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Oct 15, 2023

腸粘膜解離プロトコルは細胞タイプの割合と単一細胞に影響を与える

Rapporti scientifici Volume 12,

Scientific Reports volume 12、記事番号: 9897 (2022) この記事を引用

4403 アクセス

4 引用

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

単一細胞 RNA シーケンス (scRNA-seq) は、臓器の細胞状況の研究に革命をもたらしました。 ほとんどの単一細胞プロトコルでは新鮮な材料が必要であるため、実験ごとのサンプルサイズが制限され、その結果、バッチ効果が生じます。 これは、腸粘膜生検などの複雑な医療処置を通じて取得されたサンプルに特に当てはまります。 さらに、単一細胞を取得するために必要な組織解離手順は、大きなノイズ源となります。 組織の異なる区画に異なる解離手順を適用すると、細胞サブセット間の人為的な遺伝子発現の違いが引き起こされます。 これらの課題を克服するために、我々はワンステップ解離プロトコルを開発し、凍結保存された腸粘膜生検でのその使用を実証しました。 フローサイトメトリーと scRNA-seq 解析を使用して、この 1 ステップ解離プロトコルを、現在のゴールドスタンダードである 2 ステップ コラゲナーゼ消化、および最近発表された代替の 3 ステップ コールド活性 Bacillus licheniformus プロテアーゼ消化の適応と比較しました。 細胞生存率と細胞型組成はいずれも、1 段階コラゲナーゼ解離と 2 段階コラゲナーゼ解離で同等であり、前者の方が時間効率が高かった。 コールドプロテアーゼ消化により、細胞生存率は同等になりましたが、上皮細胞タイプはより良く保存されました。 したがって、グリア細胞などの希少な細胞タイプを分析するには、入力材料としてより多くの総生検細胞数が必要になります。 複数ステップのプロトコルは、複数のコンパートメントにまたがる細胞タイプに異なる影響を与えました。 要約すると、凍結保存した腸粘膜生検を使用して、大規模な scRNA-seq 研究における物流上の課題とバッチ効果を克服できることを示します。 さらに、ワンステップコラゲナーゼプロトコルを使用して消化された凍結保存生検を使用すると、大規模な scRNA-seq、FACS、オルガノイドの生成、および上皮内リンパ球の増殖が可能になることを実証します。

最初の cDNA が単一細胞から抽出されたのは 30 年以上前1 ですが、単一細胞 RNA シーケンス (scRNA-seq) の分野における技術開発により、単一細胞遺伝子発現プロファイリングが可能になったのはごく最近のことです。高スループット方式で 2。 この開発により、細胞の種類を個別に分離する必要がなく、組織内の不均一な細胞集団の公平な研究が可能になります。 これにより、細胞発現のマッピングを超えて、組織内での潜在的な細胞間相互作用を研究することが可能になります3。

健康 (Human Cell Atlas4) と病気 (LifeTime コンソーシアム 5) の両方において、単一細胞解像度で人体をマッピングするためのいくつかの世界的な取り組みが進行中です。 すでに大きな取り組みが行われている分野の 1 つは、消化器病学の分野です。 胎児、小児、成人の「健康な」腸管アトラスが（現在作成中）6,7 作成されています。 これにより、pH 感知に関与する BEST4 上皮細胞などの新しい細胞型とその特定の機能が同定され 8、クローン病患者の一部が特定の薬剤に反応しない理由についての最初の手がかりが得られました 9。

腸粘膜は、いくつかの区画に分けることができる複雑な器官です。 そして上皮の下にある固有層。 各コンパートメントは、特殊な局所的な機能を持ち、胃腸管全体に異なって分布する細胞タイプの混合物で構成されています10、11。 管腔側では、腸粘膜は無細胞粘液層で構成され、腸内細菌を上皮から分離しています。 この層は、外界と腸内区画の間の第 2 の障壁として機能します。 直下には上皮層があり、免疫細胞が浸潤し、抗菌防御と抗原シグナル伝達のための特定の機能を実行します。 ここにのみ存在する免疫細胞集団の 1 つは上皮内リンパ球集団 (IEL) であり、これは下層である固有層 (LPL) のリンパ球とは機能的に異なります。 後者の層には、他の免疫細胞、血管系、神経、間葉細胞も含まれています12、11、14。

このような複雑で充実した臓器の単一細胞を効果的にプロファイリングするには、組織を解離する必要があります。これは、すべての scRNA-seq プロトコールの重要な最初のステップです。 しかし、いくつかの大きな障害が単細胞腸管アトラスの規模拡大を妨げています。 まず、解離の継続時間とその手順自体により、下流の遺伝子発現の読み取り値に望ましくないアーチファクトが導入される可能性があります 15、16。 解離手順の各ステップは遺伝子発現に影響を与える可能性があるため、処理は厳密に必要なものに限定する必要があります。 第二に、解離手順は十分に徹底的であり、より脆弱な細胞タイプを損傷することなくすべての細胞を分離する必要があります。 これは、細胞アトラスの使用など、研究者が元の組織の正確な反映を研究したい場合に特に当てはまります。 生存可能な単一細胞の代表的なグループを取得することとアーチファクトを最小限に抑えることの間のバランスを微調整する必要があります。

元の組織のこの正確な反映を得るために、腸生検の現在の解離手順は 2 つの方法で改善できます。 第一に、多段階消化によって引き起こされる同じ組織由来の細胞間の差異を回避することによって、理想的には、一段階の解離手順を使用して組織全体を処理することになる。 しかし、腸から単一細胞を分離するための現在のゴールドスタンダードは、2 段階の解離手順です。最初に EDTA を使用して上皮層が解離され、続いて 37 °C のコラゲナーゼ処理 (以下、コラゲナーゼ処理と呼ばれます) を使用して固有層が解離されます。 2段階コラゲナーゼプロトコルとして）17、16、19。 第二に、腸組織に対する現在の scRNA-seq プロトコルは、これまで結腸内視鏡検査中の生検または外科手術による切除材料として収集された新鮮な腸材料に限定されていました。 その結果、一度に処理できるサンプルの数は非常に限られており、これを修正することができないままサンプル間にバッチ効果が生じる可能性があります。 これらの懸念に答えるために、最近開発された腸粘膜組織の凍結保存手順により、生きた細胞を使用した複数の腸サンプル実験を行うことが可能になりました 20,21。

これらの制限を克服するために、我々は、すべての細胞を同じ方法で処理する scRNA-seq プロトコルに適した新しい腸解離プロトコル (ワンステップ コラゲナーゼ解離) を開発しました。これは、連続的に分離される異なる細胞型間のバッチ効果を防ぐことを目的としています。 我々はまず、凍結保存がシークエンシング品質パラメーターやワンステップコラゲナーゼ解離細胞の細胞生存率には影響を及ぼさないが、おそらく細胞型組成と遺伝子発現レベルに影響を与えることを示した。 次に、凍結保存した生検材料に対するこの 1 ステップ コラゲナーゼ解離を使用して、シーケンス パラメーター、細胞生存率、細胞収量、scRNA-seq と FACS の遺伝子発現を、代表的な腸組織解離法 (2 ステップ コラゲナーゼ プロトコル) と、別の代替法 (2 ステップ コラゲナーゼ プロトコル) で比較します。 Bacillus licheniformis から単離された 4 °C で活性なプロテアーゼによる 3 段階消化 (3 段階プロテアーゼ) [22 および 23 から適応]。 後者のプロトコルは、細胞を 4 °C で代謝的に不活性に保つことで、一般に解離に関連する遺伝子発現アーティファクトを最小限に抑えることを目的としています。 さらに、scRNA-seq 研究のために、健康な腸におけるアノイキスが起こりやすい腸上皮細胞の死を防ぐように設計されました。 この手順の最初のステップでは、生検材料を低濃度の EDTA を含む氷上でインキュベートして、緩く結合した免疫細胞 (フラクション 1) を放出します。その後、浸潤している免疫細胞を含む上皮層を低温活性プロテアーゼを使用して解離します (フラクション 2)。 ) 両方の画分をコラゲナーゼ IV で短時間処理して完全な消化を確実にします。 細胞生存率、細胞型組成、および単一細胞遺伝子発現レベルに対する影響を比較することにより、最適な使用シナリオと各プロトコルの制限を決定しました。 次に、これをプロトコル決定ツールにまとめました。これは、科学者が生物学的疑問に最も適したプロトコルを決定するのに役立ちます。

異なる細胞型における異なる解離プロトコルの効果を同時に高分解能で評価するために、フローサイトメトリー (FACS) と scRNA-seq データの両方を使用して並べて比較を実行しました (図 1A)。 2 つの別々のデータセットを使用して、凍結保存または細胞解離プロトコルの効果を決定しました (図 1B)。 scRNA-seq の場合、凍結保存の効果は、ワンステップ コラゲナーゼ プロトコルを使用して 2 つのペアのサンプルで比較されましたが、細胞生存率、細胞型組成、および遺伝子発現に対する解離の効果は、異なるサンプル (より大きなセット) で比較されました。個人。 FACS の場合、凍結保存は 1 ステップのコラゲナーゼと 3 ステップのプロテアーゼ プロトコールのフラクション 2 で評価されましたが、細胞解離の影響はより大きなデータセットで評価されました。 各プロトコルにより、異なるコンパートメントが生成されました (図 1A)。

ワンステップ コラゲナーゼ プロトコルから得られたデータは、全体としての細胞型組成について分析されました。ここでは全生検 (WB) コンパートメントと呼ばれます。

2 段階のコラゲナーゼは、上皮層 (EL) 画分と固有層 (LP) 画分の 2 つの部分でそれぞれ分析されました。

3 ステップのプロテアーゼ プロトコールは、画分 1 (F1) と 2 (F2) の 50/50 混合物として、および画分 2 のみとして scRNA-seq を使用し、画分 1 と 2 として別々に FACS を使用して分析されました。

研究の概要とデータセット。 (A) 研究セットアップの概略図。 生検をサンプリングし、新鮮なものまたは凍結保存したものを使用し、37 °C でコラゲナーゼを使用するワンステップ コラゲナーゼ プロトコールを使用して解離しました。 ステップ 1 では EDTA を使用し、ステップ 2 では 37 °C でコラゲナーゼを使用する 2 ステップのコラゲナーゼ。 または、ステップ 1 の 4 °C EDTA インキュベーション、ステップ 2 のプロテアーゼ消化、およびステップ 3 の室温での短いコラゲナーゼ消化から始まる 3 ステップのプロテアーゼ プロトコル。 (B) 調査するために 2 つのデータセットが生成されました。凍結保存の影響、および 2. 細胞タイプの生存率、組成、トランスクリプトーム、および機能に対するさまざまな解離プロトコルの影響。 IEL、上皮内細胞。 EC、上皮細胞。 結腸内視鏡検査のピクトグラムは、Gan Khoon Lay によって描かれました (https://thenounproject.com/term/colonoscopy/1250282/)。

サンプルに対する凍結保存の影響を評価するために、フローサイトメトリー用の細胞生存率色素による 1 ステップ コラゲナーゼ プロトコルと 3 ステップ プロテアーゼ プロトコルを使用して解離後に得られた細胞生存率を比較しました。 両方のプロトコルのサンプルの細胞生存率が同様の生存率を示すことがわかりました (中央値 81.5%、SD 12.8、図 2A、補足表 1)。 ワンステップコラゲナーゼからの凍結保存サンプルの平均は新鮮サンプルよりも高かったが、差は有意ではありませんでした（p > 0.05、対応のない t 検定）。

FACS および scRNA-seq のワンステップ コラゲナーゼ プロトコールを使用して解離された細胞に対する凍結保存の影響。 (A) 全生検 (1 ステップ コラゲナーゼ プロトコール) および分画 2 (3 ステップ プロテアーゼ プロトコール) の新鮮なサンプルと凍結保存されたサンプルからの解離細胞における FACS 細胞生存率 (%) を示す箱ひげ図 (p 値 > 0.05; 対応のない t -テスト）。 サンプルサイズはプロットの下部に示されています。 ワンステップコラゲナーゼで解離した 2 対の新鮮サンプルと凍結保存サンプルから得られた scRNA-seq データの UMAP を、(B) 細胞タイプおよび (C) 保存条件によって色分けしました。 (D) scRNA-seq データから回収された相対的な細胞型頻度を細胞型ごとに色分けした棒グラフ。

ワンステップコラゲナーゼプロトコール後の scRNA-seq に対する凍結保存の影響を調査するために、2 人の個人から採取した新鮮なサンプルと凍結保存されたサンプルのペアを使用しました。 まず、シーケンス品質管理の基本パラメータは、シーケンスされたリードの品質、リードのゲノムへのマッピング可能性、および細胞の QC パラメータによって測定される RNA の完全性が、凍結保存手順の影響を受けないことを示しました (補足表 2)。 。 次に、トランスクリプトームに基づいて細胞をクラスター化し、「方法」で説明したように細胞型の同一性を決定しました (図 2B)。 ミトコンドリア遺伝子数には細胞タイプ依存の違いが存在するため、ミトコンドリア遺伝子の割合を細胞カテゴリー (上皮、間質、免疫) ごとに評価しました。 間質細胞および上皮細胞は、凍結保存後にミトコンドリア遺伝子発現が増加する傾向を示しますが、免疫細胞ではミトコンドリア遺伝子数が減少するようです（補足図 1A ～ D）。 より高い細胞型分解能でミトコンドリア遺伝子の割合を比較すると、新鮮なサンプルでは T 細胞が明確な二峰性分布を示していることが観察され、これは低品質の細胞が回収されていることを示している可能性があります (補足図 1E)。

UMAP を視覚化として使用することにより、新鮮な細胞と凍結保存された細胞が細胞タイプ間で比較的よく分布していることが観察されました (図 2C)。 細胞組成が保管モードによってどのように影響されるかを明らかにするために、scRNA-seq データ (図 2D) とフローサイトメトリー (補足図 2) の両方を使用しました。 scRNA-seq データでは、骨髄細胞 (5 ～ 1%) と線維芽細胞 (11 ～ 4%) の割合が減少し、上皮細胞 (47 ～ 67%) が増加しているという示唆的な証拠に注目しました (図 1)。 2D）。 同様に、凍結保存後、骨髄細胞 (約 5 ～ 2%) および B 細胞 (約 13 ～ 6%、scRNA-seq データでは観察されない) の細胞割合の大幅な減少が観察されましたが、上皮細胞の割合は減少しました。増加しました (~ 38 ～ 55%) (補足図 2)。

要約すると、1 ステップ コラゲナーゼと 3 ステップ プロテアーゼの両方のプロトコールで、凍結保存 (最長 14 か月まで検証) が細胞の生存率に大きな影響を及ぼさないことが観察されました。 我々は、以前の報告と一致して、骨髄細胞、線維芽細胞およびB細胞を除いて、全体的な細胞タイプの組成が凍結保存によってわずかに影響を受けるという示唆的な証拠を発見しました（図2D、補足図2）。 結論として、腸生検の凍結保存により、長期保存とよりハイスループットな実験セットアップが可能になります。 したがって、細胞生存率、細胞型組成、または遺伝子発現レベルに大きな悪影響がないことと合わせて、これがサンプル処理方法として最適です。

次に、細胞の生存率に対する細胞解離プロトコルの影響を調査しました。 新鮮なサンプルでは、​​主に上皮細胞と免疫細胞で構成される 3 ステップ プロテアーゼ プロトコールのフラクション 2 で最も高い細胞生存率が達成されましたが、2 ステップ コラゲナーゼの EL フラクションと比較した場合にのみ有意な差に達しました。プロトコル (図 3A、p < 0.05)。 2 番目に高い生存率は、1 ステップ コラゲナーゼ プロトコール (WB、全生検) および 2 ステップ コラゲナーゼ プロトコールで得られた LP (固有層、主に免疫細胞) によって達成されました (図 3A、補足表 1)。 我々は、二段階コラゲナーゼプロトコールにおいてEDTAのみで処理した上皮細胞が最も低い生存率を示すことを観察した(図3A、補足表1)。 ただし、これらの比較は有意ではありませんでした (p < 0.05)。

FACSおよび血球計算法によって評価された細胞生存率に対する解離プロトコルの影響。 (A) FACS によって測定された新鮮なサンプルの細胞生存率 (%) を比較する箱ひげ図。 (B) FACS および (C) トリパンブルー排除によって測定された凍結保存サンプル。 コンパートメントと解離プロトコルは x 軸に示されています。 平均細胞生存率をコンパートメント間で比較しました (対応のない t 検定)。 有意な比較 (p 値 < 0.05) のみがバーとして表示され、それぞれの p 値が比較されたコンパートメントの上に表示されます。 サンプルサイズは各プロットの下部に示されています。 WB、全生検。 EL、上皮層。 LP、固有層。 F1、フラクション 1; F2、分数 2。

凍結保存されたサンプルにおいて、1 ステップ コラゲナーゼ プロトコールの WB と 3 ステップ プロテアーゼ プロトコールの両方の画分を比較しました。 我々の結果は、3 ステッププロテアーゼプロトコルのフラクション 1 で細胞生存率が低下していること（約 60 ～ 66%）を示唆しています（FACS による p < 0.05、図 3B; トリパンブルー排除試験では決定的ではありません、図 3C）。

最後に、すべてのプロトコルにおける総遺伝子発現のうちのミトコンドリア遺伝子の割合を調査しました。 我々は、ワンステップコラゲナーゼプロトコールでは、他のプロトコールと比較してミトコンドリア遺伝子発現の割合が上昇しており、これが細胞死レベルの上昇の指標であることを発見しました24（補足図3A-H）。

ワンステップのコラゲナーゼ解離により、線維芽細胞、内皮細胞、グリア細胞などの他の細胞種も含む上皮細胞と免疫細胞がバランスよく回復しました（図 4、補足図 4）。 対照的に、両方の多段階プロトコルは、2 つの分離されたコンパートメントのいずれかで特定の細胞タイプの分離をサポートしました (図 4、補足図 4)。 3 段階のプロテアーゼ プロトコールは、腸細胞タイプの大部分を構成する上皮細胞の生存率をサポートするため、NK、ILC (ナチュラルキラー細胞と自然リンパ系細胞の混合)、内皮細胞、線維芽細胞などの希少な細胞タイプは過小評価されているようです。 scRNA-seq データでの比較による。 たとえば、FACS では、NK ILC は 3 ステップのプロテアーゼ プロトコールのフラクション 1 で最もよく捕捉されますが (補足図 4; コラゲナーゼ プロトコールでは ~ 5% 対 < 1%)、scRNA-seq データセットでは欠落しているように見えます (図4）。

scRNA-seq を使用して各プロトコルで回復した細胞タイプの割合の違い。 scRNA-seq によって特徴付けられる細胞型の割合の箱ひげ図。 結果として得られたサンプルの細胞型組成を、プロトコルおよびコンパートメント全体にわたって試験した(複数の試験に対するホルム補正を伴うウィルコクソン順位和試験、補足表6)。 コンパートメントと解離プロトコルは x 軸に示されています。 サンプルサイズはプロットの凡例に示されています。 WB、全生検。 EL、上皮層。 LP、固有層。 F1、フラクション 1; F2、分数 2。

特定の研究課題では特定の細胞型の単離が必要になる場合があるため、最も高い細胞生存率を備えた主要な細胞型のそれぞれの単離を最もサポートするプロトコルを評価しました。 2 ステップ コラゲナーゼ プロトコールの上皮層およびプロテアーゼ プロトコールのフラクション 2 は、1 ステップ コラゲナーゼ プロトコールよりも上皮細胞の分離をサポートします (p 値 < 0.05、図 4、フローサイトメトリーで確認、補足。図 4)。 ）。 一方、3 ステップのプロテアーゼ プロトコールのフラクション 1 では、最も精製された免疫集団が得られます (図 4)。ただし、凍結保存された生検を使用した場合には細胞生存率の低下が示唆され (図 3B ～ C)、層特異的な免疫細胞の減少が見られます。 CD8 + LPL T細胞などの免疫細胞（補足図6）。 ただし、層特異的な免疫細胞を最適に分離するには、2 段階のコラゲナーゼ プロトコルが最適なプロトコルです。 それにもかかわらず、コンパートメントの可変分離はすべての多段階解離プロトコルで依然として問題であり、バイアスの潜在的な原因となっています。 この変動は、インキュベーション時間、遠心分離速度、酵素と化学物質の濃度、温度、組織表面積、およびドナー固有の変動などの複数の要因によって引き起こされる可能性があります25。 したがって、scRNA-seq と表面タンパク質配列決定 (CITE-seq) の組み合わせ 26 をワンステップのコラゲナーゼ解離生検に適用することは、層特異的免疫集団 (CD103 + IEL 細胞など) を層特異的免疫集団の研究を可能にする優れた代替手段となり得ます。特定のバッチ効果。 さらに、ビーズ濃縮や FACS などの他の濃縮戦略では、特別な実験手順が必要になりますが、特定の解離プロトコルに限定されずにこの細胞種の濃縮を行うことができます。

要約すると、ワンステップのコラゲナーゼプロトコルはバランスの取れた細胞生存率で腸組成を捕捉しますが、特定のコンパートメントまたは細胞タイプに焦点を当てる場合はマルチステップのコラゲナーゼおよびプロテアーゼプロトコルの方が好ましいということです。

細胞の種類が異なれば化学処理に対する反応も異なるため、バッチ効果が生じる可能性があります。 異なる解離プロトコルがそのようなバッチ効果を誘発するかどうかを判断するために、ワンステップコラゲナーゼプロトコルで解離した新鮮なscRNA-seqサンプルと凍結保存されたscRNA-seqサンプルのペアに対して差次的遺伝子発現（DE）および経路分析を実行しました（補足表2および3a + b）。 。

以前の研究では、トランスクリプトームの 10 ～ 50% が解離の影響を受けることが示されています 27。 したがって、ワンステップコラゲナーゼプロトコルと同様に、すべての細胞タイプに対して同様の解離処理を行うと、示差的解離処理によって誘発される細胞間の DE が減少します。 差別的治療の効果を定量化するために、Smillie et al.の EL vs LP 画分に捕捉された上皮細胞に対して DE 分析を実行しました。 データセット17。 2 段階プロトコールの両方の画分に存在するこれらの上皮細胞を研究することで、EL (EDTA のみ) 画分と LP (EDTA、その後コラゲナーゼ) 画分間の異なる処理の効果を定量化することができます。 この DE 分析により、222 個の DE 遺伝子が明らかになり、そのうち 34 個はマウスのコラゲナーゼ解離筋幹細胞においてコラゲナーゼ誘導性であることが以前に記載されていました 15。 注目すべきことに、これらの34個のコラゲナーゼ誘導性遺伝子のそれぞれが、LP画分(すなわち、コラゲナーゼで処理した画分)において上方制御されていることが見出された。 まとめると、この分析は、差動処理によって誘導された EL 画分と LP 画分の間の明確なバッチ効果を明らかにし、以前に記載されたコラゲナーゼ誘導性遺伝子 (DE 遺伝子リストの 34/222 コラゲナーゼ誘導性遺伝子の濃縮) を示します。非 DE 遺伝子にあった 104/3947、Fisher Exact p < 0.00001)。 ワンステップコラゲナーゼプロトコルを使用すると、この差動処理のバッチ効果が回避されます。

1段階プロトコールのコラゲナーゼ処理上皮細胞を、2段階コラゲナーゼのEDTA処理細胞と、プロテアーゼプロトコールのEDTA + プロテアーゼ + コラゲナーゼ処理細胞と比較しました。 我々は、ワンステップコラゲナーゼプロトコールの上皮細胞が、それぞれ95個（全DE遺伝子の10％）および60個（全DE遺伝子の7％）の既知のコラゲナーゼ誘導遺伝子16（補足表3a）の上方制御を示すことを発見した。 FOS や JUN などの遺伝子 (補足表 3a + b、補足図 5)。 これら 95 個および 60 個の DE 遺伝子のうち、重複しているのはコラゲナーゼ誘導性遺伝子の合計 13 個だけであり、コラゲナーゼがここでの遺伝子発現の違いに寄与する唯一の要因ではない可能性があることを示しています。

免疫細胞 (骨髄細胞、B および T リンパ球) は、B 細胞を除いて、ワンステップ コラゲナーゼ プロトコールとマルチステップ プロトコールの間でほぼ同様の数の DE 遺伝子を明らかにしました。 これらの細胞では、1 ステップのコラゲナーゼ プロトコルと複数ステップのプロトコルで上方制御された遺伝子の数と下方制御された遺伝子の数に大きな差異が観察されました。 2 ステップ対 1 ステップのコラゲナーゼ プロトコールでは 976 個の遺伝子がダウンレギュレートされますが、90 個の遺伝子がアップレギュレートされます (補足表 3a)。

注目すべきことに、骨髄細胞およびB細胞は、3段階プロテアーゼプロトコールと比較して、1段階コラゲナーゼで上方制御されるコラゲナーゼ誘導遺伝子の最も高い割合を示します(それぞれ27%および25%)(補足表3a)16。 これは、これらの細胞タイプがコラゲナーゼ消化時間に最も敏感である可能性があり、細胞タイプの細胞サブタイプ組成に影響を与える可能性があることを示しています（たとえば、ほとんどが形質細胞であるのに対し、ほとんどがB細胞であるなど）（補足図4）。 FACS における一段階コラゲナーゼ消化細胞と比較して、プロテアーゼ中の B 細胞の割合が高く、形質細胞の割合が低い傾向があり、この理論を裏付けています (補足図 4)。 さらに、多くの遺伝子が消化に使用される酵素以外の要因（消化時間や温度差など）の影響を受けることも示唆されています。

全体として、コラゲナーゼ I + II 含有リベラーゼで処理される 2 段階コラゲナーゼ プロトコールによる固有層には、ほとんどの骨髄細胞が含まれています (図 4、補足表 6)。 しかし、酵素消化とその持続時間は同等であるため、コラゲナーゼ IV 処理ワンステップコラゲナーゼ解離生検における骨髄細胞の割合も同様であると予想されました。 解離酵素が細胞サブタイプの解離効率に影響を与えることが示されています28。 2 ステップ コラゲナーゼ プロトコールと比較して、1 ステップ コラゲナーゼ プロトコールにおける骨髄細胞数が低いのは、1 ステップ コラゲナーゼ解離サンプルの凍結保存の結果である可能性があります 20 (図 4、補足表 6)。

1 段階のコラゲナーゼ消化と 3 段階のプロテアーゼ消化後に T 細胞で上方制御される経路の中で、「インターロイキンによるシグナル伝達」と「外部刺激に対する細胞反応」が浮上しており、温コラゲナーゼ プロトコルが間接的に T 細胞を活性化する可能性があることを示唆しています。コールドプロテアーゼ消化は、分離中の免疫細胞の活性化を妨げる可能性があります (補足表 3b)。

線維芽細胞は、1 ステップ プロトコールとの両方の比較で最も多くの DE 遺伝子を示しました。2 ステップ コラゲナーゼ プロトコールでは 2,184 個の遺伝子が DE であり、3 ステップ プロテアーゼ プロトコールでは 1,833 個の遺伝子が DE でした。 しかし、興味深いことに、これらの DE 遺伝子の中には、コラゲナーゼ誘導性遺伝子はごく一部しか存在しませんでした (それぞれ 8% および 10%) (補足表 3a)。 これは、線維芽細胞が必ずしもコラゲナーゼ処理に感受性があるわけではないが、おそらく解離に使用される他の化学物質 (つまり EDTA) の方が大きな影響があることを意味します。

凍結保存された生検材料でワンステップコラゲナーゼ消化後に生存可能で機能的な単一細胞を収集する実現可能性を実証するために、腸オルガノイド (補足図 8A) と IEL (補足図 8B–C) の両方が腸管から正常に増殖できることを実証しました。 scRNA-seq 後の残りの細胞。 IELの増殖のために、残存細胞をFACSで選別し、10日間増殖させた。 このようにして、IEL​​ は表現型を維持しながら出発材料から最大 30 倍まで拡張できました (補足図 6)。 これらの発見は、凍結保存された生検を使用して、同じサンプルからの細胞の機能と遺伝子発現の両方を研究できる可能性を強調しています。 まとめると、これらの結果は、同じ生物学的材料からの実験的検証に続く単一細胞オミクス実験を設計する可能性を開き、それによってバッチ効果を軽減し、同じ遺伝的および環境的コンテキストを持つサンプルからの複数層の情報の取得を容易にします。

この研究では、現在のゴールドスタンダードである 2 段階コラゲナーゼ解離 17,19,29 および 3 段階プロテアーゼ解離 [22 および 23 から適応] に代わる十分に根拠のある代替手段として、1 段階コラゲナーゼ腸生検消化プロトコルを提案します。 このワンステッププロトコルの主な利点は、時間、コスト、手順の削減、マルチステッププロトコルにおけるさまざまなコンパートメントの逐次解離に伴うバッチ効果の防止、および高レベルの再現性と実験の柔軟性です（図）。 .5）。 さらに、このプロトコルは、オルガノイドを使用した機能研究や scRNA-seq または FACS を使用した下流解析に適した、凍結保存後も生存可能な単一細胞を生成することを示します。

scRNA-seq の腸組織の単一細胞解離の決定木。 (A) 研究者が特定のニーズに基づいて腸組織の解離プロトコルを選択できるように設計されたフローチャート。 (B) プロトコル間の主な違いの概要。 IEL、上皮内細胞。 EC、上皮細胞。 EL、上皮層。 LP、固有層。 F1、フラクション 1; F2、分数 2。

生検を凍結保存すると、より効率的な処理が可能になり、したがって実験バッチの数が減ります。 新鮮な生検材料が複数のドナーから同時に収集されることはほとんどないため、通常、新鮮な材料は一度に 1 つのサンプルずつ処理されます。 対照的に、凍結保存では、同時に処理できるサンプルの数が大幅に増加し、異なる時点や患者からのサンプルを混合することができます。 ワンステップコラゲナーゼプロトコルを使用すると、1 人あたり 8 つのサンプルを 1 時間以内に処理できます。 さらに、凍結保存により、（隣接する）組織の病理報告を待つことができるほか、サンプル処理前にサンプルの炎症や悪性腫瘍の状態を調査することができます。 これは、同じ患者を長期的に研究する場合や、特定の関連する臨床事象に関連するサンプルを収集しようとする場合に非常に有利です。 このターゲットを絞ったサンプルの選択により、不適切なサンプルの処理が制限されるため、コストがさらに制限されます。 これまでに、凍結保存により、腎臓 30、膵臓 31、滑膜 32 組織などのさまざまな組織で scRNA-seq に適した生存細胞が得られることが示されています。 私たちの知る限り、腸粘膜に関してはこれまでそのような研究は行われていません。 さらに、Konnikova et al. は、腸粘膜の凍結保存により高い細胞生存率と機能が維持されることを示し、凍結保存された腸粘膜組織が scRNA-seq20 に適していることを示唆しています。 限られた数の 2 つのペアのサンプルでは、​​良好な細胞生存率と機能性を超えて、凍結保存は細胞型の組成と遺伝子発現にわずかな影響しか与えず、scRNA-seq 解析での使用に適していることがわかります。

サンプルを凍結保存し、マルチステップ プロトコルよりもワンステップ プロトコルを使用することには明らかな利点がありますが、他の実験セットアップがより最適である特定のケースもあります。 たとえば、層特異的な細胞型の収量を最適化する場合や、特定の層にのみ存在する細胞型をマークする表面タンパク質が利用できない場合には、多段階の解離プロトコルが好ましい場合があります。 さらに、凍結保存には多くの利点がありますが、骨髄細胞が目的の主要な細胞タイプである場合には、骨髄細胞が失われるため、新鮮な材料を使用する必要があります。

要約すると、解離プロトコルを決定する際には、細胞組成、細胞生存率、バッチ効果などの多くの要素を比較検討する必要があります。 尋ねられる研究質問に応じて、これらの要素の重要性は変わる可能性があります。 したがって、考えられるすべての状況に最適な解離アプローチは存在しません。 この研究での比較に基づいて、我々はプロトコル決定ツールを開発しました。このツールは、科学者が実験設定と質問に最適な解離戦略を決定するのに役立つ決定ツリー内のいくつかの質問をガイドします (図 5)。

凍結保存して解離した細胞を使用して上皮細胞と免疫細胞を増殖させることにより、scRNA-seq 以外の実験でも使用できるワンステップ プロトコールの多用途性を示しました。 私たちは、同じ生物学的材料から複数の層のデータを取得できるため、機能検証とハイスループット技術の両方の適用が可能になると考えています。 たとえば、プロテアーゼまたはコラゲナーゼのいずれかを使用して細胞を解離した後の表面マーカーの存在を示す我々の結果に基づいて、CITE-seqなど、表面マーカーと単一細胞転写の両方を同時に研究する方法で細胞を使用できます。 適用できるもう 1 つの方法は CyTOF です。これにより、数百万の細胞で約 40 個の細胞表面マーカーを同時に探索でき、（まれな）細胞タイプの表面マーカーの同定が可能になります 33。 実証されているように、適切に処理すれば、細胞を単離して増殖させることができ、それによってさらなる機能分析が可能になります。 まとめると、凍結保存された生検を使用したここで提示されたワンステップコラゲナーゼ解離プロトコルは、個別化医療にプラスの影響を与える可能性があります。 まず、疾患に関連する特定の組織を詳細に特徴づけて、病原性細胞の種類を特定できます。 第二に、これらの病原性細胞は、治療のための新しい薬物標的の発見を可能にし、そのような薬物の有効性を評価するために使用することさえできるかもしれない34。

すべての細胞解離プロトコルにおける制限の 1 つは、細胞の空間構成が失われることです。 前述したように、腸は複雑な組織であり、特定の細胞がどのように動作するかを決定する際に位置が重要な役割を果たします。 現在、組織内の細胞局在の研究に役立つイメージングマスサイトメトリー 35 や空間トランスクリプトミクス 36,37 などの新しい開発が行われています。 深い単一細胞マルチオミクス技術と組み合わせて、複雑な疾患における腸のインタラクトームを特徴付けることは、医学の新たな進歩への扉を開く可能性があります。

この原稿で比較した単細胞解離法に加えて、単核単離法は、解離法に関連するバッチ効果を回避するため、または凍結組織しか利用できない場合に適切な代替手段となる可能性があります 38,39。 核と個々の細胞の細胞質トランスクリプトームを比較すると、相関は高くなりますが、核に捕捉された UMI の数は常に、単一細胞で捕捉できる数の一部にとどまります 40,41。 その上、現在、腸の非常に不均一な組織内に存在するあらゆる種類の細胞から scRNA-seq 用の核を効率的に単離できるプロトコルは存在しません。 それにもかかわらず、このようなプロトコルが利用可能になれば、凍結保存された単一細胞解離法の興味深い代替手段となる可能性があります。

我々は、将来の科学者がバッチ効果を限定しながら計画可能な大規模（多施設）研究を実施できるようにする新しい腸粘膜組織解離プロトコルを提案します。 腸粘膜組織の解離の解離プロトコルを比較した研究はほとんどなく、ましてやその後の scRNA-seq の解離プロトコルを比較した研究はほとんどなく、ここで提示した発見の重要性が強調されています。 腸粘膜の組成を考慮すると、この論文で説明した方法論は、単一細胞シーケンス研究を目的とした、肺や口腔粘膜などの他の粘膜組織の解離と凍結保存の良い出発点になる可能性があると考えられます。 さらに、この結果は、他の分野の研究者に、scRNA-seq データに影響を与える要因について疑問を抱かせる可能性があります。

生検は、GlutaMax (Gibco) および 5% 熱不活化 FCS を添加した RPMI1640 で収集されました。 収集後、氷上で最大 30 分間保管しました。 生検は、解離のために直接使用されるか（新鮮な）、または冷凍結培地（10％ DMSOを含む90％熱不活化FCS）で凍結保存されました。 生検の凍結保存と解凍手順は前述のように実行されました20。 つまり、生検を 37 °C のウォーターバスですばやく (60 秒未満) 解凍し、冷解凍溶液 (MgCl2 および CaCl2 を含まない PBS、5% 熱不活化 FCS を補充) で 2 回洗浄しました。 我々は 2 つのデータセットを生成しました。1 つはワンステップコラゲナーゼプロトコールのみで解離した 2 人の個体から採取したペアの新鮮な凍結保存サンプルを使用した「凍結保存データセット」、もう 1 つはペアのない「細胞解離」データセットで、すべての方法で分離された異なる個体からの腸生検を使用しました。解離プロトコルは以下に記載されています。 「細胞解離」データセットについては、Smillie et al. の 2 段階コラゲナーゼ消化細胞を使用しました。 データセット17。

生検は、次の 3 つのプロトコルのいずれかに従って分離されました。

前述のように、新鮮な生検材料とコラゲナーゼ I + II 含有リベラーゼを使用し、IEL 層と LPL 層を分割する 2 段階のコラゲナーゼ プロトコル。

前述のように新鮮な生検とコールドプロテアーゼを使用し、F1 と F2 を分割する 3 ステップのプロテアーゼプロトコル [22 および 23 から適応]

ワンステップのコラゲナーゼプロトコル。凍結保存した生検とコラゲナーゼ IV を使用して、1 つの消化ステップで生検全体 (WB) を分離します。

つまり、2 ステップのコラゲナーゼ プロトコールでは、新鮮な生検材料を EDTA を含む RPMI1640 中で 37 °C のロティサリー ラック上で 15 分間インキュベートし、その後完全に振盪して固有層から上皮層を剥離します。 次に、分割層を 37 °C で 30 分間回転させながら別々に消化します。上皮層は TrypLE Express Enzyme (Gibco) で消化し、固有層は混合コラゲナーゼ調製物 (Liberase TM) で消化します。

3 段階のプロテアーゼ プロトコールでは、まず生検材料を小さな断片に切断します。 続いて、EDTA を添加した冷 (4 °C) HBSS 中でピペット混合することにより、主に免疫細胞である画分 1 が分離されます。 これらは上清中に除去され、上皮細胞と固有層細胞は組織塊の中に残ります。 次に、冷(4°C)プロテアーゼおよびEDTAとともにHBSS中で30分間インキュベートして、上皮層と固有層を解離させ、続いて室温で10分間のコラゲナーゼ消化を行って、最終的な組織塊を解離させます(画分2)。 次に、すべての細胞を ACK 溶解バッファーとインキュベートして、未生存細胞を除去した後、最後の 2 回の洗浄を行います。

ワンステップコラゲナーゼプロトコルでは、生検を消化培地（GlutaMax (Gibco)、200 iU/mL コラゲナーゼ IV C1889 (ThermoFisher)、10 iU/mL DNAse II D8764 を添加した RPMI1640 を添加した RPMI1640) の振盪インキュベーター内で 37 °C で 25 分間インキュベートします。 ThermoFisher)、35 iU/mL SUPERaseIn AM2694 (Invitrogen)、2% 熱不活化 FCS)。 最適には、2.5 ml の消化培地あたり 2 ～ 4 個のピンチ生検が解離されます。 消化培地中で 10 分間インキュベートした後、生検材料を p1000 ピペットチップで再懸濁します。 生検が十分に消化されない場合（直腸は一般に回腸よりも丈夫で、線維化組織はより困難な場合があります）、（洗浄、滅菌した）ハサミで生検を切断したり、より大きなピペッティング内腔を可能にするためにピペットチップを切断したりすることがあります。 さらに 15 分間インキュベートした後、p1000 チップ、続いて p200 チップを使用して生検を再度ピペットで濾します。 次に、5 mM EDTA (Sigma) を氷上で 2 分間添加して消化を停止します。 次いで、コラゲナーゼ－ＥＤＴＡ試薬の残留効果を最小限に抑えるために＞１０ｍｌのＲＴ ＰＢＳ－／－を添加し、その後細胞を３００ｇ、ＲＴで５分間遠心分離する。 ペレットを１００μｌのＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ中に再懸濁し、３７℃の水浴中で１．５分間インキュベートする。 2% 熱不活化 FCS を含む冷 RPMI1640 を添加することで酵素反応を停止し、細胞を 300 g、4 °C で 5 分間遠心分離します。 次に、ペレットを冷洗浄バッファー I (0.4% BSA および 10 iU/mL DNase II を補充した PBS -/-) に再懸濁し、70 um セル ストレーナーで濾過します。 細胞収集を最大限に高めるために、フィルターを冷洗浄バッファー II (0.4% BSA を添加した PBS -/-) でもう一度洗浄し、4 °C、300 g で 5 分間遠心分離した後、細胞を収集します。

配列バッチ間の違いによって誘発される影響を防ぐ可能性がある多重化を可能にするために、個別のサンプルからの解離細胞は、メーカーのプロトコールに従って TotalSeq-A オリゴ結合ハッシュタグ抗体 (Biologend) を使用してバーコード化抗体で標識されます (「セルハッシュ」)。アル。 2018]。 つまり、400,000個の細胞を、0.5μgのハッシュタグ抗体および100μlの染色緩衝液とともに、氷上のロッキングプレート上で30分間インキュベートする。 この後、細胞を0.4% BSAを添加したPBS-/-で2回洗浄して、過剰なハッシュタグを除去する。 そうすることで、ワンステップ コラゲナーゼ プロトコルで解離された凍結保存サンプルが個別にハッシュされ、10 × レーン プールあたり 4 サンプルごとにプールされます。 新鮮なサンプルが収集され、分離され、単一の 10 × レーンに個別にロードされます。

細胞生存率は、トリパンブルー染色試薬 (Sigma、T6146) で細胞を 1:1 で染色することにより、10X Genomics Chromium Controller にロードする前に測定し、血球計を使用して計数しました。 %生存率は、[染色された細胞の数]を[全細胞の数]×100%で割ったものとして計算されました。

ハッシュタグおよび cDNA ライブラリは、Biolegend の説明書と 10X Genomics ライブラリ キットに付属のプロトコルを組み合わせて使用​​して生成されました (1 ステップ コラゲナーゼ プロトコルの場合は v2 と v3、3 ステップのプロテアーゼ プロトコルの場合はそれぞれ v3 と v3.1)。 これらの解離手順は、10X ゲノミクス ライブラリープレップ v1 および v2 を使用して生成された、2 ステップ コラゲナーゼ プロトコル 17 を使用して収集された以前に公開されたデータと比較されました。 ワンステップコラゲナーゼプロトコールのサンプルを含むライブラリーの一部は、BGI (香港) で 150 bp PE キットを使用して Illumina NovaSeq6000 で、またカスタム プログラム (28-8-150 bp) を使用して 100 bp PE キットを使用して BGISEQ500 で配列決定されました。それぞれ100-8-150 bp）。 ライブラリーの配列は、cDNA ライブラリーの場合は細胞あたり平均 110,442 (SD 42,975) リード、ハッシュタグ ライブラリーの場合は細胞あたり 3,073 (SD 1,768) リードでした。 3 ステップ プロテアーゼ プロトコールのサンプルを含むライブラリーは、Sanger Institute (Hinxton、UK) で、一部は HiSeq 4000 75 PE キット、一部は NovaSeq S4 100 PE XP マシンで配列決定されました。 プロテアーゼ ライブラリーは、cDNA ライブラリーの細胞あたり平均 103,181 (SD 34,489) リードまで配列決定されました。

CellRanger v3.0.2 mkfastq および count パイプラインは、FASTQ ファイルの作成、ワンステップ コラゲナーゼ サンプルの hg19 参照ゲノムおよびプロテアーゼ サンプルの hg38 参照ゲノムへのシーケンシング リードの位置合わせ、細胞および UMI (固有分子識別子) のフィルタリングに使用されました。 ) バーコード、および細胞ごとの遺伝子発現のカウント。 下流データ分析は、Seurat v3.1.4 を使用して実行されました。 カウントマトリックスは、200 個未満の遺伝子と 60% を超えるミトコンドリア読み取りを含む細胞についてフィルタリングされました。 ハッシュタグ データは中心対数比変換を使用して正規化され、HTODemux を使用して各セルにハッシュタグ ID が割り当てられました。 さらなる分析のために、単一のハッシュタグ ID 付きセルのみが選択されました。

クラスターは、データ内に存在する細胞タイプに適合することを目的として、さまざまな解像度を使用して定義されました。 細胞型の分類は 2 段階のアプローチを使用して実行されました。 まず、scPred パッケージ 42 を使用して、2 ステップのコラゲナーゼ プロトコル 17 からのソース データの細胞タイプごとに 750 細胞のサブセットで SVM 予測モデルをトレーニングしました。これは、上記と同じ QC ステップを使用してフィルタリングおよび準備されました。 このモデルは、他の 2 つのプロトコルのそれぞれで生成されたサンプルの大まかな細胞タイプを予測するために使用されました。 次に、ミトコンドリア遺伝子とリボソーム遺伝子の割合を退行させながら、3 つのプロトコルすべてのデータセットを SCTransform 統合 43 を使用して統合しました。 この統合データセットの最初の 30 の主成分は、Seurat の FindCluster 関数を使用したセル クラスタリングに使用され、UMAP を使用してこれを視覚化しました。 得られた細胞型の細胞型特異的マーカーは、付録に示されています。 図9。

凍結保存データセットを使用して、基本的なシーケンス品質パラメーターに対する新規使用と凍結保存の影響を評価しました。 まず、凍結保存データセットの新鮮なサンプル 1 つと、凍結保存データセットの 1 対の凍結保存サンプルおよび研究室で同様に処理された 5 つの凍結保存サンプルからシーケンス パラメーターの概要を作成しました。

次に、凍結保存データセットと解離データセットについて、発現した遺伝子の数と各データセットに存在する UMI の数の間の関係をクエリすることでデータの品質を評価しました。 次に、ミトコンドリア遺伝子発現とデータセット内に存在する UMI の数を視覚化しました。

DE 分析は、Seurat の FindAllMarkers 機能を通じて MAST を使用して実行されました44。 このために、ライブラリースケール (細胞あたり 10,000 転写物)、log-2 変換された RNA 発現データを入力として使用しました。 調査したクラスターのいずれかに属する細胞の少なくとも 10% に存在し、対数倍率変化が少なくとも 0.25 である遺伝子のみをテストしました。 解析にはグループあたり 100 個を超える細胞の比較のみが含まれ、比較されたグループすべてに存在する遺伝子のみがその後の経路解析に含まれました。

遺伝子発現に対するコラゲナーゼ処理の影響を評価するために、Smillie et al. プロトコルの最初のステップと 2 番目のステップからそれぞれ得られたデータセット 17 を比較しました。 まず、主要なデータセットからセルをサブセット化しました。 2 つのステップ間のサイズの違いにより分析が歪む可能性があるため、細胞は解離ステップごとに一致する数の 2617 細胞にダウンサンプリングされました。 示差的発現分析を以下に記載するように実行し、得られた遺伝子を 140 個のコラゲナーゼ誘導性遺伝子セットとの重複についてスキャンしました 15。 フィッシャーの直接確率検定を実行して、差次的に発現された遺伝子にコラゲナーゼ誘導遺伝子が豊富であるかどうかを評価しました。

クラスターごとに上方制御される経路は、Reactome 経路データベース (https://reactome.org/) を備えた ReactomePA パッケージ 45 を使用して決定されました。 まず、上方制御された遺伝子の遺伝子シンボルを Entrez ID に変換し、次に調整された p 値 < 0.05 で濃縮された経路を計算しました。

補足表 4 に示すように、単一細胞懸濁液を 3 つの抗体パネルの 1 つで染色しました。簡単に説明すると、細胞を 300 g で 5 分間遠心分離し、2% FCS を補充した 100 μL PBS に再懸濁しました。 次に、細胞を 4 °C で 30 分間染色し、その後 2 回洗浄し、2% FCS を補充した 400 μL の PBS に再懸濁しました。 FACS データは、BD LSR-II システム (BD Bioscience) を使用して生成され、補足に示されているゲーティング戦略に従って FlowJo v10 を使用して分析されました。 図9。

細胞は、補足表 4 に示されている生存率色素を使用して染色されました。死細胞は、補足表 4 に示されているゲーティング戦略によって決定されました。 図9。

オルガノイドは、ワンステップ コラゲナーゼ プロトコールで解離された細胞を使用して生成されました。 scRNA-seq用の10×チップをロードした後に残った細胞をオルガノイド培養に使用しました。 細胞を10mlのHGF培地で洗浄した。 細胞を4℃、1000rpmで5分間遠心分離し、上清を除去した。 １５μｌのマトリゲルをペレットに添加し、これを９６ウェルプレートにプレーティングした。 プレートを37℃のインキュベーター内で上下逆にして15分間インキュベートした。 プリモシンを含む200μlのEM培地をウェルに添加した(1:500)。 液体窒素中での凍結に必要な密度が達成されるまで、オルガノイドを膨張させました。

IEL 細胞 (CD45 + CD3 + TCRαβ + CD8αβ + CD103 +) を腸組織から単離し、プロトコル 46 に従って in vitro で増殖させました。 簡単に説明すると、IEL 表現型を持つ腸からの解離細胞を Beckman Coulter MoFlo Astrios セルソーターで選別しました。 IEL は、10% ヒト AB 血清 (Sigma Aldrich、H4522)、0.1% IL-2 (RD System、AE5916003)、0.1% pPHA-L (Sigma、L2769-2MG) および以下からなるフィーダー細胞の混合物を含む RPMI で培養しました。 3 人の異なるドナーからの放射線照射された PBMC とエプスタイン・バーウイルスで形質転換された B 細胞のデータ。 フィーダー細胞混合物は、10 PBMC:1 EBV:1 CD8 + 細胞の比率で調製されました。 次いで、細胞を10日間増殖させ、FACSによって分析して細胞の純度を確認した。

生物学的材料は、地域の倫理委員会（フローニンゲン大学医療センターおよびイングランド東部の医療倫理委員会、ケンブリッジ南研究倫理委員会）によって承認されたプロトコールに従って患者から取得され、材料を提供した個人は書面によるインフォームドコンセントを与えた。 実験プロトコルは、フローニンゲン大学医療センターの医療倫理委員会 (NL58808.042.16、NL24572.018.08) およびイングランド東部ケンブリッジ南研究倫理委員会 (17/EE/0338) によって承認されました。

現在の研究中に生成されたデータセット、および/または現在の研究中に分析されたデータセットは、MOLGENIS47 リポジトリ https://downloads.molgeniscloud.org/downloads/singelcell_methodspaper/ で入手できます。 この研究をサポートする FACS ファイルは、著者へのリクエストに応じて入手できます。

すべてのコードは GitHub から入手できます: https://github.com/WeersmaLabIBD/SingleCell/tree/master/Method_comparisons。

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原稿を編集してくれた Kate Mc Intyre に感謝します。 オルガノイドの生成における彼の努力と、オルガノイド製品のプロトコルと画像を共有してくれた Tjasso Blokzijl に感謝します。 IEL 細胞の単離と増殖における Joram Mooiweer 氏と Fulya Doganay 氏の尽力に感謝します。

WTCUV は武田薬品からの無制限の研究助成金によって支援されています。 ADRS は、CONACYT-I2T2 奨学金 (番号 459192) によってサポートされています。 IJ は、フローニンゲン大学のロザリンド フランクリン フェローシップとオランダ科学研究機構 (NWO) VIDI 助成金 (番号 016.171.047) によって支援されています。 SWは、オランダ政府の教育・文化・科学省が資金提供するNWO重力プロジェクト(024.003.001)であるオランダ・オルガン・オン・チップ・イニシアチブの支援を受けました。 RKW は武田薬品、ジョンソン・エンド・ジョンソン、トラメディコ、フェリング 37 ファーマシューティカル カンパニーからの無制限の研究助成金によって支援されており、さらに武田薬品工業のコンサルタントでもあります。 LF は、武田薬品からの無制限の研究助成金、Oncode Investigator 助成金および NWO Vici 助成金 (番号 917.14.374) によって支援されています。 EAMFは、武田薬品からの無制限の研究助成金、ZonMWからの臨床フェロー助成金、およびオランダ消化器病学会からのGastrostart助成金によって支援されています。 MGPvdW は、NWO Veni 助成金 (番号 192.029) によってサポートされています。

これらの著者は同様に貢献しました: Werna TC Uniken Venema と Aarón D. Ramírez-Sánchez です。

フローニンゲン大学、フローニンゲン大学医療センター、消化器科および肝臓病科、フローニンゲン、オランダ

ヴァーナ TC ユニケン ベネマ、エミリア ビガエワ、リンス K. ウィールスマ、エレオノーラ AM フェステン

フローニンゲン大学遺伝学部、フローニンゲン大学医療センター、フローニンゲン、オランダ

ウェルナ TC ウニケン・ヴェネマ、アーロン・D・ラミレス＝サンチェス、セボ・ウィソフ、アイリス・ヨンカーズ、ルーデ・フランケ、モニーク GP ファン・デル・ワイスト

ウェルカム サンガー研究所、ヒンクストン、ケンブリッジシャー、CB10 1SA、英国

レベッカ・E・マッキンタイア & メンナタラ・グーラバ

ケンブリッジ大学病院NHS財団トラスト、アデンブルックス病院、消化器科、ケンブリッジ、英国

ティム・レイン

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WTCUV、ADRS、EVB、REM、MG、MGPvdW はウェットラボ実験を実施しました。 RKW、EAMF、TR がサンプルを提供しました。 WTCUV、ADRS、EAMF、MGPvdW がこの原稿を考案し、執筆しました。 SW と IHJ は原稿の執筆と査読を支援しました。 LF、RKW、および EAMF は、この原稿につながるプロジェクトに対して財政的支援を提供しました。 WTCUV と ADRS は統計分析を実行しました。 著者全員が原稿の編集に参加しました。

Eleonora AM Festen または Monique GP van der Wijst への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

ユニケン・ベネマ、WTC、ラミレス・サンチェス、AD、ビガエバ、E. 他腸粘膜解離プロトコルは、細胞型の割合と単細胞遺伝子発現レベルに影響を与えます。 Sci Rep 12、9897 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-13812-y

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受信日: 2021 年 1 月 19 日

受理日: 2022 年 5 月 27 日

公開日: 2022 年 6 月 14 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13812-y

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