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Oct 25, 2023

SARS の感受性の比較

Giornale ISME Volume 17,

ISME Journal volume 17、pages 549–560 (2023)この記事を引用する

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1 引用

79 オルトメトリック

メトリクスの詳細

病原性ウイルスの野生の保有場所を探索することは、ウイルスを長期的に制御し、将来のパンデミックのシナリオを予測するために重要です。 ここでは、SARS-CoV-2、SARS-CoV、およびMERS-CoVのSタンパク質を有する偽型ウイルスを使用して、55の哺乳類種に由来する83の細胞培養物に対して、比較インビトロ感染解析が最初に実行された。 トーマスキクガシラコウモリ、キングキクガシラコウモリ、ミドリザル、フェレットの培養細胞は、SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV シュードタイプウイルスに対して非常に感受性が高いことが判明した。 さらに、スパイク受容体結合ドメイン以外の 5 つの変異体 (del69-70、D80Y、S98F、T572I、および Q675H) は、SARS-CoV-2 の宿主指向性を大きく変化させる可能性があります。 形質導入率の系統発生シグナルの検査により、密接に関連した分類群は一般に、MERS-CoVに対して同様の感受性を有するが、SARS-CoVおよびSARS-CoV-2シュードタイプウイルスに対してはそうではないことが明らかになった。 さらに、PZDK1 や APOBEC3 などの 95 の遺伝子の発現が、SARS-CoV、MERS-CoV、および SARS-CoV-2 シュードタイプウイルスの形質導入率と一般に関連していることも発見しました。 この研究は、これらのコロナウイルスの種間感染の根底にある感受性、変異体、分子に関する基本的な文書を提供します。

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) は公衆衛生と世界経済に多大な脅威をもたらしており、2023 年 1 月の時点で世界中で 5 億人以上の人が感染し、660 万人以上が死亡しています。 2 はコウモリに起源があり、その後中間動物宿主を介して人間集団に侵入したと推測されています [1、2、3]。 マレーキクガシラコウモリ (Rhinolophus malayanus) 由来の BANAL-20-52、中間種のキクガシラコウモリ (Rhinolophus affinis) 由来の RaTG13、およびマレーセンザンコウ (Manis) に存在するセンザンコウ新型コロナウイルスなど、SARS-CoV-2 に類似したウイルスもありますが、 avonia) [4,5,6] は特定されているが、現時点では SARS-CoV-2 の正確な動物起源は不明のままである。 COVID-19 より前に流行を引き起こした他の 2 つのコロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス (SARS-CoV) です。これは感染したハクビシンを介してキクコウモリから人間に感染した可能性があります。もう 1 つは中東呼吸器症候群コロナウイルス (MERS-CoV) です。おそらく感染したヒトコブラクダを介してコウモリから人間に波及した可能性がある[7、8、9]。 SARS-CoV と MERS-CoV の両方の現在の脅威は最小限ですが、自然の保有源から人間への波及の潜在的なリスクについて警戒する必要があります [10、11]。

SARS-CoV-2 は、イヌ、ミンク、フェレット、カワウソ、ハムスター、ハタネズミ、シカ、シカネズミ、コウモリ、小型および大型のネコ科動物、およびいくつかの非ヒト霊長類を含む広範囲の宿主に感染することができる [12、13、–14] ]。 しかし、種間の標準化された測定が採用されていないため、これらの種の感受性を比較することは依然として課題です。 これに関して、いくつかの研究では、アンジオテンシン変換酵素 2 (ACE2) オルソログを分析することにより、SARS-CoV-2 の感染確率を予測しています。 たとえば、Damas et al. らは、410種の脊椎動物種のACE2配列を利用し、特定の絶滅危惧種（アカアシドク、テングザル、アカゲザル、クロミンククジラなど）がSARS-CoV-2感染のリスクが最も高いことを発見した[15]。 同時に、結晶構造分解能、表面プラズモン共鳴解析、分子動力学シミュレーションを使用して、さまざまな ACE2 オルソログのスパイクタンパク質に対する結合親和性を評価しています [15、16、–17]。 これらの研究は、SARS-CoV-2 の考えられる宿主範囲に関する貴重な情報を提供しますが、その予測には実験による検証が必要です。 さらに、ウイルス侵入に関連する ACE2 以外の宿主因子の影響は、これらの予測では過小評価されてきました [15、18、19]。

動物感染実験は、さまざまな分類群にわたる病原体の感受性、病原性、伝染性を理解する最良の機会を提供します[20、21、22、–23]。 しかし、広範囲の種、特に野生動物で in vivo 接種研究を行うことは非現実的です。 あるいは、多様な細胞株の in vitro 感染アッセイは、SARS-CoV-2 の感染力についての重要な洞察を提供する可能性があります [24、25]。 例えば、Chuら。 は、異なる種に由来する 25 の細胞株の複製動態と細胞変性効果を評価しました。 彼らは、SARS-CoV-2がヒト以外の霊長類、ネコ、ウサギ、ブタの細胞内で複製できることを実証した[24]。 別の研究では、12の動物種から気道上皮細胞が収集され、SARS-CoV-2がサルとネコの培養モデルで効率的に複製することが判明した[25]。 潜在的な宿主スペクトルを評価するための細胞アッセイの需要とは別に、変異が異なる種への SARS-CoV-2 の感染力と伝播力の両方にどのような影響を与える可能性があるかを調査することも急務です。 SARS-CoV-2 の継続的な適応進化により、新たな変異が急速に出現しました。 しかし、これらの変異のうちどれだけが動物の SARS-CoV-2 に対する感受性を高めたのかは依然として不明である。

ここで我々はまず、55種類の哺乳動物種に由来する偽型ウイルスと細胞培養物を用いて、SARS-CoV、MERS-CoV、およびSARS-CoV-2の潜在的な宿主範囲を評価した。 S タンパク質の部位変異が SARS-CoV-2 の宿主範囲に影響を与える能力は、部位特異的変異誘発を使用して決定されました。 次に、比較トランスクリプトミクスアプローチを使用して、これらのウイルスに対する種の感受性に関連する遺伝子発現を特定しました。 この研究は、SARS-CoV、MERS-CoV、およびSARS-CoV-2のもっともらしい宿主指向性に関する新しい情報を提供する。 さらに、我々は、SARS-CoV-2の種間感染に影響を及ぼし、将来これらのコロナウイルスがヒトから他の種へ波及するのを防ぐ可能性がある宿主因子の発現を明らかにした。

この研究の再現性を高めるために、性別、年齢、免疫力、および関連要因の影響を軽減するために、可能な限り各種の健康な若い成人男性をサンプリングしました。 最も感受性の高い細胞を再現するために、以前のプロトコルに基づいて、ペット、家畜、野生動物の複数の組織（腎臓、肺、脳、脾臓、心臓）からこの研究で使用した初代培養細胞（表S1）を単離しました。と説明されている[26]。 動物は CO2 またはペントバルビタール カルシウム (200 mg/kg) を使用して安楽死させました。 死体を解剖し、無菌条件下で腎臓、肺、心臓、脾臓、または脳を採取しました。 乾燥を避けるために、細胞抽出まですべての組織を 2% ペニシリン - ストレプトマイシン溶液 (Gibco、米国) を補充した滅菌 PBS に入れました。 各組織を 35 mm ディッシュに移し、解剖はさみを使用して小さな断片に切り刻みました。 組織断片をさらに 50 mL コニカルチューブに移し、0.25% EDTA-トリプシン (Gibco、USA) を使用して 37 °C で 30 分間酵素消化しました。 消化中、混合物を 10 分ごとに激しく振盪しました。 トリプシン消化は、コニカルチューブに FBS を添加することによって停止されました。 組織断片を含む混合物を、5 mL ピペッターを使用して 3 分間上下にピペッティングし、塊を砕きました。 得られた溶液を２５０ｇ、４℃で５分間遠心沈降させた。 次いで、ペレット細胞を収集し、再懸濁し、計数し、100 mm ペトリ皿に播種しました。 すべての皿を 37 °C、5% CO2 に置きました。 細胞の増殖と汚染について毎日細胞をチェックしました。 細胞がコンフルエントに達したときに、定期的な細胞継代を実行しました。 すべての初代細胞を単離し、10% FBS、1% ペニシリン - ストレプトマイシン溶液、および 20 mM HEPES を含む DMEM-F12 で培養しました。 すべての実験はバイオセーフティ レベル 2 (BSL-2) 施設で実施され、中国科学院動物研究所の動物倫理委員会によって承認されました (許可番号: IOZ-IACUC-2021-163)。

Huh-7 (ヒト、肝臓)、A549 (ヒト、肺)、SW480 (ヒト、結腸)、HEK-293T (ヒト、胎児腎臓)、Vero-E6 (Cercopithecus aethiops、腎臓)、 Marc-145 (Cercopithecus aethiops、腎臓)、OK (Monodelphisdomestica、腎臓)、BHK-21 (Mesocricetus auratus、腎臓)、SP2/0 (Mus musculus、骨髄腫細胞)、NIH3T3 (Mus musculus、胚)、MDBK (Bos)おうし座、腎臓）、PK-15（Sus scrofa、腎臓）、MDCK（Canis familyis、腎臓）、F81（Felis catus、腎臓）、および Mv.1.lu（Neovison vison、肺）細胞を DMEM で培養しました。 HT-29 (ヒト、結腸) 細胞株を RPMI-1640 (Gibco、米国) で培養しました。 NEF (ハダカデバネズミ、胚) 細胞株を DMEM-F12 で培養しました。 不死化コウモリ細胞株 PaKi (Pteropus alecto、腎臓)、PaLu (Pteropus alecto、肺)、および PaBr (Pteropus alecto、脳) は、Linfa Wang 博士 (Duke-NUS Medical School) のご厚意により提供され、DMEM-F12 で培養されました。 。 すべての細胞株は、10% ウシ胎児血清 (FBS、Gibco、米国)、1% ペニシリン - ストレプトマイシン溶液、および 20 mM ヒドロキシエチルピペラジン エタンを添加した特定の培地を使用して、5% CO2 の存在下、37 °C でインキュベートしました。スルホン酸（HEPES、Gibco、米国）。

pVSV-eGFP-dG (Addgene #31842)、pCAG-VSVN (Addgene #64087)、pCAG-VSVP (Addgene #64088)、pCAG-VSVL (Addgene #64085)、pCAG-VSVG (Addgene #64084)、および pCAG- T7pol (Addgene #59926) プラスミドは、Addgene から取得しました。 SARS-CoV (SARS コロナウイルス Tor2、GenBank アクセッション番号 NC_004718.3)、SARS-CoV-2 (SARS コロナウイルス 2 Wuhan-Hu-1、GenBank アクセッション番号 NC_045512.2)、および MERS のヒト コドン最適化 S 遺伝子-CoV (MERS コロナウイルス HCoV-EMC、GenBank アクセッション番号 NC_019843.3) を合成し、シュードタイプ ウイルス生成のために pcDNA3.1 ベクターにクローン化しました。 構築したプラスミドをそれぞれpcDNA3.1-SARS-S、pcDNA3.1-SARS2-S、pcDNA3.1-MERS-Sと名付けた。 HEK-293T 細胞における S タンパク質の発現は、ウェスタンブロットを使用して検証されました。 部位特異的突然変異誘発は、pcDNA3.1-SARS2-Sを鋳型として使用して実施した。 フォワードプライマーは約75℃のTmで設計され、変異は中央に集中し、対応するリバース相補配列がリバースプライマーとして選択されました。 10μLの2×Phanta Max Master Mix（Vazyme、PR China）、10pmolのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、および10ngのテンプレートプラスミドを含むように20μLのPCRミックス容量を調製した。 部位特異的突然変異誘発 PCR を 20 サイクル行った後、DpnI 制限エンドヌクレアーゼ (NEB、米国) を使用して鋳型プラスミドを消化しました。 その後、PCR 産物を大腸菌 DH5a コンピテント細胞 (Transgen、中国) に形質転換しました。 単一のクローンが選択され、配列が決定されました。 すべてのプラスミドは、QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen, USA) を使用して抽出されました。 偽型ウイルスの生成中に細胞培養物に汚染が入るのを避けるために、抽出したプラスミドを 65 °C の水浴中で 30 分間不活化しました。 プラスミドの濃度は、Nanodrop2000 (Thermo Scientific、米国) を使用して定量されました。

まず、以前の出版物 [27] で開発された方法に基づいて、VSVΔG*-G ウイルスをレスキューしました。 詳細には、80％コンフルエンスのHEK-293T細胞に、pVSV-eGFP-dG、pCAG-VSVN、pCAG-VSVP、pCAG-VSVL、pCAG-VSVG、およびpCAG-T7polプラスミドを10、3の比率で同時トランスフェクトしました。 、リポフェクタミン 3000 (Invitrogen、リトアニア) を製造業者の指示に従って使用して、それぞれ、5、1、3、および 5 μg の量で投与した。 トランスフェクションの 48 時間後に上清液を採取し、その液の半分を、pCAG-VSVG プラスミドでトランスフェクトされた HEK-293T 細胞の 2 番目のプレートに感染させるために割り当てました。 感染の 24 時間後に、HEK-293T 細胞の EGFP 発現を蛍光顕微鏡で検査しました。 VSVΔG*-G ウイルスの力価は、HEK-293T 細胞の感染とそれに続く EGFP 陽性シグナルのフローサイトメトリー分析によって定量化されました。

次に、以前の研究で報告されたプロトコルを使用して、SARS-CoV、MERS-CoV、およびSARS-CoV-2のSタンパク質が組み込まれたシュードタイプウイルスを構築しました[28]。 コンフルエンス 70 ～ 90% の HEK-293T 細胞に、リポフェクタミン 3000 を使用して、SARS-CoV、MERS-CoV、および SARS-CoV-2 S タンパク質をコードするプラスミド 15 μg をトランスフェクトしました。同時に、VSV-G タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトまたはモックしました。 - ポジティブまたはネガティブコントロールとして 293 T 細胞にトランスフェクトされます。 トランスフェクトされた細胞は、37 °C、5% CO2 で培養されました。 24 時間後、細胞を MOI = 3 ～ 4 で VSVΔG*-G ウイルスに感染させ、2 時間インキュベートしました。 その後、細胞上清を廃棄し、温かい PBS で細胞を 2 回穏やかにリンスしました。 次に、10% FBS、1% ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、および 20 mM HEPES を補充した新鮮な DMEM 10 ml をディッシュに加え、37 °C、5% CO2 でインキュベートしました。 24 時間後、これらの細胞の EGFP 陽性シグナルをチェックし、上清を収集し、遠心分離し、濾過し、アリコートに分割しました。 シュードタイプ化されたウイルスはすべて -80 °C で保存されました。 凍結融解サイクルの繰り返しは避けました。

Huh-7 細胞は、生成されたシュードタイプウイルスの定量化に使用されました。 詳細には、Huh-7細胞を定量の前日に培養した。 80% コンフルエンスに達したら、細胞を消化、定量し、48 ウェル プレートに播種しました。 一晩インキュベートした後、細胞を一連の 100、50、25、12.5、6.3、3.2、および 1.6 μL の偽型ウイルスによって 3 回複製して感染させました。 感染細胞を 37 °C、5% CO2 に置きました。 感染の 24 時間後、これらの細胞を蛍光顕微鏡を使用して検査し、続いて EGFP 陽性細胞をフローサイトメトリーで定量しました。 シュードタイプウイルスに感染した個々の細胞を計数することによって、シュードタイプウイルスを滴定した（形質導入単位、TU）。 VSVΔG*-SARS2、VSVΔG*-SARS、および VSVΔG*-MERS の最終濃度は、それぞれ 4.85 × 106 TU/mL、5.54 × 106 TU/mL、および 1.14 × 107 TU/mL でした。

この研究の再現性を高めるために、初代培養細胞の P3 および P4 継代をシュードタイプ ウイルスの in vitro 感染に使用しました。 細胞培養物を 48 ウェル プレート (ウェルあたり 10,000 細胞) に播種し、10% FBS、1% ペニシリン - ストレプトマイシン溶液、および 20 mM HEPES を補充した DMEM-F12 で培養しました。 細胞が 70% コンフルエンスに達したら、培養上清を廃棄しました。 補充された温かい PBS バッファーと 1% ペニシリン - ストレプトマイシン溶液を使用して細胞を 2 回洗浄しました。 細胞培養物を、野生型および変異型Sタンパク質、VSV-G糖タンパク質、およびネガティブコントロール（モックトランスフェクト細胞から採取した培養上清）を有するシュードタイプウイルスを含むシュードタイプウイルスに感染させた。 各感染実験には 3 つの独立した反復実験がありました。 ウイルスを 1% FBS および 1% ペニシリン - ストレプトマイシン溶液を添加した培地中で 24 時間維持し、その後顕微鏡観察および GFP 陽性細胞のフローサイトメトリー分析を行いました。 VSVΔG*-SARSおよびVSVΔG*-SARS2については、細胞培養物をMOI = 0.15で感染させた(Huh-7細胞と呼ぶ)。 VSVΔG*-MERSの場合、細胞培養物をMOI = 0.3で感染させました(Huh-7細胞と呼ばれます)。 VSVΔG*-noG と VSVΔG*-SARS2 の形質導入率の間に相関関係は観察されませんでした (cor = -0.0637、p > 0.05)、VSVΔG*-noG と VSVΔG*-SARS の間 (cor = -0.0324、p > 0.05)、 VSVΔG*-noG と VSVΔG*-MERS の間 (cor = −0.0723、p > 0.05)。

同じ割合の細胞に形質導入する感染量は同じウイルス粒子数を反映せず、異なる変異 S タンパク質を持つ偽型ウイルスの同量のウイルス粒子は同じ効率で細胞に感染しないため、同じ効率で細胞を感染させることは困難です。変異した SARS-CoV-2 S タンパク質を有するシュードタイプ ウイルスによって細胞が感染する場合、シュードタイプ ウイルスを同じ感染量に調整します。 そして、RT-qPCR によって偽型ウイルスの定量化を試みましたが、その結果には、1) 合理的な参照遺伝子が欠如しているため、高い系統誤差が含まれていることがわかりました。 2) RNA 抽出効率はウイルスによって異なるという事実。 3) qPCR 技術によって引き起こされるエラー。 4) 偽型ウイルスの収量濃度は理想的には安定していませんでした。 したがって、各細胞感染試験で各細胞培養物を感染させるために、75 μL のシュードタイプウイルスを使用しました。

偽型ウイルスに感染または疑似感染した細胞を蛍光顕微鏡で観察しました。 培地を廃棄した後、細胞を温ＰＢＳで２回洗浄し、続いて０．２５％ ＥＤＴＡ－トリプシンで５分間消化した。 次に、細胞を 1.5 mL チューブに集めました。 細胞をＰＢＳで２回洗浄してトリプシンを除去し、７０μｍセルストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、米国）を使用して濾過して細胞の塊を除去した。 最終的な細胞を暗室内の氷上に置いた。 フローサイトメトリー分析を実行しました（CytoFLEX、Beckman Coulter、米国）。 VSV△G*-G ウイルスに感染した細胞またはネガティブコントロールを使用して、FSC、SSC、および FITC 検出器の電圧を最適化し、ポジティブまたはネガティブ粒子の細胞集団を定量しました。 各感染アッセイでは、少なくとも合計 5000 個の細胞が入力されました。 形質導入率のパーセンテージは、3 つの独立した反復に基づいて平均 ± SD として表示されました。

SARS-CoV-2 の S タンパク質の RBD と異なる種の ACE2 オルソログの間の界面は、Amber 20 を使用した分子動力学 (MD) シミュレーションによって検査されました [29、30、–31]。 まず、NCBI (国立バイオテクノロジー情報センター) データベースまたは生成した RNA-seq データセットからアミノ酸配列をダウンロードしました。 RBD-ACE2 結晶構造 (PDB ID: 6M0J) は Protein Data Bank [32] からダウンロードされ、SWISS-MODEL で SARS-CoV-2 S-RBD および ACE2 オーソログの 3D モデルを準備するためのテンプレートとして機能しました [33] 。 次に、各システムをリープによってチェックし、溶質から 10 Å 延長された TIP3P 水の立方体周期ボックス内で溶媒和しました。 このシステムは、Na+ または Cl- の有理数の対イオンを使用して中和され、その後、Amber ff14SB 力場を使用してパラメーター化されました [34]。 次に、最急降下法を使用した 5000 ステップと共役勾配最小化の 5000 ステップを含む 10,000 ステップのエネルギー最小化が実行されました。 次に、各システムは NVT アンサンブル内で 0.2 ns で 300 K まで加熱されました。 最小化、加熱、平衡シミュレーションは、Amber20 のサンダー プログラムを使用して、重原子に強い制約 (500 kcal/mol/Å2) を与えて実行されました。 30 ns MD シミュレーションは、NPT アンサンブルと pmemd.cuda を使用して 300 K の一定温度下で実行されました。 システム温度は、ランジュバン力学を使用して維持されました。 ファンデルワールスエネルギーと短距離静電エネルギーの間のカットオフ距離は10Åでした。 粒子メッシュ Ewald 法を使用して、長距離静電相互作用を計算しました。 各 RBD-ACE2 複合体の最終平均構造の平衡軌道から少なくとも 3000 のスナップショットが抽出されました。 MM/GBSA 法を使用して結合自由エネルギー (ΔG) を計算し、結合自由エネルギーを各残基のエネルギー寄与に分解しました [35]。

私たちは、種間の形質導入率に基づいて、スパイク変異体が特定の ACE2 残基と相互作用するかどうかを調査しました。 各スパイク変異体について、細胞株/種は、k 平均クラスタリング法を使用して 2 つのグループ (それぞれ高感染グループと低感染グループ) に分類されました。 次に、MD シミュレーションによって推定された ACE2 の 42 個の主要な残基の各位置で、最も大きい番号を持つアミノ酸がその位置の主要な残基として特定され、その頻度が計算されました。 最後に、フィッシャーの直接確率検定を使用して、主要な残留物が高感染グループと低感染グループに均等に分布しているかどうかを定量化しました。 フィッシャーの直接確率検定の p 値が 0.05 未満の残基は、高感染グループと低感染グループの間で残基の頻度が大きく異なることを示します。 これは、スパイクの亜種と相互作用した可能性があることを意味します。

この研究の再現性をさらに向上させるために、生成された細胞培養物に対して RNA-seq 分析を実行しました。 インビトロ感染解析に使用した細胞培養物の全 RNA は、ユーザーズガイド (Invitrogen、米国) に従って TRIzol 試薬を使用して単離しました。 ライブラリー構築前に、Agilent 2100 Bioanalyzer (レキシントン、米国) を使用して RNA の品質と濃度を評価しました。 各 RNA サンプルについて、ライブラリー調製キット NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina® (NEB、USA) を使用して、150 bp のライブラリー サイズを構築しました。 ペアエンド配列決定は、「Illumina」NovaSeq 6000 プラットフォーム上の Novogene Co. Ltd を使用して実行されました。 これにより、約 27 億の読み取りが生成されました。 生データの低品質読み取りを削除するために、パッケージ「NGSQCTools」の IllQC_PRLL.pl を使用しました [36]。 種特異的なオルソログ セットを生成し、発現値を計算するために、公開データベースから種の参照ゲノム (利用可能な場合) をダウンロードしました。 参照ゲノムを持たない人のために、Trinity を使用して、以前に生成された肝臓、腎臓、脳のトランスクリプトームに基づいて転写物の de novo アセンブリ [37] を実行し、転写物を組み立てました [38]。 固定パラメータ k-mer サイズは 25、最小コンティグ長は 200、ペアフラグメント長は 500 でした。次に、「cd-hit-est」を使用して、同じ種の異なる組織から集められた転写産物を処理し、クラスター化しました。 90% の類似性を持つ配列を検出し、各クラスターに最も長い転写物を残します [39、40]。 最後に、Augustus を使用して、重複を除いた転写産物に対して遺伝子予測を実行し、GTF アノテーション ファイルを取得しました。

ヒト参照配列を構築するために、「カフリンク」パッケージの「gffread」を使用してヒト CDS 配列を抽出し、不完全な ORF 転写物と偽遺伝子転写物を除去し、各遺伝子の最長転写物を抽出しました [41]。 BLAST は、フィルタリング閾値として e 値 <10-6 および同一性 >90% を持つ、反復性が高く類似性の高い遺伝子を除去するために使用されました [42]。 データセット全体のマッピング率は 9.63% ～ 66.58% の範囲でした。 最終的に、18,552 個のユニークなタンパク質コード遺伝子が参照配列として得られました。

各遺伝子の最も長い転写物が抽出され、ヒトサンプルからのタンパク質配列を用いて相互の「BLAST」が実行されました[43]。 フィルタリングの閾値は、e 値の場合は 10-6、同一性の場合は 30% に設定されました。 互いに最もよく整列した 2 つの遺伝子をオルソロガス遺伝子として定義しました。 完全なゲノムとデノボゲノムは比較すると大きく異なるため、オルソロガス遺伝子の CDS 配列を参照ゲノムとして使用し、RNA-seq データマッピング用の GTF 形式のアノテーション ファイルを生成しました。 STAR を使用して、オルソロガス遺伝子セットの配列サイズと異なる種のリード長に基づいてインデックスを構築しました。 デフォルトのパラメーターを使用して、RNA-seq データを参照ゲノムと位置合わせしました [44]。 Subread ソフトウェア パッケージの「featureCounts」を使用してリードをカウントし、複数一致するリードを排除しました [45]。

最後に、正規化係数として各サンプルのライブラリ サイズを計算しました。 R ソフトウェアパッケージ「edgeR」を使用して、ライブラリのサイズと遺伝子長（ヒトに基づく）を log2（RPKM-TMM + 1）で正規化しました [46、47]。 サンプル情報、マッピング率、オルソログのリスト、遺伝子長、および発現レベルは表 S12 ～ S17 で入手できます。

発現が VSVΔG*-SARS2、VSVΔG*-SARS、および VSVΔG*-MERS の形質導入に関連している遺伝子を同定するために、一般化線形モデルを使用して遺伝子発現と形質導入率の相関関係をテストしました。 特定の種で 1 つのオルソロガス遺伝子が同定されなかった場合、その遺伝子はその種では発現していないとみなされました (遺伝子発現値 = 0)。 3 サンプル未満で発現した遺伝子を除外しました。 通常の最小二乗法、ブラウンモデル、およびオーンシュタイン・ウーレンベックモデルを使用して、各遺伝子の形質導入率の最良の相関関係を決定しました。 VSVΔG*-SARS2およびVSVΔG*-SARSの形質導入率については系統発生シグナルが検出されなかったため、2つの偽型ウイルスの形質導入率の回帰分析では系統関係は考慮されなかった。 ただし、p 値を補正するためにすべての回帰分析で 2 段階の方法が採用されました [47、48]。 最初のステップでは、傾きに最も大きな影響を与えた種 (つまり、潜在的な外れ値) が残差によって除去され、その後、回帰が再度実行されました。 回帰に対する異常値の影響を除去するために、結果の p 値を p.robust として定義しました。 2 番目のステップでは、残りの種に対して回帰プロセスを繰り返し、残りのすべての種が一度削除されるまで、毎回残りの種の 1 つを削除します。 次に、回帰に対する種の影響を除去するために、プロセス内の最大 (最も重要度の低い) p 値を p.max としてスコア付けしました。 重要な遺伝子のカットオフは、p.robust < 0.01 および p.max < 0.05 に設定されました。 遺伝子濃縮分析は、DAVID 2021 更新版 (注釈、視覚化、統合発見のためのデータベース) を使用して実行されました [49]。 EASE のパラメータは、フィッシャーの直接確率検定で 0.3 でした。

R はプロットと統計分析に使用されました。 値は平均±SDとして表されました。 細胞培養物が野生型 S タンパク質を有する VSVΔG*-SARS2 に感染した場合、相対的な形質導入率は、以下の原則に基づいて 4 つのカテゴリー (つまり、最小、軽微、中程度、効率的な形質導入) に分類されました。 まず、すべての形質導入率の分位数をリストし、四分位範囲 (IQR) を計算しました。 次に、最小値から Q1 までの範囲の形質導入率の標準偏差 (SD) を計算しました。 これを SDQ1 と名付けました。 SDQ1 の形質導入率が 10 倍未満の細胞感染は無視できる感染として分類されました。 10* SDQ1 ～ Q3 の間の形質導入率の細胞感染は軽度の感染として分類されました。 Q3 から Q3 + 1.5*IQR までの形質導入率は中程度の感染として分類されました。 Q3 + 1.5*IQR を超える形質導入率は効率的な感染として分類されました。 この原理は、VSVΔG*-SARS および VSVΔG*-MERS による細胞培養の感染結果を評価するためにも適用されました。 SARS-CoV-2 由来の変異 S タンパク質を有する VSVΔG*-SARS2-Smut 偽型ウイルスを細胞培養物に感染させた場合、各 VSVΔG*-SARS2-Smut の感染結果は、A549 細胞の相対的な形質導入結果に対して正規化されました。 外れ値は、SARS-CoV-2 の指向性を大幅に強化する変異であると仮定されました。

SARS-CoV-2、SARS-CoV、および MERS-CoV に対する感受性を評価するために、それぞれ VSVΔG*-SARS2、VSVΔG*-SARS、および VSVΔG*-MERS と名付けられた、関連する S タンパク質を保有する GFP をコードする偽型ウイルスが検査されました。生成されます（図S1）。 次に、双歯目（1 種）、ディデルフィモル目（1 種）、ヒラコイデア（1 種）、スカンデント目（1 種）、霊長類（3 種）、ウサギ目（1 種）を含む 12 目に属する 55 の哺乳類種に由来する細胞培養物を収集しました。齧歯目（8 種）、ユーリポティフラ目（1 種）、奇蹄目（2 種）、偶蹄目（3 種）、食肉目（7 種）、翼手目（26 種）（図 1、図 S1）。 64 個の初代細胞培養物、3 個の不死化細胞培養物、および 16 個の細胞株を含む、合計 83 個の細胞培養物が得られました (表 S1)。 これらの細胞培養物のうち、56 個は ACE2 が豊富に発現している腎臓に由来しました。 10 件は肺由来でした。 7つは心臓から抽出されました。 そして、残りの10個の細胞培養物は、胚、結腸、脾臓などの他の組織に由来したものでした（図1、表S1）。 これらの細胞培養物を偽型ウイルスに感染させ、GFP 陽性シグナルのフローサイトメトリー分析を行って、その形質導入率を定量化しました (図 S1)。 全体として、腎臓由来の細胞培養物は、他の組織由来の細胞培養物よりも比較的高い形質導入率を示しました（図S2A）。 初代細胞培養と永久細胞株の間で、偽型ウイルスへの形質導入率に有意な差は観察されませんでした（図S2B）。

この研究では、55 個の哺乳類細胞培養の系統樹を使用しました。 系統発生は TIMETREE (http://www.timetree.org/) から取得されました。 赤色のフォントで示された分類群は、以前の研究に基づいて SARS-CoV-2 に自然に感染する可能性がある種であり、青色のフォントで示された分類群は、in vivo の実験的感染分析によってテストされた種です。 さらに、83 個の細胞培養物が腎臓、心臓、肺、脳、その他の組織に由来しました。 黒枠の漫画要素はこれらの組織に由来する細胞株です。 小さな漫画は BioRender (https://biorender.com/) から入手しました。 B VSVΔG*-SARS2、VSVΔG*-SARS、およびVSVΔG*-MERSウイルスに感染した83細胞培養の形質導入率（平均±SD、n = 3）。 一部の細胞培養物は同じ宿主に由来しました。 その場合、形質導入率が最も高い細胞培養物がこのパネルに表示されます。 灰色と黒の破線は、それぞれ中程度の伝達と効率的な伝達を定義するための基準を表します。

VSVΔG*-SARS2に感染すると、83個の細胞培養物は異なる感受性を示し、全体の形質導入率は0〜26.7％でした（図1、図S3、表S1）。 44 個の細胞培養物に、VSVΔG*-SARS2 による最小限の形質導入を行いました (形質導入率 <1.2%)。 イヌ由来の細胞培養物 (BcKi、BcLu、および MDCK) を含む、合計 32 の細胞培養物に VSVΔG*-SARS2 がわずかに (形質導入率 1.2 ～ 3.8%) または中程度 (形質導入率 3.8 ～ 8.8%) 形質導入されました。ネコ（F81）、フェレット（MpuHe）、タヌキ（NpKi）、ミンク（Mv.1.Lu）、トガリネズミ（TbKi）、ブタ（PK-15）（図1、図S3）。 これは、タヌキ、犬、猫、ミンク、フェレット、トガリネズミ、ハムスターが無症候性から中程度の臨床症状を伴うSARS-CoV-2に感受性があることが知られているという事実と一致している（表S2）[22、50]。 我々は、VSVΔG*-SARS2がPK-15細胞（4.9％）に感染できることを発見しました（図1）が、以前の実験感染では一貫性のない結論が導かれました。 いくつかの研究では、ブタがSARS-CoV-2に耐性があることが示されている[23、51、52]が、他の研究では、SARS-CoV-2がブタに感染し、共同飼育されている未処置のセンチネルブタに感染する可能性があることが示されている[53、54]。 デグー (オクトドン デグー、ヒストリコモルフ齧歯類) の心臓 (OdHe)、肺 (OdLu)、腎臓 (OdKi) 細胞やケレンヤマネ (Graphiurus kelleni) の心臓 (GkHe) 細胞培養など、いくつかのペットからの細胞培養、グリリドげっ歯類）は、VSVΔG*-SARS2によって中程度に形質導入されました（図1）。 マウスはSARS-CoV-2感染に対して耐性があることが判明した。 ただし、マウス（NIH3T3およびSP2/0）からの細胞培養物は、VSVΔG*-SARS2によってわずかに形質導入されました（図S3、表S1）。 SARS-CoV-2 が高齢の BALB/c マウスの気道での連続継代によって適応できることを考えると [55、56]、SARS-CoV-2 に感受性のなかった動物が、ウイルス進化の過程で潜在的な宿主となる可能性があると推測した。繰り返しの暴露。

最後に、トーマスキクガシラコウモリ (RtKi)、キクガシラコウモリ、ヒト、ハクビシン、アフリカミドリザル、およびフェレットに由来する 7 つの細胞培養物が、VSVΔG*-SARS2 に対して非常に感受性が高いことが判明しました (形質導入率 > 8.8%)。 その中で、ヒト、ハクビシン、フェレットは、生体内分析に基づいて、SARS-CoVおよびSARS-CoV-2の感受性宿主として特定された(表S2)[57]。 特に、Huh-7 (ヒト細胞株) の 14.0%、Vero-E6 (ミドリザル細胞株) の 11.4%、Marc-145 (ミドリザル細胞株) の 11.9%、および MpuKi.2 (フェレット) の 10.0%腎臓細胞株）に形質導入したところ、以前の研究で見出されたように、これらの細胞株がSARS-CoV-2に対して非常に感受性が高いことが確認された[28、58]。 ハクビシンはSARS-CoVの複製宿主の1つとして認識されているため、我々はハクビシン腎臓細胞（PlKi）がVSVΔG*-SARS2に対して非常に感受性が高いことに注目した[8、59]（図1、図S2）。 重要なのは、フェレット (Mustela putorius furo) の腎臓細胞 (MpuKi.2) も SARS-CoV-2 に対して非常に感受性が高かったことです。 実験研究では、フェレットが SARS-CoV-2 に感染しやすいことが示されています [23、51、60、61、62]。 トーマスキクガシラコウモリおよびキングキクガシラコウモリ由来の初代細胞培養物は、ヒト Huh-7 細胞株よりも VSVΔG*-SARS2 に対して感受性が高いことが判明し (図 1、表 S1)、これらが SARS の宿主となる可能性があることを示唆しています。 -CoV-2。

VSVΔG*-SARS2、VSVΔG*-SARS、およびVSVΔG*-MERSの形質導入率に対するPagelのλの最尤推定値は、6.74 × 10−5 (系統発生的シグナル検定: logλ = −163.95、p > 0.05)、6.33 × でした。それぞれ 10-5 (logλ = −192.22、p > 0.05)、0.74 (logλ = −174.13、log0 = 1475.26、p = 0.09 × 10−2) であり、近縁な分類群は一般に VSVΔG* に対して同様の感受性を持っていることを示しています。 -MERS ではありますが、VSVΔG*-SARS および VSVΔG*-SARS2 には影響しません。 一貫して、VSVΔG*-SARS は、VSVΔG*-MERS よりも VSVΔG*-SARS2 (R2 = 0.61、p < 0.001、系統発生的一般化最小二乗検定) とより類似した向性プロファイルを示しました (R2 = 0.29、p < 0.001、系統発生的一般化最小二乗検定)平方テスト）。 特に、VSVΔG*-SARS に感染した 83 個の培養細胞は、0 ～ 38.4% の形質導入率を示しました (図 1)。 全体として、38 の細胞培養には最小限 (形質導入率 0 ～ 1.1%)、23 にはわずかに (1.1 ～ 3.8%)、10 には中等度に (3.8 ～ 8.9%)、11 には高度に (8.9 ～ 38.4%) VSVΔG*-SARS が形質導入されました。 。 VSVΔG*-SARSに対して最も高い感受性を示した細胞培養物は、飼いならされたフェレットに由来し、フェレット腎臓MpuKi.2細胞の38.4%およびフェレットMpuKi.1細胞の31.1%が形質導入された。 これは、ヒト細胞（Huh-7）と比較して2.6倍および2.0倍の増加を表します（図1、図S4、表S1）。 フェレットはSARS-CoVの動物モデルとして使用されており、くしゃみ、発熱、下痢などの臨床症状を経験するため、これは注目に値する[63]。 フェレットの腎臓細胞に次いで最高位にランクされた細胞培養物はトーマスキクガシラコウモリ由来のもので、形質導入率は37.2%であり、この種がSARS-CoVの重要な宿主としても機能する可能性があることが示された。

ハクビシンは、SARS-CoV の複製宿主として認識されています。 我々の結果は、ハクビシン PlKi 細胞の一貫した高い形質導入率 (9.1%) を示しています。 さらに、VSVΔG*-SARS は、RtKi (37.2% 対 25.5%)、PK-15 (13.4% 対 4.9%)、MpuKi などの感受性の高い種からの細胞培養物への形質導入において、VSVΔG*-SARS2 よりも高い能力を示しました。 (38.4% vs 10.0%)、MpuKi.1 (33.3% vs 1.9%)、および BcKi (21.1% vs 3.8%) 細胞 (図 1、図 S4)。 これは、SARS-CoVがSARS-CoV-2よりも人間から自然宿主に感染しやすい可能性があることを示唆しています。

我々は、41 の培養細胞が VSVΔG* によって最小限に (形質導入率は 0 ～ 1.3% の範囲)、21 がわずかに (1.3 ～ 4.3%)、13 が中程度に (4.3 ～ 10.0%)、8 が効率的に (10.0 ～ 32.9%) 形質導入されたことを発見しました*。 -MERS (図 1、図 S3)。 驚くべきことに、ヒト細胞株は、VSVΔG*-MERS感染時に最も高い形質導入率を示し、これはVSVΔG*-SARSおよびVSVΔG*-SARS2とは異なっていた。 さらに、形質導入率が最も高い上位10の細胞培養物のうち、6つ（MlKi、RrKi、RtKi、MsKi、PlaKi、およびMfiKi）はコウモリ由来でした（図1、図S3）。これは、いくつかのコウモリ種が次の役割を果たすことを示唆しています。 MERS-CoVの潜在的な保有宿主。 特に、アオコウモリ (Pipistrelus abramus) は懸念される種です。 彼らは人間のコミュニティのすぐ近くに住んでおり、ウイルスを人間に伝染させる可能性があります[64]。 また、これまでの研究ではフェレットがMERS-CoV感染に耐性があることが示唆されていたが[65]、フェレット腎臓MpuKi.2細胞培養物の10.0％がMERS-CoVシュードタイプウイルスによって形質導入されたことが判明した（図1）。 さらに、MERS-CoV 受容体 DPP4 [66] はフェレットの腎臓細胞でわずかに発現しています。 これらの結果は、DPP4 以外にも MERS-CoV の侵入を助ける因子が存在すること、そしてフェレットが SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV に感染しやすいことを示唆しています。

SARS-CoV-2 S タンパク質変異体が SARS-CoV-2 への感受性を変えるかどうかを調べるために、SARS-CoV-2 の 77,125 個のスパイク遺伝子が GISAID (2020/10/26 に取得) から取得され、残基頻度を持つ 65 個の変異体が抽出されました。 0.075% より高いものが選択されました (図 2A)。 さらに、マウス、ネコ、イヌ、ミンク、トラのサンプルから分離された SARS-CoV-2 変異株の S タンパク質の 14 残基の変異と、bat-CoV RaTG13 (GISAID: EPI_ISL_402131)、bat の S タンパク質の変異が選択されました。 -CoV RmYN02 (GISAID: EPI_ISL_412977)、およびセンザンコウ-CoV MP789 (GISAID: EPI_ISL_412860)。 合計で、変異した SARS-CoV-2 S タンパク質を持つ 79 の偽型ウイルスが構築され、続いて 44 の細胞培養物に in vitro 感染が行われました (図 2B)。

A GISAIDデータベースから取得したS配列を基に各部位の置換頻度を解析しました。 B S タンパク質からの 79 の部位変異の分布。 黒枠の部位は、動物宿主由来のウイルスゲノムの比較解析に基づいて選択された変異であることを意味する。 C 異なる細胞培養におけるすべての変異の全体的な正規化された形質導入率。 図に示されている小さな漫画は、さまざまな哺乳類の目の種を表しています。 これらの細胞培養物の組織起源は x 軸に示されています。 DA del69-70、D80Y、S98F、T572I、および Q675H が S タンパク質の RBD の外側に位置することを示す S-ACE2 複合体の 3D 構造。

我々は、これらの変異のほとんどが、VSVΔG*-SARS2-Smutシュードタイプウイルスの細胞培養物への形質導入効率にほとんど影響を及ぼさないことを発見した（図2C、図S5）。 予想通り、ヒト、サル、コウモリの細胞培養物 (Huh-7、Vero-E6、Marc-145、および PabKi.1) は、他の細胞培養物と比較して偽型ウイルスに対してより感受性が高かった (図 2C)。 これまでの研究では、Sタンパク質の置換N439K、N501Y、D614G、およびH655YがヒトにおけるSARS-CoV-2の病原性と伝播を高めることが示されている[67、68、–69]。 本研究では、これらの置換が常に形質導入率を促進するとは限らないことを発見しました。 たとえば、H655Yはトガリネズミ細胞（TbKi）へのVSVΔG*-SARS2の形質導入を増加させました（図S5）が、D614G置換はハダカデバネズミ線維芽細胞および日本人へのVSVΔG*-SARS2の形質導入能力を大幅に減少させました。ピピストレルコウモリ細胞（PabKi.1）（図S6）。 さらに、T22I 置換により、SARS-CoV-2 の F81 (ネコ腎臓細胞株) および BHK-21 (ゴールデンハムスター腎臓細胞株) に対する指向性が大幅に減少しました。 さらに、H519N および T716I 置換は、PK-15 (ブタ腎臓細胞株) および PaKi (クロオオコウモリ腎臓細胞株) の形質導入能力の低下を示しました。 最後に、置換T29I、E281V、およびS939Fは、SARS-CoV-2のMfuKi（東ベントウィングコウモリ腎細胞）細胞培養に対する指向性を大幅に低下させました（図S5）。

いくつかの変異は、特定の細胞培養物に対するVSVΔG*-SARS2-Smutの形質導入効率を有意に増加させることが判明した（図2C、図S5）。 特に、Sタンパク質のdel69-70は、VSVΔG*-SARS2-Sdel69-70のコウモリPabKi.1細胞(17.8%)への形質導入能力をHuh-7細胞(9.8%)の2倍のレベルまで促進した(図1)。 S5B）。 同様に、VSVΔG*-SARS2-SD80Yは、ゴールデンハムスター細胞において7.2％の形質導入率を引き起こし、これはHuh-7細胞（6.6％）よりも高かった（図S5C）。 我々は、置換S98Fが、Huh-7細胞（38.9％）と比較して、タヌキ腎細胞（62.4％）およびリケットオオアシコウモリ腎細胞（45.0％）における形質導入率を有意に増強することを発見した（図S5D）。 同様に、置換T572Iは、Huh-7細胞（12.2％）と比較して、ブタPK15細胞（11.3％）へのVSVΔG*-SARS2の形質導入効率を有意に増加させました（図S5E）。 Q675H変異はまた、SARS-CoV-2シュードタイプウイルスがファットテールスナネズミ腎細胞に感染する能力を大幅に強化し、形質導入率はHuh-7細胞の15.7％と比較して13.4％でした（図S5F）。 注目すべきことに、これら 5 つの変異は S タンパク質の受容体結合ドメイン (RBD) の外側に位置していました (図 2D)。 したがって、これらの結果は、さまざまな変異が特定の哺乳類種のウイルス感受性に独特の影響を及ぼし、RBD 領域内と外部の変異はウイルスの侵入と結合にとって同等に重要であるという考えを裏付けています。

Amber 20 および RBD-hACE2 の結晶複合体 (PDB ID: 6M0J) を使用した分子動力学シミュレーションは、RBD とさまざまな ACE2 オルソログ間の結合自由エネルギー (ΔG) が -64.7 ～ -24.8 kcal/mol の範囲であることを示しています。 ミドリザル（Chlorocebus sabaeus）およびキクガシラコウモリ（Rhinolophus ferrumequinum）のACE2は、それぞれSARS-CoV-2 S-RBDとの結合自由エネルギーが最高および最低を示した（図S6A）。 さらに、残基ごとに基づいて自由エネルギーの寄与を分析しました（図S6B–D）。 結果は、RBDとACE2間の相互作用に重要な42アミノ酸残基があることを示しました（図S6B-E）。

この点において、異なるスパイク変異体の種間感染スペクトルにより、種を超えた形質導入率に影響を与える可能性がある、ACE2アミノ酸残基とスパイク変異体間の部位ごとの「相互作用」の可能性を調査することができました。 主要な残基の頻度が各スパイク変異体によって示唆される高感染群と低感染群間で均等に分布しているかどうかをテストすることにより、そのような潜在的な「相互作用」の候補となるスパイク変異体とACE2残基の98の組み合わせを特定しました（「材料と方法」、図S7、表S3）。 これらの重要な相互作用に関与する上位の ACE2 位置は 49、31、354、82、75、35、353 でしたが、上位のスパイク変異体には P26L、S254F、H519N、H146Y、A262S、および T478I が含まれていました。 これらの相互作用の大部分 (86.7%) には、RBD 領域のスパイク変異体が関与していました (表 S3)。 これらの結果は、さまざまなスパイク変異体が、特定の哺乳類種の異なる ACE2 残基および/または他の内因性因子と相互作用することにより、ウイルス感受性に独特の影響を与えている可能性を裏付けています。

42 種の哺乳動物種からの細胞培養のトランスクリプトーム プロファイルが作成され、回帰分析が実行されて、その発現が VSVΔG*-SARS2、VSVΔG*-SARS、および VSVΔG*-MERS の形質導入率と有意に相関する遺伝子が特定されました。 合計で、発現レベルがVSVΔG*-SARS2の形質導入率と有意に関連した遺伝子は590個ありました（図3A、表S4）。 最も顕著に濃縮された経路は単純ヘルペスウイルス 1 感染であり (p = 4.30 × 10−23、フィッシャーの直接確率検定)、関連遺伝子の 93.6% (63 遺伝子中 59) がジンクフィンガータンパク質でした (図 3B、表 S5)。 ）。 ジンクフィンガータンパク質を含む対応する濃縮された生物学的プロセスは、DNA 鋳型転写制御 (p = 2.40 × 10−12、フィッシャーの直接確率検定) および RNA ポリメラーゼ II プロモーター転写制御 (p = 5.10 × 10−10、フィッシャーの直接確率検定) です (表S6)。 ジンクフィンガータンパク質は宿主とウイルスの相互作用において機能し、宿主細胞の転写プロファイルを調節することによってウイルス複製において複数の役割を果たしているようである[70]。 多くのジンクフィンガータンパク質は、VSVΔG*-SARS2 感染率と正の相関があります。 これは、宿主細胞の転写レベルがSARS-CoV-2の侵入に重要であり、通常、インフルエンザウイルスで観察される「キャップスナッチング」と呼ばれる機構に依存していることを示している[71]。 細胞培養における VSVΔG*-SARS2 の形質導入率に関連した上位 5 つの遺伝子は、PDZK1 (p.robust = 5.87 × 10−11)、SERPINF2 (p.robust = 2.31 × 10−9)、SCG5 (p.robust) でした。ロバスト = 3.51 × 10−9)、DEPP1 (p.robust = 4.57 × 10−9)、ABCC6 (p.robust = 2.71 × 10-8) (図 3C、図 S8、表 S4)。 これらの遺伝子はさらに研究する価値があります。 たとえば、PDZK1 は、PDZ (PSD95/DLG/ZO-1) ドメインを含む足場タンパク質 (NHERF3 と呼ばれる) をコードします。このタンパク質は、細胞間接合を媒介するタンパク質のグループに属し、さまざまな分子間の調整に関与しています。規制プロセス。 以前の研究では、SARS-CoVと神経向性狂犬病ウイルスが、それらのエンベロープタンパク質のPDZ結合機能に関連していることが示された[72]。 PDZK1はSR-B1と相互作用し、C型肝炎ウイルスの侵入を促進することができる[73]。 さらに、ACE2 C末端PDZ認識モチーフ802QTSF805はNHERF1および/またはNHERF3に結合し、ACE2媒介SARS-CoV-2細胞侵入を促進する[74、75]。 SERPINF2 は、セリンプロテアーゼ阻害剤の 1 つをコードします。 最近の研究では、他のいくつかの SERPIN (SERPINA1 および SERPINA3) とともに、SERPINF2 の発現が COVID-19 患者の血清レベルで増加することが明らかになりました [76]。 さらに、MAK16 (p.robust = 1.92 × 10−5)、H3Y2 (p.robust = 4.08 × 10−5)、RBMX (p.robust = 6.14 × 10−5) などのいくつかの遺伝子は、形質導入率との有意な負の相関(図S8、表S4)。 ウイルス感染におけるMAK16とH3Y2の役割は不明であるが、X-ed RNA結合モチーフタンパク質をコードするRBMXは、ウイルスRNAと宿主タンパク質の相互作用を介してSARS-CoV-2の侵入に応答する[77、78]。

それぞれ、VSVΔG*-SARS2、VSVΔG*-SARS、およびVSVΔG*-MERS偽型ウイルスの形質導入率と有意に関連した590個の遺伝子、453個の遺伝子、および416個の遺伝子を示すAAベングラフ。 合計 95 個の遺伝子が 3 つの偽型ウイルスに共通して関連していました。 B これらの遺伝子によって強化され、VSVΔG*-SARS2、VSVΔG*-SARS、およびVSVΔG*-MERSの形質導入率に関連した発現を示したKEGG経路。 C 発現が VSVΔG*-SARS2、VSVΔG*-SARS、および VSVΔG*-MERS の形質導入率と関連していたいくつかの遺伝子のプロット。 D 3 つのシュードタイプのウイルスに共通して関連する 95 個の遺伝子のヒートマップ。 発現量はlog2(RPKM+1)で表した。 赤色のフォントでマークされた細胞培養物は、VSVΔG*-SARS2 によって効率的に形質導入されました。 ツリーの下の青色のバーは、VSVΔG*-SARS2 形質導入と負に関連した遺伝子を示し、一方、赤色のバーは、VSVΔG*-SARS2 形質導入と正に関連した遺伝子を示します。

我々は、VSVΔG*-SARSの形質導入率に関連する453個の遺伝子の発現レベルとVSVΔG*-MERSの形質導入率に関連する416個の遺伝子の発現レベルの間に有意な関連性があることを確認した。 これらの遺伝子は主に代謝経路および単純ヘルペスウイルス 1 感染に富んでいます。これは、すべての遺伝子発現の半分以上が VSVΔG*-SARS2 形質導入と相関していたという事実と一致しています (図 3B、表 S6 ～ S11)。 発現が VSVΔG*-MERS に関連する遺伝子は、生物学的プロセスの濃縮、特に DNA 鋳型転写制御および RNA ポリメラーゼ II プロモーター転写制御において、VSVΔG*-SARS2 と同様のプロファイルを示しました。 しかし、発現がVSVΔG*-SARS形質導入に関連する遺伝子によって富化された生物学的プロセスのトップはタンパク質分解であった（p = 7.7 × 10−4、フィッシャーの直接確率検定）（表S8）。これは、宿主細胞のプロテアーゼが必須であることを強調している。 SARS-CoVシュードタイプウイルスの感染力について[79]。 さらに、最近の研究では、プロテアーゼがSARS-CoV-2の感染プロセスの中心であり、プロテアーゼを標的とする薬剤は用量依存的にSARS-CoV-2力価の低下を引き起こす可能性があることを示唆している[80]。 これは、プロテアーゼが SARS 様疾患の治療の一般的な標的である可能性があることを示唆しています。 ただし、SARS-CoVおよびMERS-CoVの認識されている受容体（ACE2およびDPP4）の発現は、形質導入率と有意な相関はありませんでした。 この結果を考慮して、これらの関連遺伝子の潜在的な役割を検討しました。 SARS-CoV-2感染ではいくつかの遺伝子応答（例、HSD17B2、IGLL1）が見出された[81、82]が、VSVΔG*-SARS形質導入に関連する上位遺伝子の役割はより限定的であった。

私たちは、SARS-CoV、MERS-CoV、およびSARS-CoV-2シュードタイプウイルスの形質導入率に一般的に関連する95個の遺伝子のリストを作成しました（図3D、表S12）。 このリストには、上記の遺伝子だけでなく、SARS-CoV-2 ウイルスと宿主の相互作用に関与する可能性のある APOBEC3B、MYO5B、HPN (ヘプシン) などの遺伝子も含まれていました。 たとえば、哺乳動物のタンパク質ファミリーに属するAPOBEC3Bは、細胞のシトシンデアミナーゼで構成され、レンチウイルスの種間感染を潜在的に防ぐ障壁として機能します[83]。 さらに、APOBEC3はシチジンをウリジンに編集することでSARS-CoV-2のゲノムを絶えず形成することができる[84]。 対照的に、MYO5B は Spike-RBD 誘発肥満細胞脱顆粒モデルでは下方制御されており、エンドソーム輸送に役割を果たしています [85]。 MYO5B はウイルスタンパク質とも相互作用します。 以前の研究では、MYO5タンパク質の阻害がCOVID-19治療の効果的な標的となる可能性があることが示唆されている[85]。 これらの結果は、これらの共通遺伝子がウイルスの侵入と複製に広く関与していることを示しており、したがって、それらは依然として種間感染リスクをさらに評価するための適切な標的である。

今回我々は、SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoVが数十種の哺乳類の細胞に感染できることを実証し、これらが汎用ウイルスでありヒトに特異的に適応していないことを示している。 さらに、さまざまな哺乳動物の培養細胞は、SARS-CoV-2、SARS-CoV、および MERS-CoV シュードタイプウイルスに対してさまざまな感受性を示します。 これは、SARS-CoV-2が、小規模または大規模な適応進化変化の後に複数の種に波及し、自然の保有源を確立する能力があることを意味します。 私たちの結果は、トーマスキクガシラコウモリ、キングキクガシラコウモリ、ミドリザル、フェレットがこれらのコロナウイルスの保有宿主として機能する可能性を強調しました。 特に、トーマスキクガシラコウモリおよびキングキクガシラコウモリ由来の初代細胞培養物は、ヒト細胞株よりもVSVΔG*-SARS2に対して感受性が高いことが判明した。 キクガシラコウモリ（キクガシラコウモリ科）は多くの人獣共通感染症ウイルスの保有源であると考えられており、一般に感染に耐性があると考えられているため、これは重要です。 しかし、非常にまれなサルベコウイルスは、トーマスキクガシラコウモリとキングキクガシラコウモリの両方で報告されていますが、他のキクガシラコウモリ（例えば、チャイニーズキクガシラコウモリ）では報告されていません[86]。 これは、SARS-CoV-2がヒトからこれら2種のコウモリに波及する可能性があるという懸念を引き起こすだけでなく、キクガシラコウモリのウイルス不耐症の監視を優先することにもなる。

ACE2 が SARS-CoV および SARS-CoV-2 のスパイクタンパク質の機能的受容体であることが判明して以来、先駆的な研究では、ACE2 配列および/またはその結合親和性を使用して、さまざまな動物種の SARS-CoV-2 に対する感受性を予測してきました。スパイクタンパク質[15、87、88]。 私たちの実験的アッセイでは、いくつかの種（アカゲザルやゴールデンハムスターなど）のSARS-CoV-2に対する感受性が検証されましたが、コンピュータでの予測と細胞アッセイの間にはかなりの矛盾があります。 たとえば、チャイニーズトガリネズミとフェレットは、SARS-CoV-2 感染のリスクが低いかまったくないと予測されています [15]。これはおそらく、それらの ACE2 配列がヒト ACE2 から分岐しているという事実によるものと考えられます。 しかし、私たちの実験では、両方の種の感受性が中程度であることが示されました。 同様に、コウモリは一般に感染リスクが低いと予測されていますが、我々の結果は、いくつかのコウモリ種は感染率が高い可能性が高いことを示唆しています。 したがって、感染感受性を実験的に調べる研究は、将来のインシリコ予測と比較する上で非常に価値があります。 さらに、表 S2 に示すように、我々の研究で示された in vitro 感受性の 75% は in vivo 接種アッセイによって裏付けられました。 in vitro アッセイと in vivo アッセイの違いは、マウス、アカギツネ、ウシで観察されました。 たとえば、接種アッセイでは、マウスがSARS-CoV-2感染に耐性があることが示唆されましたが、私たちの研究では、マウスの細胞培養が中程度の形質導入率を示すことがわかりました。 これは、細胞モデルが生物全体の複雑さに似ていない可能性があるという事実、または in vitro で生成されたデータを in vivo モデルに変換するという特定の課題によるものである可能性があります [57]。 それにもかかわらず、SARS-CoV-2 および他のサルベコウイルスの感受性リスクおよび自然宿主を決定する際には、in vivo 検査は in vitro 検査から恩恵を受ける可能性があります。

また、さまざまなスパイク変異体に対するいくつかの哺乳類種の感受性を調べたところ、各スパイク変異体が異なる感染スペクトルを示すことがわかりました。 特に、RBD 領域にないいくつかのスパイク変異体 (Del69-70、D80Y、S98F、T572I、および Q675H) は、SARS-CoV-2 の感染力を高めることが示されました。 変異体 del69-70 は 2020 年の初めに最初に特定され、過去数年間で 3 つの異なる変異体 (Y453F、S493K、N501Y) に変異しました [89]。 以前の報告では、del69-70 が S タンパク質の切断と SARS-CoV-2 B.1.1.7 変異体の感染力を増加させることが示されています [90、91]。 この変異は、人口密度の高い都市部に生息するアオコウモリなど、他の動物へのSARS-CoV-2の波及を促進する可能性がある。 さらに、感染率に影響を与える可能性がある ACE2 残基とスパイク変異体との間の相互作用が、我々の研究で発見されました。 これらの ACE2 残基の一部は、SARS-CoV RBD と ACE2 の間のインターフェースにインポートされます。 たとえば、Lys31 と Lys353 はウイルス結合ホットスポットであり、Lys31 と Glu35 の間、および Lys353 と Asp38 の間の塩橋で構成されています [92、93]。 しかし、これらの予測された相互作用におけるスパイク変異体のほとんどは、N 末端ドメイン (NTD) に位置していました。 したがって、RBD の内側と外側の領域は、ウイルスの侵入と感染にとって同等に重要である可能性があります。 これらのスパイク変異体（例、P26L、S254F、H146Y、A262S）は、既知のすべての NTD 特異的中和抗体 [94] によって認識される「NTD スーパーサイト」を構成し、したがって、免疫逃避。

系統発生シグナルの検査により、SARS-CoV は MERS よりも SARS-CoV-2 とより類似した指向性プロファイルを示すことが示されています。 これは、SARS-CoV と SARS-CoV-2 が同じ受容体を使用しているという事実による可能性があります。 しかし、SARS-CoVシュードタイプウイルスは、イヌ、ブタ、フェレットのいくつかの培養細胞への形質導入においてより高い効率を示しており、さらなる調査により、この違いに寄与するSARS-CoVとSARS-CoV-2の間のスパイク変異やその他の要因が明らかになる可能性があることが示唆されている。 (図S4)。 回帰分析の結果、SARS-CoV-2、SARS-CoV、およびMERS-CoVの侵入を促進することが知られている一般に知られている受容体および因子の発現は、種間感染と相関しないことが示されました（図S8）。 特に、ACE2（p.robust = 0.14）、FURIN（p.robust = 0.89）およびTMPRSS2（p.robust = 0.11）の発現レベルは、VSVΔG*-SARS2形質導入率と有意な相関を示しませんでした（図S9A- C; S9D、および表 S4、表 S6)。 対照的に、CTSL (p.robust = 7.4 × 10−3) は、VSVΔG*-SARS2 形質導入率と有意に相関していました。

我々は、特定の細胞株が高レベルのACE2を発現していること（例、フクロモモンガ、ネパールヒゲコウモリ、キクガシラコウモリ由来の細胞）が、VSVΔG*-SARS2による形質導入が最小限またはほんのわずかであることを発見しました（図S9A-C）および表S1)。 ただし、RNA発現は細胞表面上のACE2タンパク質を完全に表すことができないため、これは他の種のSARS-CoV-2感受性の決定におけるACE2の役割を否定するものではない可能性があります。 さらに、その後の罰則付き回帰モデル分析により、ACE2の配列変化が系統的に多様な分類群全体の形質導入率と有意に相関していることが明らかになりました（F = 15.78、p = 8.9×10−13）（図S10、S11）。 これは、ACE2 発現ではなく配列の変化が感受性の違いに寄与していることを示唆しています。 ただし、ACE2 配列によって説明される形質導入率の合計分散は、約 28.9% 変化します。 したがって、将来の研究では、この研究で同定された発現が形質導入率と有意に相関していた遺伝子など、感受性に関連する他の宿主内因性因子を調査する必要がある。

最後に、我々の結果は、細胞培養モデルが、SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoVに感受性のある哺乳類宿主のスペクトルを特定することにより、サルベコウイルスの種間感染を理解する重要な方法であるという事実を強調している。亜種。

この研究の RNA 配列データは、ScienceDB (https://doi.org/10.57760/sciencedb.j00001.00445) および中国国立生命情報センター/北京ゲノミクス研究所の国立ゲノミクスデータセンターのゲノム配列アーカイブに保管されています。 、中国科学院 (GSA: CRA009056) および NCBI (PRJNA906190)。

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サンプルの収集と準備をサポートしてくださった Pengcheng Wang、Xuanjing Li、Yun Huang、Linfa Wang、Alice C. Hughes に感謝します。 また、この原稿の執筆中にサポートしてくれた Chrissie、Sara、Jenni、Dax にも感謝します。 このプロジェクトは、中国国家自然科学財団 (32070528)、中国科学技術省国家重点研究開発プロジェクト (2021YFC2301300)、中国国家自然科学財団 (82050002)、中国科学院 (KJZD-SW-L11) および北京自然科学財団 (JQ19022) の主要プログラム。

これらの著者は同様に貢献しました：Meng Li、Juan Du。

中国科学院動物研究所、動物生態学および保全生物学の主要研究室、北京、100101、中国

Meng Li、Juan Du、Weiqiang Liu、Zihao Li、Fei Lv、Chunyan Hu、Yichen Dai、Xiaoxiao Zhang、Zhan Zhang、Gaoming Liu、Qi Pan、Xiao Wang、Pingfen Zhu、Xuming Zhou

中国科学院大学、北京、100049、中国

Juan Du、Weiqiang Liu、Zihao Li、Fei Lv、Chunyan Hu、Xiaoxiao Zhang、Zhan Zhang、Qi Pan

中国科学技術大学生命科学部（中国、安徽省）

ヤン・ユウ

北京先端構造生物学センター、北京フロンティアイノベーションセンター、薬学部、清華大学清華北京生命科学センター、100084、北京、中国

徐丹

イリノイ大学、イリノイ州アーバナ、人類学部、生態学、進化、保全生物学プログラム

ポール・A・ガーバー

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XZ と ML は研究を発案し、プロジェクトを設計しました。 ML は実験を実施し、分析を完了し、原稿を書きました。 JD、ZL、FL は細胞培養物を準備しました。 WL と CH は RNA 解析、データ解析、生成された構造図を実行します。 GL、LW.、XW、QP、XT、PAG、および XZ は結果について議論し、この原稿を改訂しました。 すべての著者がデータ解釈に貢献しました。

周Xuming氏への通信。

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転載と許可

Li、M.、Du、J.、Liu、W. 他哺乳類における SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV の感受性の比較。 ISME J 17、549–560 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41396-023-01368-2

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受信日: 2022 年 8 月 15 日

改訂日: 2023 年 1 月 10 日

受理日: 2023 年 1 月 12 日

公開日: 2023 年 1 月 23 日

発行日：2023年4月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01368-2

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自然 (2023)