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Oct 26, 2023

結核ワクチンMycobacterium bovis BCGおよびワクチン候補BCGΔBCG1419cに対する初期自然免疫応答および適応免疫応答の評価

Rapporti scientifici Volume 12,

Scientific Reports volume 12、記事番号: 12377 (2022) この記事を引用

1722 アクセス

2 引用

7 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ワクチン Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) は、特定の形態の結核 (TB) に対して防御的な免疫応答を誘発します。 ただし、BCG の有効性には限界があるため、代替の結核ワクチン候補を特定することが重要です。 最近、BCG欠失変異体およびワクチン候補BCGΔBCG1419cは、バイオフィルム形成の増強により静脈内感染したBALB/cマウスにおいてより長く生存し、結核の慢性期における結核誘発性肺病変に対してBALB/cおよびC57BL/6マウスの両方をよりよく保護することが実証された。 BCG 対照と比較した感染。 BCGΔBCG1419cによって誘発される防御は、C57BL/6マウスの感染部位における炎症誘発性サイトカイン(すなわち、IL6、TNFα)のレベルの低下にも関連していた。 慢性結核中のBCGおよびBCGΔBCG1419c免疫マウスの異なる免疫プロファイルを考慮して、免疫直後の肺および他の組織の多次元フローサイトメトリー分析を使用して、これら2つのグループを区別する初期の免疫学的イベントがあるかどうかを判断することに着手しました。 。 我々の結果は、BCGで免疫したマウスとBCGΔBCG1419cで免疫したマウスの間の多くの先天的および適応的反応の違いを示しており、これは後者の方が持続期間が長く、炎症が少ない可能性があることと一致しており、これには疲弊したCD4+ Tヘルパー（TH）細胞の頻度が低く、IL10の頻度が高いことが含まれる。 -T細胞をそれぞれ産生します。 これらの研究は、BCGΔBCG1419c の使用が代替結核ワクチン候補として有利である可能性を示唆しています。

結核（TB）は感染症による主な死亡原因です1。 結核は、肺胞マクロファージに感染し、リンパ管または血行性の広がりを介して肺外組織に広がる可能性がある細菌種である結核菌（Mtb）の空気感染によって引き起こされます2。 結核には、重度、活動性、慢性、無症状、潜伏性など、宿主の反応に応じてさまざまな臨床症状が現れます3。 社会経済状況の改善、公衆衛生の実践、効果的な薬物治療の使用により、世界的な結核率は減少しました。 しかし、これらの感染率は、2015 年までに結核発生率を逆転させるという世界保健機関 (WHO) の目標には達しておらず4、2030 年までに結核流行を終結させるという WHO の基準を達成するという目標には達していません5。結核抵抗性を効果的に促進する安全なワクチンです。

結核ワクチンであるカルメットゲラン桿菌（BCG）は、ヒトでの毒性が人工培養での複数回の継代によって弱毒化されたウシ型結核菌の弱毒化生菌株です。 BCG は、重症型の小児 TB6 に対する新生児ワクチンとして世界中で投与されています。 しかし、小児におけるBCGの使用は、その有効性が一定ではないこと7、および初期の免疫原性に起因する有害事象の数8により議論の余地があります。 予防接種後最初の 2 週間以内に、ほぼすべての BCG 接種者は、ワクチン接種部位での丘疹形成（潰瘍化または瘢痕を残す可能性がある）から、流入リンパ節の腫れに至るまで、軽度の有害事象を経験します。 重篤な有害事象には、より顕著な形態の皮膚病変（BCG 尋常性狼瘡など）、化膿を伴うリンパ節炎、および骨炎が含まれます。 BCG 予防接種に伴う有害な炎症事象の数と、結核流行国の親の間でワクチンへの躊躇が増加している9,10,11,12 ため、(有効性にかかわらず) 炎症性ワクチンを子供に投与することに消極的であるため、 BCGと比較して、早期の反応原性は低下しているが、結核に対する予防効果は同等以上である結核ワクチン候補を特定することが重要である。

最近、ワクチン候補 BCGΔBCG1419c は、さまざまなマウスモデル (BALB/c13,14、C57BL/615,16、および B6D2F1 [ C57BL/6J × DBA/2J]13)、2 型糖尿病 BALB/c モデル 17 を含むが、モルモットでは感染後 2 か月の時点で血行性拡大の抑制において BCG よりも効果的でした 18。 M. ボビス BCG1419c 遺伝子は、ビス-(3'-5')-環状二量体 GMP (c-di-GMP) を加水分解するホスホジエステラーゼ活性をコードします。ビス-(3'-5')-環状二量体 GMP (c-di-GMP) は、細菌の運動性を低下させ、バイオフィルムの形成を増加させる分子です (バイオフィルムは、内部に包まれた固着細菌です)細胞外高分子物質のマトリックス）19． BCG1419c 欠失の結果として、BCGΔBCG1419c 株はバイオフィルム産生能力が増加し、静脈内感染後の BCG パスツールと比較して免疫正常マウスにおいてより長く持続します 20。 重要なことは、BCGΔBCG1419cで免疫化したマウスは、後にMtb15に感染させたBCGで免疫化したマウスと比較して、Mtb感染後の肺の病変も少ないことである。 興味深いことに、ワクチン接種後60日目で、BCGΔBCG1419c免疫マウスは、親BCG16と比較して、C57BL/6から得られたBALF中のT CD3+ CD4+ 細胞およびT CD3+CD4+CD44+ 細胞の数の増加を示した。 また、BALB/c マウスの脾臓では、BCGΔBCG1419c は、親の BCG13 と比較して、T CD3+CD4+IFNγ+ 細胞および T CD3+CD8+IFNγ+ 細胞を増加させました。 さらに、我々は、BCGΔBCG1419cが、活動性および慢性TB13のBALB/cモデルにおいて、IFNγ産生T細胞の肺における異なる存在を促進し、マクロファージを活性化する一方で、肺におけるB細胞、CD8+細胞、および樹状細胞の相対的な存在を変化させることを観察した。 、結核 2 型糖尿病の BALB/c モデルにおける 17。 これらすべての発見は、BCG および BCGΔBCG1419c が、ワクチン接種された宿主のさまざまな臓器および組織における感染前および感染後の適応免疫細胞の相対的組成に影響を与えることを示しています。

BCGΔBCG1419cが実験的結核の複数のモデルにおいて有効なワクチンであり、肺の病理として測定される結核疾患の予防および脾臓への転移においてBCGを上回っていることを考慮して、我々はBCGΔBCG1419cの初期免疫原性が結核と同等であるか、または異なるかを決定するために一連の実験を実施した。 BCG によって誘発され、その有害な炎症作用は通常、予防接種後 2 ～ 3 週間以内に観察されます。 具体的には、野生型マウスとトランスジェニックIL10レポーターマウス株をBCGまたはBCGΔBCG1419cで免疫し、続いて詳細な免疫表現型検査を実施して、免疫後最初の2～3週間以内に起こる自然免疫事象と適応免疫事象、および細胞性免疫事象を包括的に特定しました。 IL1021、22、23、24のソース。 我々のデータは、これまで知られていなかった、BCGによって誘発される初期の免疫学的事象、ならびにBCGとBCGΔBCG1419cによって誘発される免疫応答の間の表現型および機能の違いを実証している。 BCGΔBCG1419cの有効性の理解と同様に、BCGの初期免疫原性のメカニズムと我々のデータの関連性について議論します。

この研究とそれに関連する実験は、オハイオ州立大学 (OSU) の施設内バイオセーフティ委員会 (IBC) および OSU 施設内動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認されました。 この研究は関連する施設ガイドラインに従って実施され、ARRIVE ガイドライン (https://arriveguidelines.org) に従って報告されています。

ボビス結核菌 BCG パスツール株 (BCG) と、遺伝子 BCG1419c20 によってコードされる環状ジ GMP ホスホジエステラーゼを欠くその同質遺伝子誘導体 BCGΔBCG1419c の冷凍バイアルを、以前の研究でコロラド州立大学 (コロラド州フォートコリンズ) から受け取りました15。 、-80 °C で保存。 解凍後、細菌懸濁液 (1 mL) を、滅菌 150 × 25 mm ネジ蓋付きガラス培養管内の 9 mL 7H9 培地 (OADC、0.1% Tween 80 を補充) に移しました。 培養物の通気と撹拌のために、非常に小さなプラスチックでコーティングされた磁気撹拌棒が追加されました。 この細菌/7H9 懸濁液をマグネチックスターラー上に置き、37 °C、5% CO2 で 15 日間培養しました (この期間中、スターラーバーを撹拌するのに必要な最小限の磁力を適用しました)。 この最初の 15 日間の後、5 mL の細菌/7H9 懸濁液を 50 mL の合成 Proskauer Beck 培地 (Youmans and Karlson25 から改変、PB: 0.5% KH2PO4、0.5% l-アスパラギン一水和物、0.06% MgSO4・7H2O) に移しました。 、０．２５％クエン酸マグネシウム、２％グリセロール、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０）を滅菌ガラス培養ボトルに入れ、３７℃、５％ＣＯ２でさらに１７日間培養した（この期間中、培養物を３０ＲＰＭで穏やかに揺動させた）。 この 17 日間の期間の終わりに、BCG および BCGΔBCG1419c を等分し、ネジ蓋付き微量遠心管内で -80 °C で急速凍結しました。 -80℃で5日間凍結した後、BCGおよびBCGΔBCG1419cの個々のアリコートを解凍し、段階希釈物を7H10（OADC、0.1％L-アスパラギンを補充）およびTCA（汚染をテストするため）上にプレーティングした。 コロニー数は、BCG および BCGΔBCG1419c アリコートの両方が 5 × 104/mL であることを示しました。 ＴＣＡプレートは増殖を示さなかった（すなわち、ＢＣＧもＢＣＧΔＢＣＧ１４１９ｃも汚染物質を含まなかった）。

C57BL/6 マウスは、The Jackson Laboratory (メイン州バーハーバー) から入手しました。 IL10 レポーター マウス (C57BL/6 バックグラウンド) は、Weiguo Cui 博士 (ウィスコンシン州ミルウォーキー、ウィスコンシン州血液センターの血液研究所) から寛大にも提供されました 26。 すべてのマウスは、オハイオ州立大学 (OSU) の大学実験動物資源 (ULAR) 内で飼育され、滅菌水と水を自由に与えられました。 すべての方法および手順は、OSU 動物管理使用委員会 (IACUC) が承認したプロトコルおよび手順に従って実行されました。

免疫化の日（０日目）に、ＢＣＧおよびＢＣＧΔＢＣＧ１４１９ｃのアリコートを解凍し、ツベルクリン注射器に直接装填した。 マウスの首の後ろに、1 × 104 CFU の BCG または BCGΔBCG1419c (つまり、5 × 104 CFU/mL アリコートの 200 μL) を皮下 (sc) 免疫しました。 免疫後 14 日目に、安楽死させた IL10 レポーター マウスから頸部リンパ節と脾臓を採取し、フローサイトメトリー分析に使用しました。 免疫後 18 日目に、安楽死させた C57BL/6 マウスから血液、脾臓、肺を採取し、フローサイトメトリー分析に使用しました。 結果に記載されているように、IL10 レポーター マウスの分析は、BCG 免疫化 C57BL/6 マウスと BCGΔBCG1419c 免疫化 C57BL/6 マウスの間の表現型の違いよりも IL10 発現の違いが先行するかどうかを決定するために、C57BL/6 マウスの分析（14 日目と 18 日目）の前に実行されました。

1 mL シリンジのプランジャー部分を使用して、脾臓およびリンパ節組織をメッシュ スクリーンを通して静かに押しました。 コラゲナーゼ/DNase 処理後に肺も同様に処理しました。 得られた細胞懸濁液を、氷冷したR10培地(Gibco® Thermo Fisher製RPMI 1640、10% FBS、2 mM l-グルタミン、100 U/mLペニシリンG、 100μg/mLストレプトマイシン）。 チューブを250×g、4℃で7分間遠心沈降させた。 細胞ペレットをR10培地で再懸濁した。 上清を捨てた後、細胞ペレットを再度洗浄し、1 mLのRBC溶解緩衝液とともに室温でインキュベートした。 ＲＢＣ溶解反応は、１ｍＬのＲ１０培地を使用して１０分後に停止され、２５０×ｇで７分間、４℃で遠心分離された。

脾臓、肺、血液組織から新たに単離した細胞を、あらかじめ温めておいた R10 培地に移し、洗浄しました。 次に、細胞をR10培地に1mlあたり100万〜200万細胞で再懸濁し、最終濃度10μg/mLのゴルジプラグの存在下でPMA/イオノマイシン（最終濃度2μg/mL）を用いてFACチューブ内で刺激しました。 (BD Biosciences、サンノゼ、カリフォルニア) 37 °C、5% CO2 インキュベーター内で 12 時間。 インキュベーションの最後に、細胞内染色手順を実行しました。 以下のモノクローナル抗体を使用しました:FITC 抗 CD3 (クローン 17A2)、Alexa Fluor 532 抗 CD4 (クローン RM4-5)、PE 抗 CD127 (クローン SB/199)、PE-eFluor 610 抗 PD1 (クローン J43) )、PE-Cy5 抗 CD11b (クローン M1/70)、PerCP-Cy5.5 抗 CD44 (クローン IM7)、PerCP-eFluor 710 抗 CXCR5 (クローン SPRCL5)、PE-Cy7 抗 CD117 (クローン 2B8) 、Alexa Fluor 647 抗 CRTH2 (クローン No3m1scz)、Alexa Fluor 700 抗 TNFα (クローン MP6-XT22)、Brilliant Violet 421 抗 CD45 (クローン 30-F11)、Super Bright 436 抗 CD62L (クローン MEL-14) 、eFluor 450 抗グランザイム b (クローン NGZB)、BD Horizo​​n BV480 抗 IFNγ (クローン XMG1.2)、Brilliant Violet 570 抗 CD8 (クローン 53-6.7)、Brilliant Violet 605 抗 IL17 (クローン TC11-18H10)。 1)、Brilliant Violet 650 anti-Gr1 (クローン RB6-8C5)、Brilliant Violet 711 anti-CD19 (クローン 6D5)、Brilliant Violet 750 anti-CD27 (クローン LG.3A10)、Brilliant Violet 785 anti-NK1.1 (クローン) PK136）。 サンプルを Fixability Viability Dye (Aqua Live/Dead 染色) で染色し、15 分間インキュベートしました。 次に細胞を洗浄し、続いて表面抗体カクテルを添加した。 30 分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、固定バッファー (カタログ番号: 420801 Biolegend) で 20 分間固定し、1 × 細胞内染色透過化洗浄バッファー (カタログ番号: 421002 Biolegend) で透過処理しました。 細胞内抗原の検出に推奨される量の直接結合一次抗体を添加し、暗所で 4 °C で 25 分間インキュベートしました。 すべての洗浄ステップは、4 °C、700 g で 6 分間実行されました。 すべての抗体は、最適な濃度を決定するために事前に滴定されています。 最後に、ストレーナーキャップ付き FACs チューブを通して細胞を洗浄および濾過した後、Cytek Aurora または FACS Canto フローサイトメーターでサンプルを取得し、FlowJo バージョン 10.6.1 (Becton Dickinson、オレゴン州アッシュランド) を使用して分析しました。

図は、GraphPad Prism バージョン 7 を使用して作成されました。統計分析には、バンドルされたソフトウェアを使用しました。 図中の棒は、平均値と標準偏差 (SD) を加えたものを示します。 データ点間に示された数字は、図に示された比較の p 値を表します。 統計的比較を実行する前に、Shapiro Wilk テストを使用してデータ分布が正常かどうかを判断しました。 3 つ以上の実験グループが関与する統計的比較には、分散分析 (ANOVA) が使用されました。 他のすべての統計的比較では、Student の t 検定を使用しました。 各図に示されているデータは、実験グループ (PBS、BCG、BCGΔBCG1419c) あたり少なくとも 3 匹のマウスを使用した 3 つの別個の実験の代表です。

BCGに応答する初期の自然免疫集団と適応免疫集団を同定するため、またBCG1419cの欠失がこれらの応答にどのような影響を与えるかを同定するために、我々はC57BL/6マウスを104CFUの生BCGパスツールとその同系誘導体であるBCGΔBCG1419cで免疫した（図1）。 .1A）。 PBSのみで免疫したマウスを陰性対照として使用した。 免疫後 18 日目に、複数の組織 (血液、脾臓、肺) を収集し、単一細胞懸濁液に処理し、多次元フローサイトメトリーで分析して、自然免疫サブセットと適応免疫サブセット間の表現型および機能の違いを特定しました (図 1B)。

実験の概要。 (A) ワクチン接種スケジュールと (B) 先天的および適応的サブセットを特定するためのゲート戦略。

BCG1419c の欠失がマウスの BCG 誘発免疫状況を変えるかどうかを包括的に評価するために、肺および全身の免疫集団を特徴付ける 27 色のフローサイトメトリー パネルを設計しました。 従来のフローサイトメトリーと脾臓、肺、血液由来の CD45+ 細胞の t 分布確率的埋め込み (tSNE) 次元削減プロットを適用したところ、19 の免疫細胞集団の同定が可能になりました (図 2)。 クラスタリング アルゴリズムにより、CD3 および CD19 の発現が存在しない 8 つの自然免疫メタクラスター (図 2A)、および CD3 および CD19 の発現が存在する 11 の適応免疫メタクラスター (図 2B) の自動定義が可能になりました。図 2 に示したのと同じ tSNE プロット.2A ただし、T セルと B セルのオーバーレイを使用します)。 肺、脾臓、および血液クラスターの分布の違いは、図 2A、B の上、中、下の行を比較することによって観察できます。また、PBS コントロール、BCG および BCGΔBCG1419c 免疫マウスを比較することによって観察できます（図 2 の左、中、右の列を比較） ２）。 先天性系統に関しては、BCG および BCGΔBCG1419c 免疫マウスの脾臓 (図 2A 上のパネル、赤色のデータ点) および肺 (図 2A 上のパネル、赤色のデータ点) において、CD45+ 細胞における NK 細胞の発現の減少が観察されました。 ２Ａ中パネル）および血液（図２Ａ下パネル）。 逆に、BCGおよびBCGΔBCG1419c免疫後の血液中では、PBS対照と比較して、CD45+中の単球の発現が増加した(図2A下パネル、水色のデータ点)。 適応系統に関しては、tSNE 分析により、BCG または BCGΔBCG1419c 免疫グループの脾臓における B 細胞クラスターの増加、ならびに肺における CD4+ および CD8+ T 細胞クラスターの増加がさらに明らかになりました (図 2B)。

T 分布確率的近傍埋め込み (tSNE) によって視覚化された、PBS、BCG、および BCGΔBCG1419c によって誘導された免疫集団のグラフベースのクラスタリング。 対照マウス、BCG免疫マウスおよびBCGΔBCG1419c免疫マウスの(A)血液、(B)脾臓および(C)肺におけるCD45+細胞の代表的なtSNEマップ。 各 t-SNE プロットでは、クラスターが色分けされ、図 1B で定義されているマーカーに基づいて系統識別が割り当てられます。

tSNE 分析では高レベルのデータ視覚化が可能ですが、我々は従来のフローサイトメトリー分析を使用して、BCG および BCGΔBCG1419c によって差次的に影響を受けた先天性集団と適応集団をより綿密かつ定量的に検査しました。 tSNE 分析により、ワクチン接種に対する肺反​​応と全身反応が異なることが実証されたため、脾臓 (図 3、4、5、6 の左パネル)、肺 (図 3、4、5、6 の中央パネル)、および血液 (図 3、4、5、6 の右パネル）は個別に検討されました。

BCG および BCGΔBCG1419c で免疫化されたマウスにおける自然免疫サブセットの頻度。 BCG および BCGΔBCG1419c で免疫化したマウス、および PBS 対照における自然免疫サブセット (すなわち、ILC、NK 細胞、単球、および Gr1 細胞) の頻度を、免疫化後 18 日目に脾臓、肺、および血液で測定しました。ゲートされた脾臓 (左列)、肺 (中列)、および血液 (右列) における (A) ILC3、(B) ILC1、(C) NK 細胞、(D) 単球および (E) Gr1 細胞の頻度単一の生きた CD45+ 細胞から採取。 ILCはCD3-CD19-CD127+でゲートオフされ、CRTH2対cKitの発現に従って異なるサブセットが決定されました：ILC1、CRTH2-cKit-; ILC2、CRTH2+cKit+/-; ILC3、CRTH-cKit+。 ボックスはグループあたり 3 匹のマウスからのデータを表します。 アスタリスクは、示された行間の統計的に有意な差を表します (*p ≤ 0.05; **p ≤ 0.005; ***p ≤ 0.0005)。

BCG および BCGΔBCG1419c で免疫化したマウスにおける適応免疫サブセットの頻度。 BCG および BCGΔBCG1419c で免疫化したマウス、および PBS コントロールにおける適応免疫サブセット (つまり、T 細胞および B 細胞) の頻度を、免疫後 18 日目に脾臓、肺、および血液で測定しました。(A) の頻度を示します。単一生細胞 CD45+ 細胞をゲートオフした脾臓 (左列)、肺 (中列)、および血液 (右列) の CD4+ T 細胞、(B) CD8+ T 細胞および (C) B 細胞。 ボックスはグループあたり 3 匹のマウスからのデータを表します。 アスタリスクは、示された行間の統計的に有意な差を表します (*p ≤ 0.05; **p ≤ 0.005; ***p ≤ 0.0005)。

BCG および BCGΔBCG1419c で免疫化したマウスにおける CD4+ T 細胞サブセットの頻度。 BCG および BCGΔBCG1419c で免疫化したマウス、および PBS 対照における CD4 T 細胞 (TH) サブセットの頻度を、CD62L、CD44、PD1、および CXCR5 の発現に基づいて脾臓、肺、血液で測定しました (ナイーブ、CD62LHICD44LO、ナイーブ、CD62LHICD44LO;エフェクター、CD62LLOCD44HI、記憶、CD62LHICD44HI、疲労、PD1+、濾胞性、CXCR5+PD1+）。 脾臓（左の列）、肺（中央の列）および血液（右の列）。単一生CD45+細胞をゲートオフしたもの。 ボックスはグループあたり 3 匹のマウスからのデータを表します。 アスタリスクは、示された行間の統計的に有意な差を表します (*p ≤ 0.05; **p ≤ 0.005; ***p ≤ 0.0005)。

BCG および BCGΔBCG1419c で免疫化したマウスにおける CD8+ T 細胞サブセットの頻度。 BCG および BCGΔBCG1419c 免疫マウス、ならびに PBS コントロールにおける CD8 T 細胞 (TC) サブセット頻度を、CD62L および CD44 (ナイーブ、CD62LHICD44LO; エフェクター、CD62LLOCD44HI;メモリ、CD62LHICD44HI、使い果たした、PD1+)。 脾臓 (左の列)、肺 (中列)、および血液 (右の列) における (A) ナイーブ TC 細胞、(B) エフェクター TC 細胞、(C) メモリー TC 細胞、および (D) 消耗した TC 細胞の頻度を示します。 )、単一の生細胞 CD45+ 細胞をゲートオフしたものとして。 ボックスはグループあたり 3 匹のマウスからのデータを表します。 アスタリスクは、示された行間の統計的に有意な差を表します (*p ≤ 0.05; **p ≤ 0.005; ***p ≤ 0.0005)。

先天性系統 (ILC3、ILC1、NK 細胞、単球、および Gr1 細胞) のうち、ほぼすべてが BCG および/または BCGΔBCG1419c 免疫に応答して変化しましたが、その程度は脾臓、肺、血液の間で異なりました (図 3)。 すべての組織において、BCG または BCGΔ1419c 免疫化後に NK 細胞の頻度は減少しましたが (図 3C)、ILC1 の頻度は変化していませんでした (図 3B)。 その他の変化は組織特異的でした。脾臓 ILC3、単球、および Gr1 細胞の頻度は免疫化の影響を受けませんでしたが、BCG または BCGΔBCG1419c 免疫化動物の肺ではそれらの頻度が減少しました (図 3A、D、E)。 免疫化によってプラスの影響を受けた唯一の先天性頻度は、BCGΔBCG1419c 免疫化動物の血中単球 (図 3D)、および BCG 免疫化動物の血中 Gr1 細胞 (図 3E) でした。 まとめると、これらのデータは、BCG および BCGΔBCG1419c 免疫化がそれぞれ、脾臓および肺の自然細胞頻度に対して一般的に負の影響を与えるが、血液中の単球および Gr1 細胞頻度に対しては独特の影響を与えることを示しています。

従来のαβ T 細胞は、BCG ワクチン接種の長期的な有効性にとって重要であり 27,28、B 細胞は歴史的に BCG の有効性に不可欠であると考えられてきましたが、B 細胞の存在は抗体非依存的に T 細胞応答を形作る可能性があります 29,30。 肺のCD4+およびCD8+ T細胞の頻度は、BCGおよびBCGΔBCG1419cで免疫した動物で増加し、それに対応して脾臓と血液も減少しました（おそらく循環からのT細胞再分布の結果）（図4A、B）。 皮下投与された BCG が肺 T 細胞数を増加させる能力は以前に報告されています 31。 免疫に対するB細胞の反応も同様に組織特異的でした。肺や血液では群間で差が観察されませんでしたが、PBS対照と比較してBCGおよびBCGΔBCG1419cで免疫した脾臓ではB細胞頻度の増加が観察されました（図4C）。 まとめると、これらのデータは、BCG および BCGΔBCG1419c 免疫化が肺 T 細胞および脾臓 B 細胞頻度の同様の増加を引き起こすことを示しています。

BCG 媒介免疫の重要な要素は、T 細胞の記憶発達能力です。 他の肺感染モデルとは異なり、BCG 媒介免疫は、ナイーブな抗原経験のない表面表現型を維持する T 細胞内にあります 31。 図1〜3に示されています。 図 5、6 はそれぞれ、ナイーブ (CD62LHICD44LO)、エフェクター (CD62LLOCD44HI)、および中央記憶 (CD62LHICD44HI) 表面表現型を示す CD4 および CD8 T 細胞の頻度です。 濾胞性TH細胞(すなわち、Tfh細胞)の頻度も調べた。

PBS 対照と比較して、BCG および BCGΔBCG1419c 免疫マウスでは肺 CD4 T 細胞の割合が高く、ナイーブ表面表現型 (図 5A) または記憶表面表現型 (図 5C) のいずれかを発現し、それに対応して脾臓と血液が減少しました。 BCGおよびBCGΔBCG1419cは両方とも、血液エフェクターTH細胞(図5B)および脾臓Tfh頻度(図5E)の有意な低下を誘発した。 しかし、興味深いことに、BCG と BCGΔBCG1419c は、肺エフェクター TH 細胞と枯渇した TH 細胞の割合に対して異なる影響を及ぼしました。一方、BCGΔBCG1419c のみが肺エフェクター TH 細胞の頻度の有意な低下を引き起こし（図 5B）、BCG のみが肺のエフェクター TH 細胞の頻度の有意な増加を引き起こしました。 TH セル周波数 (図 5D)。 同様のパターンが CD8 T 細胞 (TC) コンパートメントでも観察されました。肺コンパートメントでは、BCG と BCGΔBCG1419c の両方が、ナイーブな表面表現型を持つ CD8 T 細胞の頻度の増加 (およびそれに対応する脾臓の減少) と、肺および血液におけるエフェクター CD8 の頻度 (図 6)。 まとめると、これらのデータは、BCG と BCGΔBCG1419c の両方が記憶を保持することが知られている T 細胞の割合の増加を誘発する一方で、BCG 誘発 T 細胞は枯渇した表現型を持つ可能性が高く、BCGΔBCG1419c 誘発 T 細胞は記憶を保持する可能性が低いことを示しています。エフェクター表現型。

BCG による結核菌感染に対する防御とのサイトカインの相関関係は広く受け入れられていますが 32、リンパ球の IFNγ、IL17、および TNFα 分泌能力が BCG ワクチンの有効性に寄与している可能性があります 33。 BCG および BCGΔBCG1419c 誘発リンパ球の初期サイトカイン プロファイルを比較するために、表面表現型分析に使用した同じ細胞調製物 (図 2、3、4、5、6) をポリクローナル免疫原 (PMA/イオノマイシン) で刺激し、その後NK 細胞 (図 7)、CD4 T 細胞 (図 8)、CD8 T 細胞 (図 9) のリンパ球コンパートメントの細胞内サイトカイン染色 (ICS) に使用されます。 各コンパートメントの結果を以下に説明します。

BCGおよびBCGΔBCG1419c免疫マウスにおけるNK細胞サイトカイン産生。 C57BL/6マウスを、104 CFUのBCGまたはBCGΔBCG1419cのいずれか、あるいは対照としてPBSで皮下免疫した。 18日後、脾臓、肺、血液から単核細胞を調製し、PMA/イオノマイシンで刺激した後、細胞内サイトカイン染色に使用しました。 示されているのは、非刺激単核細胞および刺激された単核細胞（ゲートオフされた NK 細胞）の（A）代表的な IFNγ 染色および（B）代表的な TNFα 染色です。 (C) 脾臓、肺および血液中の単一陽性 (IFNγ+ および TNFα+) および二重陽性 (IFNγ+TNFα+) NK 細胞のスパイス分析。

BCGおよびBCGΔBCG1419c免疫マウスにおけるCD4 T細胞サイトカイン産生。 C57BL/6マウスを、104 CFUのBCGまたはBCGΔBCG1419cのいずれか、あるいは対照としてPBSで皮下免疫した。 18日後、脾臓、肺、血液から単核細胞を調製し、PMA/イオノマイシンで刺激した後、細胞内サイトカイン染色に使用しました。 CD4 T 細胞をゲートオフした非刺激および刺激単核細胞の (A) 代表的な IFNγ 染色、(B) 代表的な TNFα 染色、および (C) 代表的な IL17 染色を示します。 (D) シングルポジティブ (IFNγ+、TNFα+、IL17+)、ダブルポジティブ (IFNγ+IL17+、IFNγ+TNFα+、IL17+TNFα+)、およびトリプルポジティブ (IFNγ+、TNFα+、IL17+) CD4 T のスパイス分析脾臓、肺、血液の細胞。

BCGおよびBCGΔBCG1419c免疫マウスにおけるCD8 T細胞サイトカイン産生。 C57BL/6マウスを、104 CFUのBCGまたはBCGΔBCG1419cのいずれか、あるいは対照としてPBSで皮下免疫した。 18日後、脾臓、肺、血液から単核細胞を調製し、PMA/イオノマイシンで刺激した後、細胞内サイトカイン染色に使用しました。 CD8 T 細胞をゲートオフした非刺激単核細胞および刺激単核細胞の (A) 代表的な IFNγ 染色および (B) 代表的な TNFα 染色を示します。 (C) 脾臓、肺および血液における単一陽性 (IFNγ+ および TNFα+) および二重陽性 (IFNγ+TNFα+) CD8 T 細胞のスパイス分析。

BCGまたはBCGΔBCG1419c免疫後にNK細胞の頻度は低下します（図3C）。 それにもかかわらず、BCG-およびBCGΔBCG1419cで免疫したマウスの脾臓、肺および血液ではIFNγ+TNFα+NK細胞の増殖が存在するという点で、残っているサイトカインプロファイルはPBS対照のサイトカインプロファイルとは異なっています(図7)。 BCGΔBCG1419cで免疫化したマウスは肺により多くの単一IFNγ+細胞を有し、BCG免疫化マウスはより多くの二重IFNγ+TNFα+細胞を肺に有していたが、BCGはより高い割合の単一IFNγ+細胞を誘導し、BCGΔBCG1419cは単一IFNγ+、単一TNFαのよりバランスのとれた存在を誘導した。 +、血液中の IFNγ+TNFα+ 細胞が 2 倍になります。

図8A〜Cに示すのは、ポリクローナル刺激に応答してIFNγ（図8A）、IL17（図8B）、およびTNFα（図8C）を分泌できるTH細胞を同定および列挙するためのゲーティングプロファイルです。 これらのフローサイトメトリーデータに基づいて、我々は 7 つのサイトカイン産生 TH 細胞を区別することができました。すなわち、個々のサイトカインに対して単一陽性 (つまり、IFNγ+、IL17+、または TNFα+)、2 つのサイトカインに対して二重陽性 (IFNγ+IL17+、 IFNγ+TNFα+、IL17+TNFα+)、または 3 つのサイトカインすべてに対するトリプルポジティブ (IFNγ+IL17+TNFα+)。 各実験群の脾臓、肺および血液について、サイトカイン産生CD4+ TH細胞間の各サブセットの相対比率を図8Dに示す。 ベースライン（つまり、PBS コントロールマウス）では、すべての組織のサイトカイン産生 TH 細胞は主に TNFα+ でしたが、サブセットが二次的に豊富であるという組織特異的な違いがありました（脾臓：IFNγ+TNFα+、肺および血液：IFNγ+）。 。 脾臓では、BCG 免疫化により IFNγ+IL17+TNFα+ 細胞の発現が拡大しました。 興味深いことに、IFNγ+IL17+TNFα+の拡大はBCGΔBCG1419c免疫動物ではそれほど大きくなく、IFNγ+TNFα+の縮小を伴った(図8D上段)。 BCG免疫動物と比較して、IFNγ+TNFα+TH細胞の同様の収縮が血液中で観察された(図8D下段)。 肺では、BCG および BCGΔBCG1419c も同様に、IFNγ+IL17+TNFα+ および IFNγ+TNFα+ の拡大、および IFNγ+ の縮小をもたらしました。 IL17+TNFα+細胞は、PBSと比較してBCGおよびBCGΔBCG1419c肺にも出現した。 まとめると、TH 細胞サイトカインプロファイルの分析は、BCGΔBCG1419c 免疫動物では、BCGΔBCG1419c 免疫動物と比較して、全身性 IFNγ+IL17+TNFα+ および IFNγ+TNFα+ 集団の誘導がそれほど強力ではなかったが、肺では BCGΔBCG1419c 免疫した動物であることを示唆しています。動物はBCGよりもIFNγ+IL17+およびIFNγ+TNFα+集団の存在を増加させた。 ただし、上記の傾向はいずれも統計的に有意ではありませんでした。

図９Ａ、Ｂに示されているのは、ポリクローナル刺激に応答してＩＦＮγ（図９Ａ）およびＴＮＦα（図９Ｂ）を分泌できるＴＣ細胞を同定および列挙するためのゲーティングプロファイルである。 CD4 T細胞とは異なり、IL17を発現するCD8 T細胞は検出されませんでした。 PBS コントロールでは、脾臓内のサイトカイン産生 CD8 T 細胞は主に TNFα+、次に IFNγ+ でした。 BCG および BCGΔBCG1419c 免疫化に応答して、TNFα+ である CD8 T 細胞の割合は、IFNγ + CD8 T 細胞を犠牲にして、IFNγ + TNFα と並んでさらに増加し​​ました。 TNFα+ および IFNγ+ TNFα+ 細胞の同様の拡大 (およびそれに伴う IFNγ+ CD8 T 細胞の収縮) が、BCG および BCGΔBCG1419c 免疫動物の肺と血液で観察されました。 NK 細胞について観察したのと同様に、BCGΔBCG1419c で免疫化したマウスの肺には単一 IFNγ+ 細胞が多く、BCG 免疫化マウスの肺には二重 IFNγ+TNFα+ 細胞が多くありました。 しかしながら、TH細胞と同様に、BCGとBCGΔBCG1419c免疫動物との間の上記の差はどれも統計的に有意ではなかった。

IL10 は、BCG 免疫後の TH1/TH17 分化を​​抑制します 34。 免疫後18日目では、BCGΔBCG1419cは、（わずかではあるが）より少ないIFNγ産生TH細胞およびIL17産生TH細胞を誘発する傾向にあり（図8D）、より炎症促進性の「エフェクター」TH表現型からの大きなシフトを示した。 (図5B); したがって、BCGΔBCG1419cで免疫化したマウスは、BCGで免疫化したマウスと比較して、18日目以前に全身性IL10産生細胞の頻度が高いと予測しました。この予測をテストするために、表面Thy1.1を同時に発現するトランスジェニックVertXマウスを免疫化しました。 IL10発現 26 により、抗Thy1.1によるフローサイトメトリー染色によるIL10産生細胞の同定が可能となる（図10A）。 VertX マウスは、C57BL/6 マウスに使用したのと同じ方法で BCG または BCGΔBCG1419c で免疫化しました。 免疫後14日目に脾臓を摘出した。 この研究の結果は図１０に示されており、ＢＣＧΔＢＣＧ１４１９ｃが脾臓においてより高い頻度でＩＬ１０＋細胞を誘発すること（図１０Ｂ）、およびこれらのＩＬ１０＋細胞の大部分がＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞であることを実証している（図１０Ｂ）。 10C）。 全体として、これらのデータは、BCGΔBCG1419cがIL10産生T細胞をより高い頻度で誘発することを実証しており、これが野生型BCG免疫動物と比較してBCGΔBCG1419c免疫動物の炎症反応が少ないことを説明している可能性がある。

BCGΔBCG1419c 免疫化により、IL10 産生 T 細胞がより高い頻度で誘発されます。 IL10レポーターマウスを104CFUのBCGまたはBCGΔBCG1419cで皮下免疫した。 14日後、各グループの脾細胞をThy1.1（IL10産生の導入遺伝子レポーター）およびT細胞マーカーCD4およびCD8について染色した。 （A）BCG免疫マウスからの代表的な側方散乱（SSC）およびThy1.1染色、（B）BCGおよびBCGΔBCG1419c免疫マウスにおけるIL10+脾細胞の頻度（平均+標準偏差; 1グループあたり3匹のマウス）、および(C) CD4 T 細胞、CD8 T 細胞、または非 T 細胞である IL10+ 細胞の相対割合。 アスタリスクは、示された比較間の統計的に有意な差を表します (*p ≤ 0.05)。

BCG は、胆汁を吸収したジャガイモのスライス上で M. bovis を 11 年間（約 230 継代）連続継代した後、1900 年代初頭に Calmette と Guerin によって結核ワクチンとして開発されました 35。 ウシ型結核菌と比較して、得られた菌株 (つまり BCG) は複数の動物種において無毒性であり、結核を引き起こすことができませんでした。 現在、この弱毒化の一部は、多くの病原性因子 (ESX など) をコードする 3 つの異なるゲノム領域 (RD1、RD2、RD3) の喪失に起因することがわかっています 36。 安全性への懸念から何度か開始と中止があったにもかかわらず、ヒトBCGの治験は多くの国（英国、米国、インド）で進められ、その予防効果については異なる結論が得られ、研究によって0～80％の範囲であった37。 まだ議論の余地があるが、国や人口が異なるとBCGの有効性が異なる理由には、調製方法の違い、時間の経過による遺伝的浮動、環境中のマイコバクテリア自体が結核に対するある程度の防御効果を与え、BCGの効果を覆い隠していることが挙げられる38。 理由に関係なく、BCG の成功にもかかわらず、結核罹患率を減少させるための WHO のベンチマークを満たすためには、より効果の高い結核ワクチンが必要であるということには、ほぼ普遍的な合意があります 5。 現在のBCGが十分な効果を発揮していないこともあり、推定20億人が結核菌潜在性感染症（LTBI）を保有していると考えられている。 結核症例数（MDR-TBを含む）が最も多い国の一つである中国では、2050年までに新規結核症例の最大75％が新規感染ではなくLTBIからの再活性化によるものになると推定されている。 39. 実際、中国、南アフリカ、インドのデータを含むモデルでは、結核菌に感染した集団の病気を予防するワクチンが 2050 年までに最大の効果をもたらすだろうことが示唆されています（10 年間、病気に対して 70% の有効性、発症率の低下）中国、南アフリカ、インドではそれぞれ51%、52%、54%）40。

多くのマイコバクテリア種と同様に、BCG は、in vitro 挙動および in vivo 持続性に影響を与えるバイオフィルムを形成することができます。 バイオフィルムは、構成種によって生成される細胞外マトリックスに囲まれた細菌群集で構成され、一般に環境ストレスに対してより耐性があり、環境貯留層や生体材料中での存続を可能にします41。 インビトロでは、マイコバクテリアのバイオフィルム形成は媒体と空気の境界面でペリクルとして現れます 42,43。BCG では定義された遺伝的プログラムに従います 44。 ペリクルは、浮遊細菌に比べて転写プロファイルが変化しており、抗生物質耐性細胞または持続細胞が豊富に含まれています 45、46、47。 肺疾患に対するマイコバクテリアのバイオフィルム形成の生体内での寄与は、感染した肺の組織病理学的検査（例えば、抗酸染色による）ではその存在が明らかではなく、マイコバクテリアの病因には肺胞食細胞内の細胞内生存が関与しているため、しばしば議論の対象となる。緑膿菌やその他の標準的なバイオフィルム形成病原体によく見られる、気道表面での細胞外生存ではなく、少なくとも疾患の初期段階では）。 とはいえ、遺伝子操作または自然変異によりバイオフィルム形成が欠損しているマイコバクテリアは、一般に生体内感染モデル中に弱毒化した毒性を示し、異なる炎症反応を誘発します 42,48。 したがって、バイオフィルム形成とマイコバクテリアの病因との関係についての我々の理解は完全には程遠い。

BCGΔBCG1419c 株は、BCG のバイオフィルム形成能力とワクチンの有効性との関係を試験するために一部生成されました 20。 BCG1419c 遺伝子は、通常、細菌増殖のバイオフィルム相を促進するセカンドメッセンジャーであるビス-(3'-5')-環状二量体 GMP (c-di-GMP) を加水分解するように機能する環状ジ GMP ホスホジエステラーゼ (PDE) をコードします 49 。 BCG1419c の非存在下では、欠失変異体 BCGΔBCG1419c は、BALB/c マウスの静脈内感染に使用した場合、親の BCG または相補変異体と比較して、免疫担当マウスの肺および脾臓においてコロニー形態の変化、より高いバイオフィルム産生、および生存期間の延長を示します 20。 BCG で免疫した対照と比較して、および Mtb 攻撃後 6 か月の時点で、BCGΔBCG1419c で免疫した対照では肺の組織病理学的スコアが大幅に低下し、肺の IL6 および TNFα タンパク質レベルも低下しました 15。 IL-6およびTNF-αは慢性疾患における肺の病理に寄与する可能性があるため、これらのデータは、BCG1419c依存性のc-di-GMP加水分解がワクチン接種動物の長期結核反応の条件付けに関与していることを示唆している。 重要なことに、細菌のセカンド メッセンジャー c-di-GMP は、タンク結合キナーゼ 1 (TBK1) - インターフェロン制御因子 3 (IRF3) カスケードを介したインターフェロン (IFN) 遺伝子刺激因子 (STING) シグナル伝達経路のリガンドです。その結果、I 型 IFN および NF-κB 媒介サイトカインが生成されます 50,51。 これらの STING アゴニストは、その免疫刺激特性によって証明されるように、抗原特異的 T 細胞および体液性応答を増加させる能力により、新規ワクチンアジュバントとしての使用の可能性を示しています 52,53。 c-ジ-GMPホスホジエステラーゼをコードする遺伝子BCG1419c54,55が欠失しているため、BCGΔBCG1419cワクチン候補はより多くのc-ジ-GMPを産生し、したがってI型IFN応答を調節して結核に対する有効性を高める可能性があると予想されます。 これに加えて、BCGΔBCG1419c は、親の BCG と比較して、細胞性抗原タンパク質および分泌抗原タンパク質の変化を含む改変されたプロテオミクス レパートリーを有しており 54、最終的に肺結核に対する防御にプラスの影響を与える差次的免疫応答を引き起こす可能性もあります。

BCGΔBCG1419cで免疫化したマウスでは結核攻撃後の肺病理が少なく、疾患予防の改善が示唆されていることを考慮して、我々はその長期効果と同時に起こる初期の免疫学的事象があるかどうかを判断するために上記の研究を実施した。 我々の結果は、BCGおよびBCGΔBCG1419cに対する初期の先天的反応と適応的反応には多くの類似点がある一方、先天的コンパートメントと適応的コンパートメントには顕著な違いがあることを示しています。 先天性系統では、BCG と BCGΔBCG1419c の両方が、調べたすべての組織にわたって NK 細胞頻度の強い減少を引き起こしましたが (図 3C)、BCGΔBCG1419c のみが循環単球の有意な増加 (図 3D) と肺 Gr1 細胞の減少 (図 3E) を引き起こしました。 。 適応系統の中で、BCG と BCGΔBCG1419c の両方が肺 CD4+ T 細胞頻度の有意な増加を誘発し (図 4A)、BCG によって誘導されたものは、BCGΔBCG1419c によって誘導されたものと比較して枯渇した表現型を示す可能性が高かった (図 5D)。 BCGΔBCG1419cによって誘発されたCD4 T細胞も、炎症誘発性エフェクター表現型を示す可能性が低かった(図5B)。 重要なことに、BCGΔBCG1419cによって誘発されるCD4およびCD8 T細胞応答には、IL10産生細胞が含まれる可能性も高く（図10C）、IL10は抗原提示を介して保持を介して抑制するため、慢性結核段階におけるBCGΔBCG1419cの炎症性が低い性質の基礎となっている可能性があります（図10C）。 （細胞表面から離れた）エンドソーム画分におけるマイコバクテリアペプチド：MHC-II複合体の変化56および/または共刺激分子発現の負の制御57,58。 我々は、BCGΔBCG1419cが親BCG14と比較してバイオフィルム培養物中で生成するDnaK、HbhA、PstS2、35KDa抗原、およびAcpM（ミコール酸の合成に関与するタンパク質）の生産量が少ないことを示しており、これがその炎症性の低さに寄与している可能性がある。 BCGΔBCG1419c によって誘発される免疫応答が、抗原提示の延長またはマイコバクテリアの免疫原性に寄与する脂質プロファイルの変化のいずれかにより、BCG によって誘発される免疫応答と異なるかどうかはまだ判明していません。

細菌による炎症反応と同様に、BCG で免疫化された宿主は、強力な免疫の生成と、過剰なサイトカイン産生による有害な非特異的影響の可能性とのバランスをとらなければなりません。 ここで、我々はマウスモデルを使用して、BCGΔBCG1419c免疫化に関連する初期の免疫学的事象がBCGと比較して炎症性が低いことを実証した。 肺における結核菌の複製を制御するBCGΔBCG1419cの有効性はBCGに匹敵するかそれより優れており、マウスにおける結核関連免疫病理に対してより防御的であるため、これは重要である。 予防接種を受けた人におけるBCGの反応原性（通常、発熱、頭痛、リンパ節の腫れとして現れる）を考慮すると、BCGΔBCG1419cの独特の免疫学的プロファイルは、ワクチンの有効性とは無関係に、幼い子供の親が炎症性ワクチンの投与をますます躊躇している結核流行地域において重要であることが判明する可能性がある9 、10、11、12。

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この研究は、オハイオ州立大学 (OSU)、国立衛生研究所 (R01 AI134972 から KJO、K22 AI127072 から NPML、R01 AI121212 から RTR) によって支援され、CONACYT Grant 86396 (MAFV および MJAS へ) により BCGΔBCG1419c の建設が許可されました。歪み。

オハイオ州立大学、微生物感染免疫学部、米国オハイオ州コロンバス

マヌージャ・グナセナ、ラジニ・カント・シュクラ、ナイクアン・ヤオ、オスカー・ロサス・メヒア、マイケル・D・パウエル、ケネス・J・オストライヒ、ナマルPM・リヤナゲ、リチャード・T・ロビンソン

吉林農業大学、中国吉林省長春市

ヤオ・ナイクアン

医療および製薬バイオテクノロジー、ハリスコ州技術および設計研究支援センター、Av. Normalistas 800、Col. Colinas de la Normal、44270、グアダラハラ、メキシコ

ミシェル・デ・ヘスス・アセベス=サンチェス & マリオ・アルベルト・フローレス=バルデス

オハイオ州立大学獣医生命科学部、米国オハイオ州コロンバス

ナマル首相リヤナゲ

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著者全員が、実験の実行、分析、説明、原稿、および関連する図に参加しました。

マリオ・アルベルト・フローレス＝バルデス、ナマル・リヤナゲ首相、またはリチャード・T・ロビンソンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Gunasena、M.、Shukla、RK、Yao、N. 他。 結核ワクチンMycobacterium bovis BCGおよびワクチン候補BCGΔBCG1419cに対する初期の自然免疫応答および適応免疫応答の評価。 Sci Rep 12、12377 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-14935-y

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受信日: 2021 年 10 月 29 日

受理日: 2022 年 5 月 3 日

公開日: 2022 年 7 月 20 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14935-y

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