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Mar 09, 2023

中和抗体の推進

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 13、記事番号: 4831 (2022) この記事を引用

8177 アクセス

4 引用

165 オルトメトリック

メトリクスの詳細

T細胞とB細胞はどちらもSARS-CoV-2感染後に生成されることが示されているが、どちらかを研究するためのプロトコルや実験モデルはあまり一般的ではない。 ここでは、スパイク (S) の受容体結合ドメイン (RBD) と SARS-CoV-2 のヌクレオカプシド (N) 抗原を含むキメラタンパク質 (SpiN) を生成します。 SpiN に特異的な記憶 CD4+ および CD8+ T 細胞は、コロナバック SARS-CoV-2 ワクチンを接種した個人と、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) 回復期のドナーの両方の血液から検出できた。 マウスでは、SpiN は T 細胞による強力な IFN-γ 応答と、不活化ウイルスに対する高レベルの抗体を誘発しましたが、中和抗体 (nAb) は検出できませんでした。 重要なのは、ポリ ICLC アジュバント添加 SpiN を用いたシリアンハムスターおよびヒト アンジオテンシン転換酵素 2 トランスジェニック (K18-ACE-2) マウスの免疫化は、ウイルス量、肺のウイルス量によって示されるように、野生型 SARS-CoV-2 に対する強力な耐性を促進することです。炎症、臨床転帰、致死率の低下。 SpiN によって誘導された防御は、CD4+ および CD8+ T 細胞の枯渇によって消失し、ワクチン接種されたマウスからの抗体によって伝達されませんでした。 最後に、SpiN のワクチン接種は、K18-ACE-2 マウスをデルタおよびオミクロンの SARS-CoV-2 分離株による感染からも保護します。 したがって、NおよびRBDタンパク質に特異的なエフェクターT細胞を誘発するワクチン製剤は、新型コロナウイルス感染症ワクチンを改良し、懸念される変異体による免疫回避を回避するために使用できる可能性がある。

2019年末以来、世界中で新型コロナウイルス感染症による5億人以上の感染者と600万人以上の死亡が報告されている。 現在使用されているすべてではないにせよ、ほとんどの 新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) ワクチンは、スパイク (S) タンパク質と中和抗体 (nAb) に基づいています 1、2。 しかし、Sタンパク質からの受容体結合ドメイン（RBD）および隣接セグメントのアミノ酸変化を伴うSARS-CoV-2変異体のポジティブセレクションは、懸念される変異体（VOC）を生成する頻繁な事象である3,4。 VOC は RBD の構造変化を起こし、アンジオテンシン変換酵素 2 (ACE-2) に対する親和性と nAbs5 の作用を回避する能力を強化します。 フィットネスを維持しながら、S タンパク質のこれらの構造変化は、多くの場合、ウイルスの感染力の強化と関連しており、ヒトに広がります 6,7。 実際、立体構造 RBD エピトープを標的とする現在のワクチンの有効性は、VOC 1、6、8、9、10、11、12 の出現によって疑問視されています。

nAb はスパイク (S) タンパク質の RBD に結合し、SARS-CoV-2 と ACE-2 の相互作用および後方の宿主細胞侵入を防ぎます 13。 ワクチン接種または感染によって誘発される nAb のレベルは防御免疫の主な予測因子として考えられていますが、因果関係はまだ確立されていません 14、15、16。 重要なことは、SARS-CoV-2 に対する免疫を媒介する T 細胞の機能に関する証拠が蓄積されていることです 17。 例えば、無症候性患者の抗 SARS-CoV-2 nAb レベルは低く、多くの場合検出不可能ですが、中等度または重度の COVID-19 患者は中レベルから高レベルの循環 nAb を示します 18、19、20、21、22、23。 24、25。

CD4+ T 細胞、CD8+ T 細胞、および nAb の協調した応答は、疾患の好ましい転帰にとって理想的であると考えられます 14,26。 SARS-CoV-2 タンパク質には複数の T 細胞エピトープが同定されており、その一部はヒト集団内を循環する他のコロナウイルスのポリペプチドと相同性を示し、一部の血清陰性個体の症候性 COVID-1916、27、28 に対する耐性を説明できる可能性があります。 29. これらの研究を総合すると、SARS-CoV-230の一次感染に対する耐性の媒介におけるエフェクターT細胞の重要な関与が示唆される。 ただし、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) から防御するために開発されたワクチンのほとんどは、S タンパク質の立体構造エピトープと nAb の誘導に基づいています。

今回我々は、標準的なスパイクタンパク質とNタンパク質（SpiN）からの折り畳まれていないRBDを含むキメラタンパク質がIgG抗体によって認識され、回復期およびワクチン接種を受けたヒトドナーのCD4+およびCD8+ T細胞によるIFN-γ産生を誘導することを示す。 マウスでは、SpiN が強い体液性応答と T 細胞応答を誘導するが、検出可能な nAb は誘導されないことを実証します。 いずれにしても、SpiN で免疫化されたマウスは、SARS-CoV-2 の野生型、デルタ、およびオミクロン変異体に対して高い耐性を示します。 したがって、我々は、SARS-CoV-2の保存されたエピトープを標的とするエフェクターCD4+およびCD8+T細胞の機能を探索し、VOCの免疫回避を回避する可能性があるモデルを提供する。

まず、N タンパク質と S タンパク質のコンピュータ解析を実行して、T 細胞エピトープが豊富な領域を特定しました 31,32。 図1aに示すように、Sタンパク質とNタンパク質を表すバーの下の垂直線は、それぞれヒトの推定CD8+ T（赤線）およびCD4+ T（黒線）細胞エピトープのそれぞれを示します。 補足表1〜4に示した結果は、HLA-I、HLA-DR、およびマウスMHC-IおよびIIのRBDおよびNのエピトープ配列を示しています。 以前の研究と一致して、N タンパク質には T 細胞エピトープが非常に豊富に含まれていることを発見しました 29。 補足表 1 (パーセンタイル ランク列) に示されている結果は、選択された T 細胞エピトープを検証するための IEDB および NETMHCII からの結合スコアです。 HLA-ABCおよびHLA-DRのスコア<1を示したペプチドのみを表に含めました。 マウス MHC I では < 1.3。 マウス MHC II では < 2.0。 この仮想分析に基づいて、N タンパク質には、CD8+ T 細胞によって認識される HLA-ABC に対して高い親和性を持つ 32 個の免疫原性ペプチド (補足表 1) と、CD4+ T 細胞によって認識される HLA-DR に対して 11 個の免疫原性ペプチド (補足表 2) があります。 S タンパク質では、RBD セグメントが潜在的な T 細胞エピトープの最も多くの割合を占めており、結合によって決定されるように、HLA-ABC (補足表 1) および HLA-DR (補足表 2) に対して高い親和性を持つ 10 個および 8 個のエピトープを示します。スコア。 したがって、N タンパク質と RBD タンパク質は両方とも、CD4+、CD8+ T 細胞および B リンパ球に対して免疫原性があることが示されています 16、26、28、33、34、35。

SARS-CoV-2系統B（武漢）のN配列とS配列との関連で、5つの変異体のヌクレオカプシド（N）とスパイク（S）のタンパク質配列におけるアミノ酸分岐点の数を示すニードルプロット。 丸付きのピークは、最も頻繁にアミノ酸が変化する位置を示します。 ピークの高さは、各発散点の変化の頻度を示します。 青と紫の円は、それぞれ一般的な変異と懸念される変異体で観察された変異を示します。 6 つの SARS-CoV2 系統を考慮した、S タンパク質と N タンパク質の各セグメント (S1、RBD、および S2) のアミノ酸変化の合計も示します。 NおよびSポリペプチドを示すバーの下の黒と赤の縦線は、それぞれ、インシリコエピトープ予測によって同定された推定上のCD4+ TおよびCD8+ T細胞エピトープの位置を示しています。 bg 表面マーカー CD45RO、CD27、および CD69 によって決定された、さまざまな CD4+ (b) または CD8+ (c) T 細胞コンパートメントによる IFN-γ 産生を示す FACS データの UMAP 投影。 データは、合計 CD4+ (d、f) または CD8+ (e、g) IFN-γ+ T 細胞における各部分集団のパーセンテージによっても表されます。 これらの実験に使用された個体数は、対照 5 名、ワクチン接種者 8 名、回復期患者 8 名でした。 IFN-γ産生の統計分析（f、g）は、両側Wilcoxon一致ペアの符号付きランクを使用して実行されました。 「ns」は差が統計的に有意ではないことを示し、NS = 非刺激PBMC。

次に、野生型武漢分離株と世界中に分布する 5 つの VOC 系統 (Alpha-B.1.1.7、Beta-B.1.351、Gama-P.1、Delta、および Omicron) の N および S タンパク質配列を分析しました 36。 丸付きのピークは、N および S タンパク質で最も頻繁に起こるアミノ酸変化の位置を示し、ピークの高さは武漢および 5 つの VOC 系統でこれらの変化が発生する頻度を示します。 青と紫の円は、VOC で観察される最も頻繁なアミノ酸変化を示します。 重要なことに、Nタンパク質に見られるT細胞エピトープは2つだけであり、変異体に関連するアミノ酸変化の部位（紫色の丸のピーク）と重複していました（図1a）。 これらの発見は、N タンパク質からの推定上の T 細胞エピトープの大部分が VOC に保存されていることを示唆しています。 さらに、N タンパク質は宿主細胞のサイトゾルで高度に発現されているため 37、HLA-I を介した細胞傷害性 CD8 T 細胞へのプロセシングおよび提示に容易に利用できる可能性があります。 したがって、N タンパク質は、変異株に対して広範な効果を持つ T 細胞ベースのワクチンにとって理想的な抗原であると考えられます。

強力な T 細胞媒介免疫を誘導するワクチンの開発を目指して、私たちは Spike の RBD と SARS-CoV-2 のヌクレオカプシド (N) タンパク質をもつ SpiN という融合タンパク質を構築しました。 ポリアクリルアミドゲル（補足図1a）およびウェスタンブロット（補足図1b、c）は、大腸菌で発現された高度に精製されたN（約45 kDa）およびRBD（約25 kDa）タンパク質、ならびにS表面抗原（約200 kDa）を示しています。 kDa) 真核細胞から得られます。 組み換えSpiNも細菌由来であり、見かけの分子量は70 kDaです（補足図1a〜c）。 タンパク質は、ニッケルカラム (RBD および N) またはイオン交換クロマトグラフィー (SpiN) のいずれかで精製されました。 イムノブロットは、ウサギポリクローナル抗 N (補足図 1b) または抗 RBD (補足図 1c) 血清のいずれかを使用して生成され、SpiN タンパク質が両方の抗体によって認識されることを示しています。 N または RBD タンパク質がヒトの抗体と T 細胞の両方によって認識されることを確認するために、COVID-19 の回復期患者および不活化ウイルス ワクチン (CoronaVac) を接種した個人からのサンプルを使用しました。 血清サンプルの採取時期は、回復期患者では RT-PCR によるウイルス検出後 2 ～ 8 か月、ワクチン接種者では 2 回目の投与後 1 ～ 2 か月とさまざまでした。 回復期の個人は、S（補足図1d）およびNタンパク質（補足図1e）に対する高いが変動する抗体応答、および細菌で発現されたRBDに対する低い応答（補足図1f）を発現しました。 ワクチン接種を受けた個体は、Nタンパク質とRBDタンパク質の両方に対して低い抗体反応を示し(補足図1e、f)、Sタンパク質に対しては高い反応を示しました(補足図1d)。 次に、S、N、および RBD タンパク質に対する PBMC の応答を評価しました。 重要なことに、回復期およびワクチン接種済みの個人からのPBMCは、血清陰性の健康なドナー（HD）ではなく、組換えS（補足図1g）、N（補足図2h）およびRBD（補足図1i）に対する強いIFN-γ応答を示しました。 ）T細胞に対して免疫原性が高いことを示しています。

また、Th1/Th2/Th17サイトメトリービーズアレイを使用して、免疫化された個体および回復期の個体のSpiNに対するT細胞応答を評価しました。 SpiN による PBMC の in vitro 刺激は、非常に高レベルの IFN-γ、IL-2、TNF、IL-6、IL-10 の産生を誘導しましたが、IL-4 と IL-17 は誘導しませんでした。これは、両方がワクチン接種されたことを示しています。そして回復期の個人は、SARS-CoV-2のRBDおよびNタンパク質に対するI型ヘルパーT細胞（Th1）応答を開始しました（補足図1j）。 また、どの T 細胞集団が Th1 リンパ球によって産生される主要なサイトカインである IFN-γ を産生しているかも評価しました。 ゲート戦略を補足図2に示します。まず、CD4+ T細胞（図1b）またはCD8+ T細胞（図1c）をゲートしました。 細胞表面マーカー CD45RO、CD27、および CD69 を使用して、中央記憶、エフェクター記憶、エフェクターおよびナイーブ T 細胞を定義しました。 次に、IFN-γ を発現する主要な T 細胞サブセットがどれであるかを評価しました。 IFNγ産生中枢細胞とエフェクターメモリーCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞は両方とも拡大しましたが、エフェクターとナイーブサブセットはSpiNによる刺激後に縮小するか変化しませんでした（図1b〜e）。 また、CD4 + Tリンパ球（図1d）とCD8 + Tリンパ球（図1e）の両方の中で、IFN-γを発現する主要なサブセットはエフェクターメモリーT細胞であり、次にセントラルメモリーT細胞であることもわかりました。 SpiNによる刺激前後のIFNγ産生中枢記憶、エフェクター記憶、エフェクターT細胞、ナイーブCD4+およびCD8+Tリンパ球の頻度をそれぞれ図1f、gに示します。

次に、免疫原性を評価し、RBD、N、または SpiN による免疫がマウスを SARS-CoV-2 攻撃から保護するかどうかを評価しました。 マウスは、21日間隔で計画された2回の筋肉内投与により、いずれかの組換えタンパク質で免疫化されました（図2a）。 免疫学的アジュバントとして、安定剤のカルボキシメチルセルロースおよびポリリシン（Poly-ICLC、Hiltonol）と混合した合成ポリイノシン酸ポリシチジル酸（Poly I:C）を使用しました。 私たちがこのアジュバントを選択したのは、このアジュバントが、気道を介してヒトにも感染するインフルエンザに対する効果的な免疫を誘導することが示されているためです38,39。 さらに、Poly-IC 誘導体は、RIG-I ファミリーの Toll-Like Receptor 3 (TLR3) および MDA5 の強力な活性化因子です。 どちらのサイトゾル自然免疫受容体も二本鎖 RNA を認識し、T 細胞媒介免疫を促進します 40,41。 Poly ICLC が癌治療の複数の臨床試験でも使用されていることは注目に値します 40、42、43。

図１および図２に示す実験で使用した免疫化プロトコル。 2 ～ 8 を参照して、SARS-CoV-2 に対する免疫応答と防御を分析します。 抗原特異的 IgG 抗体は、気管支肺胞洗浄液 (BALF) で 1:1 (b)、および免疫マウスからの段階希釈血清 (c) で測定されました。 IFNγ (d) および IL-10 (e) のレベルは、RBD または N 抗原で刺激された脾細胞の培養上清で測定されました。 n = 3/グループになります。 f、g ポリICLCに関連するRBD、NまたはSpiNで免疫し、SARS-CoV-2の武漢株で攻撃したK18-hACE2マウスの体重と生存。 ｈ、ｉ ポリＩＣＬＣに関連するワクチン未接種マウスおよびＲＢＤ、Ｎ、またはＳｐｉＮのいずれかをワクチン接種したマウスの肺および脳組織における、ＲＴ－ＰＣＲによって測定されたウイルス量。 f–in = 4/グループ。 j、k SpiNで免疫したマウスにおける、N、RBD、およびSタンパク質または不活化SARS-CoV-2のいずれかに特異的な循環総IgGのレベル（n = 4/グループ）。 l、m それぞれNまたはRBD、および不活化SARS-CoV-2またはSに対する回復期個体の総IgG反応（n = 5/グループ）。 n ポリ ICLC 単独または SpiN とポリ ICLC を投与したマウスからの BALF における抗 N (左パネル) および抗 RBD (右パネル) 抗体のレベルを測定しました (n = 4/グループ)。 j–nn = 3 ～ 5/グループ。 PBS、N、RBD、またはSpiNで免疫したマウスおよびCOVID-19回復期個体からのプール血清中の抗不活化SARS-CoV-2（o）および中和抗体（p）のレベル。 q アジュバントのみを投与したマウス (左パネル)、またはポリ ICLC に関連する N (左中央パネル)、RBD (右中央パネル)、または SpiN (右パネル) で免疫したマウスの血清で染色した SARS-CoV-2 感染細胞の免疫蛍光。 矢印は、抗 RBD および抗 SpiN ポリクローナル抗体と反応した S タンパク質を含む小さな小胞を示しています。 BALF (b, n) で測定された IgG の統計分析は、対応のない両側 t 検定を使用して実行されました。 サイトカイン測定値 (d、e) は、二元配置分散分析とそれに続く Tukey の多重検定によって分析されました。 データは 2 つの独立した実験の代表です。 b、d – e、h – i、n、データは平均値±SEMとして表示されます。 * P < 0.05 および *** P < 0.001。

我々の結果は、ポリICLCに関連する組換えRBDまたはNタンパク質のいずれかが、気管支肺胞液（BALF）（図2b）および血清（図2b）の両方において、それぞれ高レベルの抗RBDまたは抗N抗体を免疫原性誘導することを実証している。 2c) ワクチン接種されたマウス。 また、NまたはRBDのいずれかで刺激された脾細胞による強いIFN-γ（図2d）およびIL-10（図2e）応答も観察されました。 K18-ACE-2 マウスは重篤な疾患のモデル 44 であり、Poly ICLC に関連する N または RBD 組換えタンパク質による免疫化の有効性を評価するために使用されました。 私たちの結果は、体重減少（図2f）、死亡率（図2g）、および肺内のウイルス量（図2g）によって示されるように、いずれかのタンパク質による免疫化がSARS-CoV-2攻撃に対する部分的な防御をもたらしたことを示しています。 2h）および脳（図2i）。

重要なことは、アジュバント添加SpiNによる免疫化が強力なウイルス特異的T細胞および抗体反応を誘導し、SARS-CoV-2による実験的攻撃に対する防御に非常に有効であることを報告することである。 Poly ICLCに関連するSpiNで免疫したマウスの血清は、RBD（1：5,000）およびNタンパク質（1：25,000）（図2j）および不活化ウイルス（1：5,000）に特異的な非常に高い力価のIgG抗体を示しましたが、抗S抗体の力価が低い(図2k)。 IgG抗N（1：400）（図2l）および抗SARS-CoV-2（1：200）（図2m）のレベルは、新型コロナウイルス感染症の回復期患者の血清の方が、回復期患者の血清の方が高かった。健康な対照ではあるが、SpiN免疫マウスと比較すると比較的低い(図2j、k)。 免疫化マウスとは対照的に、回復期個体の血清中の抗ＲＢＤの力価は低く（図２ｌ）、抗Ｓ（１：２００）の力価は高かった（図２ｍ）。 図２ｎに示す結果は、ＳｐｉＮをワクチン接種したマウスのＢＡＬＦにおける抗Ｎ抗体（左パネル）および抗ＲＢＤ抗体（右パネル）のレベルの増加を示す。

感染細胞におけるNタンパク質37の高発現と一致して、NまたはSpiNタンパク質で免疫したマウスの抗体はELISAにおいてUV不活化SARS-CoV-2を強く認識した（図2o）。 この研究に関連して、我々は、N、RBD、SpiNキメラタンパク質のいずれによる免疫もSARS-CoV-2に対するnAbを誘発しないことを発見し、これはCOVID-19回復期患者の血清中の測定可能なレベルとは対照的である（図2p）。 ELISAの結果（図2o）と一致して、Nタンパク質で免疫したマウスの血清は、免疫蛍光（IFA）で実証されたように、パラホルムアルデヒドで固定されたSARS-CoV-2感染細胞と強く反応し、サイトゾルでのNタンパク質の拡散発現を示しました。 (図2q)。 対照的に、RBDで免疫したマウスからの抗体は小さな小胞と反応しました。これは、適切なフォールディングの前に、小胞体-ゴルジ中間コンパートメント（ERGIC）におけるスパイクタンパク質の集合と一致している可能性があります45。 SpiN免疫マウスの血清の反応性は、それぞれ抗Nおよび抗RBD抗血清で観察されたように、サイトゾルでのNタンパク質の拡散発現およびRBDの点状染色と一致する混合パターンを示しました（図2q）。

ワクチン接種によって誘導される免疫応答の極性を評価するために、RBD または N タンパク質で刺激された脾細胞の上清中のサイトカインのレベルを測定しました。 我々の結果は、RBD（図3a）またはN（図3b）タンパク質で刺激されたSpiNワクチン接種マウスの脾細胞によって、高レベルのIFN-γ、および程度は低いがIL-6およびIL-10が産生されたことを示しています。 。 対照的に、IL-4およびIL-17のレベルは低いか、RBD抗原またはN抗原のいずれかに応答して産生されませんでした（図3a、b）。 Poly ICLCに関連するSpiNで免疫したマウスでは、RBDに対するIgG2c抗体のレベルはIgG1よりも高く、1型免疫応答への傾向を示しています(図3c)。 対照的に、Nタンパク質および不​​活化SARS-CoV-2に特異的なIgG1およびIgG2c抗体のレベルには差はありませんでした（図3d、e）。 総IgGについて示されるように(図2k)、Sタンパク質に特異的なIgG1およびIgG2c抗体のレベルは非常に低かった(図3f)。 また、ワクチン接種されたマウスのリコール T 細胞応答も評価しました。 フローサイトメトリーで示されたように、Nタンパク質とRBDタンパク質は両方とも、SpiNワクチン接種マウスの脾臓から高レベルのCD4 + CD44 + およびCD8 + CD44 + 活性化T細胞を誘導しましたが、対照マウスでは誘導しませんでした（図4a、b）。 UMAPを生成するために、CD4+ T細胞（図4c、左パネル）またはCD8+ T細胞（図4c、右パネル）をゲートしました。 細胞表面マーカーの CD44 および CD62L を使用して、中央記憶 (Tcm)、エフェクター/エフェクター記憶 (Teff/em)、およびナイーブ T 細胞を定義しました。 細胞は抗IFN-γでも染色されました。 CD4 Teff/em および CD8 Tcm リンパ球が、免疫マウスの脾細胞における IFN-γ の主な供給源であることがわかりました（図 4d、e、補足図 3a）。

サイトメトリービーズアレイ（CBA）によって測定した、RBD（a）およびNタンパク質（b）で刺激した（刺激した）または刺激しなかった（NS）対照マウスおよびワクチン接種マウスの脾細胞の上清中のサイトカインのレベル。 アジュバントのみを投与されたマウス（下の黒い記号）または免疫されたマウスの血清中の、RBD（c）、N（d）、SARS-CoV-2（e）およびS（f）タンパク質に特異的なIgG1およびIgG2cのレベルPoly ICLC に関連する SpiN タンパク質を含む。 データは 2 つの独立した実験の代表値です (n = 3 ～ 4 匹のマウス/グループ)。 CBA の統計分析は複数の t 検定で実行され、抗体測定値は二元配置分散分析とそれに続く Sidak の多重比較検定を使用して分析されました。 **** P < 0.0001。

活性化されたCD4+ T (a) およびCD8+ T (b) リンパ球の頻度は、細胞表面CD44の発現を測定することによって評価されました。データはmea ± SEMとして表示されます。 c FACS データの UMAP 投影。脾細胞は CD4+ T 細胞集団または CD8+ T 細胞集団のいずれかでゲートされています。 抗 CD62L、抗 CD44、および抗 IFN-γ による染色を使用して、IFNγ 産生ナイーブ T 細胞、セントラル メモリー (Tcm) およびエフェクター/エフェクター メモリー (Teff/em) T 細胞を定義しました。 SpiNによる刺激の有無にかかわらず、IFN-γを産生するナイーブ、メモリーおよびエフェクターCD4+ TおよびCD8+ T集団の頻度をそれぞれパネルdおよびeに示します。 f、g 免疫化されたマウスまたは免疫化されていないマウスの肺の免疫表現型検査。 細胞はSpiNタンパク質とともに培養され、フローサイトメトリーによってCD4+ CD69+ CD103+ (f、左パネル)、CD4+ CD69+ CD103+ IFN-γ+ (f、中央パネル)、CD4+ CD69+ CD103+ TNF+ (f、右パネル)、CD8+ CD69+として特徴付けられた。 CD103+ (g、左パネル)、CD8+ CD69+ CD103+ IFN-γ+ (g、中央パネル)、および CD8+ CD69+ CD103+ TNF+ (g、右パネル)。 データは 2 つの独立した実験の代表値です (n = 3 ～ 4 匹のマウス/グループ)。 統計分析は、両側マン・ホイットニー法を使用して実行されました。 * P < 0.05 および ** P < 0.01。

また、フローサイトメトリーによって肺の局所T細胞応答を評価しました（図4f、g、補足図3b）。SpiN免疫マウスでは組織常駐記憶（Trm）CD4+の増加が見られることが観察されました（図4f、g、補足図3b）。 SpiNで刺激した場合のT細胞(図4f、左パネル)およびCD8+T細胞(図4g、左パネル)。 重要なことに、SpiNは、SpiNで免疫したマウスからのCD4+およびCD8+ Trmの両方によるIFN-γおよびTNFの産生も誘導しました（図4f、g、中央および右のパネル）。 したがって、局所的な T 細胞応答は、SpiN 免疫マウスにおけるウイルスの増殖とそれに伴う炎症の制御において重要な機能を持っている可能性があります。

シリアンハムスターは中等度の新型コロナウイルス感染症のモデルとして実験に使用されました46。 図５ａに示される結果は、ポリＩＣＬＣに関連するＳｐｉＮが、免疫化ハムスターにおいて高レベルの総ＩｇＧ抗Ｎを誘導したことを示している。 抗 RBD のレベルは低かった (図 5a)。 注目すべきことに、ワクチン接種したハムスターのnAbのレベルは検出できませんでした（図5b）。 それにもかかわらず、RT-PCRによって検出されたウイルス量は、SARS-CoV-2で攻撃されたワクチン接種を受けていないハムスターと比較して、ワクチン接種されたハムスターで有意に低かった（図5c）。 武漢株による感染後4日（dpi）のハムスターの組織病理学的分析は、PBSグループの肺がびまん性間質性肺炎を示していることを示しています（図5d、右パネル）。 比較すると、Poly ICLCをアジュバントとして添加したSpiNで免疫したハムスターは、肺胞腔が保存されているが、軽度の局所鬱血（黒い矢印）を示した（図5d、左パネル）。

a ポリ ICLC に関連する SpiN をワクチン接種したハムスターの血清中の総 IgG 抗 N および抗 RBD のレベル。 b 回復期の個体からの血清と比較した、SpiN + Poly ICLC でワクチン接種したハムスターからの血清中の中和抗体のレベル。 c SARS-CoV-2感染後4日目（dpi）に、SpiNとPoly ICLCで免疫した対照およびハムスターの肺においてRT-PCRによって測定されたウイルス量。 データは平均値 +/- SEM (b、c) として表示されます。 d 武漢株を用いたハムスターの倍率 2.5 倍、5 倍、および 20 倍での組織病理学的分析 (倍率 4 dpi) では、PBS グループの肺では、びまん性肺胞壁の肥厚が強調され、中程度の多巣性虚脱 (星印) が見られ、強調された肺胞壁肥厚と関連していることが示されています。びまん性うっ血（黒い矢印）および混合炎症性浸潤（単核細胞および多形核細胞）。 気管支腔では、炎症性細胞が細胞破片（矢印）を伴う好中球の優勢とともに認められます（d、右パネル）。 比較すると、Poly ICLCをアジュバントとして添加したSpiNで免疫したハムスターは、肺胞腔は保存されているが、軽度の限局性うっ血(黒い矢印)を示した(d、左パネル)。 a – d データは 2 つの独立した実験の代表です。 an = 5 匹のハムスター/グループ。 d PBS n = 3、SpiN + Poly ICLC n = 4、回復期 n = 3。 c 2 つの独立した実験からプールされたデータ、n = 7 ～ 8 ハムスター/グループ。 ウイルス量定量化のデータは、両側マンホイットニー検定を通じて分析されました。

Poly ICLCに関連するSpiNによる免疫は、重篤なCOVID-19のモデルであるK18-ACE-2マウスを体重減少（図6a）や、運動性の低下、毛の逆立ち、猫背などの疾患の他の臨床兆候から保護しました。 。 重要なことに、免疫化マウスの100%が感染を生き延びたのに対し、ポリICLCのみを投与されたマウスはすべて感染で死亡した(図6b)。 さらに、RT-PCRによって示されるように、SpiNワクチン接種とアジュバントのみを受けた非ワクチン接種対照を比較すると、5 dpiでは肺と脳の両方のウイルスRNA負荷（図6c、d）が低かった。 重要なことに、SpiNで免疫したマウスの血清では、5 dpiでnAbのレベルが検出できなかった(図6e)。 組織病理学的分析により、Poly ICLC グループの肺が 5 dpi でびまん性間質性肺炎を示したことが示されました (図 6f、上のパネル)。 比較すると、免疫化グループ（SpiN + Poly ICLC）は肺構造の保存を示しました（図6f、下のパネル）。

マウスにはSARS-CoV-2の武漢株を感染させた。 体重 (a)、生存率 (b)、肺 (c) および脳 (d) のウイルス量を、SpiN と Poly ICLC で免疫した K18-hACE-2 マウスおよび Poly ICLC のみを投与した対照で評価しました。 e 5 dpiでの対照および免疫マウスの血清中のnAbの力価。 回復期患者を陽性対照として使用した。 c – e データは平均値±SEMとして表示されます。 f Poly ICLC または SpiN + Poly ICLC グループの肺の 2、5 倍、5 倍、および 20 倍の倍率での組織病理学的分析 (5 dpi)。 黒い矢印: 渋滞。 白い矢印: 肺胞内滲出液。 白星: 出血病巣。 アスタリスク: 肺胞虚脱。 赤い矢印: 炎症性浸潤。 g、h 5 dpiでのマウス肺におけるqRT-PCRによって定量化されたサイトカイン(g)およびケモカイン(h)のmRNA発現。 i-o、骨髄系 (i) およびリンパ系 (j) の頻度、ならびに好中球 (k)、単球 (l)、単球由来樹状細胞 (m)、常駐 CD8+ T 細胞 (n) および従来の樹状細胞の総数(o) 5 dpiでのSARS-CoV2によるワクチン接種、チャレンジ(感染)、または非接種(NI)の対照の肺。 g–o データは平均値 ± SEM として表示されます。 a、b 2 つの独立した実験、Poly ICLC n = 4 および SpiN + Poly ICLC n = 7 からのプールされたデータの個々の値。c – o データは 2 つの独立した実験、n = 3 マウス/グループ（c – h）の代表です。 i-o、n = 4 PBS NI および感染、n = 3 SpiN + Poly ICLC NI、n = 6 SpiN + Poly ICLC 感染。 重量測定値の統計分析 (a) は、二元配置 ANOVA を使用して実行されました。 生存分析 (b) はログランク検定を使用して実行されました。 ウイルス定量化のデータ (c、d) は、二元配置分散分析とそれに続く Sidak の多重比較検定を使用して分析されました。 qRT-PCR データ (g、h) は対応のない両側 t 検定で分析されました。 肺のフローサイトメトリー (i-o) は、Kruskal-Wallis に続いて Dunn の多重比較検定によって分析されました。 * P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001、および **** P < 0.0001。

強い炎症反応と一致して、非感染者の肺ではIL-6およびTNFの高いmRNAレベル（図6g）、およびケモカイン（CCL2、CCL5、CXCL9、およびCXCL10）（図6h）が見つかりました。ワクチン接種を受けたマウスに SARS-CoV-2 を感染させた。 対照的に、2型サイトカイン（IL-4およびIL-5）のレベルはワクチン接種マウスの方が高く（図6g）、肺粘膜環境の微小環境がワクチン接種マウスでは保存されていたのに対し、ワクチン接種マウスでは肺粘膜環境の微小環境が維持されたことを示唆しています。重篤な疾患を発症したマウスの肺では炎症反応が観察されました。

SARS-CoV-2にチャレンジしたワクチン接種を受けていないマウスの肺では、総骨髄細胞の頻度が劇的に増加し（図6i）、リンパ系細胞が減少しました（図6j）が、免疫化により激しい炎症性浸潤が防止されました。 一貫して、SARS-CoV-2に感染したワクチン接種を受けていないマウスの肺では、好中球（図6k）、単球（図6l）、および単球由来樹状細胞（図6m）の総数が劇的に増加した。 対照的に、ワクチン接種マウスでは常在CD8+ T細胞（図6n）および従来のDC（図6o）の数が増加しており、SARS-CoV-2および新型コロナウイルスに対する耐性における常在T細胞の関与の可能性をさらに示唆している。 1947年。 したがって、Poly ICLC に関連する SpiN は免疫原性が高く、SARS-CoV-2 に対する強力な防御を誘導しました。

この研究の関連する発見は、SpiNで免疫したマウスは、感染時に循環nAbが存在しない場合でも、SARS-CoV-2に対して高い耐性を示すという実証である。 重要な問題は、SARS-CoV-2 による攻撃直後の免疫化されたげっ歯類の nAb レベルに関するものです。 4 dpiのワクチン接種ハムスター（図5b）および5 dpiのマウス（図6e）では、nAbのレベルは検出できないままである一方、炎症は軽度であり（図5d、6f）、肺内のウイルス量は少ないことがわかりました。減少しました（図5cおよび6e）。 これらの結果は、SpiN で免疫したマウスにおける nAb 非依存性免疫の仮説を裏付けています。

CD4+ および CD8+ T 細胞がウイルス量の制御と SARS-CoV-2 に対する防御免疫に必須であるかどうかをさらに調べるために、SpiN ワクチン接種マウスを -3 日目に抗 CD4 抗体と抗 CD8 抗体のいずれかまたは両方で治療しました。チャレンジ前は -2、および -1。 90％を超えるT細胞の枯渇がフローサイトメトリーによって確認されました（補足図4）。 図 7a、b に示すように、CD4+ または CD8+ T 細胞のいずれかを枯渇させたマウスの 50% は大幅な体重減少を示し、感染により死亡しましたが、CD4+ および CD8+ T リンパ球の両方を枯渇させたマウスの 100% は体重が減少し、最大 8 歳まで死亡しました。感染から数日。 まとめると、我々の結果は、SARS-CoV-2感染の初期段階におけるSpiNで免疫したマウスの防御は、nAbではなくエフェクターT細胞によって媒介されることを示している。

K18-hACE2マウスを、Poly ICLC（a、b）またはCovishield（e、f）でアジュバントを添加したSpiNで免疫化し、感染チャレンジの前-3、-2、および-1日目に抗CD4+、抗CD8+、またはその両方で処理しました。 ナイーブＫ１８－ｈＡＣＥ２マウスに、感染前－１日目に、対照またはＳｐｉＮ－（ｃ、ｄ）もしくはＣｏｖｉｓｈｉｅｌｄ－（ｇ、ｈ）免疫マウスからのプール血清を投与した。 SARS-CoV-2 武漢株の感染後 11 日間、体重 (a、c、e、g) と生存率 (b、d、f、h) をモニタリングしました。 a-h 1 グループあたり 4 匹のマウス。

ワクチン接種されたマウスは非常に高レベルの抗 N 抗体を産生しましたが、それらが SARS-CoV-2 に対する耐性を媒介するという証拠はありません。 N タンパク質はウイルス RNA ゲノムと結合しており、ウイルス表面膜では発現されないため、抗 N 抗体が抗体依存性細胞傷害 (ADCC) を媒介したり、オプソニン化ウイルスの貪食を促進したり、オプソニン化ウイルスを遮断したりすることによって作用する可能性は低いです。 SARS-CoV-2による宿主細胞への侵入。 一貫して、我々の結果は、抗N抗体がSARS-CoV-2による宿主細胞へのin vitro侵入を阻止できないことを示している（図2p）。 SpiN誘導抗体がSARS-CoV-2感染からマウスを保護できるかどうかを評価するために、攻撃の-1日前に免疫マウスの血清をナイーブK18-ACE-2マウスに移しました。 対照マウスまたはワクチン接種マウスのいずれかからの血清を投与された動物はすべて体重減少を示し、SARS-CoV-2感染で死亡した（図7c、d）。

対照として、Sタンパク質をコードするアデノウイルスベクター（Covishield）をワクチン接種したマウスからの血清の移入およびT細胞枯渇の影響を評価しました。 免疫化されたマウスは、高レベルの中和抗体を示します (PRTN > 320)。 SpiNワクチン接種マウスとは対照的に、CD4+およびCD8+ T細胞の両方を枯渇させたCovishieldワクチン接種動物の100％が武漢分離株による攻撃で生き残りました（図7e、f）。 このモデルにおけるnAbの主な機能と一致して、Covishield免疫マウスからの血清の移入は、ナイーブK18-ACE-2マウスをSARS-CoV-2による攻撃から保護した（図7g、h）。

最後に、デルタとオミクロンは、インビトロと実験モデルの両方で nAb による認識を効率的に回避する、より高い感染力を持つ VOC として 2021 年に出現しました 48,49。 さらに、集団ワクチン接種に使用されている現在の S ベースのワクチンの有効性は、デルタまたはオミクロン分離株の感染に対する有効性が低くなります 55、56、57、58、59、60、61。 したがって、我々は、SpiN による免疫がこれらの VOC による攻撃からマウスを保護するかどうかを評価しました。 我々の結果は、体重減少と致死率で測定すると、SpiNによる免疫化がK18-ACE-2マウスをデルタ変異体による感染から完全に保護したことを示しています（図8a、b）。 以前の研究と一致して、ナイーブK-18-ACE-2マウスは体重が減ったり、Omicron51の感染で死亡したりしませんでした（図8c）。 それにもかかわらず、6 dpiでのRT-PCRによって測定されたウイルス量の16倍の減少によって示されるように、SpiNによる免疫化は、Omicron分離株による攻撃からK18-ACE-2マウスを有意に保護した（図8d）。 さらに、Poly ICLCのみを受けた対照マウスでは、肺はびまん性間質性肺炎を示し（図8e、上のパネル）、SpiN免疫マウスの保存された肺構造とは対照的でした（図8e、下のパネル）。

K18-hACE2 マウスにポリ ICLC に関連する SpiN をワクチン接種し、2 回目の投与の 30 日後に 5 × 104 PFU のデルタ (a、b) または 2.5 × 104 PFU のオミクロン (c、d) 変異体を投与しました。 体重 (a、c) と生存率 (b) を 11 日間測定しました。 d ウイルス量は、Omicron を使用して 6 dpi で RT-PCR によって測定されました。データは平均 +/- SEM として表示されます。 a～e 1 グループあたり 6 匹のマウス。 e SARS-CoV-2 オミクロン株に感染したマウスの肺組織の顕微鏡写真。 さらに、Poly ICLCのみを受けた対照マウスでは、肺は、激しいうっ血（黒い矢印）、肺胞内滲出液（黒い輪郭の白い矢印）を伴う、混合炎症性浸潤（単核細胞と多形核細胞）を特徴とするびまん性間質性肺炎を示しました。 ）、出血病巣（白い星）および肺胞虚脱の領域（星印）（e、上のパネル）。 免疫化グループでは、主に単核性炎症性浸潤が存在するものの、肺構造が保存されていることが注目される（e、下のパネル）。 a – e データは 2 つの独立した実験の代表です。 ウイルス量の統計分析 (d) は、二元配置 ANOVA に続いて Sidak の多重比較検定を使用して実行されました。 **** P < 0.0001。

nAb が大幅に失われているにもかかわらず、現在の COVID-19 ワクチンは、病気に対する有意なレベルの防御を誘導する能力を保持しています。 実際、T 細胞応答のほとんどは VOC に対して保存されており、少なくとも部分的に VOC の保護効果に関与している可能性があります 62,63。 しかし、Omicron 変異体の S タンパク質には 30 を超える変異があり、ワクチン接種によって誘導される T 細胞応答の損失は約 30% と推定されており 64、防御免疫がさらに損なわれます。 したがって、保存された T 細胞エピトープ 29 が高度に濃縮され、非同義変異の選択に耐性のある N タンパク質のような抗原の使用 (図 1a および補足表 1 ～ 4) は、普遍的な治療に向けた良い戦略である可能性があります。 SARS-CoV-2 変異種に対するワクチン。

限られた数の研究では、マウスとヒトの両方でペプチドベースの新型コロナウイルスワクチンの免疫原性を試験している65,66。 注目すべきことに、SARS-CoV-2変異体に共通する複数のT細胞エピトープを含むワクチンがヒト第I相臨床試験でテストされ、T細胞反応と安全性の点で有望な結果が示された66。 ただし、これらのワクチンの有効性は評価されていません。 SARS-CoV-2 N タンパク質は、主要な HLA ハプロタイプ全体にわたって推定 CD4+ および CD8+ T 細胞エピトープが高度に濃縮されているため、この抗原はペプチド ワクチンの優れた代替品と思われます。 さらに、無症候性または軽度の感染症を患っている小児では、N 抗原に対する CD8+ T 細胞の反応が亢進しています 35。 さらに、SpiNワクチンはヒトに注射するのに非常に安全であるはずだが、子供だけでなく抗体反応に影響を与える疾患を持つ個人にも優先的に使用される可能性がある。

他の研究では、COVID-19 ワクチンの候補として SARS-CoV-2 N タンパク質の使用が考慮されています67、68、69、70。 しかし、それらは、nAbs を誘発する S または RBD タンパク質と関連付けられているか 68,69、または N タンパク質のみを使用しており 70、我々の発見と同様に (図 2f–i) 部分的な防御を誘発しました。 さらに、これらの研究では、T 細胞に対する抗体の機能は詳細に調査されておらず、変異体に対する防御も評価されていません。 今回我々は、キメラタンパク質にRBD領域を含めることが、野生型および変異型SARS-CoV2で攻撃されたマウスの100％を保護するために必要であったことを示す。 さらに、N/RBD 融合タンパク質がデルタおよびオミクロン変異体に対する強力な免疫を誘発することを示します。

S タンパク質の RBD 領域に見出されるエピトープに加えて、N タンパク質に見出される潜在的な T 細胞エピトープの数を考慮すると、SpiN による免疫化により T 細胞の多様なレパートリーが誘発されると考えられます。 これはウイルス感染に対する T 細胞媒介免疫の中心であり、SARS-CoV-2 の可塑性を克服するのに非常に関連しています。 突然変異は確率的に発生するため、さまざまな T 細胞エピトープで同時に突然変異が発生する可能性は低いです。 さらに、1 つまたは少数の特定の変異における選択圧は、複数のエピトープを標的とする T 細胞応答に依存する防御免疫を弱体化させるのには効果がありません。 したがって、CD4+ ヘルパー T 細胞応答と CD8+ 細胞傷害性 T 細胞応答の両方を促進する、より広範な線状 T 細胞エピトープを含むワクチンは、防御 nAbs を回避する SARS-CoV-2 変異体に対してもより効果的であるという仮説を立てています 4,6,7 、9、10。

結論として、我々は、ポリ ICLC をアジュバントとして添加した、原核生物系で発現させた N および RBD 融合タンパク質 (SpiN) による免疫化が、T 細胞に対して高い免疫原性を示したことを報告します。 このワクチンは、費用対効果が高く、安定しており、安全であり、SARS-CoV-2の野生型、デルタ型、またはオミクロン型のいずれかの変異体による実験的挑戦から新型コロナウイルス感染症（COVID-19）のげっ歯類モデルを保護する上で非常に有効である。 我々の結果を総合すると、この保護は主に CD4+ および CD8+ T 細胞によって媒介され、nAbs ではないという仮説が裏付けられます。 特定の配列の定義はさらに調査する必要があるが、この研究は、SpiN には CD4+ および CD8+ T 細胞エピトープが非常に豊富であり、非サイレント点突然変異が SpiN 誘発防御免疫を弱体化させる可能性は低いことを示唆しています。 したがって、SARS-CoV-2の可塑性を克服するために抗COVID-19ワクチンを改良するには、nAb、Nタンパク質、そしてより広範には複数のT細胞エピトープの使用の重要性を否定するものではないが、検討されるべきである。

Fundação Hospitalar do Estado de Minas Gerais (FHEMIG) の人体実験に関する倫理委員会は、ヒトのドナーを使用して実施されるこの研究を承認しました (CAAE: 43335821.4.0000.5119)。 マウスを用いた実験は、動物倫理に関する施設のガイドラインに従って実施され、オズワルド・クルス財団およびサンパウロ連邦大学倫理学部の施設倫理委員会によって承認された。 それぞれ動物使用委員会 (CEUA) LW 25/20 および 105/2020。

ヒトの血液サンプルは、ワクチン接種者 (n = 33)、回復期患者 (n = 13)、および健康な対照者 (n = 9) から収集されました。 すべての個人は 18 歳から 70 歳の間でした (36 ± 11、女性:男性比 = 3.2) (補足表 5)。 ワクチン接種を受けた人はコロナバック（中国、シノバック）を2回投与され、2回目の投与から27～54日後にサンプルが採取された。 回復期の人は、サンプリングの24～196日前に軽度の新型コロナウイルス感染症に罹患していると報告し、PCRによって確認された。 サンプリングと同意書に署名する前に、すべての個人に簡単なインタビューが行われ、参加者への報酬はありませんでした。

生後 6 ～ 10 週齢のメスの C57BL/6 マウスを、ミナス ジェライス連邦大学実験動物施設センター (CEBIO-UFMG) から購入しました。 C57BL/6 バックグラウンドのヒト アンジオテンシン変換酵素トランスジェニック マウス (K18-hACE2) マウス (生後 6 ～ 10 週、ジャクソン研究所由来) は、フィオクルス ミナスまたはフィオクルス サンパウロの動物施設で飼育され、動物施設のモデルとして使用されました。深刻な新型コロナウイルス感染症。 生後8～10週のメスのゴールデン・シリアン・ハムスターはフィオクルス・ミナス動物舎からのもので、軽度の新型コロナウイルス感染症（COVID-19）のモデルとして使用された。 実験は、ブラジル国立動物実験評議会（CONCEA）の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に従って行われました。 マウスとハムスターは、フィオクルス・ミナス大学とサンパウロ大学のマイクロアイソレーター内で、12時間の明暗サイクル、温度範囲68～79°F、湿度30～70%で飼育、維持された。 この研究で使用された重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) ウイルス株は、系統 B (分離株 BRA/SP02/2020)、デルタ (EPI_ISL_2965577)、およびオミクロン (EPI_ISL_7699344) の変異株でした。 ウイルスストックを、37℃、5% CO2の加湿インキュベーター内でVero E6細胞（ATCC CRL-1586）で増殖させ、細胞変性効果（CPE）を毎日72時間まで観察しました。 ウイルスは、プラーク形成単位 (PFU) アッセイによって Vero E6 細胞で滴定されました 71。 ウイルスのアリコートは、さらに使用するまで -80 °C で保存しました。

エピトープ予測は、クラス I 分析については免疫エピトープ データベースおよび分析リソース (IEDB) プラットフォーム、クラス II については NetMHCII を通じて実行されました 31,32。 潜在的な HLA-ABC、HLA-DR、およびマウス MHC-I/II 結合エピトープを、スパイク (6VSB https://doi.org/10.2210/pdb6VSB/pdb) およびヌクレオカプシド (7SD4_1 10.2210/pdb7SD4/pdb) の配列で探索しました。タンパク質。 HLA-ABC および HLA-DR の結合スコア <1 を示すエピトープを選択しました。 マウス MHC I では < 1.3; マウス MHC II では <2.0。 ニードル プロットは、バリアント アルファ (MZ344997)、ベータ (MW598419.1)、デルタ (MZ359831.1)、ガンマ (MZ169911.1)、オミクロン BA.1 (OL672836.1)、オミクロン BA.2 (PRJNA784038)。 元の系統 (B1 – 武漢 – EPI_ISL_402123 https://www.epicov.org/epi3/frontend#4c5e54) に関連して獲得された変異を特定するために、タンパク質のコード配列が区切られ、翻訳され、再調整されました。 アライメントは、MUSCLE ツールとデフォルトのパラメーターを使用して行われました。 突然変異は「自家製」スクリプトによって数えられ、名前が付けられ、特定の変更を加えた R ムッツニードル パッケージを使用して図を構築し、抗原に関する情報を組み込みました。

全長N、スパイクのRBD、および大腸菌での発現に最適化されたコドンを有するキメラSpiNタンパク質をコードする配列を含むプラスミドをGenscriptから購入した。 コンピテント大腸菌スター(DE3)をNまたはRBD配列を有するpET24ベクターで形質転換し、大腸菌pRAREをpET24_with SpiNで形質転換した。 形質転換した細菌を、カナマイシン（50μg/ml）を含むLB培地中で37℃でOD600 0.6に達するまで増殖させた。 この時点で、IPTGを最終濃度0.5 mMで培養物に添加することによってタンパク質発現を誘導した。 3 つのタンパク質の発現の誘導は、N および RBB については 37℃で 3 時間、SpiN については 18 時間行いました。 N および RBD タンパク質にはヒスチジンタグが含まれており、製造元の指示に従って、Histrap HP (GE HealthCare) カラムを使用したアフィニティークロマトグラフィーステップを通じて精製されました。 細菌溶解後、可溶化用緩衝液に8M尿素を添加することにより、Nタンパク質を可溶性画分から精製し、RBDタンパク質を不溶性画分から精製した。 ヒスチジンタグなしで発現されたSpiNタンパク質は、8 M尿素の添加後、2段階のクロマトグラフィーを経て、細菌細胞溶解物の可溶性画分および不溶性画分から精製されました。 Ｈｉｔｒａｐ ＳＰ ＨＰカラム（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーに続いて、製造業者の指示に従って、カラムＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－１００ ＨＲ（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）を用いた分子排除を行った。 哺乳動物細胞で発現された S タンパク質は、リオデジャネイロ連邦大学の Leda Castilho 博士のご厚意により提供されました。

末梢血単核球 (PBMC) は、Ficoll 勾配によってヘパリン添加血液から単離されました。 簡単に言うと、Ficoll-Paque plus (GE-Healthcare) 上に層状にした血液を 410 x g、40 分間、室温で遠心分離しました。 ウェルあたり 100 万個の細胞を 96 ウェル平底プレートに分配し、N、 RBD および S 組換え抗原、または抗 CD3 (1 μg/mL) および抗 CD28 (0.5 μg/mL) を陽性対照として使用します。 刺激されていない細胞を使用して、サイトカインのバックグラウンド産生を評価しました。 72時間後に培養上清を回収し、分析まで-80℃で凍結した。 IFN-γのレベルは、製造業者のプロトコル(BD、OptEIA Human IFN-γ、Cat 555142)に従ってELISAによって測定した。 あるいは、上清中のサイトカインは、キット Human Inflammatory CBA および Human Th1/Th2/Th17 CBA (それぞれ BD Biosciences、カタログ 551811 および 560484) を使用して、メーカーの指示に従い、Cytometric Bead Array (CBA) によって測定されました。 サンプルをFACSVerse (BD Biosciences) で読み取って分析しました。

健康なドナー、回復期患者、またはコロナバックワクチン接種を受けたドナーからのPBMCをRPMI 1640 (Sigma-Aldrich) ベンゾナーゼヌクレアーゼ (20 U/mL、Sigma) 中で解凍しました。 細胞を完全培地（RPMI 1640、10% FBS、100 mg/ml ストレプトマイシン、100 U/ml ペニシリン）に播種し、5 時間静置した後、陽性対照（抗 CD3、1 μg/mL および抗 CD28）とともにインキュベートしました。 、０．５μｇ／ｍＬ、ＢＤ）、陰性対照（ＳｐｉＮビヒクル）、または３７℃、５％ＣＯ２中２０μｇ／ｍＬのＳｐｉＮ。 12 時間のインキュベーション後、BFA およびモネンシンをそれぞれ 2.5 μg/mL 加えてさらに 6 時間放置しました。 合計 18 時間のインキュベーション後、細胞を回収し、生存率 (7-AAD、BD Pharmingen) および表面抗原抗 CD4 (BV605、RPA-T4、BD)、抗 CD8 (AlexaFluor700、SK1、Biolegend)、抗 CD45RO について染色しました。 (BV786、UCHL1、BD) および抗 CD27 (APC-Cy7、O323、Biolegend)。 洗浄後、製造業者の指示に従って細胞を固定し、透過処理した(FoxP3染色緩衝液セット、eBioscience)。 次に、細胞を細胞内抗原である抗 IFN-γ (PE-Cy7、4 S.B3、eBioscience)、抗 CD3 (FITC、UCHT1、BD)、抗 CD69 (BV421、FN50、Biolegend)、および抗 TNF について染色しました。 (APC、Mab11、eBioscience)。 サンプルは LSR-FORTESSA で取得され、FlowJo で分析されました。 T 細胞部分集団は、生存可能な CD3+CD4+ および CD3+CD8+ イベントでゲート制御されました。 CD27/CD69/CD45RO 発現および細胞内 IFN-γ: エフェクター記憶 (EM、CD45RO+CD27-)、中央記憶 (CM、CD45RO+CD27+)、エフェクター (Eff) に基づいて、ナイーブおよび記憶部分集団のより詳細な分析が行われました。 、CD45RO−CD27−）、およびナイーブ（Nv、CD45RO−CD27+）細胞。 次元削減分析は、FlowJo に実装された均一多様体近似および投影 (UMAP) プラグインのデフォルト設定を使用して実行されました。

プレートを 0.4 μg/ウェルの N、RBD、S 組換えタンパク質、または 104 PFU/ウェルの UV 不活化 SARS-CoV-2 で一晩コーティングし、2% ウシ血清アルブミンを含む PBS (PBS) で 2 時間ブロックしました。 -2% BSA)、37 °C。 血清を段階希釈し、気管支肺胞洗浄液 (BALF) サンプルを PBS-2% BSA で 1:1 希釈でテストし、37 °C で 1 時間インキュベートした後、抗ヒト IgG-HRP 抗体 (Fapon) とインキュベートしました。 、ストレプトアビジン-HRPと結合した抗ハムスターIgG-HRPまたは抗マウス総IgG、IgG1、IgG2c（Southern Biotech）、すべて1:5000に希釈。 ５回洗浄した後、プレートを暗所で１５分間１−Ｓｔｅｐ ｕｌｔｒａ ＴＭＢ基質溶液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で露出させ、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４（Ｓｉｇｍａ）を添加することによって反応を停止させた。 プレートを 450 nm で読み取り、結果を生の光学濃度 (OD) として表しました。 抗体力価は、ELISAにおいて抗原に対する最大抗体反応性の50%をもたらす血清希釈によって決定した。

感染の1日前に、105個のVero E6細胞を、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（Vitrocell、ブラジル）中で48ウェルプレートの各ウェルに播種した。 翌日、マウスまたはヒトからの血清サンプルを温浴上で 56 °C で 1 時間インキュベートして熱不活化しました。 サンプルを DMEM で 2 倍段階希釈し (1:10 ～ 1:320 (v/v))、100 PFU の SARS-CoV-2 ウイルスストックと混合しました。 陽性対照には血清サンプルの代わりに培地のみを使用した。 混合物を37℃で1時間インキュベートして、抗体をウイルス粒子に結合させた。 次に、Vero E6 細胞培養上清を除去し、細胞に 50 μl/ウェルの血清-ウイルス混合物を接種し、ウイルスが細胞に結合できるように穏やかに振盪しながら室温で 1 時間インキュベートしました。 次に、2% FBS および 2% カルボキシメチルセルロース (CMC) を含むあらかじめ温めた DMEM 1 ml を各ウェルに静かに加え、プレートを 37 °C、5% CO2 雰囲気で 4 日間インキュベートしてウイルスプラークを形成させました。 次に、細胞を PBS で希釈した 4% ホルムアルデヒド溶液で 2 時間固定し、プラークを視覚化するために 1% ナフトール ブルー ブラック (Sigma、米国) 溶液で 1 時間染色しました。 中和活性は、陽性対照と比較したプラーク数の減少によって決定されました。

メーカーが提供するプロトコールに従って、RNeasy Mini Kit (Qiagen、カタログ 74104) を使用して、ホモジナイズしたマウス組織から全 RNA を抽出しました。 qRT-PCR は、GoTaq Probe 1 ステップ RT-qPCR システム (Promega、米国) を製造業者の指示に従って使用し、1 反応あたり 75 ng の全 RNA を使用して 12 μL 反応で実施しました。 プライマーと蛍光プローブは、SARS-CoV-272 の E 遺伝子から 100 bp のアンプリコンを増幅する、SARS-CoV-2 に特異的な以前に記載された診断 qRT-PCR プロトコルに基づいて設計されました。 プローブ FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ、F 5' ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT 3'、R 5' ATATTGCAGCAGTACGCACACA 3'。 サイクル条件は、Quantstudio 5 リアルタイム PCR システム (Applied Biosystems、米国) を使用して、45 °C で 15 分間、95 °C で 3 分間、その後 95 °C で 15 秒間および 58 °C で 60 秒を 45 サイクルしました。 ウイルス量の定量化のために、E 遺伝子配列 (SARS-CoV-2 Wuhan-Hu 分離株配列) を含むプラスミドに基づいた標準曲線が作成されました。 2 ～ 2 × 105 の範囲のウイルスコピーに対応するプラスミド DNA の 10 倍段階希釈物をテンプレートとして使用して、標準曲線を作成しました。 リアルタイム PCR アッセイを 3 回実行し、得られた Ct 値をウイルスゲノムのコピー数に対してプロットしました。

ハムスターおよびC57BL/6またはhACE2マウスには、50μgのヒルトノール（Poly ICLC、Oncovir（ワシントンDC）により供給）をアジュバントとして添加した10μgのRBD、NまたはSpiNを含むものを21日の間隔で2回投与した40,42。 あるいは、武漢SARS-CoV-2由来のSタンパク質をコードする非複製チンパンジーアデノウイルス（Covishield）を1010 PFU/マウスの濃度で1回投与した。 溶液を最終体積５０μＬで各脛骨筋に筋肉内接種した。 免疫付与の 30 日後、動物に 5 × 104 PFU の SARS-CoV-2 武漢、デルタまたは 2.5 × 104 PFU の Omicron 分離株 (hACE2 マウスの場合)、およびハムスターの場合は 105 PFU を鼻腔内に投与しました。 感染後 11 日間、体重、臨床徴候、生存率を評価しました。 組織病理学的分析では、採取した組織をリン酸緩衝 10% ホルマリンで 7 日間固定し、パラフィンに包埋し、組織プロセッサー PT05 TS (LUPETEC、英国) 組織プロセッサーを使用して処理し、組織学的パラフィン (Histosec、Sigma-Aldrich) に包埋しました。 。 厚さ 4 μm の切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色しました。

SpiN + Poly ICLC または Covishield のいずれかで免疫化した K18-hACE2 マウスを、0.5 mg/マウスのラット抗マウス CD8a または CD4 mAb (それぞれ BioXCell、クローン 2.43、および GK1.5)、あるいはその両方で腹腔内治療しました。 対照群には、０．２ｍｇ／マウスのアイソタイプ対照ラット抗ＫＬＨ ＩｇＧ（クローンＬＴＦ−２、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を与えた。 処置は、攻撃の-3、-2、および-1日前に行われた。 枯渇は、感染前の全血のフローサイトメトリー分析によって確認された。 抗体受動的移入では、免疫されていないK18-hACE2マウスに、SpiN + Poly ICLC、Covishield、またはPoly ICLCのみを投与されたマウスからの血清200μLを投与した。 接種は、攻撃の1日前に腹腔内投与により行った。 抗NおよびRBDに対する抗体の力価はELISAによって確認した。

マウス脾細胞は、100μm孔のセルストレーナー(Cell Strainer、BD Falcon)を通して脾臓を浸軟化し、続いて赤血球溶解のためにACK緩衝液で処理することによって単離した。 細胞数をウェルあたり 106 細胞に調整し、10 μg/mL の RBD または N で刺激しました。コンカナバリン A (Sigma、5 μg/mL) を陽性対照として使用しました。 刺激の 72 時間後に上清を収集し、IFN-γ および IL-10 のレベルを ELISA (R&D Systems、それぞれ Cat DY485 および DY417) によって測定しました。 あるいは、サイトカインは、製造業者の指示に従って、マウスＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７ ＣＢＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ ５６０４８５）を介して培養上清中で測定された。 サンプルをFACSVerse (BD Biosciences) で読み取って分析しました。

免疫化および攻撃を受けたマウスの肺から 5 dpi で単離した RNA サンプルを DNase (Promega) で処理し、次に、メーカーの指示に従って、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems、カタログ 4368814) を使用して cDNA に変換しました。 。 qPCR 反応は、標準条件下で ABI7500 リアルタイム PCR システム (Applied Biosystems) で Sybr Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) を使用して実行されました。 プライマー配列を補足表 6 に示します。qRT-PCR データは 1/ΔCT として示しました。

16 ウェル チャンバー スライド (ThermoFisher) を 104 個の Vero E6 細胞/ウェルでコーティングし、感染多重度 (MOI) 10 で SARS-CoV-2 とともに一晩インキュベートしました。その後、細胞をブレフェルディン A で 4 時間処理しました、パラホルムアルデヒド 4% で固定し、PBS-P (PBS 0.5% BSA + 0.5% サポニン) で透過処理しました。 その後、ウェルを 1% BSA でブロックし、RBD、N、または SpiN で免疫したマウスの血清とともにインキュベートしました。 二次抗体 Alexa Fluor 594 anti-mouse IgG (ThermoFisher) を添加し、核を DAPI (ThermoFisher) で染色しました。 スライドは、共焦点顕微鏡 LSM 780 Carl Zeiss AxioObserver、対物レンズ x63 オイル NA 1.4 で分析されました。 画像は、Mac 用ソフトウェア ImageJ バージョン 2.1 で処理しました。

免疫表現型検査では、免疫化マウス由来の合計 2 × 106 個の脾細胞を、RPMI 1640 培地単独または 10 μg/mL の SpiN、RBD、または N タンパク質を含む培地を用いて 37 °C、5% CO2 で 18 時間インキュベートしました。 培養の最後の 6 時間の間に、GolgiStop および GolgiPlug タンパク質輸送阻害剤 (BD Biosciences) を細胞培養物に添加しました。 次いで、脾細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、ＦｃＢｌｏｃｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）７３とともにインキュベートした。 以下の mAb を使用して細胞表面マーカーを標識しました:抗 CD3 PerCP-Cy5.5 (BD、クローン 145-2C11) または FITC (BD、クローン 145-2C11)、抗 CD4 Alexa Fluor 700 (Invitrogen、クローン KG1)。 5）、抗CD8 APC-Cy7（Biolegend、クローン53-6.7）、抗CD62L PE-Cy7および抗CD44 APC（Invitrogen、クローンIM7）。 細胞内染色では、製造業者の指示に従って細胞を洗浄、固定および透過処理し（Cytofix/Cytoperm、BD Biosciences）、抗IFNγ PERCP（eBioscience、XMG1.2）で染色した。 BD FACSDIVA V8.0.1 ソフトウェアを備えた BD LSRFortessa を使用してフローサイトメトリーを実行し、約 100,000 個の生 CD3+ 細胞を取得しました。 データは、FlowJo v10.5.3 ソフトウェアを使用して分析されました。

フローサイトメトリー染色のために、肺を切除し、ハサミで切り刻み、1 mLのRPMIで希釈した2 mg/mlのコラゲナーゼIV (Sigma)を使用して酵素消化した。 懸濁液を定期的に振とうしながら 37 °C で 30 分間インキュベートしました。 組織断片を、孔径50μmのナイロンフィルターFilconシステム(BD Biosciences)を使用して濾過し、次いで遠心分離した。 上清を廃棄し、細胞ペレット内の赤血球をACK溶液を使用して溶解した。 残りの細胞をRPMI 5% FBSに再懸濁し、ノイバウアーチャンバー内で計数し、PBSで1回洗浄し、細胞外フローサイトメトリー染色に使用した。 次に、細胞を以下の抗体で固定、透過処理し、染色しました: Zombie Aqua Fixable Viability Kit (Biolegend、カタログ 423101)、抗 CD11b APC-Cy7 (M1/70、Biolegend)、抗 CD11c PE-Cy7 (N418、Biolegend) 、抗Ly6C PERCP (HK1.4、Biolegend)、抗MHC-II FITC (M5/11.15.2、Biolegend)、および抗Ly6G APC (1A8、Biolegend)。 あるいは、細胞を SpiN タンパク質で培養し、抗 CD3 FITC (145-2C11、Biolegend)、抗 CD4 APC-Cy7 (GK1.5、BD)、抗 CD8 PERCP (53-6.7、Biolegend)、抗CD69 PE (H1.2F3、Biolegend)、抗 CD103 BV421 (2E7、Biolegend)、抗 IFN-γ APC (XMG1.2、Biolegend)、および抗 TNF PE-Cy7 (MP6-XT22、Biolegend)。 BD LSRFortessa を使用してフローサイトメトリーを実行し、約 100,000 個の生細胞を取得しました。 データは、FlowJo v10.5.3 ソフトウェアを使用して分析されました。

統計分析は、GraphPad Prism 6.0 for Mac (GraphPad Inc, USA) を使用して実行されました。 まず、グラブス検定で外れ値が検出され、次に D'Agostino-Pearson が実行されてデータの正規性が検証されました。 各データ分析で使用されるテストは、図の凡例で説明されています。 一般に、グループ間の比較は、データ分布に従って、対応のない t 検定またはマンホイットニー U 検定を通じて実行されました。 重量測定値とフローサイトメトリーデータは、二元配置分散分析とそれに続く Sidak の多重比較検定によって分析されました。 生存分析には、ログランク検定を使用しました。 p 値 ≤0.05 の場合、統計的差異は有意であると見なされます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

著者らは、この研究の結果を裏付けるすべてのデータが論文およびその補足情報ファイル内で入手可能であることを宣言します。 スパイク (6VSB https://doi.org/10.2210/pdb6VSB/pdb) およびヌクレオカプシド (7SD4_1 10.2210/pdb7SD4/pdb) タンパク質のエピトープ予測には、免疫エピトープ データベース (IEDB) を使用しました。 ニードルプロットでは、アルファ (MZ344997)、ベータ (MW598419.1)、デルタ (MZ359831.1)、ガンマ (MZ169911.1)、オミクロン BA の参照ゲノムのアラインメントから回収されたスパイクおよびヌクレオカプシドのアミノ酸配列を使用しました。 .1 (OL672836.1)、Omicron BA.2 (PRJNA784038)、および元の系統 (B1 – 武漢 – EPI_ISL_402123 https://www.epicov.org/epi3/frontend#4c5e54)。 図のソースデータ。 1f、g; 2b-p; 3a～f; 4a–g; 5a–c; 6a～e、g～o。 7a–h; 8a ～ 8d は用紙に付属しています。 さらに情報が必要な場合は、合理的な要求に応じて対応著者からデータを入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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この研究は、科学技術イノベーション省の Rede Virus から資金提供を受けました (Finep 01.20.0010 および 01.20.0005.00; CNPq 403514/2020-7 および 403701/2020-1 RTG)。 国立ワクチン科学技術研究所 (Fapemig APQ-03608-17/CNPq 465293/2014-0 RTG); FAPESP (2020/05527-0 RTG); 教育省 (CAPES); オズワルド・クルス財団 (INOVA、2020)、ベロオリゾンテ保護区。 ミナスジェライス州および連邦議員の議会修正案も同様です。 プロジェクト アナリストのクリスティアーヌ ゴメス氏、秘書のエリザベス アラウージョ氏、技術者のフランシエレ ピオト氏、ロザンゲラ ペレイラ氏、ロドリゴ モレリ氏に感謝します。

ワクチン技術センター、ミナスジェライス連邦大学、ベロオリゾンテパルケテクノロジコ、31.310-260、MG、ブラジル

ジュリア・T・カストロ、パトリック・アゼベド、ナタリア・S・ホホ＝ソウザ、ナタリア・サラザール、アレックス・フィオリーニ、ルーベンス・マガリャンエス、ブルーノ・カサロ、ガブリエラ・ブール、ダニエル・ドロ、ヘルトン・サンティアゴ、アレクサンドル・マシャド、フラヴィオ・ダ・フォンセカ、アナ・パウラ・フェルナンデス、サントゥザ・R.テイシェイラ & リカルド・T・ガツィネリ

オズワルド クルス ミナス財団、ベロオリゾンテ、30.190-002、MG、ブラジル

ジュリア・T・カストロ、パトリック・アゼベド、ナタリア・S・ホホ＝ソウザ、グレゴリオ・G・アルメイダ、リヴィア・I・オリベイラ、リディア・ファウスティノ、リス・R・アントネッリ、トーマス・G・マルサル、ブルーノ・バリアーテ、ガブリエラ・ブール、ダニエル・ドロ、アレクサンドル・マシャド、リカルド・T・ガツィネッリ

オズワルド・クルス財団とサンパウロ大学リベイラン・プレト医科大学のトランスレーショナル・メディスン・プラットフォーム、リベイラン・プレト、14.040-030、SP、ブラジル

ジュリア・T・カストロ、マルシリオ・J・フマガリ、ブルーナ・ラティス、シモーネ・G・ラモス、マリエラ・ピッチン、オスバルド・カンポス・ノナート、ルシアナ・ベネビデス、ジョアン・S・シルバ、リカルド・T・ガツィネッリ

ミナス ジェライス州病院財団、ベロオリゾンテ、31.630-901、MG、ブラジル

リヴィア・I・オリヴェイラ & マルコーニ・アウグスト

サンパウロ大学心臓研究所、サンパウロ、05403-900、SP、ブラジル

ホルヘ・カリル

サンパウロ大学生物科学研究所、サンパウロ、05508-000、SP、ブラジル

エドソン・デュリゴン

オンコビル株式会社; Orygen、Biotechnologia、サンパウロ、04538-133、SP、ブラジル

アンドレス・サラザール & オタヴィア・カバレロ

ミナスジェライス連邦大学生物科学研究所、ベロオリゾンテ、31.270-901、MG、ブラジル

ヘルトン・サンティアゴ、フラヴィオ・ダ・フォンセカ、サントゥザ・R・テイシェイラ

ミナスジェライス連邦大学薬学部、ベロオリゾンテ、31.270-901、MG、ブラジル

アナ・ポーラ・フェルナンデス

マサチューセッツ大学医学部、ウースター、01605 MA、米国

リカルド・T・ガツィネッリ

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JC はエピトープ予測を実行しました。 RM はニードル プロットの構築を担当しました。 JC、GB、DD はタンパク質の概念とプラスミドの構築に貢献しました。 NS および BC は、タンパク質の発現と精製、SDS-PAGE、およびウェスタンブロットを実行しました。 GGA、LIO、TGM、および MA は、ヒトサンプルの IgG および IFN-γ ELISAS を実行しました。 GA、BV、JC、および LA は、ヒトサンプルの CBA およびフローサイトメトリーを実施しました。 JC、NSH-S.、PA はマウスとハムスターの免疫化と ELISAS を担当しました。 JC はマウスの脾臓と BALF のフローサイトメトリーを実施しました。 JC、MJFPA、OCNはSARS-CoV-2を用いた攻撃実験を実施した。 MJF は中和アッセイを実施しました。 JC と MJF は免疫蛍光アッセイを実施しました。 JC、LF、および AF は、RT-PCR によるウイルス RNA の抽出と定量を実行しました。 JC は RT-PCR によりサイトカインおよびケモカインの mRNA 測定を実施しました。 MP と LB は、マウスの肺のフローサイトメトリーを担当しました。 BR と SGR は病理組織学的分析を実施しました。 ED は SARS-CoV-2 ウイルスを提供しました。 AS および OC は試薬を提供しました。 JC、MJF、RTG、SRT、APF、FF、HSJSS、AM、JK が研究の構想と設計に貢献しました。 JC と RTG が原稿を書きました。 著者全員が結果と原稿について議論しました。

リカルド・T・ガツィネッリへの通信。

RTG、SRT、APF、FF、NS、JC、NSH-S.、および PA は、この研究で評価された潜在的な COVID-19 ワクチンの共同発明者です。 この特許は評価手続き中、出願番号 BR1020210095733。 他の著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Juliane Walz と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

カストロ、JT、アゼベド、P.、フマガリ、MJ 他 RBD-ヌクレオカプシド融合タンパク質を使用した、懸念される野生型およびSARS-CoV-2変異体に対する中和抗体非依存性免疫の促進。 Nat Commun 13、4831 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32547-y

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受信日: 2022 年 4 月 15 日

受理日: 2022 年 8 月 5 日

公開日: 2022 年 8 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32547-y

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