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Oct 27, 2023

両PDの二重遮断

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 2472 (2023) この記事を引用

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1 引用

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メトリクスの詳細

結腸直腸がんは免疫原性が低いです。 このようなプロパティは、ICD を使用して元に戻すことができます。 しかし、ICD誘導剤は、腫瘍細胞上で阻害性チェックポイント受容体CD47およびPD-L1の発現も誘導する可能性があり、CRC腫瘍を主にCD8 T細胞殺傷およびマクロファージ媒介性食作用に対して耐性にします。 この研究では、CD47 および PD-L1 に対するブロック抗体と組み合わせたオキサリプラチンおよび FOLFOX レジメンの治療効果を調べました。 FOLFOX およびオキサリプラチン治療により、インビトロおよびインビボで CT-26 細胞上の CD47 および PD-L1 発現が増加します。 CD47 および PD-L1 に対するブロック抗体と FOLFOX を組み合わせると、生存率が大幅に向上し、腫瘍サイズが減少します。 この 3 つの組み合わせレジメンは、腫瘍微小環境における Treg および MDSC の大幅な減少、CD8 + INF-γ + リンパ球および M1/M2 マクロファージ比の大幅な増加にもつながります。 私たちの研究では、FOLFOX、CD47、PD-L1 の 3 剤併用療法が CT-26 マウス腫瘍モデルにおける効果的な治療法であることが示され、臨床応用の可能性があると考えられます。

長年にわたる研究の進歩にも関わらず、結腸直腸がん (CRC) は依然として最も一般的で進行性の固形腫瘍の 1 つです。 進行性大腸癌における治療の第一選択として、FOLFOX (5-フルオロウラシルとオキサリプラチン) が併用化学療法レジメンとして日常的に使用されています。 しかし、獲得された薬剤耐性により、その抗腫瘍効果は制限されます。 したがって、化学療法は治癒を目的として行われるものではありません1,2。

プログラム細胞死タンパク質-1 (PD-1)/プログラム細胞死リガンド-1 (PDL-1) 軸のブロックは、がん免疫療法のパラダイムシフトをもたらし、がん治療において大きな可能性を示しましたが、すべての種類のがんに一般化することはできません。がん3、4。 最近の研究では、免疫チェックポイント遮断（ICB）に対する不均一な反応における腫瘍微小環境の免疫構造の重要性が強調されています5。 CRC、特にマイクロサテライト安定（MSS）腫瘍は、免疫原性が低く、腫瘍浸潤 CD8+ T 細胞が少ないため、チェックポイント療法に対する反応が乏しい腫瘍の 1 つです 4,6,7。 マイクロサテライト不安定（MSI）を患う CRC 患者は、既存の腫瘍浸潤 CD8+ T 細胞が高く、抗 PD-1 療法に対する反応が良好であることを示しました 7,8。

腫瘍および CD8+ T 細胞浸潤の低い免疫原性を強化する 1 つの方法は、免疫細胞死 (ICD) 誘導物質を化学療法剤として利用することです 1,9,10。 FOLFOXレジメンとオキサリプラチンは両方ともICDを効果的に誘発することが示されていますが、それらは腫瘍細胞とリンパ球の両方でチェックポイント受容体の発現を増加させます1,11。 チェックポイント受容体のうち、PD-L1 と CD47 は両方とも、患者における FOLFOX とオキサリプラチンによる治療後に過剰発現します1。

CD47 アップレギュレーションは、がん細胞の「自己性」を高めるメカニズムであり、マクロファージや樹状細胞 (DC) による腫瘍細胞の食作用の阻害に重要な役割を果たします。 さらに、その発現の増加は、DC による交差提示の遮断につながります 12、13。 CD47 のより高い発現は、予後の低下と死亡率の増加に関連する幅広い種類の癌で観察されます。 CD47/シグナル調節タンパク質 α (SIRPα) のブロックは、がん免疫療法における新たな時代です 14。 いくつかの臨床試験研究では、この自然免疫チェックポイント受容体の臨床的利点が調査されており、一部の第 I 相試験が発表されています 15,16。 しかし、CD47/SIPR-αを阻害する単独療法は治癒治療として機能しないことが予想され、先天性ICBと適応性ICBおよび化学療法の併用療法が焦点となっている14、17、18、19。

現在の研究では、効果的な ICD 誘導剤としてオキサリプラチン (OXP) を使用し、抗 CD47 および抗 PD と内因性ワクチンとして機能する損傷関連分子パターン (DAMP) を放出することによる併用療法の可能性を調査しようとしました。 L1。 我々は、それぞれICD誘導物質を介して「私を食べてください」シグナルを提供し、CD47をブロックすることで「私を食べないでください」シグナルをブロックすることにより、DCとマクロファージが腫瘍細胞を貪食し、免疫応答を誘導すると仮説を立てています。 CD8+ T細胞によるエフェクターアームでは、PD-L1をブロックするとエフェクター機能が強化され、腫瘍細胞が破壊されます。 CT-26マウスモデルを使用して、我々が設計した併用療法においてオキサリプラチンをFOLFOXに置き換えることをさらに検討し、潜在的な相乗効果の原因を評価します。 我々のデータは、CT-26 腫瘍担持マウスにおいて、抗 CD47 抗体と抗 PD-L1 抗体を組み合わせた FOLFOX 投与により、生存率が大幅に向上し、腫瘍サイズが縮小したことを明らかにしました。

OXP および FOLFOX レジメンが in vitro での CT-26 細胞における CD47 および PD-L1 の発現に影響を与えるかどうかを評価するために、化学療法剤による治療後のそれらの発現をフローサイトメーターで分析しました。 細胞培養培地中でOXPまたはFOLFOXのいずれかで細胞を処理した6時間後、細胞をウェルから抽出し、フローサイトメーターで分析しました。 OXP レジメンと FOLFOX レジメンはどちらも、CT-26 細胞表面の CD47 と PD-L1 の発現を増加させます (図 1A ～ F)。 FOLFOX は、OXP よりも CD47 および PD-L1 の発現を増加させます (P < 0.0001)。

FOLFOX および OXP は、CT-26 細胞株の細胞表面における CD47 および PD-L1 の発現を増加させました。 (A – D) OXP および FOLFOX による治療後の CT-26 腫瘍細胞株における CD47 および PD-L1 細胞表面発現を分析するためのゲーティング戦略。 (E) CT-26 腫瘍細胞を OXP または FOLFOX で処理し、CD47 発現をフローサイトメトリーで分析しました。 (F) 腫瘍細胞を OXP または FOLFOX で処理し、PD-L1 発現をフローサイトメトリーで分析しました。

次に、生体内での CD47 および PD-L1 発現に対する OXP および FOLFOX レジメンの効果を調べました (図 2A ～ G)。 CT-26 腫瘍を有するマウスを OXP または FOLFOX で治療し、治療の 3 日後にマウスを安楽死させ、腫瘍バルクから単細胞を採取しました。 FOLFOX レジメンと OXP は、マウスから抽出した腫瘍細胞における PD-L1 発現を有意に増加させました (それぞれ P < 0.0001 および P = 0.048)。 さらに、図2Cに示すように、FOLFOXはOXPと比較してPD-L1発現も増加します。 CD47 発現はマウスを FOLFOX で処理した場合にのみ有意に増加しましたが (P < 0.0001)、OXP は CD47 発現を有意に増加させることができませんでした。

CT-26接種腫瘍におけるCD47およびPD-L1の細胞表面発現に対するFOLFOXおよびOXPの効果。 (A – E) OXP および FOLFOX による治療後のマウスの CT-26 腫瘍における CD47 および PD-L1 細胞表面発現を分析するためのゲーティング戦略。 (F) CT-26 腫瘍細胞を OXP または FOLFOX で処理し、CD47 発現をフローサイトメトリーで分析しました。 (G) 腫瘍細胞を OXP または FOLFOX で処理し、PD-L1 発現をフローサイトメトリーで分析しました。

次に、抗CD47、抗PD-L1、および免疫学的死誘導化学療法剤（OXPまたはFOLFOX）との併用療法が、化学療法または化学療法とチェックポイント阻害剤の併用療法と比較して、抗腫瘍反応を引き起こすことができるかどうかを判断することを目的としました。 CT-26 マウス腫瘍モデルが確立されると、各グループに対応する治療薬が投与されました。 化学療法剤および/または抗CD47および抗PD-L1の注射の詳細なスケジュールを図3Aに要約する。 我々の併用療法の副作用と毒性の可能性を監視するために、研究中にマウスの体重を測定した。 どの治療グループでも有意な体重減少は見られませんでした（図３Ｂ）。

FOLFOX、抗 CD47、および抗 PD-L1 の組み合わせは、同系 CT-26 腫瘍モデルにおいて最高の可能性を示しました。 (A) 治療薬の注射の詳細なスケジュール。 (B) 対照群および異なる治療群における腫瘍担持マウスの平均体重 (g) の変化。 (C) マウスの生存日数を示し、生存期間の中央値を示します。 有意性はログランク (MantelCox) 検定によって決定されました。 n = 1 グループあたり 5 匹のマウス。 (D) CT-26腫瘍を有するBALB/cマウスに、示されたスケジュールに従って対応する治療レジメンを注射した。 腫瘍体積は、示された時点で測定されました。 (E – K) すべての治療グループの各マウスの腫瘍体積。

抗 CD47 および抗 PD-L1 と OXP または FOLFOX レジメンのいずれかを組み合わせると、化学療法剤との併用療法（抗 CD47 または抗 PD-L1 と抗 PD-L1 OXP) (図 3C)。 このデータは、表 1 の終点到達時間 (TTE) および腫瘍増殖遅延率 (TTG) データによっても裏付けられています。腫瘍サイズ分析では、抗 CD47、抗 PD-L1、および FOLFOX を投与されたマウスの腫瘍形成が最も遅いことも示されました。成長率 (図 3D–K)。

CT-26腫瘍を有するマウスにおける3剤併用レジメンに対するより良い治療反応をもたらした可能性のある要因を決定するために、脾臓およびリンパ節におけるTregおよびCD8+/INF-γ+ T細胞含有量を調べた。 腫瘍流入リンパ節における免疫細胞プロファイリングでは、治療群間で有意な変化は示されませんでした（補足図S1）。 脾臓では、OXP および FOLFOX の単独療法により Treg 集団が増加しましたが、この Treg 集団の増加は有意ではありませんでした。 OXP を抗 CD47 抗体または抗 PD-L1 抗体と組み合わせても、Treg 集団には重大な影響はありません。 トリプル併用レジメンはどちらも、OXP および FOLFOX の単独療法と比較して Treg 含量を有意に減少させました (図 4A、B)。 CD8+/INF-γ+ T細胞は、対照群のマウスおよびOXPまたはFOLFOXを受けたマウスと比較して、OXPまたはFOLFOX + 抗CD47および抗PD-L1を受けたマウスの脾臓でも増加します。 さらに、FOLFOX + 抗 CD47 および抗 PD-L1 は、OXP + 抗 PD-L1 と比較して CD8+/INF-γ+ T 細胞を増加させました (図 4C、D)。

OXPまたはFOLFOXと抗CD47および抗PD-L1との併用療法は、脾臓のCD4+細胞のTregを減少させ、CD45+集団のCD8+/INF-γ+細胞を増加させた。 (A) 脾臓における Treg 分析に使用されるゲーティング戦略。 (B) OXP および FOLFOX は CD4+ 細胞の Treg を増加させましたが、この増加は有意ではありませんでした。 OXP または FOLFOX を抗 CD47 および抗 PD-L1 と組み合わせると、CD4+ 細胞の Treg が減少し、この減少は OXP または FOLFOX レジメンを単独で投与されたマウスと比較して有意でした。 (C) 脾臓の CD45+ 集団における CD8+/INF-γ+ 分析に使用されるゲーティング戦略。 (D) OXP または FOLFOX を抗 CD47 および抗 PD-L1 と組み合わせると、CD45+ 集団における CD8+/INF-γ+ が増加しました。 この増加は、他の治療グループのほとんどと比較して有意でした。

上記の証拠に基づいて、併用療法が免疫系の活性化に有利な腫瘍微小環境の変化をもたらした可能性が非常に高くなります。 そこで、治療後の腫瘍微小環境におけるさまざまな免疫細胞集団の変化を調査しました。 腫瘍 1 グラムあたりの Treg 数は、化学療法による単独療法後にのみ増加しましたが、この Treg 含有量の増加は、FOLFOX を受けたマウスでは顕著でした。 抗CD47および抗PD-L1をOXPおよびFOLFOXの両方と同時に投与すると、化学療法剤による単独療法と比較して腫瘍のTreg含有量が減少します。 しかし、このTreg含有量の減少は、FOLFOX単独を投与されたマウスと比較して、FOLFOX+抗CD47および抗PD-L1を投与されたマウスにおいてのみ有意であった(図5A)。

CT-26腫瘍を有するマウスの腫瘍微小環境における免疫細胞の分析。 (A) 腫瘍 1 グラムあたりの Treg 数。 Treg 数は、OXP および FOLFOX レジメンの両方による治療後に腫瘍微小環境で増加しましたが、有意であったのは FOLFOX 投与群のみでした。 抗CD47および抗PD-L1をFOFOXと組み合わせると、FOLFOXを単独で投与したマウスと比較して、腫瘍1グラムあたりのTregが大幅に減少します。 (B) 腫瘍 1 グラムあたりの CD8+T 細胞数。 OXP、FOLFOX、FOLFOX の CD8+T 細胞数は変化しませんでしたが、治療の一部として抗 CD47 を投与したグループでは、腫瘍 1 グラムあたりの CD8+ T 細胞数が大幅に増加しました。 (C) 腫瘍 1 グラムあたりの MDSC 数。 (C) OXP、FOLFOX は MDSC 数を増加させましたが、併用レジメンに抗 CD47 を追加した場合、FOLFOX 投与群でのみ有意であり、OXP、FOLFOX および OXP + PD を投与されたマウスと比較して MDSC 数の有意な減少につながりました。 -L1。 D、腫瘍微小環境における M1/M2 マクロファージ比。 組み合わせレジメンに抗 CD47 を追加すると、他のグループと比較して M1/M2 マクロファージ比が増加します。

腫瘍 1 グラムあたりの CD8+ T 細胞は抗 CD47 様式で増加しました。 治療計画において抗CD47を受けたほぼすべての治療群は、抗CD47を受けなかった群と比較してCD8+ T細胞の有意な増加を示した(図5B)。 腫瘍 1 グラムあたりの MDSC も、OXP および FOLFOX 治療後に有意に増加しました。 さらに、FOLFOX 単独療法は、OXP 単独療法と比較して腫瘍内の MDSC 含有量を増加させました。 腫瘍 1 グラムあたりの MDSC の増加は、腫瘍内の Treg 含有量に対する抗 CD47 の効果と一致して、抗 CD47 を使用することによって逆転しました (図 5C)。 また、腫瘍微小環境における M1/M2 比における治療計画の効果も調査します。 FOLFOX または OXP の単独療法は腫瘍の M1/M2 比に大きな影響を与えません。 しかし、OXPとの二剤併用療法およびOXPまたはFOLFOXとの三剤併用療法の形で抗CD47を受けたマウスでは、M1/M2比は有意に増加した(図5D)。

この研究では、CT-26 マウスモデルにおいて、自然免疫チェックポイント受容体と適応免疫チェックポイント受容体の両方を遮断する化学療法の併用の可能性を評価しました。 先天性チェックポイント ブロッカーと適応性チェックポイント ブロッカーの両方を組み合わせる重要性は、いくつかの出版されたレポートで強調されています。 先天性チェックポイント阻害剤と適応型チェックポイント阻害剤を組み合わせる理由は、腫瘍細胞に対する DC、マクロファージ、および T 細胞の応答を調整することです 20,21。 OXP レジメンと FOLFOX レジメンはどちらも効果的な ICD 誘発剤として報告されており、CRC 患者の日常的な治療に使用されています。

化学療法治療後のチェックポイント受容体の増加を報告した多数の研究と一致して、OXP および FOLFOX による治療後に CD47 および PD-L1 発現の増加が見られます 11,22。 OXP および FOLFOX 化学療法レジメンの毒性のため、in vitro CD47 および PD-L1 発現分析は、CT-26 細胞の処理後 6 時間しか評価できませんでした。 この制限を考慮すると、in vitro および in vivo 実験の両方で OXP および FOLFOX の両方によって PD-L1 発現が増加し、in vitro での OXP および FOLFOX による処理後に CT-26 細胞表面の CD47 発現の増加が見られました。 腫瘍担持マウスでは、FOLFOX のみが CD47 発現の増加を誘導し、OXP 処理により CT-26 細胞表面の CD47 発現が増加しましたが、この増加はわずかでした。 いくつかの研究により、酵素消化が細胞表面マーカーの発現に影響を与えることが明らかになりました。 したがって、OXP による CD47 発現の有意な増加が見られないのは、腫瘍の酵素消化後の CD47 の部分的損失に起因する可能性があります 23,24。 化学療法後のチェックポイント受容体発現の増加には、いくつかのメカニズムが関与している可能性があります。 最近の研究では、サマンタら。 らは、化学療法剤による治療後の PD-L1 および CD47 発現の増加に関する HIF 依存性のメカニズムを報告しました 11。 さらに、ICD誘導化学療法は、T細胞の浸潤と浸潤したリンパ球によって分泌されるINF-γを増加させます。 このエフェクター細胞の浸潤と INF-γ 分泌の増加は、腫瘍細胞上の PD-L1 や CD47 などの阻害性チェックポイント発現を増加させる別の因子であることを示唆しています 25、26、27、28。

抗 CD47 抗体と抗 PDL-1 抗体は両方とも、異なる化学療法レジメンと組み合わせて使用​​され、マウスおよび臨床試験で有望な結果を示しました。 しかし、私たちの研究は、3剤の化学療法と免疫療法の組み合わせを使用した可能性のある相乗効果を調査した最初の研究です。 OXP を抗 CD47 および抗 PD-L1 と組み合わせると、OXP 単独と比較してマウスの生存率が増加し、腫瘍の増殖が減少しました。 この結果は、OXP 治療後の CD47 および PD-L1 の発現の増加が、免疫応答の活性化期およびエフェクター期の抑制につながることと一致しています。 抗 CD47 および抗 PD-L1 を使用することにより、陰性チェックポイントシグナルを抑制し、腫瘍に対する免疫応答を調整することができました。 FOLFOX は、抗 CD47 および抗 PD-L1 と組み合わせて使用​​すると、さらに大きな可能性を示しました。 この観察の背後にある理由は、OXP よりも FOLFOX による化学療法後の腫瘍細胞による DAMP 放出が強力である可能性があり、これは Dosset らによって報告されました 1。

予想通り、私たちの治療プロトコルは脾臓と腫瘍の微小環境における免疫細胞のプロファイルに大きな影響を与えました。 脾臓では、OXP レジメンと FOLFOX レジメンの両方が Treg 頻度を増加させました。 ただし、この増加は統計的に有意ではありませんでした。 しかし、抗CD47および抗PD-L1をOXPまたはFOLFOXと組み合わせて使用​​すると、OXPおよびFOLFOX単独での治療と比較してTreg頻度が大幅に減少しました。 抗CD47または抗PD-L1と組み合わせた二重剤のOXPでマウスを治療した場合、このTregの減少は観察されませんでした。 腫瘍微小環境では、腫瘍 1 グラムあたりの Treg 数の変化は、脾臓における Treg 頻度の変化と同じパターンに従いました。 しかし、静的に重要な変更を加えたのは FOLFOX だけでした。 以前の研究では、抗 PD-L1 と抗 CD47 の両方が腫瘍およびリンパ器官における Treg 機能を抑制し、Treg 数を減少させることができました 29,30。 私たちの研究では、それらの有益な効果は、抗CD47および抗PD-L1を化学療法剤との3剤併用療法で使用した場合にのみ観察されました。

我々は、治療計画の 1 つとして抗 CD47 を投与されたマウスの腫瘍微小環境において CD8+ T 細胞浸潤が有意に増加することを示しました。 最近の研究では、CD47/SIPR-α の遮断により、腫瘍微小環境における CD8+ T 細胞の頻度と機能が増加しました 30,31。 劉ら。 CD47 遮断において、抗腫瘍効果は DC 細胞による CD8+ T 細胞のクロスプライミングに依存することを報告しました 32。 現在の研究における腫瘍 1 グラムあたりの CD8+ T 細胞数の増加は、OXP と抗 CD47 を投与されたマウスの生存における利点が観察されなかったことを除いて、生存の利点と腫瘍サイズの減少の結果を裏付けています。 OXP および抗 CD47 は、脾臓および腫瘍微小環境における Treg 含有量を減少させることができませんでした。 この失敗が、この治療戦略では CD8+ T 細胞の増加にもかかわらず治療反応が見られなかった理由である可能性があります。

化学療法剤は、細胞毒性効果に加えて、GM-CSF、G-CSF、IL1β、IL6、CCL233,34 などの炎症性メディエーターの作用を通じて MDCS 頻度を増加させます。 また、腫瘍微小環境における腫瘍 1 グラムあたりの MDSC 数と M1/M2 比も分析します。 腫瘍 1 グラムあたりの MDSC 数は、OXP レジメンと FOLFOX レジメンの両方による単独療法後に増加しました。 併用療法に抗 CD47 を追加すると、MDSC の増加は逆転し、腫瘍 1 グラムあたりの MDSC 数が減少しました。 Wuらの研究と一致しています。 また、抗CD4735による治療後のMDSC集団の減少も報告した。 M2 マクロファージは、腫瘍増殖のための免疫抑制微小環境を提供することにより、がんの進行において重要な役割を果たしています 36。 張ら。 は、抗CD47治療後のM2マクロファージのM1への再分極を報告しました37。 レジメン治療を組み合わせて抗CD47を投与された3匹のマウスグループでの我々の研究では、M1/M2マクロファージ比が増加しました。

私たちの結果は、先天的および適応的チェックポイント阻害剤の両方を化学療法剤と組み合わせて使用​​するという概念を検証しました。 多数の研究に基づくと、さまざまな化学療法剤の中で、ICD 誘導能力を持つ化学療法剤は、チェックポイント阻害剤との併用療法に最も適しているようです。 すべてのがんではないにしても、少なくとも CT-26 腫瘍モデルでは、最良の治療反応を得るには CD47 軸と PD-L1 軸の両方を遮断することが必要であると思われます。

IgG 抗マウス CD47 および IgG 抗マウス PD-L1 遮断モノクローナル抗体 (それぞれクローン: MIAP301 および 10F.9G2) は、Bioxcell (NH、USA) から購入しました。 PerCP ラット抗マウス CD4 抗体 (RM4-5 クローン)、PE 標識ラット抗マウス CD8a 抗体 (53-6.7 クローン)、PE 標識ラット抗マウス CD25 抗体 (PC61 クローン)、Alexa-flour® 488 標識ラット抗マウス Foxp3 抗体 (MF-14 クローン)、Alexa Fluor® 488 抗マウス CD47(MIAP301)、PE 抗マウス CD274 (B7-H1、PD-L1) 抗体 (10F.9G2 クローン)、PerCPanti-mouse /ヒトCD11b抗体（M1/70クローン）、Alexa Fluor® 488抗マウスCD80抗体（16-10-A1クローン）、PE抗マウスCD206（MMR）抗体（C068C2クローン）、APC標識抗マウスCD45抗体(30F11 クローン)、NIR ゾンビ ダイ (生死判別用)、および適切なアイソタイプ コントロール抗体および True-Nuclear™ 転写因子バッファー セットは、Biolegend (カリフォルニア州、サンディエゴ) から購入しました。 コラゲナーゼ タイプ I は Gibco (ニューヨーク州、米国) から購入しました。 DNase タイプ I は Roche (USA) から購入しました。 残りの化学溶媒および試薬は化学グレードでした。

CD47 および PD-L1 の細胞表面発現に対する OXP および FOLFOX の効果を測定するために、CT-26 細胞株 (Pasture Institute、テヘラン、イラン) を 10% FBS Gibco (ニューヨーク州) を含む RPMI 1560 Gibco (ニューヨーク州、米国) で増殖させました。 、米国）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを6ウェルプレートに播種しました。 24 時間後、細胞を 50 μM OXP (イラン、テヘラン、ソボーン) または 50 μM OXP (イラン、テヘラン、ソボーン) と 10 μM 5-フルオロウラシル (FOLFOX レジメン) (イラン、テヘラン、アルハヴィ) のいずれかで処理しました。 インビトロ研究に使用された化学療法剤の濃度は、最大の ICD 誘導をもたらす以前の研究に基づいていました 1。 CT-26 腫瘍細胞を化学療法剤で処理してから 6 時間後、細胞を回収し、蛍光色素結合抗体で染色し、BD FACSlyric フローサイトメーター (Becton Dickinson、米国) を使用して CD47 および PD-L1 の細胞表面発現を分析しました。

生後 6 ～ 8 週齢の雌 BALB/c マウスをイラン、スランのパスツール研究所から購入し、適切な状態で飼育しました。 すべての動物実験は、関連するガイドラインと規制、および ARRIVE ガイドラインに従って実施されました。 この動物研究は、シャヒド・ベヘシュティ医科大学の施設内倫理委員会および研究諮問委員会によって倫理コード番号: IR で承認されました。 SBMU。 MSP.REC.1396.370。 詳細な腫瘍誘発手順は以前に説明されています 38,39。 簡単に説明すると、106 個の CT-26 腫瘍細胞を各 BALB/c マウスの右脇腹に注射しました。 腫瘍が 150 mm3 に達したとき、マウスは腫瘍の体積に基づいて次のように治療グループにランダムに割り当てられました: コントロール (プラセボを投与されたマウス)、OXP (オキサリプラチン、6 mg/kg を投与されたマウス)、FOLFOX (オキサリプラチン、6 mg を投与されたマウス) /kg + 5FU、50 mg/kg + フラビニン 90 mg/kg)、OXP + 抗 CD47 (マウスあたり 100 μg)、OXP + 抗 PD-L1 (マウスあたり 200 μg)、OXP + 抗 CD47 + 抗-PD-L1 および FOLFOX + 抗 CD47 + 抗 PD-L1。 OXP および FOLFOX レジメンに使用される用量とスケジュールは、ICD 誘導が最大で細胞毒性が最小である以前の研究に基づいています 1。 腫瘍が 150 mm3 に達した後（腫瘍接種後 7 日）、化学療法剤の注射を開始しました。 治療薬の注射の詳細なスケジュールを図３Ａに示す。 CT-26 腫瘍を有するマウスの腫瘍サイズを 3 日ごとにデジタル ノギスで測定し、腫瘍体積を a × b2/2 として計算しました。ここで、a は最大直径、b は最小直径です。 腫瘍サイズの測定は、腫瘍サイズが 2000 mm3 に達するまで継続されました。 各マウスのエンドポイント到達時間 (TTE)、腫瘍増殖遅延 (%TGD)、および寿命延長 (ILS) の詳細な計算は、以前の研究で説明されています 40,41。

腫瘍接種から 22 日後 (治療群では最後の注射から 7 日後)、各群から 3 匹のマウスをイソフルラン安楽死下で CO2 窒息により屠殺し、その流入リンパ節、脾臓、および腫瘍の免疫細胞集団を分析しました。 。 流入リンパ節および脾臓の場合、CD45+ 生細胞集団における Treg および CD8+/INF-γ+ T 細胞の頻度を分析しました。 単一細胞の分離には、70 µm セル ストレーナー (SPL、韓国) を使用し、フローサイトメトリーのすべての染色手順は製造元の指示に基づいています。 腫瘍分析のために、RPMI培地中の2 mg/mlコラゲナーゼI型および10 IU/ml DNase I型を用いて腫瘍を消化しました。 90 分間の消化後、70 μm セルストレーナーを使用して単一細胞を細胞懸濁液から分離しました。 インビボでのＣＤ４７およびＰＤ－Ｌ１の細胞表面発現に対するオキサリプラチンおよびＦＯＬＦＯＸの効果を分析するために、それらの発現をＣＤ４５－生細胞ゲートで分析した。 また、腫瘍微小環境における T reg、CD8+/INF-γ+ T 細胞、MDCS、および M1/M2 マクロファージの正確な集団も分析しました。 浸潤細胞の正確な数を定量化するために、腫瘍 1 グラムあたりの分離細胞数を計算しました。 生細胞のゲート内の各細胞集団の頻度を使用して、各細胞集団の頻度を腫瘍 1 グラムあたりの特定の細胞の数に変更することができました。 各細胞集団に使用されるゲーティング戦略は、対応する図にまとめられています。

統計分析は、GraphPad Prism ソフトウェア (カリフォルニア州、米国) を使用して実行されました。 2 つのグループの比較には、t 検定とマンホイットニー検定が使用されました。 複数のグループを比較するには、一元配置または二元配置の ANOVA 検定を使用しました。 すべての差異は、p < 0.05 (*p < 0.05、**p < 0.01) のレベルで統計的に有意であるとみなされました。 生存率の分析はマンテル-コックス検定で行われました。 p < 0.05 の値は統計的に有意であるとみなされました。

この研究の結果を裏付けるデータは、責任著者である Seyed Amir Jalali に電子メール ([email protected]) でリクエストすることで入手できます。

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この論文は、シャヒド・ベヘシュティ医科大学医学部のレザー・アリモハマディ氏が執筆した論文（登録番号：364）から抜粋したものです。 倫理委員会承認ID:IR. SBMU。 MSP.REC.1396.370。 この研究は、シャヒド ベヘシュティ医科大学 (助成金番号: 10244) の支援を受けました。

シャヒード・ベヘシュティ医科大学医学部免疫学科、テヘラン、198571-7443、イラン

レザ・アリモハマディ、エスマイル・モルタズ、ナリマン・モサファ、セイド・アミール・ジャラリ

ルクセンブルク保健研究所 (LIH) 腫瘍学部、腫瘍免疫療法および微小環境 (TIME) グループ、ルクセンブルク、ルクセンブルク市

ガンバー・マフムーディ・チャルバタニ

イラン、テヘラン医科大学医学部免疫学科

マスーメ・アリモハマディ

イラン、マシュハド医科大学マシュハド医科大学医科学部免疫学科

ハニヤ・ガッファリ・ナザリ

イラン、テヘランのタルビアト・モダレス大学医科学部免疫学科

アレゾウ・ラヒミ

JJP Biologics、ワルシャワ、ポーランド

ルイ・ビーン

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著者のRAとSAJがこの研究を企画した。 RA は多色フローサイトメトリー実験を設計し、実施しました。 RA、GMC、MA、HG、AR は、in vitro および in vivo 実験を実施しました。 RA、MA、AR が原稿を書きました。 RA、MA、EM、NM、LB、SAJ、AR が原稿を編集しました。 SAJはプロジェクトに資金を提供した。

シード・アミール・ジャラリへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

アリモハマディ R.、マフムーディ チャルバタニ G.、アリモハマディ M. 他 PD-L1 と CD47 の両方を二重に遮断すると、CT-26 マウス腫瘍モデルにおけるオキサリプラチンと FOLFOX の治療効果が高まります。 Sci Rep 13、2472 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-29363-9

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受信日: 2022 年 8 月 24 日

受理日: 2023 年 2 月 3 日

公開日: 2023 年 2 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29363-9

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