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Oct 26, 2023

前駆体の特定とSARS

Natura Volume 588, pagina

Nature volume 588、pages 670–675 (2020)この記事を引用

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メトリクスの詳細

肺の遠位には、ガス交換を促進する終末細気管支と肺胞が含まれています。 三次元の in vitro ヒト遠位肺培養システムは、間質性肺炎、がん、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) によって引き起こされるコロナウイルス病 2019 (COVID-19) 肺炎などの病態の研究を非常に容易にします。 ここでは、単一の成人ヒト肺胞上皮 II 型 (AT2) または KRT5+ 基底細胞に由来するオルガノイドとして、遠位肺前駆細胞の長期フィーダーフリー化学的に定義された培養系の開発について説明します。 AT2 オルガノイドは AT1 細胞に分化することができ、基底細胞オルガノイドは分化した棍棒細胞と繊毛細胞が並ぶ内腔を発達させました。 基底オルガノイドにおける KRT5+ 細胞の単一細胞分析により、ITGA6+ITGB4+ 有糸分裂細胞の異なる集団が明らかになり、その子孫は KRT5+ 基底細胞の約 10 パーセントを構成する TNFRSF12Ahi サブフラクションにさらに分離されました。 この部分集団は末端細気管支内にクラスターを形成し、豊富なクローン原性オルガノイド成長活性を示しました。 われわれは、露出した外表面にACE2を提示するための頂端外極性を備えた遠位肺オルガノイドを作製し、AT2および基礎培養物へのSARS-CoV-2の感染を促進し、クラブ細胞を標的集団として特定した。 このヒト遠位肺オルガノイドのフィーダーフリー長期培養と単細胞解析を組み合わせることで、基底細胞間の機能的不均一性が特定され、新型コロナウイルス感染症関連肺炎を含むヒト遠位肺感染症の容易なインビトロオルガノイドモデルが確立される。

遠位肺は、炎症性疾患、腫瘍性疾患、または新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) 肺炎などの感染性疾患によって損なわれる可能性がある重要な呼吸機能を実行します。 これらの状態の研究は、ヒト細胞に基づいた堅牢な in vitro モデルによって促進されるでしょう。 ヒトの生涯にわたって生体内で肺遠位上皮を再生する幹細胞の正体は、これらの種間の違いにもかかわらず、マウスの研究から推測されている1。 ヒトでは、基底幹細胞は気道樹全体に広がっていますが、マウスでは、クラブ細胞 2 および/またはセクレトグロビン 1A1 (SCGB1A1) を発現する非クラブ細胞 3 が老化中に遠位細気管支を更新します。 ガス交換領域では、マウス肺胞上皮 II 型 (AT2) 細胞がホメオスタシス中に AT1 および AT2 細胞を生成し 4,5、重度の損傷に応答して追加の前駆細胞が補充されます 3,6,7,8,9。 ヒト肺における通性前駆細胞の存在および/または役割は不明です。 ヒト AT2 細胞は AT1 細胞に分化できますが、これらの培養物は寿命が短く、長期的な自己複製を示さず、疾患モデリングのための増殖を可能にしません 4,10,11。 さらに、フィーダー細胞に対するそれらの要件は、特定のニッチ構成要素の定義を妨げます12、13。 私たちは、AT2 細胞や基底幹細胞を含むヒト肺遠位部の長期オルガノイド培養を確立し、このシステムを機能的な前駆細胞の検証と SARS-CoV-2 感染のモデル化に使用しました。

我々は、コラーゲン/ラミニン細胞外マトリックス（ECM）における136人の個体からの遠位ヒト肺前駆細胞のクローン増殖をサポートする培地条件を経験的に定義した（図1a、補足表1）。 EGFとBMPアンタゴニストNOGGINは一緒に、凝集していない遠位肺細胞またはその精製上皮画分の増殖をサポートしました（拡張データ図1a〜c）。 単一細胞（拡張データ図1d〜g）は、SFTPC + HTII-280 + AT2嚢胞性オルガノイド（図1b〜e）、または基底細胞マーカーKRT5を発現するKRT5+固体オルガノイド（図1b、f〜h）のいずれかに増殖しました。

ａ． ヒト遠位肺 D14 (14 日目) オルガノイド培養物には、嚢胞性オルガノイドと固体オルガノイドが含まれています。 左下、明視野。 右、ヘマトキシリンおよびエオシン (H&E)。 スケールバー、100μm。 b、抗KRT5（基底細胞）、抗SFTPC（AT2細胞）および抗SCGB1A1（クラブ細胞）抗体を用いたホールマウント免疫蛍光。 スケールバー、100μm。 c〜e、D32の肺胞オルガノイド。 c、嚢胞性AT2オルガノイド。 彼; スケールバー、25μm。 d、抗SFTPC、抗HTII-280、ファロイジン（Ph）およびDAPIのホールマウント免疫蛍光。 スケールバー、50μm。 e、dに隣接するセクションの抗KI67およびDAPI蛍光。 f〜h、D32の基底オルガノイド。 f、H&E; スケールバー、50μm。 g、抗 KRT5 および DAPI のホールマウント免疫蛍光。 スケールバー、100μm。 ｈ、ｇに隣接する切片の抗ＫＩ６７およびＤＡＰＩ免疫染色。 i-k、D28 における全遠位肺オルガノイドの単細胞 RNA 配列。 i、AT2、基底、クラブ集団を示す 7,285 個の個々の細胞の t 分布確率的近傍埋め込み (t-SNE) プロット。 ｊ、ＳＦＴＰＣ（ＡＴ２）、ＫＲＴ５（基礎）およびＳＣＧＢ１Ａ１（クラブ）の発現。 ｋ、ＳＦＴＰＣ（ＡＴ２）、ＫＲＴ５（基礎）およびＳＣＧＢ１Ａ１（クラブ）の発現に関する特徴プロット。 l–p、クローン形成性 AT2 オルガノイド培養。 l、D180におけるAT2オルガノイドの明視野顕微鏡検査。 スケールバー、200μm。 m、lと同様の培養物からのH&E染色。 スケールバー、50μm。 n、D32 での AT2 オルガノイドの透過型電子顕微鏡観察。 LB、層状体。 スケールバー、5μm。 o、p、D32 での AT2 オルガノイドの免疫蛍光 (o)。 ガラス上でさらに 10 日間培養すると、AT1 細胞への分化が誘導されます (p)。 抗 HTI-56 (AT1) および抗 HTII-280 (AT2) の免疫蛍光。 スケールバー、50μm。 q、scRNA-seq は、累積培養の D89 における 2,780 個の AT2 オルガノイド細胞のプロットを特徴としています。

遠位肺オルガノイドの単一細胞RNA配列（scRNA-seq）により、SFTPC+ AT2細胞、KRT5+基底細胞、およびSCGB1A1+クラブ細胞の集団の存在が確認されました（図1i、j、拡張データ図2）。 KRT5とSCGB1A1を共発現する細胞は、基底細胞集団とクラブ細胞集団の両方で見つかり、SPADE14およびMonocle15の軌跡分析の結果によって裏付けられた移行状態（図1j、k、拡張データ図2）を示唆しています（拡張データ）図 3、補足表 2)。

我々は、ラメラ体へのリソソーム色素の取り込みを介して、混合培養物から純粋なAT2オルガノイドを生成しました（拡張データ図4a、b、補足図1）。 EPCAM+LysoTracker+AT2細胞は、最大180日間クローン的に増殖しました（図1l、m、拡張データ図4c、d）。 化学的に定義されたEGF / NOGGIN培地は、AT2オルガノイドのベースラインクローン増殖に十分であり、これは全体的な内因性WNT生合成をブロックすることによって弱められました（拡張データ図4e）。これは、マウスAT2細胞における自己分泌WNTシグナル伝達の要件と一致しています16。 血清およびWNTアゴニストを含む線維芽細胞馴化培地を添加することにより、増殖が促進された(拡張データ図4f)。 透過型電子顕微鏡により、成熟AT2細胞に特徴的な微絨毛および層状体が明らかになった（図1n、拡張データ図4g）。 AT2オルガノイドは、血清を含むガラス上で培養した場合、AT1マーカーの上方制御を示した（図1o、p）。

混合遠位肺オルガノイドまたは精製肺胞オルガノイドの単細胞 RNA 配列決定により、肺胞集団における標準 AT2 細胞マーカーの均一な高い発現が明らかになりました（図 1i-k、q、拡張データ図 2、補足データ 1）。 AT2 細胞サブセットは容易には観察されず、細胞周期関連 mRNA は特定の AT2 サブ集団に局在しませんでした (図 1q、補足データ 1、補足表 3)。

混合遠位肺培養における基底細胞オルガノイドは、肺胞オルガノイドよりも急速に成長し、最初は固体のKRT5+スフェロイドを形成しました（図1a、b、f〜h）。 しかし、1ヶ月の培養までに、オルガノイドの約50％が、棍棒（SCGB1A1+KRT5-）と繊毛（AcTUB+KRT5-）を備えた単一または時折複数の内腔を発達させました（図2a、b、拡張データ図5a–c）。 ）内面を裏打ちする細胞（図2a、b）。 密度沈降によって精製された基礎培養物は、連続クローン増殖、EGFおよびNOGGINへの依存性、および管腔SCGB1A1 +クラブおよびAcTUB +繊毛細胞によって裏打ちされたキャビテーションを示しました（図2c、d、拡張データ図5d–h、補足ビデオ1、2）。 オルガノイドを2D気液界面（ALI）培養物に移したときにも、同様の分化が起こりました（図2e）。

a、b、混合培養における基礎的なオルガノイド分化を示す免疫蛍光。 内腔には、SARS-CoV-2 受容体 ACE2 を発現するが KRT5 を欠くアセチル化チューブリン + (AcTUB) 繊毛細胞 (a) と SCGB1A1+ クラブ細胞 (b) が並んでいます。 スケールバー、20μm。 c〜e、沈降した基底オルガノイド培養物。 c、3D クローン形成培養で 38 日後の精製基底オルガノイドにおけるクラブ細胞の分化。抗 SCGB1A1 (赤)、ファロイジン (白)、および DAPI (青) のホールマウント蛍光によって示されます。 スケールバー、50μm。 ｄ、ｃと同様のオルガノイドの繊毛分化。 共焦点透過像。 スケールバー、20μm。 差し込み内の白いボックスはメイン画像に拡大されます。 矢印は繊毛を示します。 e、2D ALI培養物に再播種されたオルガノイドにおけるAcTUB+繊毛細胞およびSCGB1A1+クラブ細胞を示す免疫蛍光。 スケールバー、50μm。 f、g、図1iのKRT5+基底細胞の単一細胞RNA配列。 f、t-SNE プロットは、Basal 1 および Basal 2 サブクラスターを示します。 Basal 1 は Basal 1.1 と 1.2 に細分され、後者は増殖性 mRNA CDK1 と PCNA を発現します。 g、合計 2,303 個の基底細胞からの Basal 1 および Basal 2 サブクラスターにおける差次的遺伝子発現。 h、fの基底マーカー転写物t-SNEオーバーレイ（固有分子識別子（UMI）のlog10数）。 i、擬似時間軌跡にわたる f と g の相対的な遺伝子発現動態プロット (n = 3,721 細胞)。 j、生シングレット上で事前にゲートされた、混合遠位肺オルガノイドからのTNFRSF12Ahi細胞とTNFRSF12Aneg細胞のFACS単離。 k、D14におけるjからの細胞のオルガノイド培養の明視野画像。 l、k（1,000細胞あたりのオルガノイドの数）の定量化。 ***P < 0.001 (P = 1.0 × 10−4)、両側スチューデント t 検定。 j、k のデータは、各 TNFRSF12A 集団に対する n = 5 の独立した実験を表します。

ソースデータ

複数の個体からのオルガノイドKRT5+基底細胞の単一細胞RNA-seqクラスタリングにより、基底1および基底2の2つの集団が再現性よく同定されました（図2f、g、拡張データ図6a、補足データ1）。 Basal 1には、増殖マーカー（PCNA、CDK1）および遺伝子細胞濃縮分析（GSEA）の細胞周期関連プロセスが豊富な、活発に周期する部分集団（Basal 1.2）が含まれていました（図2f、g、拡張データ図6a–c） 、補足表 3)。 Basal 1は、TP6317、インテグリンα6（ITGA6）、インテグリンβ4（ITGA618の結合パートナーをコードし、マウス系統陰性上皮前駆細胞（LNEP）をマークするITGB4）などの標準的な肺基底細胞mRNAを発現しましたが、Basal 2は発現しませんでした。 ７（図２ｈ）。 基底2は、小胞輸送、小胞体プロセス、および扁平上皮マーカーに関連する遺伝子の発現が豊富でした（図2g、補足表3）。

我々は、蛍光活性化細胞選別（FACS）単離および腸幹細胞マーカーTNFRSF1919との相同性。 不偏擬似時間解析により、KRT5 + Basal 1細胞とSCGB1A1 + club細胞を結ぶ連続的な単一細胞の軌跡が明らかになり、TNFRSF12A mRNAは増殖マーカー遺伝子MKI67と強く関連しています（図2i、拡張データ図3e）。 EPCAM、ITGA6、および ITGB4 を共発現する Basal 1 細胞を 3 つの画分（低、中、高レベルの TNFRSF12A mRNA を発現する）に分割した場合、増殖遺伝子モジュール 20 は最も高い画分（TNFRSF12Ahi）と最も低い画分（TNFRSF12Alo）で有意に濃縮されました（拡張データ図 6d–f)。 この濃縮が固有の増殖能を反映しているかどうかを判断するために、FACSによって合計遠位肺オルガノイドをEPCAM + ITGA6 + ITGB4 + Basal 1細胞に分別し、次にTNFRSF12AhiおよびTNFRSF12Anegサブセットに分別しました（図2j）。 培養すると、TNFRSF12Ahiサブセットは、TNFRSF12Anegサブセットよりも4〜12倍大きなクローン原性オルガノイド形成能力を示しました（図2k、l）。

我々は、FACSにより密度沈降したKRT5+基底オルガノイドをEPCAM+ITGA6+ITGB4+TNFRSF12Ahi（基底1）集団とEPCAM+ITGA6−ITGB4−TNFRSF12Aneg（基底2）集団に分別することにより、基底1と基底2の間の系統関係を調べた（拡張データ図1）。 7a)。 クローン原性オルガノイドの形成は、3 人の別々の個体からの Basal 1 と Basal 2 で非常に豊富でした（拡張データ図 7b–d）。 Basic 2が豊富な遺伝子SPRR1BおよびTMSB4X（図2g、補足表3）はBasal 1細胞オルガノイドで一時的に誘導され（拡張データ図7e、f）、Basal 2細胞がBasal 1から分化する可能性があることを示唆しています。

NOTCH標的遺伝子HES1は、Basal 1オルガノイドで最も差次的に発現される遺伝子座の1つであり、遺伝子ネットワークにはNOTCH1、NOTCH2、JAG1が含まれていました（図2g、補足表3）。 NOTCHの阻害により、TNFRSF12AhiEPCAM+ITGA6+ITGB4+細胞からの基礎オルガノイド増殖が有意に増加し(拡張データ図7g、h)、NOTCHシグナル伝達がこれらの細胞の増殖を抑制することを示唆している。 逆に、NOTCH アゴニズムは増殖に影響を与えませんでしたが、上気道細胞と同様に SCGB1A1 の発現を誘導しました 21,22 (拡張データ図 7i)。

ヒト遠位肺組織の免疫染色により、細気管支溝の先端または基部で断続的に濃縮されるTNFRSF12A + 基底細胞が示されました（図3a、拡張データ図8a、b）。 後者は杯細胞ニッチとして認識されます23。 TNFRSF12Aはさまざまな肺間質細胞および上皮細胞で見つかりましたが、KRT5+およびp63+基底細胞の少数の集団を明らかに示していました（図3a、拡張データ図8a-c）。 KRT5+基底細胞のTNFRSF12A+サブセットは、in vivoで全KRT5+細胞よりも高い有糸分裂指数を有し(図3b、c)、オルガノイドscRNA-seqの結果と一致した(図2i)。 ヒト遠位肺細胞のFACS分析により、TNFRSF12Aが基底細胞の10.9%で発現していることが確認された(拡張データ図8d、上)。

a、左、ヒト遠位肺の抗KRT5および抗TNFRSF12A免疫蛍光。 黄色のボックスで囲まれた領域は、DAPI あり (中央) と DAPI なし (右) で拡大されています。 スケールバー、100μm。 b、KRT5、TNFRSF12A、KI67、およびDAPIを示す遠位気道TNFRSF12A+基底細胞増殖の免疫蛍光。 スケールバー、100μm。 c、bからのTNFRSF12A+KRT5+細胞の分裂指数。 3 つの独立した実験。 K5+、合計 KRT5+。 K5+T+、TNFRSF12A+KRT5+。 箱ひげ図は、第 1 四分位、中央値、および第 3 四分位を表します。 ひげは最小値と最大値を示します。 **P < 0.01 (P = 4.4 × 10−3)、両側スチューデント t 検定。 d、D14におけるFACSで単離したTNFRSF12AnegおよびTNFRSF12Ahiオルガノイド培養物の明視野免疫蛍光および抗KRT5免疫蛍光。 スケールバー、500μm。 e, d (1,000 細胞あたりのオルガノイドの数) の定量化。 データは、各 TNFRSF12A 集団に対する n = 5 の独立した実験を表します。 箱ひげ図は、第 1 四分位、中央値、および第 3 四分位を表します。 ひげは最小値と最大値を示します。 P = 1.1 × 10−3、両側スチューデント t 検定。 f、FACSで選別されたEPCAM+ITGA6+ITGB4+遠位肺細胞のTNFRSF12Ahi画分からのオルガノイドのH&Eおよび抗KRT5、抗TNFRSF12A、抗SCGB1A1、および抗AcTUB免疫染色。 スケールバー、50μm。 g、fのようなTNFRSF12Ahi基底細胞からの基底細胞オルガノイドからの2D ALI培養物のH&Eおよび抗SCGB1A1および抗AcTUB免疫蛍光。 スケールバー、50μm。

ソースデータ

オルガノイド中間体を使用せずにヒト肺から直接前向き培養したところ、FACS で単離された EPCAM+ITGA6+ITGB4+TNFRSF12Ahi 細胞 (TNFRSF12Ahi Basal 1 細胞、拡張データ図 8d、下) は、EPCAM と比較して KRT5+ オルガノイド形成が 15 倍増加したことを示しました。 ＋ＩＴＧＡ６＋ＩＴＧＢ４＋ＴＮＦＲＳＦ１２Ａｎｅｇ細胞（ＴＮＦＲＳＦ１２ｎｅｇ基底１細胞；図３ｄ、ｅ）。 TNFRSF12Ahi基底オルガノイドは、長期間培養した場合（図3f）、または2D ALI単層として成長させた場合（図3g）、SCGB1A1+クラブおよびAcTUB+繊毛細胞にも分化しました。

インフルエンザウイルス H1N1 は、近位気道オルガノイドと同様に、インフルエンザ受容体も発現する遠位肺オルガノイドに激しく感染しました 24,25。 インフルエンザ H1N1 PR8 によるオルガノイドの感染は、以前の研究 26 と一致してヌクレオシド類似体によって阻害され (拡張データ図 9e)、48 ウェルフォーマットでの多様な抗ウイルス化合物クラスのスクリーニングにより異なる活性が明らかになり (拡張データ図 9f)、以下のことを示唆しています。このシステムは、拡張可能な治療法の発見に使用できる可能性があります。

COVID-19 肺炎では、肺遠位部の重度の SARS-CoV-2 感染が肺胞損傷と呼吸不全を引き起こします27。 繊毛分化前の時点でのオルガノイド scRNA 配列により、主にクラブ細胞および AT2 細胞における SARS-CoV-2 受容体 ACE2 およびプロセシング プロテアーゼ TMPRSS2 mRNA の発現が同定されました（拡張データ図 10a）。これは、KRT5 分化内部における ACE2 の発現と一致しています。管腔細胞（図２ａ）。 SARS-CoV-2 の ACE2 発現管腔細胞へのアクセスを促進するために、我々は頂端外浮遊培養極性化法 28 を遠位肺オルガノイドに適応させた（拡張データ図 10b）。 懸濁液中で 48 時間以内に、オルガノイドは、微絨毛、頂端接合部、およびオルガノイドの外側に面した運動性繊毛を備えた頂端外側上皮スフェロイドに再編成されました。 外側に配向した繊毛細胞の分化は5日間で加速し、数週間で進行しました（図4a、拡張データ図10c〜f、補足ビデオ3）。 頂端外側の基底オルガノイドは、頂端の分泌顆粒を持つ外側に面したクラブ細胞の増加も示し（図4a、拡張データ図10g）、頂端外側のAT2オルガノイドはAT1細胞への分化を示しました（拡張データ図10h–j）。 。 重要なことに、頂端外オルガノイドでは、ACE2はオルガノイド外部表面の頂端細胞膜に局在していた(図4b、拡張データ図10k)。

a、ECM包埋非分極増殖（左）または頂端外懸濁培養（右）における、SCGB1A1+クラブ細胞（緑色）およびAcTUB+繊毛細胞（白色）の分極および表面局在を比較する免疫蛍光。 b、抗ACE2、抗SCGB1A1、およびDAPIで染色したaと同様の頂端側基底オルガノイドの横断面。 c、感染後72時間（hpi）の、心尖部を外した遠位肺オルガノイドにおけるSARS-CoV-2のスプライスされていないゲノムRNA（gRNA、左）とスプライスされたsgRNA（右）の定量PCR。U3 snoRNAに対して正規化。 n = 2 の独立した実験。 d、擬似感染またはSARS-CoV-2に感染した、頂端から出たヒト遠位肺オルガノイドの抗dsRNA免疫蛍光、48 hpi。 e、96 hpiでの感染または疑似感染した頂端アウトオルガノイドにおけるSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質（NP）の免疫蛍光。 f、96 hpiでの、示された抗体を用いたSARS-CoV-2感染頂端アウトAT2オルガノイドの免疫蛍光。 g、96 hpiでの肺尖端から遠位の肺基底オルガノイドにおけるSARS-CoV-2 NPとSCGB1A1の免疫蛍光共局在。 h、SARS-CoV-2に感染した頂端側オルガノイドにおける細胞型特異性を示す免疫蛍光。 Inf、SARS-CoV-2 感染細胞。 c〜hでは、オルガノイドは感染前に6〜10日間（基礎）または3日間（AT2）浮遊状態にありました。 スケールバー、f、h (10 μm) を除く 20 μm。

SARS-CoV-2は、頂端を外した混合遠位肺オルガノイドに感染し、スプライスされていないSARS-CoV-2ゲノムRNAの誘導は、豊富に発現されたU3低分子核小体RNAと同様のレベルに達しました（図4c、左）。 さらに、感染したオルガノイドは、複製特異的SARS-CoV-2スプライスサブゲノムRNA（sgRNA;図4c、右）と、VeroE6細胞プラーク形成を伴う感染性ビリオンの産生を示しました（オルガノイド溶解物から35 PFU ml-1、および65 PFU ml- 1 オルガノイド上清から）。 SARS-CoV-2に感染した基底オルガノイドでは、感染後48時間までに二本鎖RNA（dsRNA）が出現し（図4d）、96時間までにSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質（NP）が出現した（図4e）。 AT2 オルガノイドの約 10% が SFTPC+ 細胞で顕著な SARS-CoV-2 NP 発現を示しました。 残りのオルガノイドには感染がありませんでした（図4f）。 同様に、SARS-CoV-2は基底オルガノイドの約10％に感染した。 4 人の個人からの培養物を表す合計 2,621 個の遠位気道基底細胞 (補足表 5) では、上部気道感染とは対照的に、KRT5+ 基底細胞または AcTUB+ 繊毛細胞では SARS-CoV-2 感染は検出されませんでした (オッズ比 0、P < 0.05)。 2D ALI 培養における SARS-CoV-2 による気道繊毛細胞 29,30。 ただし、SARS-CoV-2 NPおよびdsRNA免疫蛍光は主にSCGB1A1+クラブ細胞に存在し（図4g、h）、NPまたはdsRNA陽性細胞と強く関連しており、NPまたはdsRNA陽性細胞の79％を占めていました（オッズ比19.33、 P < 0.0001); 感染細胞の21％はSCGB1A1を欠いていました（図4g、h、補足表5）。 全体として、これらの研究は、AT2 細胞が SARS-CoV-2 に直接感染したことを示しており、クラブ細胞が肺遠位の標的集団であることを示唆しています。

私たちは、ヒト遠位肺オルガノイドの長期培養を、前駆細胞の発見と感染症のモデリングに応用してきました。 我々の発見は、初期の短期間およびフィーダー依存性の成人肺培養法 4,10,11 に拡張され、誘導性多能性幹細胞の分化を伴う技術の代替手段を提示します 31,32,33,34。 オルガノイドには、KRT5+ヒト遠位肺基底細胞の関連する2つのサブタイプ、Basal 1およびBasal 2が含まれていました。注目すべきことに、TNFRSF12Aを発現するBasal 1画分は、豊富なクローン原性前駆細胞活性を有しており、増殖が豊富な基底細胞サブタイプの機能的先例を確立しました。 TNFRSF12A は決して基底細胞に排他的に存在するわけではありませんが、基底層内では気道溝の基部と先端の仮定されたニッチに局在することが多く 23、肺上皮が空間的特殊化を示すという最近の概念を拡張します 35。 TNFRSF12A または類似マーカーが他の組織の基底細胞前駆細胞サブセットを区別できる可能性があります。 また、当社のオルガノイドは、新型コロナウイルス感染症関連肺炎に関連する SARS-CoV-2 肺遠位感染症の容易な探索を可能にし、SCGB1A1+ クラブ細胞がその感染により肺のグリコサミノグリカンを保護し、悪性感染サイクルを引き起こす可能性がある標的であると示唆しています。 2D ALI 肺研究とは対照的に、繊毛細胞の感染は観察されませんでした 29,30。 これには別の培養条件が必要になる可能性があります。 SCGB1A1 陰性の集団も感染しており、さらなる調査が行われています。 たとえば、気管支の一過性分泌細胞は、ACE2 および TMPRSS236 を発現します。

全体として、ここで説明するオルガノイド培養の単一細胞分析は、ゆっくりと増殖する組織内の候補幹細胞を特定し、機能を検証するための一般的な戦略を表す可能性があります。 肺胞を含むすべての成人ヒト遠位肺上皮系統の前駆細胞の培養により、腫瘍性肺や間質性肺の状態などの疾患のモデリングが実質的に可能になり 12、組織工学や精密医療への応用が可能になるはずです。 最後に、このオルガノイド システムは、劇症呼吸不全に関連する SARS-CoV-2 遠位肺感染症を含む肺病原体のさまざまな研究を容易にするはずです。

追加の実験の詳細は補足方法に記載されています。 サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでした。 実験はランダム化されておらず、研究者は実験と結果の評価中に割り当てについて知らされていませんでした。

この研究で行われたすべての実験は、スタンフォード大学医学部治験審査委員会によって承認され、プロトコル番号 2 に基づいて行われました。 28908. 研究に対する標準的なインフォームドコンセントは、組織を入手する前にこの研究に貢献したすべての患者から書面で取得し、すべての実験は関連するガイドラインと規制に従っていました。 内臓胸膜から 1 cm 以内の末梢肺組織を、葉切除からの廃棄手術組織から取得しました。 肺癌が疑われる患者については、臨床的 T4 (米国合同癌委員会第 6 版) 疾患 (例えば、気管支浸潤や実質衛星結節/転移などの特徴) を伴う症例は延期されました。 正常組織は、明白な病変に対して解剖学的に最も遠位にある肺の縁から、または肺切除術の場合には関与していない葉から除去された。 境界が不明確な腫瘍を含むサンプルは延期されました。 組織は新鮮に処理するか、4 °C で一晩保存して翌朝処理します。

遠位気道細胞を単離するために、内臓胸膜から 1 cm の肺実質を Castro ハサミで機械的に剥離し、洗浄し、1 ml あたり 5 単位のブタエラスターゼ (Worthington)、1 ml あたり 100 クニッツ単位の DNase I (Worthington)、およびノルモシンとともにインキュベートしました ( InvivoGen) を使用し、10 mM ニコチンアミド、N-アセチルシステイン、1× B27 サプリメントマイナスビタミン A、組換えヒト NOGGIN (100 ng ml-1) を補充した高度な DMEM/F12 (Invitrogen) を含む 2 組織量の肺オルガノイド培地に再懸濁しました。 、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、組換えヒトＥＧＦ（５０ｎｇ ｍｌ−１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびＴＧＦ−β阻害剤Ａ８３−０１（１００ｎＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）。 この肺オルガノイド培地は、拡張データ図 4f に示されているものを除くすべての実験に使用されました。 次に、組織を 37 °C で 1 時間撹拌し、得られた細胞懸濁液を 100 ～ 40 μm のセルストレーナーで濾過し、塩化アンモニウム赤血球溶解に供しました。 次いで、細胞ペレットを洗浄し、１０容量の還元成長因子基底膜抽出物ＩＩ（トレビゲン）中に再懸濁した。 次に、マトリックス中の細胞を 50 μl 液滴で 24 ウェルプレートに播き、液滴が室温で 10 分間固化した後に温かい培地を加えました。培地は 3 ～ 4 日ごとに交換し、オルガノイドは 3 ～ 4 週間ごとに継代しました。 TrypLE との解離によって。 継代は、ECM の耐久性と完全性、および ECM 液滴の体積に対する推定オルガノイド体積によって判断される推定オルガノイド集密度に基づいて行われました。 遠位肺オルガノイドは約 6 か月間継代でき、基底オルガノイドは最初に 2 週間ごとに 6 ～ 7 回の倍加を示しました。 肺胞オルガノイドは、初期速度が 2 週間ごとに 3 ～ 4 倍倍となり、よりゆっくりと増殖しましたが、数か月後には基底オルガノイドよりも優勢になりました。 初期細胞分裂速度から計算すると、基礎および肺胞の拡大の上限はそれぞれ 219 (524,288 倍) および 216 (65,536 倍) でした。 悪性細胞による汚染を排除するために、認定された病理学者によって、長期培養物について異形成または癌腫の存在が体系的に評価されました。 さらに、5 つの長期オルガノイド培養物 (2 ～ 6 か月) に対して、病原性ヌクレオチド変異体を排除するためのターゲット次世代シークエンシングが行われました (以下を参照)。 完全な詳細は補足方法で提供されます。

遠位肺を上記のように分離し、すべてのインキュベーションステップを氷上で実行した。 107 個の細胞を Fc Block (Biolegend 422301) とインキュベートし、FACS バッファー (2 mM EDTA および 0.2% ウシ胎児血清を含む 1× PBS、pH 7.4) で 1:100 に希釈しました。 次いで、細胞を、FACS緩衝液中1μg ml-1のAPC結合抗CD45抗体と30分間混合し、洗浄し、製造業者のプロトコールに従って磁気ビーズによる2ラウンドの枯渇に供した(Miltenyi:抗ヒト線維芽細胞) 130-050-601、抗CD31 130-091-935、抗APC 130-090-855、LSカラム130-042-401）。 次いで、未標識細胞を300gで遠心分離し、FACS緩衝液中のストック濃度から1:400に希釈した1μg ml-1のPerCP-Cy5.5抗EPCAM抗体とZombie Aqua生存率染色液(Biolegend 423101)のカクテルで標識した。

凍結保存および回収のために、ECM 液滴を 5 mM EDTA を含む 3 倍量の PBS にピペッティングすることによって解離させ、氷上で 1 時間インキュベートしました。 細胞を 300g で 5 分間ペレット化し、凍結培地 (ウシ胎児血清 (Gibco)、10% v/v DMSO) に再懸濁し、凍結バイアルに入れてから Mr. Frosty (Thermo Fisher) 容器に入れ、-80 °C で保存しました。一晩放置し、その後、長期保存のために液体窒素気相に移します。 オルガノイドを、37℃の水浴中で急速解凍し、続いてオルガノイド培地で洗浄し、オルガノイド培地＋10μM ROCK阻害剤Y-27632(Tocris)を含むECMにプレーティングすることによって回収した。

以下の例外を除いて、遠位気道細胞を単離し、上記と同様にプレーティングしました。肺組織のエラスターゼ消化中にオルガノイド培地の代わりに高度な DMEM/F12 を使用し、細胞を段階希釈して 40 μm セル ストレーナーで濾過し、血球計算板で計数しました。 。 ECM 1μlあたり1000個の生存上皮細胞(トリパンブルー排除、サイズ、および形態による)を、ウェルあたり5μlのマトリゲル液滴ごとにプレーティングした。 基本培地は、A83-01、EGF、NOGGIN、WNT3A、またはRSPO1を欠くオルガノイド培地から構成されました。 EGF (最終 50 ng ml-1、研究開発)、NOGGIN (最終 100 ng ml-1、研究開発)、WNT3A (最終 100 ng ml-1、研究開発)、RSPO1 (最終 500 ng ml-1、Peprotech)、または PORCUPINE阻害剤Ｃ５９（最終１μＭ、Ｂｉｏｇｅｍｓ）を単独または組み合わせて基本培地に添加した。 一次メッキから１０日後に、倒立光学顕微鏡を用いて倍率５倍で画像を取得した。 各条件を 4 つずつプレーティングし、ImageJ の粒子分析 (しきい値、4902 ピクセル) プラグインを使用してオルガノイド形成を定量化しました (補足方法を参照)。

個別の個体からの肺オルガノイド培養物を、一次プレーティングの 4 週間後に解離し、メーカーのプロトコールに従って、5 ヌクレオチド UMI を備えた 10x Genomics Single Cell 3' プラットフォームを使用した液滴ベースの scRNA-seq に供しました。 細胞の捕捉、ライブラリーの調製、および配列決定は、前述のように実行されました 37。 図1kのscRNA-seq分析では、AT2（SFTPC）、基底（KRT5）、およびクラブ（SCGB1A1）細胞の差次的マーカー遺伝子発現の有意性を決定するために、修正されたクラスカル・ウォリス順位和検定が実行されました。 < 0.001。 主成分分析、t-SNE、教師なしグラフベースのクラスタリング、統計的検定、およびすべての scRNA-seq 解析の擬似時間軌跡については、補足方法と補足データ 1 で説明されています。

未分画オルガノイドからの LysoTracker+ AT2 細胞 38 を FACS によって精製し、1 継代で 2 か月間培養しました。 これらを解離し、メーカーのプロトコルに従って 10x Genomics Chromium Single Cell 3' プラットフォーム v2 を使用して液滴ベースの scRNA-seq を行いました。 ライブラリーは、Illumina NextSeq 500 で単一サンプル インデックス (8 bp) を使用したペアエンド シーケンス (26 bp リード 1 および 98 bp リード 2) を使用してシーケンスされました。データの前処理と主成分分析は CellRanger v1.2 で実行されました。 その後の分析については、補足方法と補足データ 1 で説明されています。

オルガノイド培養物を、0.1 M カコジル酸緩衝液 (pH 7.4) 中の 2.5% グルタルアルデヒドを含む ECM で固定し、脱水し、エポキシ樹脂に包埋し、120 kV の LaB6 エミッターを備えた JEOL (モデル JEM1400) 透過型電子顕微鏡で可視化しました。

オルガノイドを 2% パラホルムアルデヒドで 4 °C で一晩固定し、パラフィン包埋し、前述のように切片 (10 ～ 20 μm) に切り出しました 37。 組織学的分析のために切片を脱パラフィンし、H&E で染色しました。 標準的な染色プロトコル 39 に従って免疫細胞化学染色に使用される抗体は補足方法にリストされており、画像は Leica-SP8 共焦点顕微鏡で取得されました。

RNA in situ ハイブリダイゼーションは記載どおりに実行され 40、プローブ配列は補足方法に提供されています。

無傷の未感染オルガノイドを、100 mM リン酸緩衝液 (pH 7.4) 中の 2% パラホルムアルデヒド (感染オルガノイドの場合は 4% パラホルムアルデヒド) で室温で 1 時間固定し、100 mM グリシンを含む PBS で洗浄し、0.5% Triton X-100 で透過処理しました。 ＰＢＳ中で１時間インキュベートし、その後、染色緩衝液（ＰＢＳ中４％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４、１０％ヤギ／ロバ血清）中でさらに１時間インキュベートし、その後、一次抗体とともに室温で２４時間インキュベートした染色バッファー中。 次に、ホールマウントを PBS-T で洗浄し、蛍光二次抗体、ファロイジンおよび DAPI とともに染色バッファー中、室温で 4 時間インキュベートしました。 さらに洗浄した後、マウント全体を封入剤 (Vectashield、Vector Laboratories) に浸し、Zeiss LSM 700 または 900 共焦点顕微鏡を使用して 4 つのチャネルでイメージングするためにチャンバー付きカバースリップにマウントしました。 共焦点画像スタックの 3D レンダリングは、Volocity 画像解析ソフトウェア (Quorum Technologies Inc.、オンタリオ州グエルフ) を使用して実行されました。 図 4h では、5 つの色が必要ですが、2 つの蛍光二次抗体で染色し、Volocity ソフトウェアを使用して共局在化したボクセルを擬似カラー チャネルにマージすることで繊毛を区別しました。 レクチン染色 (FITC-Sambuca Nigrin、Vector Labs FL-1301; Biotin-Maackia Amurensis、Vector Labs FL-1301) は、オルガノイドを PBS 中の 0.1% パラホルムアルデヒドで室温で 1 時間固定した後、メーカーのプロトコールに従って実行されました。アビジン/ビオチンでブロックすることによる (Vector Labs SP-2001)。 ビオチン-Maackia Amurensis レクチンをストレプトアビジン-PE コンジュゲート (Thermo Fisher SA10041) で標識し、洗浄後レクチン染色を Keyence BZ-X700 で画像化しました。

131のがん遺伝子をエンドツーエンドでカバーする市販の標的再配列アッセイとコンパニオンソフトウェア（TOMA COMPASS Tumor Mutational Profiling System、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用して、10個のオルガノイド培養物を配列決定し、長期オルガノイドにおける発がん性変異の存在を判定しました。文化。 ライブラリーは、Illumina NextSeq 500 で配列決定されました。非同義変異体は補足表 6 にリストされています。変異体コール ファイルは補足データ 2 に提供されます。

一次播種から 2 ～ 3 週間以内のオルガノイド培養物を、肺オルガノイド培地中の 1 U ml-1 中性プロテアーゼ (Worthington、カタログ LS02100) および 100 KU DNase I で解離させました。 次に、基底オルガノイドを重力沈降によって収集し、上清を吸引するか、下流で使用するために収集しました。 次いで、基底オルガノイドをカスタムのFicoll-Paque勾配(4体積のFicoll-Paque対1体積のPBS)でさらに分画し、室温で10分間300gで遠心分離した。 上清を吸引し、オルガノイドペレットを15 mlコニカルチューブ中の10 ml PBSに再懸濁し、重力沈降により収集し、上記のようにECMにプレーティングした。

オルガノイドを TrypLE で解離し、その後 10% 容量のウシ胎児血清で中和し、100 KU ml-1 の DNase に供し、肺オルガノイド培地で洗浄し、その後 10 nM LysoTracker Red DND を含む 100 細胞ペレット容量の肺オルガノイド培地でインキュベートしました。 99 (Thermo Fisher L7528)、37 °C で 30 分間。 次に細胞を洗浄し、上記のように FACS バッファーに再懸濁し、Fc ブロックとともにインキュベートし、次に 1 μg ml-1 の PerCP-Cy5.5 抗 EPCAM 抗体と Zombie Aqua 生存率染色からなる標識カクテルとともに氷上でインキュベートしました (Biolegend) 423101) を FACS バッファーでストック濃度から 1:400 に希釈しました。 EPCAMhi 細胞と LysoTrackerhi 細胞を 10 μM Y-27632 (Tocris 1254) を含む肺オルガノイド培地に選別し、ECM および Y-27632 を含む肺オルガノイド培地で 24 時間培養し、続いて Y-27632 を含まない肺オルガノイド培地で培養しました。 純粋な AT2 オルガノイドの増殖は、WNT3A、R-SPONDIN3、および NOGGIN を含み、組換え EGF41 を補充した 1:1 vol:vol の血清含有 L 細胞馴化培地 (L-WRN CM) の添加によって増強されました。 完全なゲーティング戦略を補足図 1 に示します。すべての FACS 抗体は Biolegend から購入しました。 LysoTracker の代わりに抗 HTII-280 (AT2 マーカー、Terrace Biotech) FACS 精製を使用しても、定性的に同一の結果を得ることができました。 AT2 オルガノイド細胞は、TrypLE による ECM からの解離とチャンバー付きカバーガラス上への播種により AT1 細胞に分化転換され、その後高度な DMEM/F12 および 5% ウシ胎児血清で培養されました 42。

D14 の FACS EPCAM+ 間質枯渇オルガノイドを、前述のとおり推定 0.9 の MOI でレンチウイルスに感染させました 43。第 3 世代レンチウイルス ベクター (PGK-GFP T2A Puro、SBI カタログ番号 CD550A-1; pLentiCRISPRv1 から改変した mCherry (Addgene no .49545) を使用して、Paul Rack からの贈り物である EF-1a-mCherry P2A Puro カセットを組み込みます。 感染の96時間後、オルガノイドを600 ng ml-1の濃度のピューロマイシンで48時間処理して、形質導入された細胞を選択した。 選択の 2 週間後、GFP 発現オルガノイドまたは mCherry 発現オルガノイドを単一細胞に解離し、1:1 の比率で混合し、各継代 28 日後に単色または混合としてスコア付けしました。 最初のFACS精製、EPCAM+、間質枯渇オルガノイドスターター培養物からのそれぞれの単離戦略の後、精製AT2培養物および基礎培養物に対して同じアプローチを使用した。

成人ヒト肺組織を入手し、上記のように解離しましたが、細胞を上記のように Zombie Aqua live:dead 染色で標識し、FACS バッファーで洗浄し、その後 2% PFA の PBS 溶液中で 4 °C で一晩固定しました。 次いで、ＰＢＳ－グリシン洗浄を省略して、上記のホールマウント手順を使用して細胞を染色した。 次に、固定および透過処理した細胞を、1:400 希釈の Alexa Fluor 647 結合マウス抗ヒトサイトケラチン 5 抗体 (Abcam) とともに透過処理バッファー中、4 °C で 24 時間インキュベートしました。 次に細胞をFACS緩衝液で洗浄し、PE結合マウス抗ヒトTNFRSF12A抗体(クローンITEM-4、Biolegend)で氷上で30分間標識し、続いて洗浄し、BD Aria Fusion装置で分析した。 ITEM-4 抗体の完全なゲーティング戦略と qPCR 検証については、補足図 1 に詳しく説明されています。

培養約4週間後の新鮮なヒト遠位肺または初代オルガノイド培養液からの単細胞懸濁液を上記のように解離し、Fc Block (BioL​​egend)で処理し、Zombie Aqua 1:400、1 μg ml-1を含むFACS緩衝液中でインキュベートしました。 PerCP-Cy5.5 抗ヒト EpCAM (CD326)、1 μg ml-1 APC 抗ヒト ITGA6 (CD49f)、2 μg ml-1 FITC 抗ヒト ITGB4 (CD104)、および 1 μg ml-1 PE 抗ヒト TNFRSF12A (CD266)。 標識の30分後、細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、EPCAMhi、ITGA6/ITGB4hi、TNFRSF12AhiおよびTNFRSF12Anegについて選別した。 完全なゲーティング戦略を補足図1に示します。5,000個を超える細胞を、肺オルガノイド培地および10μMのROCK阻害剤Y-27632を含むエッペンドルフチューブに選別しました。 すべての FACS 抗体は Biolegend から購入しました。

細胞をECMに播種し、10μMのROCK阻害剤Y-27632を含む肺オルガノイド培地に浸漬した。 オルガノイド培養物からFACSで単離された細胞の播種密度は、1μl ECMあたり100細胞の密度でウェルあたり1,000細胞であった。 新鮮なヒト遠位肺からFACSで単離した細胞の播種密度は、1μl ECMあたり300細胞の密度でウェルあたり3,000細胞であった。 24時間後、培地を交換してROCK阻害剤を除去し、その後は72時間ごとに交換した。 オルガノイド形成は、播種後 14 日後に 2 人の独立した観察者によって手動で定量化されました。

AT2、基底細胞、およびクラブ細胞型を含む2〜3週間の未分画培養物に、抗ウイルス化合物で24時間前処理した後、ウイルス複製時にGFPを発現するように改変されたH1N1 PR8株44を3回感染させた。 PBS中の5 mM EDTAの添加によってECMを分散させ、続いて洗浄し、ビヒクルまたは抗ウイルス薬のいずれかを含む培地中で推定MOI 1でPR8-H1N1-GFPレポーターウイルスを接種しました。 12 時間後（インフルエンザ感染 1 サイクル）、インタクトなオルガノイド GFP 発現を Keyence BZ-X700 自動顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡で視覚化するか、単一細胞に解離させて PBS 中の 0.1% PFA で固定し、その後 GFP+ 細胞を FACS 定量しました。ゲート戦略は補足図1に示されています）。 抗ウイルス用量反応曲線は、GraphPad Prism 7 (GraphPad Software、カリフォルニア州サンディエゴ) でフィッティングした 4 パラメーター非線形回帰曲線を使用して作成しました。 H1N1 指向性は、Ficoll で沈降した基底細胞画分と非基底細胞画分を単一細胞に解離し、計数し、推定 MOI 1 でオルガノイド培地中 37°で 1 時間感染させた点を除き、上記と同様の方法で評価しました。 Ｃで洗浄し、続いて洗浄し、ＥＣＭに再播種し、１６時間培養し、次いで上記のように解離およびＦＡＣＳに供した。

50 μl ECM 液滴に埋め込まれて増殖した肺オルガノイドを、記載されているように 28 修正を加えて懸濁培養に移しました。 簡単に説明すると、ECM包埋オルガノイドを、滅菌LoBindチップ(Eppendorf 22493008)を使用してピペッティングすることによって穏やかに取り除き、PBS中の氷冷した5 mM EDTAを含む15 ml LoBindコニカルチューブ(Eppendorf 30122216)に配置した。 回転プラットフォーム上で 4 °C で 1 時間回転させながら、ECM 液滴あたり 5 ミリリットルの EDTA 溶液を使用しました (15 ml コニカル チューブあたり 3 ECM 液滴)。 オルガノイドを200g、4℃で3分間遠心分離し、上清を除去しました。 ペレットを、超低付着性６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ３４７１）内の増殖培地中に再懸濁した。 懸濁したオルガノイドを 37 °C、5% CO2 でさまざまな時間 (0 ～ 30 日の範囲) でインキュベートして、頂端アウト極性、繊毛形成および分化を特徴付け、SARS-CoV-2 の感染実験用に頂端アウトオルガノイドを調製しました。

VeroE6 細胞はマイコプラズマフリーストックとして ATCC から入手し、10% FBS を補充した DMEM で維持しました。 SARS-CoV-2 (USA-WA1/2020) を、2% FBS を含む DMEM 中の VeroE6 細胞で継代しました。 Avicel (FMC Biopolymer) およびクリスタルバイオレット (Sigma) を使用した VeroE6 細胞のプラークアッセイによって力価を決定し、ウイルスゲノム配列を確認し、すべての感染を継代 3 ウイルスで実行しました。 オルガノイドを計数し、懸濁培地に6〜8日間継代し、サンプル中の総オルガノイド細胞に対してMOI 1でウイルス培地または等量の模擬培地に再懸濁し、37℃、5%でインキュベートしました。 CO2 を 2 時間。 次いで、オルガノイドを肺オルガノイド培地に懸濁してプレーティングした(頂端側オルガノイド)。 示された時点で、頂端側から取り出されたオルガノイドを肺オルガノイド培地およびPBSで洗浄し、TRIzol LS (Thermo Fisher)、新たに作製したPBS中の4% PFA、または250μlの肺オルガノイド培地に再懸濁した。 肺オルガノイド培地に再懸濁した細胞を、-80 °C で凍結することにより溶解しました。 培養上清は TRIzol LS に保存するか、プラークアッセイ単層に直接添加しました。 SARS-CoV-2 に関するすべての研究は、スタンフォード大学の BSL3 条件下のクラス II バイオセーフティキャビネット内で実施されました。

SARS-CoV-2に感染したオルガノイドからのRNAは、750μlのTRIzol（Thermo Fisher Scientific）を添加し、55℃で5分間インキュベートし、その後150μlのクロロホルムを添加することによって抽出した。 各サンプルを 7 秒間ボルテックスして混合した後、サンプルを 25 °C で 5 分間インキュベートし、その後 4 °C、12,000 rpm で 15 分間遠心分離しました。 各サンプルから水層を注意深く除去し、2 倍量の 100% エタノールと混合し、RNA Clean & Concentrator-25 キット (Zymo Research) を製造元の指示に従って使用して精製しました。 すべての RNA サンプルを DNase (Turbo DNA-free キット、Thermo Fisher Scientific) で処理しました。 Brilliant II SYBR Green QRT–PCR 1-Step Master Mix (VWR) を使用して、RNA を cDNA に変換し、CFX96 Touch リアルタイム PCR 検出システム (Bio-Rad) で特定の RNA 領域を増幅しました。 逆転写反応を 50 °C で 30 分間、95 °C で 10 分間実行し、続いて 95 °C で 10 秒間および 55 °C で 30 秒間の 2 ステップ qPCR を合計 40 サイクル実行しました。 2 つのプライマー セットを使用して、ヌクレオチド位置 14221 ～ 14306 にわたるスプライスされていない SARS-CoV-2 ゲノム RNA (gRNA) またはスプライスされた SARS-CoV-2 sgRNA30 のいずれかを増幅しました。 プライマー配列は補足表 7 にあります。

ヒト遠位肺組織の最適な染色は、一次外科切除後 30 分以内に 4% パラホルムアルデヒドを含む PBS で固定された標本から達成されました。 標本を固定液中で 4 °C で一晩インキュベートし、30% スクロースに移し、OCT に包埋しました。 凍結切片を10μmに切断し、クエン酸ベースの抗原賦活化（Vector Labs）を70℃で30分間行い、その後、上記のようにIF洗浄緩衝液中の10％ヤギ血清で1時間ブロックした。 マウス抗TNFRSF12A（クローンITEM-4、Biolegend）を図3aに使用し、ポリクローナルウサギ抗TNFRSF12A（ThermoFisher PA5-20275）を図3b、fおよび拡張データ図845に使用しました。

生きたオルガノイドを観察室（Lab-Tek II 2室カバーガラス）内の2枚のカバーガラスの間に保持し、63倍の対物レンズを備えた微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡を使用するNikon TE2000E顕微鏡を使用して撮影しました。 イメージング中、サンプルは 37 °C、5% CO2 に保たれました。 デジタル ビデオは、Hamamatsu 高解像度 ORCA-285 デジタル カメラによって収集され、OpenLab 5.5.2 ソフトウェア (Improvision) を使用してレンダリングされました。 記録後、サンプルはチャンバーから取り出さずに固定および染色され、免疫蛍光顕微鏡検査のために共焦点顕微鏡に移されました。

特に明記しない限り、すべてのデータは少なくとも 2 つの独立した実験の代表であり、それぞれの独立した実験は 1 人の個体に由来するオルガノイド培養物を使用して実行されました。 箱ひげ図の境界は第 1 四分位から第 3 四分位までに広がり、水平線は中央値を表し、ひげはデータ範囲の最小値または最大値、または外れ値の場合はデータ ポイントで表される外れ値の四分位間範囲の 1.5 倍を表します。 t 検定は両側で行われ、P 値は *P < 0.05、**P ≤ 0.01、および ***P ≤ 0.001 として示されます。 詳細については、補足メソッドで説明されています。

研究デザインの詳細については、この論文にリンクされている Nature Research Reporting Summary を参照してください。

scRNA-seq データセットは、アクセッションコード GSE106850 で Gene Expression Omnibus に寄託されています。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

scRNA-seq データの分析を実行するためのスクリプトがこのペーパーに付属しています。 カスタム コードは GitHub (https://github.com/ameen-salahudeen/lung_organoid) で入手できます。

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リファレンスをダウンロードする

議論してくれた Kuo 研究室と Desai 研究室のメンバーに感謝します。 組織取得に関してはスタンフォード組織バンク、J.シュレーガー、M.ベリー、W.トロープ。 軌道分析のためのS. Plevitis。 技術的専門知識については、スタンフォード幹細胞 FACS 施設、P. Chu、A. McCormick、D. Mendoza、F. de la Vega、および J. Zengel に協力していただきました。 SARS 関連コロナウイルス 2、分離株 USA-WA1/2020、NR-52281 は CDC によって寄託され、NIAID、NIH の BEI Resources を通じて入手されました。 著者を支援するフェローシップは次のとおりです。AAS: AP Giannini、ECOG-ACRIN、P. Carbone、スタンフォードがん研究所。 SSC: スタンフォード医学者トレーニング プログラム助成金 T32 GM007365-44; JZ: スタンフォード大学院フェローシップ。 SMdlO: CIRM ブリッジ。 資金援助は次のとおりです。AR: NIH 助成金 T32 AI007502-23。 RAF: デーモン・ラニヨンがん研究財団 (DRG-2286-17)。 VvU: オランダ科学研究機構ルビコン助成金 (452181214)。 CS および JZ: NSF DMS 1712800 およびスタンフォード ディスカバリー イノベーション ファンド。 KCG および MMD: ハワード ヒューズ医学研究所。 CAB: Burroughs Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis of infection Grant 1016687。この研究は、CJK および TJD への CIRM DISC2-09637: CJK、MRA、および CAB への Bill and Melinda Gates Foundation OPP1113682 によっても支援されました。 MRA および MM-C へのノボ ノルディスク財団チャレンジ グラント。 マザーズ財団新型コロナウイルス基金からKCGへ。 NIH は AAS に K08DE027730、MMD に U19AI057229、JSG に R56AI111460、TJD に 5R01HL14254902、CJK および KCG に DK11572802、RSB に R01AI157155、および U19AI116484、U01DK085527 を付与します。 CJK への U01CA217851、U01CA176299、および U01DE025188。 CAB は、タシアとジョンのモーグリッジ学部奨学生であり、チャン ザッカーバーグ バイオハブ調査員です。 TJD は、小児トランスレーショナル医療におけるウッズ家寄附教員奨学生です。 CJK はモーリン・ライルズ・ダンブロージョ医学教授です。

アミーン・A・サラウディーン

現在の住所: イリノイ大学シカゴ医科大学医学部血液腫瘍科、米国イリノイ州シカゴ

これらの著者は同様に貢献しました: Ameen A. Salahudeen、Shannon S. Choi

スタンフォード大学医学部、スタンフォード、カリフォルニア州、血液内科

アミーン・A・サラウディーン、シャノン・S・チョイ、ショーン・M・デ・ラ・オー、アントニオ・J・M・サントス、ジハン・ジュ、アーピット・バティシュ、臼井達也、ダニエル・J・ハート、カルビン・J・クオ

米国カリフォルニア州スタンフォード、スタンフォード大学医学部医学部感染症および地理医学部門

アルジュン・ルスタギ & キャサリン・A・ブリッシュ

スタンフォード大学工学部電気工学科、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

朱俊傑

スタンフォード大学医学部微生物学および免疫学教室、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

ヴィンセント・ファン・ウネン、リサ・E・ワガー、ジェフリー・S・グレン、マーク・M・デイヴィス、マヌエル・R・アミエバ

スタンフォード免疫・移植・感染研究所、スタンフォード大学医学部、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

ヴィンセント・ファン・ウネン、リサ・E・ワガー、マーク・M・デイヴィス

スタンフォード ChEM-H、スタンフォード大学、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

ライアン・A・フリン

スタンフォード大学化学科、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

ライアン・A・フリン

スタンフォード大学医学部小児科、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

マル・マルガレフ・カタラ & マヌエル・R・アミエバ

10x Genomics、プレザントン、カリフォルニア州、米国

グレース XY ジェン、ジェシカ M. テリー、フィリップ ベオグラーダー、ソロンゴ B. ジラルド & タージェイ S. ミケルセン

ノースカロライナ大学チャペルヒル校疫学部、米国ノースカロライナ州チャペルヒル

ケイトリン E. エドワーズ & ラルフ S. バリック

米国カリフォルニア州スタンフォードのスタンフォード大学医学部分子細胞生理学教室

ヴィンセント・ルカ & K・クリストファー・ガルシア

米国カリフォルニア州スタンフォードのスタンフォード大学医学部医学部生物医学データ科学部門

ベネディクト・アンチャン & キアラ・サバティ

スタンフォード大学医学部、肺、アレルギー、救命救急部門、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

モニカ・ナゲンドラン & トゥシャー・J・デサイ

米国カリフォルニア州スタンフォード、スタンフォード大学医学部医学部消化器科

カーン・グエン & ジェフリー・S・グレン

スタンフォード大学医学部生化学教室、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

ペール・B・ハーベリー

ハワード・ヒューズ医学研究所、スタンフォード大学医学部、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

K・クリストファー・ガルシア＆マーク・M・デイビス

ノースカロライナ大学チャペルヒル校、微生物学および免疫学部、米国ノースカロライナ州チャペルヒル

ラルフ・S・バリック

チャン・ザッカーバーグ・バイオハブ、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

キャサリン・A・ブリッシュ

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AAS と SSC は、実験を考案、設計、実行し、データを分析し、原稿を執筆しました。 AR は SARS-CoV-2 感染症を設計および実行しました。 JZ、VvU、および CS は、単一細胞 RNA 配列研究を設計および解釈しました。 RAF は qRT-PCR を実施しました。 MM-C.、SMdlO、AJMS、TU、DJH、JJ、AB はオルガノイドの培養と分析を実施しました。 LEW および MMD 設計の FACS パネル。 VL と KCG は DLL4 E12 変異体に寄与しました。 BA は SPADE 分析を実行しました。 KN と JSG はインフルエンザ研究を計画し、実施しました。 GXYZ、JMT、PB、SBZ、および TSM は、単一細胞 RNA-seq 実験を設計および実行しました。 CEE と RSB は SARS-CoV-2 研究についてアドバイスしました。 MN および PBH は、in situ ハイブリダイゼーション プロトコルを提供しました。 MRA、CAB、TJD、CJK が実験を考案、設計し、データを分析し、原稿を執筆しました。

Catherine A. Blish、Tushar J. Desai、または Calvin J. Kuo との通信。

CJK、AAS、SSC、CAB、AR、MRA、MM-C.、SMdlO、および TU は、この論文の方法を説明する仮特許第 63/053,079 号の発明者としてリストされています。 CJK は Surrozen Inc. の創設者です。他のすべての著者は競合する利益を宣言していません。

査読情報 Nature は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a、ヒト遠位肺からの培養開始の概略図。 b、特定の組換え増殖因子を用いた化学的に定義されたオルガノイド培養10日目後の必要な外因性増殖因子の明視野顕微鏡による評価と自動オルガノイド定量、N = ノギン、E = EGF、W = WNT3A、R = RSPO1、条件ごとにn = 4、データは平均±標準誤差、* = P < 0.05、両側スチューデント t 検定、スケール バー = 500 μm。 c、上、CD45+造血細胞、内皮細胞および線維芽細胞のネガティブMACSビーズ枯渇とそれに続くEPCAM+上皮のポジティブFACS選択を含む遠位ヒト肺から上皮細胞を単離するための精製スキーム。 左下、再分析で>99.9%のEPCAM+純度(オレンジ色)と非染色対照(灰色)を示す代表的なFACS。 右下、特定の増殖因子を含むオルガノイド培養 10 日目後の遠位肺培養物から精製された EPCAM+ 細胞の増殖、N = ノギン、E = EGF、W = WNT3A、R = RSPO1、条件ごとの n = 3、データは平均値 ± sem 、** = P < 0.01、両側スチューデント t 検定。 d、単一の解離したヒト遠位肺細胞に由来する固体および嚢胞性オルガノイドのタイムラプス透過共焦点画像、スケールバー = 100 μm。 例：クローン性混合研究。 e、クローン性を決定するためのレンチウイルス-GFP-発現細胞とレンチウイルス-mCherry発現細胞の混合研究のスキーム。 f、(e)から得られた緑色および赤色オルガノイドの代表的なライブ蛍光イメージング、スケールバー= 500μm。 g、最初および連続継代（P1 = 継代1）後の2人の個体（1、2）からの赤色、緑色、またはキメラの遠位肺オルガノイド培養物の定量。

ソースデータ

a〜c、全細胞集団の教師なしクラスタリングは、基底細胞（KRT5/6）、クラブ細胞（SCGB1A1）、およびAT2（SFTPC）細胞に対応する上位の差次的に発現される遺伝子の一貫性を示しています。 これらの培養物から得られた上皮画分は全細胞の約 90 ～ 99% の範囲であり、残りは線維芽細胞 (VIM+) または単核細胞 (HLA-DR+、おそらく肺胞マクロファージ) でした。 各集団に対応するマーカー遺伝子の d–f、t-SNE 視覚化およびバイオリン プロット。 扁平上皮化生を特徴付けると記載されているSPRR遺伝子が豊富な独特の集団が、活動的喫煙者であった個人に由来する肺3のオルガノイド培養物のみに見出されたことに留意されたい。

a、プールされたセルの SPADE プロット。各点は、最小スパニング ツリーの同じまたは隣接するブランチ上でより関連性の高いセルの状態を表します。 注: AT2 細胞は基底細胞およびクラブ細胞の遠位の分岐上に存在し、AT2、基底細胞、およびクラブ細胞の間に系統階層がないことを示唆しています。 b、AT2、VIM+、およびHLA-DR+細胞を除外した後のプールされたscRNA-seqサンプルのSPADEプロットは、基底細胞から生じるクラブ細胞の枝による基底（青）集団とクラブ（赤）集団の間の系統関係を裏付けています。 c、基礎 1、基礎 2、およびクラブ集団の SPADE プロット。 d、左、SCGB1A1の遺伝子発現は、KRT5（中央）と比較してクラブ細胞系列と基底細胞系列（左）でより高い発現を示します。 右、TNFRSF12A の遺伝子発現中央値。基底細胞分枝内の高い値 (オレンジ色の輪郭) と低い値 (青色の輪郭) を示し、潜在的な系統関係を推測します。 e、UMAPで描かれたクラブ細胞に接続されたBasal 1の単一細胞トランスクリプトームのMonocle 3擬時間トラジェクトリー分析（細胞番号、n = 3,721）。（左）細胞クラスターと（右）擬時間勾配で色分けされています。

a、左、Hoescht核染色剤およびLysoTracker Red DND-99で標識した培養67日目の生きたAT2オルガノイドの共焦点画像。 右上、精製されたAT2オルガノイドの単離。 未分画オルガノイド培養物からの LysoTracker Red AT2 精製を示す代表的な FACS プロット。 右下、LysoTracker で選別された AT2 細胞のサイトスピンの免疫染色は高純度を示します (100/100 細胞 SPC+ SCGB1A1- KRT5)。 スケールバー = 50 μm)。 b、EPCAM+LysoTracker+AT2細胞としてのヒト混合遠位肺オルガノイドからのAT2細胞のFACS単離とその後の長期クローン形成オルガノイド培養のスキーム。 c、拡張データのとおり実行された、完全にmCherry+またはGFP+の存在を示すが、キメラオルガノイドは存在しないことを示す、間質枯渇、EPCAM+LysoTracker+、レンチウイルスでマークされたAT2細胞からのクローン混合研究の代表画像。図1e〜g、レンチウイルス感染後の継代1 、スケールバー = 200 μm。 d、最初および連続継代（P1 = 継代1）後の2人の個体（1、2）からの（c）と同様の赤色、緑色、またはキメラAT2オルガノイド培養物の定量。 e、組換えニッチ因子とPORCUPINE阻害剤C59（1mM）、NOGGIN（N）、EGF（E）、WNT3A（W）、R-SPONDIN1（R）のさまざまな組み合わせによるAT2オルガノイドの増殖。 条件ごとに n = 3、データは平均値 ± sem、* = P < 0.05、*** = P < 0.001、両側スチューデント t 検定。 f、化学的に定義された肺オルガノイド培地（EN）と、組換えEGFを補充したWNT3A、NOGGIN、およびR-SPONDIN3を含む血清含有L細胞馴化培地（L-WRN CM）における純粋なAT2オルガノイド増殖促進を比較する明視野顕微鏡、1つの実験。 スケールバー = 200 μm。 g、培養28日目の代表的なAT2オルガノイドの透過型電子顕微鏡画像。 頂端微絨毛 (黒い矢印) と層状体 (赤い矢印) に注目してください。 スケールバー = 10 μm。

ソースデータ

a〜c、混合培養中の基底オルガノイドは、アポトーシスを伴わない内腔を徐々に形成します。 a、KRT5 IF、26日目の培養、スケールバー = 200 μm。 b. 内腔定量、培養 12 日目と培養 26 日目、単一測定。 ｃ、２６日目の基底細胞オルガノイド内腔におけるアポトーシスの欠如、切断されたカスパーゼＩＦ、図２ｂより、スケールバー＝２０μｍ。 d、e、Ficollでの示差沈降による精製基底細胞オルガノイドの単離。 d、スキームと、沈降した基底オルガノイド細胞の細胞内KRT5 FACSによって測定した90%を超えるKRT5+細胞への濃縮。 スケールバー = 100 μm。 e、沈降した基底オルガノイドの連続タイムラプス顕微鏡検査により、継代後2週間以内または培養開始から4週間以内に自発的キャビテーションが明らかになります。 スケールバー = 25 μm。 f、g、間質が枯渇し、Ficoll精製され、レンチウイルスでマークされた基底オルガノイド細胞からのクローン混合研究。拡張データのように完全にmCherry+またはGFP+を示すが、キメラオルガノイドは示さない。図1f、レンチウイルス感染後の継代1、スケールバー= 200μm 。 f、代表的なクローン混合画像研究。 g、定量。 h、14日目の沈降、酵素解離およびクローン形成培養後の基底オルガノイドの成長因子の評価。 増殖は、PORCUPINE 阻害剤 C59 (1 μM) の影響を受けませんでした。 条件ごとに n = 4、データは平均 ± sem、*** = P < 0.001、両側スチューデント t 検定。

ソースデータ

a, 高解像度クラスタリング分析により、TNFRSF12A、NOTCH 経路マーカー HES1、および増殖マーカー MKI67 の mRNA の発現が有意に高い、再現性のある活性な基底細胞部分集団が特定されます。 修正されたクラスカル・ウォリス順位和検定の 2 つの末尾 p 値: TNFRSF12A 4.15 × 10−8; HES1 2.4×10−10; MKI67 3.4×10−3。 b. KRT5+ 集団の高解像度クラスタリングにより、2 つの Basal 1 サブクラスター、Basal 1.1 および 1.2 が特定されます。 c、遺伝子オントロジー Basal 1.2 対 1.1 で濃縮された差次的発現遺伝子の PANTHER 過剰表現は、Basal 1.2 プロセスの大部分が細胞周期 (アスタリスク) に関与していることを示しています。 完全な分析は補足表3に提供されています。 d、図2f〜hのscRNA-seq分析のバイオリンプロットは、EPCAM + ITGA6 + ITGB4 + mRNAを三重に発現する単一細胞間でのKRT5 mRNA発現を示しています（紫色、つまりタンデムmRNA発現） 3 つすべての遺伝子）対残りの細胞（灰色）、P < 0.001 両側クラスカル-ワリス順位和検定。 e、EPCAM + ITGA6 + ITGB4 + 遺伝子発現を有する細胞間のdからのTNFRSF12AおよびITGA6発現のt-SNE視覚化、および高（上位四分位、オレンジ）、中程度（ピンク）および低（下位四分位、紺色）mRNA発現による細分類。 f、増殖関連遺伝子発現は、eのようにTNFRSF12A mRNAの低発現、中発現、または高発現について階層化されたEPCAM + ITGA6 + ITGB4 + 細胞のscRNA-seq細胞分画で徐々に濃縮されます。 f のデータは、単一の実験からの細胞集団の割合を表します。 *** = P < 0.001、両側カイ二乗検定。

ａ、ＫＲＴ５＋細胞の分別沈降によるＢａｓａｌ １およびＢａｓａｌ ２の単離、その後のＥＰＣＡＭ＋ＩＴＧＡ６＋ＩＴＧＢ４＋ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ＋（Ｂａｓａｌ １）対ＥＰＣＡＭ－ＩＴＧＡ６－ＩＴＧＢ４－ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ－（Ｂａｓａｌ ２）のＦＡＣＳソーティング。 b、aからのBasal 1および2画分におけるKRT5タンパク質発現の細胞内FACS測定。 c、a、bからの14日目のオルガノイド培養の代表的な明視野。 d、a〜cからの3つの独立した実験の定量。箱ひげ図は第1四分位、中央値、第3四分位を表し、ひげは最小値と最大値を表します。 *** P < 0.001、両側スチューデント t 検定。 e、FACSで単離されたBasal 1細胞の長期培養後の、3つのscRNA-seq生物学的複製からの2つの異なる上方制御されたBasal 2遺伝子のqPCR測定（拡張データ図6、SPRR1B、TMSB4X）。 データは、3 つの独立した実験からの培養物の相対平均 ± 標準誤差です。** = P < 0.01、両側スチューデント t 検定。 f、Basal 1細胞に由来するオルガノイド内のTMSB4XおよびSPRR1B細胞転写物を示すRNA FISH（矢印）、スケールバー= 25μm。 g、ビヒクル、NOTCHアゴニズム（JAG1ペプチド）、またはデルタ様リガンド変異体4（DLL4E12; E12）またはガンマセクレターゼ阻害剤DBZによるNOTCHアンタゴニズム下でのFACS単離TNFRSF12Ahi Basal 1細胞のKRT5免疫染色およびSFTPCおよびSCGB1A1 RNA FISH。 スケールバー = 50 μm。 h、相対的な細胞増殖をgで推定するためのレザズリン色素還元の蛍光定量、データはビヒクル（V）に対して正規化されており、5回の独立した実験からの平均±semを表します、* P < 0.05、両側スチューデントt検定。 i、3つの独立した実験からのNOTCHアゴニズムまたはアンタゴニズムとの関連におけるRNA FISHによるSCGB1A1およびSFTPC遺伝子発現の定量、** P < 0.01、*** P < 0.001、両側スチューデントt検定。 SFTPC mRNA の上方制御には、層状体または SFTPC タンパク質の産生は伴わなかった (データは示さず)。

ソースデータ

a、b、2 名のヒト遠位気道における KRT5 および TNFRSF12A の免疫染色、スケール バー = 100 μm。 c、ヒト遠位気道におけるKRT5、TNFRSF12A、およびp63の免疫染色、スケールバー= 100μm。 d、抗KRT5（細胞内）およびモノクローナル抗TNFRSF12A（細胞表面）を用いた新たに固定したヒト遠位肺からのFACS分析（上）、またはEPCAM+ITGA6+ITGB4+細胞の新たに解離したヒト遠位肺からの連続FACS単離とその後の分画TNFRSF12Ahi または TNFRSF12Aneg サブセット（下）に、生シングレットで事前にゲートされ、図 3d–g の培養実験に使用されました。

a、b、H1N1 インフルエンザ感染の遠位肺オルガノイド モデリング。 a、PR8-GFP H1N1 インフルエンザウイルス感染から 12 時間後の精製基底オルガノイド (左) および精製 AT2 オルガノイド (右) の透過画像と GFP 共焦点画像を合成し、GFP+ 細胞の割合を FACS で定量したもの。 棒プロットは、3 つの技術的複製からの感染細胞の平均パーセンテージを表します (P = 0.57、カイ二乗検定)。 スケールバー = 50 μm。 b、推定感染多重度（MOI）0.01で野生型H1N1を初回感染させた混合遠位肺オルガノイド培養上清の経時的なウイルスゲノム定量、qRT-PCR、データは3回の独立した実験の平均値±sem cを表す。 、ｄ、インフルエンザウイルス宿主細胞侵入の表面分子として機能するシアル酸残基を特徴付けるための、Ｍ．ａｍｕｒｅｎｓｉｓ（ａ２−３）およびＳ．ｎｉｇｒａ（ａ２−６）レクチン、またはレクチンなしのネガティブコントロールを用いたレクチン染色。 AT2 オルガノイド (c) および基底オルガノイド (d)。 スケールバー = 25 μm。 e, インフルエンザの感染力と複製に対する 2 つの異なるクラスの抗ウイルス薬の用量反応曲線。 ヌクレオシド類似体 FdC は、ノイラミニダーゼ阻害剤ザナミビルと比較して、IC50 が 340 nM の用量依存性活性を示しました。ザナミビルはウイルスの排出のみを阻害し、感染性や複製を阻害しません。 条件ごとに n = 3、データは平均 ± sem f を表します。48 ウェル形式での H1N1 PR8-GFP オルガノイド感染後の選択されたさまざまな抗ウイルス薬のマルチウェル スクリーニングの蛍光顕微鏡写真。 FdC = ヌクレオシド類似体 2'-デオキシ-2'-フルオロシチジン。 Cpd = 化合物番号。

ソースデータ

a、図1a〜hのようなECM包埋混合遠位肺オルガノイドにおけるACE2およびTMPRSS2遺伝子発現のscRNA-seqプロット。 b、肺オルガノイドの頂端外極性をもたらすECM除去および懸濁培養の図。 c、ECM除去時のマイクロフィラメント（ファロイジン）およびアセチル化微小管（AcTUB）の再構成を示す代表的な共焦点顕微鏡。 スケールバー = 10 μm。 d – f、頂端から外側の基底オルガノイドの分極と加速された毛様体分化。 d、ECM除去後の異なる日における頂端外肺オルガノイドの共焦点3D切片（上のパネル）および表面再構成（下のパネル）。 0 日目 (d0) では、マイクロフィラメント (緑色、ファロイジン) および微小管 (赤色、アセチル化チューブリン) 組織は分極していませんが、接合鎖 (ZO-1、白色) は分極しています。 懸濁液中での 2 日目 (d2) までに、ZO-1 (白色) はオルガノイドの外側を向いた各細胞の頂端周縁に接合リングを形成し、アクチン細胞骨格は外側を向いた微絨毛 (緑色) を形成します (頂端外極性)。 また、d2 では一部の細胞が微小管分極を開始します。 5 日目 (d5) までに、さらに多くの細胞が外側を向いた運動性繊毛を持ちます。 成熟した運動性繊毛は、例えば 14 日目 (d14) など、数週間観察できます。 e、大部分が基底幹細胞からなるECMに埋め込まれたオルガノイドの3D共焦点再構成（KRT5+、白色）。 f. 浮遊培養で頂端外極性が確立され、繊毛形成が始まると、極性化した上皮の下に KRT5+ 基底細胞が見られます。 g、SCGB1A1+ 頂端外極性のクラブ細胞が外面に存在します。 すべてのパネルで、核は DAPI で青色に染色され、アクチン マイクロフィラメント組織はファロイジン (緑色) で視覚化されます。 スケールバー = 10 μm。 h – j、AT2オルガノイドの長期懸濁培養（懸濁後10日目）は、頂端外極化とAT1分化を誘導します。 h. 浮遊培養で 10 日間後の肺胞由来オルガノイドの光学切片は、AT2 細胞の存在量が減少していることを示していますが、個々の立方体細胞は、肺胞タイプ 1 の頂端膜に特異的な膜貫通タンパク質である AT1 マーカー HTI-56 (赤色) を発現し始めています。肺細胞 (AT1)。 スケールバー = 10 μm。 i、j、10日間の懸濁培養後の肺胞オルガノイドの側面図は、ファロイジン反応性の頂端結合複合体が外側を向いている（頂端外側）（i）および頂端膜上のHTI-56の発現（j）を有する薄いAT1細胞を明らかにする。 スケールバー = 10 μm。 k、SARS-CoV-2受容体ACE2（緑）、繊毛（AcTUB、赤）およびDAPI（青）を発現する懸濁液中で10日間放置した後の、頂端から出たヒト基底オルガノイドの代表的な共焦点顕微鏡免疫蛍光。 スケールバー = 20 μm。

ゲート戦略。 a、AT2 細胞を精製するための EPCAM+Lysotracker+ ゲート戦略。 純度は、SFTPC タンパク質染色陽性の 100/100 選別細胞で確認されました (拡張データ図 4a に対応)。 b、EPCAM+ITGA6+ITGB4+TNFRSF12Ahi/ネガゲート戦略。 純度は、KRT5タンパク質に対して陽性染色された100/100のプールされた選別細胞で確認された(図2j〜kに対応)。 c、KRT5+細胞および遠位ヒト肺から新たに解離した細胞内の対応するTNFRSF12A+集団を分析するためのゲーティング戦略（拡張データ図8dに対応）。 d、FACSによってTNFRSF12A neg、med、およびhi画分に分類された細胞からのTNFRSF12Aおよび他のmRNAのRT-PCR相関（図3d）。 e、ヒト肺オルガノイドにおけるH1N1 PR8 GFP感染力を推定するためのゲーティング戦略（拡張データ図9aに対応）。

この研究で使用された 136 人の肺組織ドナーの臨床人口統計。 各行は正常な肺が得られた固有の個人に対応し、列は年齢、性別、肺の解剖学的位置などの特徴に対応します。

SPADE解析に使用した遺伝子。 遺伝子は、3 人の個人の scRNA-seq 分析からの細胞のグラフベースのクラスター化アノテーションに基づいて SPADE で利用されました。 SPADE の完全な詳細は、補足メソッドで提供されます。

scRNA-seq 集団からの差次的に発現される上位遺伝子の遺伝子セット濃縮分析 (GSEA)。 集団は、精製された AT2 scRNA-seq データセットの Basal 1、Basal 2、Basal 1.1、Basal 1.2、および Cluster 1 に対応します。 各集団の上位の差次的発現遺伝子が各タブにリストされます。 太字 = GSEA 分析に使用した遺伝子 (Panther 過剰表現検定、ボンフェローニ補正あり、p 値は両側)。

Basal 1 膜タンパク質遺伝子のリスト。 遺伝子は、GO ターム 0031224 (膜の固有成分) を持つ上位の差次的発現 Basal 1 遺伝子のオントロジー分析によって同定されました。

肺オルガノイド培養における SARS-CoV-2 感染の分析。 共焦点顕微鏡を使用して、KRT5+ 基底細胞、SCGB1A1+ クラブ細胞、および AcTUB+ 繊毛細胞の間で、陽性感染細胞を dsRNA および SARS-CoV-2 NP 染色によって定量しました。 統計分析 (カイ二乗検定またはフィッシャーの直接確率検定) を指示どおりに実行しました。

5 つの遠位肺オルガノイド培養物の次世代シーケンス。 TOMA 腫瘍プロファイリング システム (TOMA、カリフォルニア州フォスターシティ) を使用した、130 個のがん遺伝子について対立遺伝子頻度 > 0.10 の非同義変異体の概要と注釈。

試薬の表。 この研究で使用したオルガノイド培地成分、免疫染色および蛍光顕微鏡試薬、RT-PCR試薬、RT-PCRプライマー、およびRNAハイブリダイゼーションプローブの個々の表。

肺オルガノイド scRNA-seq 解析のガイド。 肺 1、2、3 および精製された AT2 オルガノイドの scRNA-seq 解析は、.rmd および .html 形式で提供されます。

肺オルガノイド培養シーケンス。 5 つの遠位肺オルガノイド培養 (TOMA 腫瘍プロファイリング システム) それぞれの次世代シーケンス データは、バリアント コール フォーマットで提供されます。

分化した基底オルガノイドには機能的な繊毛がある、パート 1。鼓動する繊毛の透過型共焦点顕微鏡ビデオ (倍率 25 倍)。

分化した基底オルガノイドには機能的な繊毛がある、パート 2。鼓動する繊毛の明視野顕微鏡ビデオ (倍率 10 倍)。

頂端から外に分化した基底オルガノイドは機能的な繊毛を持っています。 懸濁培養5日目および14日目の頂端側基底オルガノイドの運動繊毛のDICおよび3D共焦点顕微鏡ビデオ。

転載と許可

Salahudeen、AA、Choi、SS、Rustagi、A. 他ヒト遠位肺オルガノイドにおける前駆細胞の同定と SARS-CoV-2 感染。 ネイチャー 588、670–675 (2020)。 https://doi.org/10.1038/s41586-020-3014-1

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受信日: 2017 年 11 月 8 日

受理日: 2020 年 11 月 18 日

公開日: 2020 年 11 月 25 日

発行日: 2020 年 12 月 24 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-020-3014-1

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