 qPCR (qPCR) は、7900HT Fast Real-Time PCR System (すべて Applied Biosystems、補足表 4) で TaqMan リアルタイム PCR アッセイを使用して実行されました。 Ct 値はΔΔCt 法を使用して分析され、標的遺伝子はハウスキーピング PPIA、GAPDH、TBP の合計平均に対して正規化されました。 EndoC-βH1 および初代膵島における CALCOCO2 発現は、以前に公開され分析された RNA-seq データから抽出されました 71,72。

RNA-seq は、NEXTSeq500 (Illumina) で平均 2,000 万を超えるペアエンド リードを持つ PolyA キャプチャーを使用して実行されました。 Fastq ファイルは、ENSEMBL 遺伝子アノテーション (v101) を備えた STAR v2.7.9a (Spliced Transcripts Alignment to Reference) を使用してヒトゲノム参照 (GRCh38) にアライメントされました。 遺伝子発現レベルは、エクソンリードの featureCounts (v2.0.1) を使用してカウントされました。 DESeq2 (v1.26.0) の Wald テストを使用して差次的発現を比較しました。 P 値は、Benjamini および Hochberg 法を使用して調整されました。

小規模スクリーニングにおける sgRNA の組み込みは、SYBR Green ベースの定量 PCR およびそれぞれの sgRNA 配列を標的とするプライマーを使用して定量されました (補足表 4)。 FACS で分類された EndoC-βH1 からの DNA を記載どおりに抽出しました。 各サンプルは、製造元の指示に従って、20 ng の総 DNA と SYBR Green PCR Master mix (Bio-Rad) を使用して調製されました。 遺伝子発現実験について説明したように、サンプルを増幅して分析しました。

サイレント化されたEndoC-βH1細胞を、トランスフェクションの48時間後、2.8Mグルコースを含む培地中で一晩飢餓状態にし、続いて0mMグルコース中で30分間インキュベートした。 インスリン分泌は、示されたグルコースまたは分泌促進物質条件での 1 時間の静的インキュベーションによって開始されました。 インスリンを含む上清を収集し、細胞を氷冷した酸性エタノール中で溶解して細胞内インスリンを放出させた。 インスリンは、上清とインスリン含有量のそれぞれ 1:10 および 1:200 の希釈に基づいて、Insulin (human) AlphaLISA Detection キットおよび EnSpire Alpha Plate Reader (両方とも Perkin Elmer) を使用して定量しました。 細胞内プロインスリンは、プロインスリンELISAキット(Mercodia)を使用して定量した。 分泌されたインスリンは、CyQUANT 直接細胞増殖アッセイ (Invitrogen) を使用して細胞溶解前に測定された細胞内インスリン含量または細胞数のレベルに対して正規化されました。

3 連の 15 個の膵島のグループを、クレブス リンガー緩衝液 (KRB) (115 mM NaCl; 5 mM KCl; 24 mM NaHCO3; 2.5 mM CaCl2; 1 mM MgCl2; 10 mM HEPES (pH)) 中で 37 °C で 1 時間プレインキュベートしました。 7.4); 0.1% BSA)、1 mM グルコース。 続いて、膵島を１ｍＭグルコースＫＲＢ中で１時間インキュベートし、続いて１６．７ｍＭグルコースＫＲＢ中で１時間刺激した。 上清を除去し、酸性エタノールを使用して島ペレットから総インスリン含有量を抽出した。 サンプルは-20℃で保存し、STELLUX Chemi Human Insulin ELISA (Alpco)を使用して化学発光によりインスリンをアッセイしました。

異なるレベルのグルコースを補充したRPMI 1640 (Gibco)におけるインビトロ分泌アッセイのために、ドナー当たり25個の偽膵島のバッチを使用した。 インスリン分泌アッセイでは、偽膵島を 2.8 mM グルコースで 1 時間プレインキュベートし、続いて 2.8、5.6、16.7 および 16.7 mM + IBMX グルコース濃度でそれぞれ 60 分間インキュベートしました。 グルカゴン分泌アッセイでは、偽膵島を 7、1、1 mM + 10 mM アルギニン グルコース濃度でそれぞれ 60 分間インキュベートしました。 上清を収集し、細胞を酸性エタノールで溶解して、インスリンとグルカゴンの内容物を抽出しました。 上清および偽膵島溶解物中のヒトインスリンを、ヒトインスリンELISAキット(Mercodia)を使用して定量した。 上清および偽膵島溶解物中のヒトグルカゴンを、ヒトグルカゴンELISAキット(Mercodia)を使用して定量した。 分泌されたインスリンおよびグルカゴンのレベルは、偽膵島溶解物から定量された gDNA のパーセンテージとして表示されます。

EndoC-βH1 をグルコース分泌アッセイバッファー (SAB) (114 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.2 mM KH2PO4、1.16 mM MgSO4、25.5 mM NaHCO3、2.6 mM CaCl2、20 mM HEPES (pH))中で 37 °C で 1 時間インキュベートしました。 7.3)、0.2% BSA)。 飢餓後、DMSOまたは10μM FCCPのいずれかを補充した0 mMまたは20 mMグルコース含有SABで細胞を40分間刺激し、100μl ATPアッセイ緩​​衝液(Biovision)で溶解した。 溶解物中のATP含有量は、製造業者の指示に従って発光アッセイ(Biovision)を使用して測定し、BCAタンパク質アッセイ(Pierce)によって決定される総タンパク質含有量に対して正規化した。

全細胞タンパク質抽出物は、1X プロテアーゼ阻害剤カクテル (Roche) を含む RIPA バッファー (50 mM Tris pH 7.4、150 mM NaCl、1% Triton X-100、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS) での溶解を通じて細胞ペレットから得ました。 。 タンパク質濃度は DC タンパク質アッセイ (Bio-Rad) を使用して定量し、総タンパク質 10 μg をサンプルバッファー (4x Laemmli Buffer (Bio-Rad)、10% β-メルカプトエタノール (Sigma-Aldrich)) と混合し、1 時間煮沸しました。 80 °C で 10 分間、変性サンプルを 4 ～ 20% Criterion TGX ステインフリー プレキャスト ゲル上で、Tris-グリシン-SDS バッファー中 300 V で 15 分間実行し、トランスブロットを使用して 0.2 μm ポリ二フッ化ビニリデンに転写しました。 Turbo Transfer System (すべて Bio-Rad). 非特異的抗体結合は、0.1% Tween-20 (TBST) を含む Tris 緩衝生理食塩水中の 3% BSA と室温で 1 時間インキュベートすることによってブロックされました. 一次抗体のインキュベーションは 4°で実行されましたC で一晩放置した後、HRP 結合二次抗体と室温で 1 時間インキュベートしました (補足表 4)。ブロットは ChemiDoc MP イメージング システム (Bio-Rad) を使用して画像化し、適切なサイズのローディング コントロール抗体を使用して説明どおりに再プローブしました。 Lab 6.0 ソフトウェア (Bio-Rad) を使用してタンパク質バンドを定量化し、目的のタンパク質を同じブロット上のそれぞれのローディング コントロールに対して正規化しました。

ヒト膵臓組織における免疫蛍光分析。 膵臓を4%パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、凍結包埋し、4μmの切片を調製した。 組織切片を蒸留水に浸し、ターゲット回復溶液 (Dako) で 20 分間煮沸し、1% PBS-Triton X-100 (Sigma-Aldrich) を使用して室温で 10 分間透過処理し、1% PBS-Triton X-100 (Sigma-Aldrich) を使用して非特異的抗体結合をブロックしました。 BSA (Roche)、0.2% 無脂肪乳、0.5% Triton X-100、1% DMSO を含む PBS (すべて Sigma-Aldrich)。 一次抗体のインキュベーションを 4 °C で一晩実行し、続いて Alexa Fluor 結合二次抗体と室温で 1 時間インキュベートしました (補足表 4)。 DAPI (Vector Laboratories) を含む VectaShield 封入媒体を使用してスライドをマウントし、×20 および×40 の対物レンズを使用して Zeiss AxioM1 (Zeiss) 顕微鏡で画像化しました。 ImageJ 1.52b ソフトウェアを使用して免疫蛍光画像を作成しました。

EndoC-βH1 細胞を Nunc Lab-Tek II Chamber Slides (Thermo Fisher Scientific) に播き、3% PFA-K-PIPES で 5 分間、3% PFA-Na2BO4 で 10 分間固定し、その後 0.1% Triton で透過処理しました。 X-100 を室温で 30 分間処理 (すべて Sigma-Aldrich)。 細胞を、ＰＢＳ中の５％ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を含むブロッキング溶液中で３０分間インキュベートした。 一次抗体をブロッキング溶液で希釈し、スライドを4℃で一晩インキュベートした後、二次Alexa Fluor結合抗体およびDAPI（MP Biomedicals）とともに室温で1時間インキュベートしました（補足表4）。 イメージングは​​、STELLARIS 8 共焦点顕微鏡 (Leica Microsystems) で実行されました。

コントロールおよびサイレンシングされたEndoC-βH1細胞を、37℃の0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）中の10%ゼラチンに再懸濁し、5分間平衡化させた。 細胞をペレット化し、過剰なゼラチンを除去し、4℃に冷却し、冷1%四酸化オスミウムとともに回転させながら4℃で2時間インキュベートした。 それらを冷限外濾過水で３回洗浄し、回転させながら４℃で１％酢酸ウラニル中で一晩一括染色した。 サンプルを一連のエタノール洗浄 (30%、50%、70%、および 95%) で 4 °C でそれぞれ 20 分間脱水し、室温に平衡化し、100% エタノールで 2 回洗浄し、プロピレンオキシド (PO) 中でインキュベートしました。 ）15分間。 PO と 1:2、1:1、および 2:1 の比率で混合した EMbed-812 樹脂をサンプルにそれぞれ 2 時間浸透させました。 これらを室温で回転させながら 2:1 の樹脂と PO の中で一晩インキュベートし、EMbed-812 に 4 時間置き、続いて新しい樹脂を入れた型に入れて 65 °C で一晩インキュベートしました。 80 nm の切片をフォルムバール/カーボンコーティングされた 100 メッシュ Cu グリッド上でピックアップし、50% アセトン中の 3.5% 酢酸ウラニルで 30 秒間染色し、続いて 0.2% クエン酸鉛で 3 分間染色しました。 イメージングは​​ JEM-1400 120 kV (日本電子) を使用して実行され、画像は Gatan Orius 4k × 4k デジタル カメラを使用して撮影されました。 画像の定量化は、盲検評価者 3 名によって独立して実行されました。

統計分析は、Prism 8.1 (GraphPad Software) で実行されました。 多数の生物学的に独立した複製が個々のデータ点として示されており、正確な数はそれぞれの図の凡例に示されています。 エラーバーは平均値の標準誤差を表します。 サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでした。 Ｔ２Ｄリスクキャリアからの主要な膵島評価における重大な外れ値は、事前に確立されたＲＯＵＴ外れ値検定（Ｑ＝１％）に基づいて除外された。 必要に応じて、倍率変化がプロットされましたが、統計分析は対数変換された値に対して実行されました。 画像解析などで必要な場合、評価者はサンプルの割り当てを知らされませんでした。 正規分布変数は、2 標本スチューデント t 検定または一元配置分散分析とそれに続く Sidak の多重比較検定を使用して 2 つ以上のグループ間で比較されました。 単一の反復内でそれぞれの対照に対して正規化されたサンプルは、1 サンプルのスチューデントの t 検定を使用して分析されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

CRISPR スクリーンからの Fastq シーケンス ファイルは、EMBL-EBI の欧州ヌクレオチド アーカイブ (ENA) にアクセッション番号 PRJEB44712​​ で寄託されています。 siCALCOCO2 サンプルの RNA シーケンス実験からの Fastq シーケンス ファイルは、研究番号 EGAS00001006127 で European Genome-phenome Archive (EGA) に寄託されており、以前に公開された研究からの EndoC-βh1 発現データは PRJEB15283 (ENA)71 でアクセスできます。 データは自由にダウンロードでき、処理された数は補足データセット 1 にあります。RNA 配列データはヒトゲノム参照 GRCh38 (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-101/fasta/) に合わせて調整されました。 homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz)、遺伝子アノテーション (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-101/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.101.gtf) でカウントされます。 .gz) は Ensembl データベースからダウンロードされます。 未処理のブロットのソース データと拡張データにはオンラインでアクセスできます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

MAGeCK のソース コードは http://liulab.dfci.harvard.edu/Mageck から自由に入手でき、差次的遺伝子発現解析は DESeq2 R パッケージを使用して実行されました。 それぞれのコードは https://doi.org/10.5281/zenodo.7226348 で入手できます。

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ALG は基礎生物医学分野のウェルカム上級研究員です。 AKR と SKT はラドクリフ医学部奨学生であり、AKR は欧州糖尿病研究財団 (EFSD) から旅行奨学金を受けています。 ALG は、Wellcome (200837)、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所 (NIDDK) (U01-DK105535、U01-DK085545、UM1DK126185)、およびスタンフォード糖尿病研究センター (NIDDK 賞 P30DK116074) から資金提供を受けました。 このプロジェクトは、国立研究資源センター (NCRR) (1S10RR026780-01) および国立衛生研究所 (NIH) (SKK に R01 DK108817 および R01 DK107507 を助成)、および若年性糖尿病研究財団 (JDRF フェローシップ) によってさらに支援されました。 RJB）。 PEM は、膵島生物学のカナダ研究委員会とカナダ保健研究研究所 (MOP、148451) の一部によって支援されています。 アドバイスと激励をいただいたGloyn研究室の過去および現在のメンバー、ライブラリーの増幅についてはDylan Jones、FACSソーティングについてはRuddy Montandon、配列決定についてはオックスフォード・ゲノミクス・センター（ウェルカム・センター・フォー・ヒューマン・ジェネティックス）、遺伝子ベクターおよびウイルス・コア（GVVC）には感謝の意を表します。 CALCOCO2 ベクター プラスミドを使用してレンチ ウイルスを生成し、EM サンプルを調製するための Cell Sciences Imaging Facility (CSIF) の EM コアと、記載されているプロジェクトは、国立研究資源センター (NCRR) からの ARRA 賞 1S10RR026780-01 によって部分的に支援されました。 ）。 LC3 染色に関するアドバイスをいただいた Karla Kirkegaard に感謝します。 ホルモン分泌アッセイのサポートについては、Yan Hang 氏、Mollie Friedlander 氏、およびスタンフォード糖尿病研究センターの Islet Core に感謝します。 私たちは、臓器提供者とそのご家族、そしてヒト臓器調達・交換（HOPE）プログラム、エンレイソウ・ギフト・オブ・ライフ・ネットワーク（TGLN）およびその他のカナダの臓器調達団体の支援を得て、アルバータ糖尿病研究所島コアを通じた膵島調達に感謝します。統合膵島分布プログラム (US NIH UC4 DK098085)、国立疾病研究交流、および国際医学進歩研究所。 すべてのドナーの家族は、研究における膵臓組織の使用についてインフォームドコンセントを与えました。 資金提供者は、研究の設計、データの収集と分析、出版の決定や原稿の準備には何の役割もありませんでした。

これらの著者は同様に貢献しました: Yingying Ye、Elena Navarro-Guerrero。

オックスフォード糖尿病・内分泌・代謝センター、オックスフォード大学ラドクリフ医学部、オックスフォード、英国

アンティエ・K・ロットナー、ソーレン・K・トムセン、サミーナ・ナワズ、アンナ・L・グウィン

米国カリフォルニア州スタンフォード、スタンフォード大学スタンフォード医学部内分泌科小児科

インイン・イェ、ヴァルシャ・ラジェシュ、アリーナ・ポルナー、ジン・ヤン、ハン・スン、ダニエル・エブナー、アンナ・L・グウィン

オックスフォード大学ナフィールド医学部ターゲットディスカバリー研究所（オックスフォード、英国）

エレナ・ナバロ＝ゲレーロ & ロベルタ・バローニオ

スタンフォード大学医学部発生生物学部、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

ロミナ・J・ベバクア＆スン・K・キム

スタンフォード糖尿病研究センター、スタンフォード大学医学部、スタンフォード大学、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

ロミナ・J・ベヴァクア、スン・K・キム、アンナ・L・グウィン

カナダ、アルバータ州エドモントンのアルバータ大学薬学部およびアルバータ糖尿病研究所

アリヤ・F・スピーゲルマン、オースティン・バプティスト、ジェームズ・ライアン、ナンシー・スミス、ジョセリン・E・マニング・フォックス、パトリック・E・マクドナルド

オックスフォード NIHR 生物医学研究センター、オックスフォード大学病院トラスト、オックスフォード、英国

アガサ・ウェソロフスカ＝アンデルセン & アンナ・L・グウィン

オックスフォード大学ナフィールド医学部、ウェルカム人類遺伝学センター、オックスフォード、英国

アンナ・L・グウィン

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AKR、YY、SKT、ALGがこの研究を発案した。 AKR、EN-G。 SKT は CRISPR スクリーニング最適化実験を実施しました。 AKR、EN-G.、RB、SN は CRISPR スクリーニングを実施しました。 英語-G。 そしてRBはシーケンシングライブラリーの調製を実行しました。 AKR は CRISPR スクリーニング データを分析しました。 AW-A。 CRISPR スクリーニング解析に貢献しました。 AKRとALGはデータ統合分析を実施した。 AKR は、ベータ セルで CALCOCO2、QSER1、および PLCB3 の検証を実行しました。 AFS、AB、JL、NS、JMF、PEM、および ALG は、ヒト膵島における CALCOCO2 リスク対立遺伝子を評価しました。 YY、VR、AP、および JY は、EndoC-βH1 における CALCOCO2 追跡調査を実施しました。 AKRおよびRJBは膵島免疫染色を実施した。 RJB、AKR、VR は膵島 shRNA ノックダウン実験を実施しました。 HS は RNA-seq データを分析しました。 SKK、JMF、DE、PEM、ALG が調査を監督しました。 AKRとALGが原稿を書きました。 著者全員が原稿の最終草案を承認しました。

アンナ・L・グウィンとの通信。

著者らは、次のような競合する利益を宣言しています。AKR は現在アストラゼネカの従業員であり、SKT は現在 Vertex Pharmaceuticals と AW-A の従業員です。 現在は Genomics plc の従業員です。 DE と EN-G も現在、XCellomics と提携しています。 すべて AKR、SKT、AW-A による実験的作品。 オックスフォード大学での雇用の下で実施されました。 AKRはアストラゼネカ株を保有している。 ALGの配偶者はロシュのストックオプションを保有している。 他の著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Genetics は、この研究の査読に貢献してくれた Bridget Wagner と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

(a) 示されているように異なるモノクローナル一次抗体 (紫、青、ピンクの抗体) と二次 Ab を組み合わせて使用​​した、細胞内インスリン (青色のグラフ) とそれぞれのアイソタイプ コントロール (ピンクのグラフ) を比較した、EndoC-βH1 におけるさまざまな FACS 染色戦略を示すヒストグラム (灰色）AF488に結合したもの（緑色）、またはFITCに直接結合したもの（緑色）、および（b）示されているように、さまざまな固定（上の行）または透過化バッファー（下の行）を使用した異なる染色プロトコルを使用しています。 3 つの独立した実験が実行され、代表的なヒストグラムが示されています。 ゲノムワイド CRISPR スクリーニングは、Cell Signaling の抗 INS 抗体と、BD Sciences の市販の固定および透過化 Cytofix/Cytoperm 試薬およびプロトコールを使用して実行されました。

ゲノムワイド CRISPR スクリーニングにおける染色された EndoC-βH1 の代表的な FACS 画像とソーティング ゲート。 (a) 細胞のサイズ、粒度、生存率を評価して破片を排除し、一重項と生細胞を定義する選別ゲート。 (b) サンプル純度を評価するための低インスリン細胞集団の再分類。 SSC-A、側方散乱エリア。 FSC-A、前方散乱エリア。 FSC-W、前方散乱幅。

（a）形質導入されたEndoC-βH1の最初のFACSソーティングから最終的な配列分析までのCRISPRスクリーンの概要。 (b、c、e) 両方の複製からの低インスリン (LOW1、LOW2)、高インスリン (HIGH1、HIGH2)、および参照サンプル (REF1、REF2) のリード数とマップされた sgRNA の品質管理。(b) 合計リード数とマッピングされたリードの割合、(c) 総 sgRNA に占めるゼロカウント sgRNA の数、および (e) 正規化されたリード カウントの分布。 ボックスは第 1 四分位数と第 3 四分位数の間の IQR を示し、水平線は中央値を示し、ひげは Q3 + 1.5 × IQR および Q1 − 1.5 × IQR を示します。 (d) 低インスリン含有量 (灰色) および高インスリン含有量 (青色) の最初の 2 つの成分と、両方の複製からの参照サンプル (紫) の正規化 sgRNA 読み取りカウントに関する主成分分析。 （ f – i ）各複製（f）、参照複製（g）、低インスリン含量の複製（h）、および高インスリン含量の複製（i）の低インスリン含量と高インスリン含量の間の倍率変化のペアワイズピアソン相関分析。 紫色の線は線形回帰直線を示します。 Log2FC、log2 (倍数変化); r、ピアソン相関係数。 すべてのデータは、2 つの独立したゲノムワイド CRISPR スクリーニング複製から得られた sgRNA リードです。

CRISPR スクリーニングヒットの物理的および機能的相互作用を含むタンパク質間関連を示す STRING 経路解析。 クラスターは手動で識別され、注釈が付けられ、個別にプロットされ、選択されたクラスターが表示されます。 相互作用を決定するための信頼レベルは、最高の信頼度 (0.9) に設定されました。

(a) 信頼できるセットの GWAS 関連シグナル (上) および隣接遺伝子 (下) を含む CALCOCO2 遺伝子座。 （b – g）CALCOCO2遺伝子座の遺伝子のゲノムワイドCRISPRスクリーニングにおける、遺伝子あたり8つのsgRNAすべて（複製あたり4つのsgRNA）のsgRNA数の分布。 低インスリン含量サンプルから高インスリン含量サンプルまでの sgRNA カウントの変化。各色は 2 つの画面の複製で同じ sgRNA を表します。 黒い破線は、この遺伝子の sgRNA 数の中央値を表します。 （ h ）EndoC-βH1に、コントロールウイルスとsiRNA（siNT）、コントロールウイルスとsiCALCOCO2、またはレンチウイルスのいずれかを安定に形質導入して、サイレント変異（mutCALCOCO2）を含むCALCOCO2を発現させ、siCALCOCO2に対して耐性にしました（P = 0.0352）。 データはそれぞれの対照 (siNT) に対して正規化され、1 サンプルの t 検定を使用して分析されました。 すべてのデータは、6 回の独立した実験または 2 回の独立したゲノムワイド CRISPR スクリーニングの反復からの平均値 ± SEM です。 P 値 * < 0.05。 有意性をグラフで示していない場合は、結果が有意ではないことを示しています。 NT、ノンターゲティング。

(a) T2D エフェクター転写物として遺伝子を因果関係の証拠と組み合わせた遺伝子優先順位付けアプローチ (統合アプローチで概説したとおり) ですが、これもスクリーニング ヒットではなく、QSER1 と PLCB3 を強調しました。 PLCB3 は、ベータ細胞の増幅経路で役割を果たしていますが、多形質生理学的クラスター化アプローチではインスリン作用とも関連付けられています。 QSER1 は最近、膵臓の分化異常に関連する DNA メチル化調節因子として同定されました。 (b) 低インスリン含量サンプルから高インスリン含量サンプルへの sgRNA 数の変化。各色は 2 つの画面複製で同じ sgRNA を表します。 黒い破線は、この遺伝子の sgRNA 数の中央値を表します。 （ d – n ）すべてのデータは、非ターゲティング対照細胞と比較した、siQSER1またはsiPLCB3で処理したEndoC-βH1からのものです。 （ d ）siNTコントロール細胞（灰色）と比較した、それぞれのサイレント細胞（青色）におけるQSER1およびPLCB3のmRNA発現（ P = 0.0010、0.0005）。 (e) 20,000 細胞あたりのインスリン含有量 (pg)。 (f) INS の mRNA 発現。 (g、k) 1 mM、20 mM、1 mM + 100 μM トルブタミドまたは 20 mM グルコース + 100 μM ジアゾキシドにおける、siNT または (i、m) インスリン含量および siNT に対して正規化されたインスリン分泌。 (h、j、l、n) インスリン分泌倍率は 1 mM から 20 mM グルコースまで変化します。 すべてのデータは、3回（d、f〜n）または12回（e）の独立した実験、または2回の独立したゲノムワイドCRISPRスクリーニング（b、c）からの平均±SEMです。 データは、2 サンプル t 検定 (d、h、j、l、n) および Sidak の多重比較検定による一元配置分散分析 (e、f、g、i、k、m) を使用して分析されました。 有意性をグラフで示していない場合は、結果が有意ではないことを示しています。 P 値 *** < 0.001。 FC、フォールドチェンジ。 LFC、log2 (倍数変化); NT、ノンターゲティング。

siCALCOCO2 または siNT で処理した EndoC-βH1 (a) および膵臓切片の外分泌組織 (b) の免疫蛍光染色。 切片をINSおよびCALCOCO2について二重免疫染色した(示されているように赤または緑)。 細胞核を DAPI (青) で対比染色しました。 スケールバーは 6 μm (a) または 10 μm (b) です。 d: 管細胞。 a：腺房細胞。 私：島。 NT、ノンターゲティング。 すべての画像は 3 つの独立した免疫蛍光染色からの代表的なものです。

すべてのデータは、非ターゲティング対照細胞と比較した、siCALCOCO2 処理された EndoC-βH1 からのものです。 (a – d、g、h、k – m) それぞれのサイレント細胞 (青) を使用して RNA-Seq (a – d、k – m) または qPCR (g、h) で測定された、示された標的遺伝子の mRNA 発現と比較siNT コントロール セル (灰色) (P = 1.87 × 10−6)。 （ e 、 f ）異常な形状またはクリステに基づくEM画像内の変化したミトコンドリアの定量化。盲検評価者2および3によってミトコンドリアの総数に正規化されました（ P < 0.0001、0.0032）。 （ i 、 j ）盲検評価者 2 および 3 による EM 画像内の細胞あたりの顆粒の総数に正規化された成熟インスリン顆粒の定量化（P = 0.0002、0.0002）。 (n、o) PCSK1 (n)、PCSK2 (o) およびその負荷制御 GAPDH のタンパク質レベル。 (p、q) GAPDH および siNT 対照細胞に対して正規化された PCSK1 (p) および PCSK2 (q) ウェスタンブロットタンパク質レベルの定量。 r、s）siNT対照細胞（点線）と比較した、1μM（+）、10μM（++）またはDMSOのMG132で処理した後のインスリン（r）またはプロインスリン含量（s）。 すべてのデータは、3 つの独立した実験、または 3 人の独立した評価者 (e、f、i、j) によって測定された少なくとも 16 個の細胞からの平均値 ± SEM です。 タンパク質レベルは siNT のパーセンテージとして表示され、100% の点線で強調表示されます。 データは、2 サンプルの t 検定 (e – j)、Benjamini および Hochberg 法を使用して調整された DESeq2 の Wald 検定 (a – d、k – m)、1 サンプルの t 検定 (p、q)、および 1 つのサンプルを使用して分析されました。 Sidak の多重比較検定 (r, s) を使用した -way ANOVA。 有意性をグラフで示していない場合は、結果が有意ではないことを示しています。 P 値 ** < 0.01、*** < 0.001、**** < 0.0001。 NT、ノンターゲティング。

ソースデータ

補足表 2 および 3、方法および考察。

補足表 1 - 画面ヒット数。 補足表 2 - T2D エフェクター遺伝子予測との統合に基づいて優先順位付けされた T2D の原因遺伝子。 補足表 3 - ヒト組織ドナーの詳細。 補足表 4—リソース。 補足表 5 - RNA 配列補足表 6 - 膵島ドナー。 補足表 7 - sgRNA ヒット。 補足表 8—Screen_all sgRNA。

未処理のウェスタンブロット。

未処理のウェスタンブロット。

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転載と許可

Rottner、AK、Ye、Y.、Navarro-Guerrero、E. 他ゲノムワイドな CRISPR スクリーニングにより、CALCOCO2 が 2 型糖尿病のリスクに影響を与えるベータ細胞機能の調節因子であることが特定されました。 Nat Genet 55、54–65 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41588-022-01261-2

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受信日: 2021 年 5 月 21 日

受理日: 2022 年 10 月 26 日

公開日: 2022 年 12 月 21 日

発行日：2023年1月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-022-01261-2

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自然遺伝学 (2023)