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Oct 21, 2023

トリグリセリド循環により、貯蔵された脂肪酸の修飾が可能になります

Metabolismo della natura, volume 5,

Nature Metabolism volume 5、pages 699–709 (2023)この記事を引用

9333 アクセス

2 引用

196 オルトメトリック

メトリクスの詳細

トリグリセリドのサイクリングは、細胞貯蔵におけるトリグリセリドの継続的な分解と再合成のプロセスです。 我々は、3T3-L1 脂肪細胞において、トリグリセリドが急速な代謝回転と脂肪酸の再配置を受け、推定半減期が 2 ～ 4 時間であることを示しました。 私たちは、トリグリセリドの無駄な基質サイクルを分子種分解能で直接研究するために、複数の脂肪酸の代謝を同時に定量的に追跡できる追跡技術を開発します。 私たちのアプローチは、アルキン脂肪酸トレーサーと質量分析に基づいています。 トリグリセリドの循環は、伸長と不飽和化による放出された脂肪酸の修飾に関連しています。 循環と修飾を通じて、飽和脂肪酸はゆっくりと一価不飽和脂肪酸に変換され、リノール酸はアラキドン酸に変換されます。 我々は、トリグリセリド循環により、貯蔵された脂肪酸が代謝変化を受けやすくなると結論付けています。 全体的なプロセスにより、細胞の変化するニーズを満たすために、貯蔵された脂肪酸プールに対する細胞の調整が容易になります。

トリグリセリド/脂肪酸 (TG/FA) サイクルは、貯蔵された脂肪が部分的または完全に分解されて遊離 FA を放出し、その後新しい TG 分子を再合成するために使用されるプロセスです。 一方で、これは全身レベルで起こる可能性があり、脂肪組織から放出された遊離FAが肝臓でTGに再エステル化され、貯蔵エネルギーの生体再分配につながります1。 一方で、生物学的物質の正味の合成を行わずにエネルギーを消費する典型的な「無駄な」基質サイクルとして、細胞内でも起こります2。 一般に、細胞内基質循環は概念的にも実験的にも科学的な課題です。 概念的な面では、基質サイクルの有益な効果がエネルギーコストを上回る可能性があるのか​​、それとも基質サイクルが複雑なネットワークの避けられない不完全性であるのかが問題となります。 TG/FA サイクルに関する初期の研究では、特にエネルギー消費量の急速な変化への適応におけるその制御的役割が強調されていました 3,4 一方で、サイクルのエネルギーコストは小さいと考えられていました 5。 しかし、近年では、このサイクルが脂肪組織における熱産生に実質的に寄与しているのではないかという考えから、このサイクルへの関心が高まっています6,7。 熱生成経路をより深く理解することは、エネルギー消費に影響を与える新しい戦略につながり、世界的な肥満のパンデミックとの戦いに役立つ可能性があります8,9。

実験技術の限界は、TG/FA サイクルをより深く理解する上での大きな障害となっています。 従来の同位体標識を使用する場合、サイクリング速度と経路を正確かつ直接決定することは代謝追跡にとって課題です。これは、遊離体と生成物がサイクリングの1ラウンド後にすでに区別できなくなる可能性があるためです（図1a）。 したがって、TG/FA サイクルを研究する既存の方法はかなり間接的です。 [3H]FA および [14C] グルコース取り込みの比率測定と、グリセロール放出の並行測定 10 または安定同位体を使用した同様の戦略 3 により、FA のエステル化および再エステル化の程度に関する情報が得られ、そこからサイクリングを少なくとも相対的に推定できます。 他の方法では、[2H]H2O または [18O]H2O 標識を使用します。 TG におけるこれらの同位体の濃縮により、TG11 の全合成と代謝回転に関する情報が得られました。 しかし、図1bに示すように、定義されたセルラーTGプール1がプール1のFAを再利用することによって新しいプール2を生成することを示す直接追跡実験は欠けています。 これには、標識された可能性のあるすべての TG 分子を包括的に多重並行追跡する標識実験が必要ですが、これは非常に大きな技術的課題です。 私たちは最近、クリックケミストリー レポーターと質量分析 (MS) を備えたアルキン標識 FA に基づく追跡技術を開発しました 12,13。 これは、TG/FA サイクルの研究に必要なすべての特徴、つまり高感度、明白な特異性、特に単一および多重標識脂質種の容易な識別を組み合わせています 12。

TG サイクリングは、TG 分子の永続的な分解とそれに伴う再合成で構成されます。 a、分解と再合成の概略図。 青い線はFAを表し、黒い水平線はグリセロール骨格を表します。 TG サイクリングには少なくとも DG への分解が含まれる必要がありますが、MG または遊離グリセロールへのさらなる分解が含まれる場合があります。 放出されたすべてのFAは、アシルCoAに活性化され、再アシル化に使用できる共通のプールに供給されると考えられています。 グリセロールは脂肪細胞内で再アシル化されず、培地中に放出されます。 b. サイクリングすると、複数の標識 FA を持つ TG (赤線) は、その標識を未標識 (青) プールと平衡化し、標識を多重標識種から単一標識種に移行します。 本研究で開発された専用技術を使用すると、このプロセスを時間の経過とともに分子分解能で追跡することができます。

以下では、この技術を適用して TG/FA サイクリングの直接的な証拠を提供し、サイクリングプロセスにおける TG の半減期を推定し、保存された FA プールの恒常性に TG サイクリングが必要であることを実証します。

従来の追跡実験では、単一標識物質をシステムに追加し、その代謝物を経時的に追跡し、標識代謝物を元の標識に明確に論理的に割り当てます。 しかし、脂肪細胞は、食品に由来する FA の多様な混合物にさらされており、保存されている TG 内で混合種を形成する長さと二重結合の数が広範囲に及びます。 TGの合成と代謝回転を追跡するには、同様に多様な異なるFAのセットをトレーサーとして使用する必要があり、その後、考えられる各代謝産物の標識を明確に同定する必要があります。 したがって、標識混合物の最大の複雑さは、分析上の識別の可能性によって制限されます。 わずか 3 つの化合物で広範囲の長さと不飽和度をカバーするために、飽和中鎖アルキン-FA、飽和長鎖アルキン-FA、および多価不飽和長鎖アルキン-FA (アルキン-PUFA) を組み合わせます。 同時トレース中に 3 つの FA を明確に区別するために、1 つの奇数番号と 1 つの偶数番号のアルキン FA を、さらに安定同位体標識を持つ 3 番目のアルキン FA と組み合わせて使用​​します。 前者の 2 つは、内因性の偶数番号の FA と代謝的に結合すると、それぞれ区別可能な奇数番号と偶数番号の代謝産物をもたらします。 3 番目のトレーサーの代謝物は、同位体標識によって簡単に識別できます。 したがって、奇数鎖培地FA 11:0;Y（図2a、アルキン脂質の命名法については、「方法」を参照）を偶数鎖アルキン-PUFA 18:2;Yおよび同位体標識飽和長鎖-チェーン FA 13C9-16:0;Y。 さらに、この 3 重のマルチラベリングを、以前に確立された 4 重のサンプル多重化戦略と組み合わせます 12。 これにより、時間とコストが節約され、データの比較可能性が向上し、その結果、標識された脂質種の包括的な定性的および定量的特性評価が可能になります (拡張データ図 1)。

a、ラベル付けに使用される FA;Y の構造。 b、3 つの異なる入力 FA;Y に対する脂質クラスごとの FA;Y の組み込み。 数値は、ウェルごとの脂質クラスごとの pmol です。 c、図1bに記載されているように、11/16/18の組み合わせで標識した場合の主要な脂質クラスに組み込まれたFA;Yの合計。 数値は、ウェルあたりのそれぞれの FA;Y の pmol です。 すべての値は平均±sd、n = 4です。

異なる FA;Y に由来する MS シグナルの分離を確立し、3 つの FA;Y の相互影響を研究するために、分化した 3T3-L1 脂肪細胞を 3 つの FA;Y で個別に、および可能なすべての組み合わせで標識しました (拡張データ図) . 2) 以下のように、「校正実験」と呼ばれます。 次に、8 つの標識の組み合わせにわたって同定された各種の分布パターンを分析し、種をそれぞれのアルキン FA に割り当てました。 この手順は、拡張データ図 3 でさらに詳細に図示および説明されています。キャリブレーション実験からの割り当ては、LipidXplorer 分子フラグメント クエリ言語 (mfql) 検索ファイルに変換され、割り当ての最大カバレッジに達するように最適化され、同時に除外されます。曖昧な種。 この戦略は、複数の標識された FA を含む多重標識種を含む他の脂質クラスを分析して割り当てるために拡張されました。 重要なことは、二重標識TG;Y2についても、シグナルのきれいな分離が達成されたことである(拡張データ図4)。 最終的な完全な分析では、ステロールエステル (CE)、セラミド (Cer)、ジグリセリド (DG)、ホスファチジン酸 (PA)、ホスファチジルコリン (PC)、ホスファチジルなど、FA 同化の定量的に関連する生成物を表す 8 つの脂質クラスがカバーされました。エタノールアミン (PE)、ホスファチジルイノシトール (PI)、TG。 この分析には、単一標識種と複数標識種の両方が含まれていました。 後者は、標識された TG;Yn にとって特に重要でした。 16 種類の標識内部標準の混合物により、pmol 量の定量が可能になりました。 必要な 131 個の mfql 検索ファイルを最適化した後、マルチラベル分析の実行時間は、サンプル数とハードウェアのパフォーマンスに応じてわずか 5 ～ 10 分でした。 キャリブレーション実験の場合、分析により 406 個の標識された脂質種が得られました。 標識された TG が優勢で、127 種の単一標識、128 種の二重標識、および 10 種の三重標識種があり、続いて標識 PC (46 種) および DG (40 種) でした。 3 つのアルキン FA 標識はすべてよく示されており、FA 11:0;Y では 121 種、FA 16:0;Y では 181 種、FA 18:2;Y では 179 種でした。 各サンプルは 4 重に多重化されているため、MS 機器で分析された 1 つのサンプルから最大 1,600 の標識種が得られ、それぞれが明確に同定および定量化されました。

3 つのアルキン FA (図 2a) はすべて、個別に適用されたか組み合わせて適用されたかに関係なく、同様の量で細胞内に取り込まれました (図 2b)。 これは、FA の取り込みとエステル化機構が実験では飽和していないことを示しています。 図 2b の定量的同定パターンで証明されているように、3 つの FA;Y の生成物をきれいに分離することは、その後の三重標識細胞内の標識分布の分析の前提条件です (図 2c)。 中鎖FA 11:0;YはTGおよびDGに対して明らかに優先的でしたが、2つの長鎖FA;Yはリン脂質と中性脂質の両方に見られました。 リン脂質内では、多価不飽和 FA 18:2;Y が飽和 FA 16:0;Y よりも豊富でした。 TG 内では、FA 11:0;Y は単一標識 TG を好みましたが、他の FA;Y は単一標識および二重標識 TG 種で同様に見つかりました。

新しい方法を使用して、3T3-L1 脂肪細胞の脂質代謝回転の時間分解分析を実行しました。 細胞を 3 つすべての入力 FA;Y (それぞれ 50 μM) で 1 時間標識し、その後 0、6、24、および 48 時間のチェイスタイムを設定しました。 追跡後、細胞脂質が抽出され、標識された種について分析されました。 同定された脂質の完全な定量化セットといくつかの注釈は、Excel 形式の補足データ 1 にあります。 主要な脂質クラスの標識の総量が決定されました (図 3)。 組み込まれた総FA;Yは、FA 16:0;Yでは経時的にほぼ一定でしたが、FA 18:2;Yでは中程度の増加を示しましたが、中鎖FA 11:0;Yでは大幅な減少を示しました（図3b） ）。

a, パルスチェイス実験の基本デザイン。 円は、分化した 3T3-L1 脂肪細胞を含む 24 ウェル プレートのウェルを表しています。 数字 11/16/18 は、50 μM で 1 時間使用した入力 FA;Y (図 2) の C カウントを指します。 インキュベーション後、培地を除去し、示された時間追跡培地と交換した。 その後、細胞を洗浄し、内部標準の存在下で脂質を抽出しました。 抽出された脂質は、右側に示されている C175-7x レポーター分子とクリック反応し、サンプルがプールされ、その後マルチプレックス MS1/MS2 によって分析されました。 同定された標識種を定量化し、合計し、合計 (b) および TG (c)、DG (d)、PA (e)、PC (f)、PE (g) および PI (h) について個別にチェイス タイムにわたってプロットしました。 ）。 パネル b ～ e には、単一標識種と複数標識種の合計が示されています。 PE (g) では、二重標識種は検出されませんでした。 PI (h) については、PI;Y2 内部標準がないために定量化できなかった二重標識種の非常に弱いシグナルがありました。 すべての値は平均±標準偏差、n = 11 ～ 12。 わかりやすくするために、シンボル サイズより小さいエラーバーは省略されています。

これらおよび次の数値には、元の FA;Y と、伸長、不飽和、または部分分解反応の考えられる代謝物が含まれることに注意してください。 脂肪細胞モデルで予想されたように、標識された FA のほとんどが TG に組み込まれました (図 3c)。 全体の損失と一致して、TG;Y 中の FA 11:0;Y も大幅な減少を示しましたが、TG;Y 中の長鎖 FA;Y の量は一定のまま (FA 16:0;Y) または増加しました。 (FA 18:2;Y) 追跡中。 この増加の約半分は全体の増加（図3b）によって説明でき、残りの大部分は標識されたDG（図3d）およびPC（図3f）からへのFA;Yのフラックスによって説明できます。 TGと表記されています。

次に、200 種を超える種の並行追跡によって 3 つの TG;Yn プール内の FA;Y の分布を分析しました。 追跡期間にわたって、単一標識されたTG;Y1種、特に長鎖FA;Yを含む種の大幅な増加が見つかりました（図4a）。同時に、二重標識および二重標識の3つのFA;Yすべての大幅な減少が見られました（図4a）。三重標識TG;Yn種（図4b、c）。 この挙動は、アルキン標識中性脂質を 73.1 m/z の中性損失 (NL) で視覚化した元のスペクトルでも直接見ることができます (拡張データ図 5)。 これらの減少の動態は、二重標識および三重標識された TG;Yn 種では異なりました。 6 時間後、初期 TG;Y3 の 36.5 ± 3.5% (図 4c) とは対照的に、初期 TG;Y2 の 46.7 ± 4.1% がまだ存在していました (図 4b)。 TG;Y3 の減少に関しては、3 つの入力 FA;Y の間に相対的な差はほとんどありませんでした。 TG;Y2 に関しては、中鎖 FA;Y の減少がわずかに速くなりました (6 時間後の残存量: FA 11:0;Y, 44.0%; FA 16:0;Y, 47.6%; FA 18:2;Y, 49.0 %) 2 つの長鎖トレーサーよりも優れています。 3つのFA;Yすべてについて、データはTG;Y1、TG;Y2およびTG;Y3に見られる総FA;Yの割合としてプロットされました（図4d）。 これらは、三重および二重標識種から単一標識の TG;Y1 への FA;Y の再分布を示しています。 TG サイクリングは、この観察に対する唯一の一貫した説明です。 最も単純なサイクルは、DG + FAを生成するTG加水分解とその後のTGへの再アシル化から構成されます（図4e）。 上の行は、1 時間の標識期間後の状況を示しています。 パルス標識中、入力 FA;Y (赤色) は TG 合成に使用される総 FA の大部分を占め、その結果、大部分の多重標識 TG 種が生成されます。 数字で見ると、標識されたTG;Ynプールには、パルスの終わりに94ピコモルのTG;Y3、1,017ピコモルのTG;Y2、および3,030ピコモルのTG;Y1が含まれており、上部の記号の上に黒の数字として示されています（図4e）。 。 さらに、同じサンプル中の未標識 TG のリピドミクスから得られるように、138,000 ± 7,000 pmol の内因性 TG の未標識プールが存在します。 理論的な二項平衡に続いて、1 つの完全な TG → DG → TG サイクルについてラベルの希釈を計算できます (青色の数字)。これにより、TG;Y2 の 55% 減少と TG;Y1 の 45% 増加が予測されます。これは、ほぼ次の値です。 6時間の追走タイムの状況。 図 4f は、データを表現する別の方法を示しています。 線は、TG プールの総 FA における FA;Y の割合の関数として、TG;Yn の 3 つのクラスにわたる総 FA;Y の理論的な二項分布を表します。 4 つの実験時点のそれぞれについて、二項分布に最もよく適合する x 軸に沿ったデータの位置を決定しました。 パルスのみの場合、合成された TG;Yn の合計における FA;Y の合計割合は 26% になります。 この数字は、標識期間中に、標識された FA;Y が、TG にアシル化されたすべての FA の 26% に寄与したことを示しています。 TG サイクルが存在しない場合、3 つの標識された TG;Yn 種の相対量は、時間が経っても一定のままになります。 しかし、実験データは、追跡時間が増加するにつれて、標識されたFA;Yが小さな元のプールから、12%、5%、および3.5%の標識含有量に対応する増加するプールサイズに広がることを示しています。 この循環希釈プロセスは、TG;Y3 が TG;Y2 よりも早く消失した理由も説明します。 TG 分解酵素が TG 種の三重結合の数を感知できない限り (これについては今のところ示唆されていません)、TG;Y2 と TG;Y3 は両方とも同じ速度で分解されるでしょう。 分解速度における明らかな違いは、DG;Y1 および DG;Y2 からそれぞれ TG;Y2 および TG;Y3 への再アシル化の統計の違いによるものです。 定量的に、これらのデータは、6 時間の追跡時間が約 1.5 t1/2 に相当することを示し、t1/2 が約 4 時間であることを示唆しています。 次に、観察されたサイクリングが特定のFAラベルの組み合わせに依存するかどうか、そしてアルキンラベル自体がサイクリング現象の原因である可能性があるかどうかを尋ねました（図4g–j）。 したがって、上記のようにパルスチェイス実験を実行しましたが、異なるFAの組み合わせ、つまりFA 11:0;Y / 16:0;Y / 18:2;Y（図4g）またはFA 16:0を使用しました。 ;Y/18:2;Y/19:1;Y（図4i）。 FA 19:1;Y は以前に肝細胞で使用されており 12、13 、オレイン酸の優れた類似体です。 後者のFAの組み合わせは、鎖長と二重結合数に関して研究中の細胞の天然FA組成をよく模倣しています（図1に示す標識実験の平均C原子と二重結合数の詳細な分析については、補足表1を参照してください） .4g–j）。 両方のFAの組み合わせからのデータの比較（図4g、i）は、サイクリングが中鎖FAの存在とは無関係であり、非常に類似した動態で起こることを示しています。 これらの実験はより高い速度論的時間分解能を持ち、前の実験の速度論を確認することに注意してください。 また、アルキン標識 FA ではなく同位体標識 FA を使用して、同様のパルスチェイス実験を実行しました。 組み合わせはFA 11:0[D3]/16:0[13C16]/18:2[13C18]（図4h）およびFA 16:0[13C16]/18:2[13C18]/19:1[D8]でした。 (図4j)。 同位体標識にはアルキントレーサーの特徴である優れた分析感度と特異性が欠けているため、同位体標識サンプルの分析は困難を伴います。 例として、拡張データ図を示します。 図６および７は、図４ｇ、ｈの実験からの一次スペクトルの比較を示す。 アルキン標識された TG 種は、大部分の未標識物質から十分に分離されており (拡張データ図 6a、b)、詳しく調べると、主要な標識種が主要な内因性種と同じであることが示されています (補足スペクトル 1 の注釈付きスペクトルを参照)。 対照的に、同位体標識された TG が m/z 700 ～ 900 の密集領域の一部になることは避けられません (拡張データ図 7a)。 少なくとも、主要な標識されたＴＧ ４３：１のピークは混合物中で直接識別できたが、他の種は視覚的に識別できなかった。 アルキン標識種の NL73 検索に相当する検索は、同位体標識種には存在しませんが、標識 FA 11:0[D3] を含む TG は、その FA の消失に対する NL 検索を使用して特定できます。アンモニア、つまり NL m/z 206.2。 このような分析が実行され (拡張データ図 7b)、妥当なスペクトルが得られました。 次に、同等の LipidXplorer 検索アルゴリズムを使用して、標識された TG を同定および定量しました。 他の同位体標識された FA についても、対応する検索が実行されました。 これは必要な特異性を達成するために必要ですが、アルキン標識種の均一な定量化とは対照的に、同位体標識された TG の各グループが異なるニュートラルロスによって定量化されることを意味し、データに定量的な偏りが生じる可能性があります。 最後に、単一、二重、三重標識TGの計算に十分な105の同位体標識TG種（対270のアルキン標識TG種）を特定することができました（図4h、j）。 これらのデータは、同位体およびアルキンで標識された種について、TG サイクリングが同じように、同等の反応速度で起こることを示しました。

a – c、パルスチェイス実験における単一標識（a）、二重標識（b）および三重標識（c）TG;Ynにおける3つの入力FA;Yの量の時間経過。 d、TG;Ynの標識クラスにわたる総FA;Yの相対パーセンテージ分布。 e, TG サイクリングと、単一標識プールと多重標識プール間の標識分布に対するその効果の図。 黒の数字は、パネル a ～ d のデータから導出された時点 0 でのそれぞれの分子形態の pmol であり、3 つすべての FA;Y の合計を表します。 非標識 TG;Y0 の量も同じサンプルで測定しました。 青色の数字は、TG 脱アシル化とその後の確率的再アシル化の 1 サイクルの予測値です。 この計算ではサイクル中の個別のステップが想定されていますが、分解と再合成は同時に行われるため、実際にはそうではありません。 f、曲線は、TG;Y1、TG;Y2、およびTG;Y3のプール内の理論的に計算された二項標識分布を、すべてのFA（非標識および標識;TG分子あたり3つ）のFA;Yの割合の関数として示します。 TG;Yn の合計プール。 記号は実験により得られた測定値です。 記号の位置と対応する数字 3.5%、5%、12%、26% は、計算された曲線に対する測定データの最適な適合点を示します。 すべての測定データ値は、変動を補償するために、TG;Y の合計 FA;Y に対して正規化されました。 g – k、パネル d のようなデータ表現を使用して、別のパルスチェイス実験での TG サイクリングが比較されます。 すべての実験は、24 時間という短い最大追跡時間と、2 時間および 4 時間という短い最小追跡時間で実行されました。 FA 標識の組み合わせは、アルキン (g) または同位体標識 (h) を使用した FA 11:0/16:0/18:2、およびアルキン (i) または同位体標識 (j) を使用した 16:0/18:2/19:1 です。パネルに示されているように。 すべてのデータは平均±sd、n = 11〜12（g〜j、n = 4）です。 わかりやすくするために、シンボル サイズより小さいエラーバーは省略されています。

次に、脂質種レベルに進んで分析を深めました。 FA 18:2;Yで標識した後のTG;Y1種の分析（図5a）は、この脂質クラス内では、いくつかの種は比較的一定であり（図5a、白矢印）、その他の種は（図5a、黒矢印）であることを示しました。 ）は、一般的な傾向よりも強く増加しました（図5a、合計）。

a、FA 18:2で標識したときのTG;Y1種の相対存在量の時間経過;Y。 パルスチェイス実験のすべての TG;Y1 種の相対量が色分けされて表示されます。 各行は 1 つの種を表します。 b、追跡時間 48 時間における 1 種の MS2 分析 (白矢印)。 m/z 1,025.8 の前駆体ピークは省略されています。 4 つの一連のフラグメント ピークは、FA 組成 16:1_18:1_18:2;Y を示します。 c、追跡時間 48 時間における 1 種の MS2 分析 (黒矢印)。 m/z 1,021.8 の前駆体ピークは省略されています。 3 つの一連のフラグメント ピークは、FA 組成 16:1_16:1_20:4;Y を示します。 b と c では、実際に組み込まれた FA;Y がピーク質量から直接特定され、赤色で印刷されていることに注意してください。 a では、数値は色の強度 (データ ブロック全体の最小値と最大値) によってエンコードされ、平均値から導出されます (n = 12)。この実験の詳細な統計データは補足表 2 に示されています。

MS2分析により、定常種（図5b）は、FA 18:2;Yとともに未標識FA16:1および18:1を含むTG 52:4;Yとして同定された。 対照的に、増加している種（図5c）は、2つの未標識FA 16:1と1つの標識FA 20:4;Yを含むTG 52:6;Yとして同定され、伸長および伸長による標識FA;Y自体の代謝を示しています。彩度の低下。 これは、元のスペクトルデータ（FA 20:4;Yの拡張データ図8およびFA 18:2;Yの拡張データ図9）の直接検索および詳細な統計分析（補足表2）によって確認されました。 したがって、専用の LipidXplorer mfql ファイルを使用して、すべての単一標識 TG;Y1 種の MS2 スペクトルを系統的に検索し、代謝的に処理された FA;Y を調べました。これらはすべて明確に同定され、定量化されました。 TG;Y1 が選択された理由は、(1) そのスペクトルに FA;Y1 のアイデンティティに関する最も明確な情報が含まれていること、および (2) 特に後の追跡時間に標識物質の大部分が含まれていることです。 両方の FA 組み合わせ、11:0;Y/16:0;Y/18:2;Y および 16:0;Y/18:2;Y/19:1;Y からのデータを分析しました。 TG;Y1の全体のパーセンテージに正規化された結果は、両方のFAの組み合わせで最も強い修飾が多価不飽和FA 18:2;Yで発生し（図6a、b）、これが伸長および不飽和化されてFA 18を与えたことを示しました。 :3;Y、FA 20:3;Y および FA 20:4;Y が最も著名な製品として挙げられます。 飽和FA 16:0;Yは、主に不飽和化と伸長によってわずかに少なく修飾され（図6c、d）、FA 16:1;YおよびFA 18:1;Yが生じました。 FA 11:0;Yは部分的に分解され、FA 7:0;Yおよび9:0;Yが得られ、FA 13:0;Yおよび15:0;Yに部分的に伸長されました（図6e）。 FA 19:1;Y は部分的に FA 17:1;Y に分解され、ごくわずかですが FA 21:1;Y にも伸長しました。 一般に、修飾は FA 組み合わせ 16:0;Y/18:2;Y/19:1;Y でより強く、この実験では全体的な TG サイクルの高速化と相関していました (拡張データ図 10b、c)。

3T3-L1 細胞は、FA 組み合わせ 11:0;Y/16:0;Y/18:2;Y (a,c,e) または 16:0;Y/18:2;Y/19:1 で標識されました。 ; Y (b、d、f) を 1 時間、その後、示されているように 6 時間から 48 時間の間の追跡期間が続きます。 図5b、cに示すFAフラグメントのピークは、すべての単一標識TG;Y1種で検出、同定、定量されました。 図は、4 つの時点における各代謝産物の割合を示しています。 FA 18:2;Yの代謝物をパネルaおよびbに、FA 16:0;Yの代謝物をパネルcおよびdに、FA 11:0;Yの代謝物をパネルeに、19:1;Yの代謝物をパネルfに示します。 すべての数値は、合計 TG​​;Y1 の変化を補償するために、それぞれのチェイス時間における TG;Y1 のそれぞれの FA;Y の合計に正規化されます。 縦座標は、入力 FA;Y の減少とその代謝物の増加を 1 つのパネルに示すために分割されています。 すべての数値は平均±標準偏差、n = 11 ～ 12。 わかりやすくするために、シンボル サイズより小さいエラーバーは省略されています。

観察された二重結合と鎖長の増加は TG;Y1 に限定されませんでした。 リン脂質では、MS2 中で標識された FA;Y フラグメントを放出しないため、リン脂質では FA 18:2;Y から FA 20:4;Y への変換を TG のように直接追跡することはできません。 それでも、側鎖 C 原子と二重結合の数は、3 つの主要なリン脂質クラスで着実に増加し、両方の FA 組み合わせでチェイスタイムが増加しました (拡張データ図 10a)。 この発見は、TG;Y1 における FA 20:4;Y の増加が、PC;Y1 プールから遊離された FA 20:4;Y によって促進される可能性を除外します。

最後に、マウスの初代白色脂肪細胞と褐色脂肪細胞でパルスチェイス実験を実行しました。 どちらの系でも、3T3-L1 脂肪細胞で見られる速度と同等の速度で TG サイクリングが明らかに存在しました (図 7、黒い三角)。 30 µM の CPT1 阻害剤 teglicar14 を使用してベータ酸化を部分的に阻害すると、その半値阻害濃度 (IC50) 値は 40 µM と決定されました (参考文献 15)。その結果、サイクリング速度が明らかに増加しました (図 7、青色)。正方形）両方の脂肪細胞タイプで。 この観察は、サイクリングには TG の最初の切断と TG 分子の再合成の両方が必要であるという考えと一致しています。 ただし、最初に放出された FA がベータ酸化によって分解されると、標識されていない DG からあまり標識されていない TG;Y1 が生成され、その結果、見かけの効率とサイクリング速度が低下します。

a、b、白色脂肪細胞（a）および褐色脂肪細胞（b）をFA組み合わせ16:0;Y/18:2;Y/19:1;Yで1時間標識し、その後6時間から48時間の追跡期間を設けました。 h、示されているとおり。 これらの図は、TG;Y1、TG;Y2、および TG;Y3 プールにわたる 3 つの FA;Y の合計の分布を示しており、TG;Yn プール全体の FA;Y の総量に正規化されています。 すべての値は平均±標準偏差、n = 4 (追跡時間 0 時間の場合は n = 12) です。 青色の記号は追跡期間中に CPT1 阻害剤であるテグリカルが存在することを示し、黒色はその非存在を示します。

適切な方法がなかったため、TG サイクリングの詳細かつ定量的な分析はこれまで不可能でした。 このプロジェクトのために開発されたマルチラベル多重トレース手法により、ここで紹介するような研究が可能になりました。 3 つのアルキン FA トレーサー (奇数/偶数 FA;Y と 1 つの同位体標識 FA;Y) を使用した標識識別に採用された戦略は、内因性の奇数 FA のかなりのバックグラウンドを持つ脂肪細胞の困難な系でもうまく機能しました16。 奇数の FA;Y と偶数の FA;Y の間で 7 個の炭素の長さのかなりの違いがあることが、標識された種の識別に役立つことが判明しました。 3 番目の FA;Y の 13C9 標識により、他の 2 つの FA;Y との関連する干渉が排除されました。 さらに困難な生物学的システムの場合、または将来の 4 番目のトレーサーの追加の場合、たとえば一価不飽和 FA;Y に D 原子をいくつか組み込むことによる他の同位体標識 FA;Y の調製は、興味深い選択肢となるでしょう。 重要なのは、私たちの方法論は特定の FA の組み合わせや細胞タイプに限定されないことです。 この研究の 11:0/16:0/18:2 および 16:0/18:2/19:1 トレーサーとは別に、12:0/16:0/19:1 の組み合わせのテストにも成功しました。脂肪細胞、および新たに単離された肝細胞におけるこれらすべての組み合わせ。

3T3-L1 脂肪細胞における TG サイクリングの直接的な実証により、いくつかの議論の余地が生まれました。 1 つ目は、データによって他の説明が可能になるかどうかです。 これは基本的に否定できます。 重要な議論は、FA 16:0;Y および FA 18:2;Y の両方の追跡の最初の 6 時間以内に、単一標識 TG;Y1 の大幅な増加が見られるという観察から得られます。 この増加を説明できる唯一の情報源は、二重および三重標識種からの標識の放出です。 例として FA 16:0;Y を使用すると、TG;Y1 の標識が 461 pmol 増加し、それに対応して TG;Y2 および TG;Y3 が 449 pmol 減少します。 対照的に、他のすべての脂質クラスの減少全体は合計 99 pmol に達しますが、TG;Y1 の増加を説明するには十分ではありません。 18:2;Y の対応する数値は、TG;Y1 が 468 pmol 増加し、TG;Y2 と TG;Y3 が合わせて 360 pmol 減少し、他のすべての脂質クラスが 56 pmol 減少したことを示しています。 繰り返しますが、数字は、TG;Y1 の増加の 76% が TG;Y2 および TG;Y3 に由来していることを示しており、これは定義上 TG サイクリングです。

2 番目の点は、TG サイクリングの経路に関するものです。 絶対的な最小値は、図示されているTG / DGサイクルです（図1および4e）が、モノアシルグリセロール（MG）または遊離グリセロールへのさらなる分解を伴う、より長いサイクルも存在する可能性があります。 実際、脂肪組織によるグリセロール放出は TG 加水分解の古典的な指標であり 17、TG サイクリングを推定するために使用されました 3。 3T3-L1 細胞と初代脂肪細胞の両方に関する最近の研究では、遊離されたグリセロールも解糖に由来する可能性があることが示され 18,19 、グリセロールの放出が TG 加水分解の定量的指標であるという考えに疑問を呈しています。 現時点では、我々のデータでは TG サイクルの考えられる形態を区別することができず、関与する酵素活性の正体も示すことができません。 データが二項ラベル分布によく一致するという事実は、プロセスの確率的性質を示しています。 より深い機構情報を得るには、候補酵素に対する阻害剤および遺伝子除去研究とともに、より短い追跡期間でのより多くのデータが必要です。 このようなデータは、TG;Yn だけでなく、ラベル付けされた DG;Yn、MG;Y、PA;Y、および PC;Y も含める必要がある数学的モデリングに入力する必要があります。

議論する価値のある 3 番目の点は、サイクルの速度とエネルギーコストです。 TG;Y3 の分解から、TG/DG サイクルにおける TG の半減期は 4 時間と推定できます。 この速度では、サイクル反応の位置特異性の問題を無視すると、TG の各 FA は 1 日に 1 回回転し、1 日あたり 1 ATP のエネルギーコストがかかります。 パルミチン酸分子あたりの正味エネルギー含量が 106 ATP であるため、3T3-L1 脂肪細胞における TG の貯蔵には 1 日あたりそのエネルギー含量の約 1% のコストがかかります。 これは、脂肪組織に移される場合には大きな数であると思われる。なぜなら、50kgの脂肪蓄積がTGサイクルだけで1日当たり0.5kgの割合で縮小することを意味するからである。 関連する代謝反応の一部が液滴表面で発生するため、より大きな脂肪滴を含む白色脂肪組織では、通常直径 5 ～ 10 μm の液滴を含む 3T3-L1 細胞よりも TG サイクルの発生率が低いと考えられます。 。

最後に、静的ストレージよりもサイクリングすることの生物学的利点の問題について議論する必要があります。 基質サイクルに関する古典的な教科書の議論は、一方向に作用する単一の酵素よりも、一対の拮抗酵素の調節の振幅を増大させることによって調節の柔軟性が向上するというものである。 身体活動終了後の TG 消費量の減少の大部分は、エステル加水分解の減少ではなく、再エステル化の増加に起因すると考えられるため、これは TG サイクリングにも当てはまると考えられます 3。 さらなる機能は、白色脂肪組織におけるUCP1非依存性の熱産生にある可能性がある20,21。

私たちのデータは、3 番目の重要な側面、つまり TG に保存されている FA プールの構成を示しています。 データは、3 つの標識 FA のそれぞれが特定の運命を持っていることを示しています。取り込まれた中鎖 FA 11:0;Y の 82% の大部分が、おそらく優先酸化により 48 時間以内に細胞から失われます。 残りの約 10% は主に伸長と不飽和によって修飾され、FA 15:1;Y および 17:1;Y が得られました。 48 時間後も、元の FA 11:0;Y の 16% だけがまだ存在していました。 同じ時間後、100 ± 13% のアルキンパルミチン酸 16:0;Y が依然として存在し、その 88% が元の形で残っていました。 修飾により、大部分が不飽和化された FA 16:1;Y および 18:1;Y が生成されました。 PUFA 18:2;Y では、物質の重大な損失は見られませんでした。 元の FA の約 20 ～ 30% が修飾され、そのほとんどはアラキドン酸とその前駆体に相当する FA 20:3;Y および 20:4;Y に修飾されました。 要約すると、これらのデータは、(1) 中鎖脂肪酸の素早いクリアランス、(2) 飽和脂肪酸のゆっくりとした不飽和化によるパルミトレイン酸とオレイン酸の等価物生成、(3) リノール酸等価物のアラキドン酸への代謝を示しています。 3 つのプロセスはすべて、細胞または生物にとって潜在的に有益です。 中鎖FAは膜構成成分としては役に立たない、あるいは潜在的に危険ですらあります。 それらを除去すると潜在的な問題が解消され、長鎖一価不飽和FAへの変換により有用な膜構成要素が提供されます。 パルミチン酸は豊富な食品成分ですが、脂質中のパルミチン酸濃度が高いと、いくつかの悪条件と相関関係があります22。 有益な一価不飽和FAへのゆっくりとした脱飽和は、保存されたTGにおけるパルミチン酸塩の蓄積の危険性を軽減し、保存された脂肪の動員時に放出されたパルミチン酸塩の悪影響を防ぐであろう。 アラキドン酸は、膜脂質代謝回転において独特の酵素を有する重要な FA であり 23,24 、炎症シグナル伝達におけるエイコサノイドの前駆体として重要な役割を果たします。 マウスを使った多くの実験研究や乳児の栄養におけるアラキドン酸の絶対必要量によって証明されているように、アラキドン酸のレベルを維持することは哺乳類の生命にとって重要です25。 哺乳類における豊富なリノール酸のアラキドン酸への変換は、肝細胞で活発な複雑な多段階のプロセスです26。 私たちのデータは、脂肪組織がその過程で他の臓器をサポートしている可能性があることを示唆しています。

TG サイクリングが存在しない場合、観察されたすべての FA 修飾または分解経路は基質として遊離 FA のコエンザイム A エステル (FA-CoA) を必要とするため、3 つの FA;Y はすべて、TG に組み込まれた後も完全に未修飾のままになります。 したがって、進行中のFA修飾には、TGサイクリング経路におけるアシル-CoAシンテターゼによるFAの再活性化と併せて、TGからFAを繰り返し放出する必要がある。 同じ論理が、例えば過酸化による損傷を受けた FA の TG プールからの除去にも当てはまります。 静的プールでは、損傷した物質が蓄積します。 TG サイクリングにより、損傷した FA にアクセスしてその後の分解が可能になります。 要約すると、私たちの実験は、脂肪細胞に保存されたFAプールの組成を監視および維持するためのTGサイクリングの重要な機能を強調しています。

通常の脂質二重結合とアルキンラベル末端三重結合との混同を避けるため、三重結合をFAの官能基化として扱い、接尾辞「;Y」を付けて示します。 これは、最新の更新では三重結合を示すシステムをまだ備えていない LipidMaps 命名法 27 の戦略に従っています 28。 ここで使用される命名法は、LipidMaps 命名法の最新の更新に参加した関心のある科学者のグループと議論され、合意されました。また、私たちの最近の出版物でもすでに使用されています。 Y により、略語内で三重結合が表示され、略語内の二重結合の正しい数が維持されます。 これにより、18 個の C 原子と 2 つの二重結合を持つ末端アルキン-FA の FA 18:2;Y が得られ、この研究ではリノール酸相当物として使用されます。 これにより、三重結合による官能基化とリノール酸との生化学的同等性の両方が容易に得られます。 脂質クラスの場合、接尾辞 Y も使用します。つまり、PC;Y および TG;Y は、それぞれアルキン FA (FA;Y) を含むホスファチジルコリンとトリアシルグリセロールを示します。 したがって、1 つの二重標識 TG 分子内に 2 つの FA;Y が存在すると TG;Y2 が得られ、三重標識分子内に 3 つの FA;Y が存在すると TG;Y3 が得られます。 グリセロ脂質の種名では、二重結合番号の隣に「Y」が付けられます。たとえば、TG 52:3;Y は、FA 18:2;Y で標識されることが非常に多い生成物です。 したがって、TG;Y 内の他の FA の正体がわかっていれば、その分子は TG 18:2;Y_16:0_18:1 になる可能性があり、位置がわかっていれば TG 16:0/18:2;Y/ になる可能性があります。 18:1。

FA 11:0;Y は TCI Germany から入手し、FA 18:2;Y は記載どおりに合成しました 29。 FA 19:1[D8]は、臭化カルボキシオクチル-トリフェニルホスホニウムとデカナール[D8]の間のWittig反応によって合成されました。 後者は、CH3OD中で重水素ガスとウィルキンソン触媒を用いた重水素化によってデカテトラエナール30から調製されました。 13C9-FA 16:0;Y は、多段階の化学合成で得られました。 簡単に説明すると、市販の U-13C 標識混合 FA メチル エステルを、メタセシス触媒としてのニトロ-グレラの存在下で、シス-1,4-ジアセトキシ-2-ブテンと反応させました。 得られた混合物から、１３Ｃ９−１１−アセトキシウンデカ−９−エン酸メチルエステルを精製した。 二重結合は H2/Pd で還元され、アセチルエステルはメタノール中の HCl で切断されました。 得られた１３Ｃ９ １１－ヒドロキシウンデカン酸メチルエステルを精製し、ジクロロメタン中のクロロクロム酸ピリジニウムで酸化して、対応するアルデヒド、１１－オキソウンデカン酸メチルエステルにした。 これを、ジオキソラニルプロピルトリフェニルホスホニウムブロミドから得たウィッティヒ試薬と結合させた。 得られた二重結合を H2/Pd で還元しました。 末端アルデヒドの保護基を湿潤アセトン中のトルエンスルホン酸で除去して、13C9-15-オキソ-ペンタデカン酸メチルエステルを得た。 最終末端三重結合は、Bestmann-Ohira試薬との反応によって導入され、メチルエステルはテトラヒドロフラン/水中のKOHで切断され、約100 mgの最終生成物を得た。 ＭＳ分析により、純度が約８７％であることが示された。 主な不純物は、13C10-17:0;Y および 13C12-19:0;Y がそれぞれ 4 ～ 5% です。 これらの不純物は、おそらく最初のメタセシス反応における二重結合の移動に由来すると考えられますが、それらに起因する MS ピークは 13C9-16:0;Y を含むものと容易に区別できるため、分析を妨げません。

内部標準は、以前の研究 12,31 で使用されたものであり、TG;Y3、PA;Y2、PC;Y2、および PE;Y2 を監視するための追加標準を加えました。 各サンプルに、内部標準を含む混合物を添加しました (組成と量については、補足表 3 を参照)。 各脂質クラスの内部標準は、それぞれのクラスの異なる存在量を考慮して、異なる量で供給されます。 目的は、同じ脂質クラスのサンプル強度の典型的な範囲にある標準強度を持つことです。

3T3-L1 前脂肪細胞 (ATCC CL-173) を増殖培地 (DMEM 4.5 g l-1 グルコース、10% FCS プラス ペニシリン/ストレプトマイシン) で培養し、48 ウェル プレートに播種し、1 μM の添加により 24 時間後に分化を誘導しました。ロシグリタゾン、10 μg ml-1 インスリン、10 μM デキサメタゾンおよび 0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチンを 3 日間添加し、その後インスリンのみを含む増殖培地で 2 ～ 4 日間培養し、培地を 2 日ごとに交換します。 分化は、位相差顕微鏡で目に見える脂肪滴の出現によって定期的に監視されました。

マウスはボン生命医科学研究所の動物施設で維持および飼育されました。 マウスには標準的な齧歯動物の餌と水を自由に摂取させた。 動物は、23 ± 1 °C で 12:12 の明暗サイクルで飼育されました。 すべての動物実験はドイツの動物福祉法に従って実施されました。 動物実験は、Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen, Germany, 81-02.04.2021.A166 によって許可されました。 初代脂肪細胞は、8 ～ 12 週齢の C57BL/6 マウスから単離されました。 2 ～ 3 匹の異なるマウスから採取した鼠径部白色脂肪組織および肩甲骨間褐色脂肪組織を、0.5% BSA およびコラゲナーゼ NB46 を含む DMEM (Invitrogen) 中で 37 °C で消化し、1,000 rpm で 10 分間遠心分離しました。 得られたペレットを再懸濁し、100μmセルストレーナーを使用して濾過した。 濾過した溶液を、10% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシンおよび 1% アムホテリシン B (白色脂肪細胞 (WA) 増殖培地) を補充した DMEM 中の T175 培養フラスコに播種し、37 °C および 5% CO2 で維持しました。 播種から 24 時間後、細胞を PBS で洗浄し、WA 増殖培地で 37 °C、5% CO2 で維持しました。 細胞がコンフルエントに達するまで培地を一日おきに交換し、その後細胞を凍結保存した。

細胞を、増殖培地中の48ウェルプレートにウェル当たり20,000細胞の密度でプレーティングした。 細胞を増殖培地中でコンフルエントになるまで増殖させた。 コンフルエントになったら、培地を WA 誘導培地 (5% FBS、1% P/S、1 nM T3、0.172 μM インスリン、50 mg ml-を含む DMEM) に変更することで、48 時間 (0 日目から +2 日目) 前脂肪細胞を誘導しました。 1 l-アスコルビン酸、1 mM d-ビオチン、17 mM パントテン酸、1 μM ロシグリタゾン、0.25 μM デキサメタゾンおよび 0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン）。 +2日目から+12日目まで、細胞をWA維持培地（5％FBS、1％P/S、1nM T3、0.172μMインスリン、50mg ml-1 l-アスコルビン酸塩、1mM d-を含むDMEM）中で維持した。ビオチン、17 mM パントテン酸)、一日おきにリフレッシュします。 細胞は+12日目の実験に使用されました。

キャリブレーション実験では、培養培地を、図の凡例に示すように、それぞれ 50 μM 濃度の FA;Y を含む増殖培地に 1 時間置き換えました。 培地を除去し、その後細胞を洗浄し、さらなる分析のために脂質を抽出した。 パルスチェイス実験では、図の凡例に示すように、細胞を 3 つの FA;Y または重同位体標識 FA のそれぞれ 50 μM を含む増殖培地で 1 時間標識しました。 培地を除去し、細胞を一度洗浄した後、脂質抽出および分析用に処理するか（チェイスなし）、または示されているチェイス時間だけ新鮮な増殖培地を添加しました。 追跡後、培地を除去し、細胞を洗浄し、抽出および分析のために処理しました。

マルチウェルディッシュ上の細胞を、温かい培地で１回、氷冷ＰＢＳで１回、そして１５５ｍＭ酢酸アンモニウムで素早く１回洗浄し、最後の洗浄後に液体をできるだけ完全に除去するように注意した。 各ウェルに、抽出混合物 500 μl (MeOH/CHCl3 5:1 490 μl、アルキン標識標準脂質および TG の非アルキン内部標準 (TG 50:1[D4]) を含む内部標準混合 10 μl) を加えます。上に示した溶液を加え、プレート全体をバス超音波処理器で１分間超音波処理した。 細胞残存物を含む抽出物を1.5mlの元のエッペンドルフチューブに集め、20,000gで5分間遠心分離してタンパク質をペレット化した。 上清を新しいチューブに移した。 400μlのCHCl3および600μlの1% AcOH水溶液を添加した後、サンプルを30秒間振盪し、20,000gで5分間遠心分離した。 上相を除去し、下相を新しいチューブに移し、スピード真空中で45℃で20分間乾燥させた。 CHCl3 (8 μl) を加え、チューブを軽くボルテックスしました。 各チューブに、クリックミックス 40 μl を加えました（50% MeOH 中の 100 mM C175-7x 10 μl（アリコートとして -80 °C で保存）と AcCN 中の 5 mM Cu(I)AcCN4BF4 200 μl を混合することによって調製されました）および800μlのエタノール)、続いて5分間超音波処理し、40℃で16時間インキュベートした。

C175-7x でクリックしたサンプルに、サンプルあたり 100 μl の CHCl3 を加え、多重サンプルをプールしました。 プールに600μlの水を加え、プールを軽く振盪し、20,000gで2分間遠心分離した。 上相を除去し、下相を上記と同様にスピード真空で乾燥させた。 スプレーバッファー (2-プロパノール/メタノール/水 8:5:1 + 10 mM 酢酸アンモニウム) (200 ～ 1,000 μl) を加え、チューブを 5 分間超音波処理し、溶解した脂質を MS で分析しました。

質量スペクトルは、Tune 機器制御ソフトウェアの制御下でシリンジ ポンプによって駆動されるハミルトン シリンジからの直接注入を使用して、標準加熱エレクトロスプレー イオン化 (HESI) イオン源を備えた Thermo Q-Exactive Plus 分光計で記録されました。 デッドボリュームを最小限に抑えるために、チューブを接続せずにシリンジポートを HESI ソースに直接接続しました。 サンプルは、次のパラメーターを使用してスプレーバッファー中 10 μl min-1 の流量でスプレーされました: シースガス 6、補助ガス 2、スイープガス 0、ガス加熱オフ、スプレー電圧ポジティブモード 4.1 kV、イオン移動キャピラリー温度 280 ° C.

MS1 スペクトルは、m/z 300 ～ 1,400 の間の m/z 100 のウィンドウを使用したセグメント化スキャンとして 1.2 分間記録し、続いて m/z 305.373 ～ 1,400.119 の包含リストを使用して、データに依存しない取得によって MS2 スペクトルを 19 分間記録しました。 z 1.0006 間隔、それぞれの質量での脂質の典型的な質量欠陥に適応します。 MS1 スキャンの一般的なスキャン パラメーターは次のとおりです。自動ゲイン制御ターゲット 3 × 106、最大イオン時間 800 ミリ秒、分解能 280,000、ピーク モード セントロイド。 MS2 スキャンの場合: 自動ゲイン制御ターゲット 2 × 105、最大イオン時間 700 ミリ秒、分解能 280,000、スペクトル多重化なし、動的最初の質量、分離ウィンドウ m/z 0.4、段階的正規化衝突エネルギー 10、35、40、スペクトル データ タイプ セントロイド。 さらに、二重荷電種の 2 回目のスキャンは、m/z 300 ～ 700 のスキャン範囲で実行され、MS2 スキャンは m/z 0.5002 の間隔で m/z 300.8052 ～ 700.0648 まで、分離ウィンドウは m/z で行われました。 0.4。 三重荷電種 (TG;Y3 および PC;Y2) は、m/z 0.3 の分離ウィンドウで FA;Y のすべての理論的組み合わせを含むターゲット包含リストを使用してスキャンされました。

MSConvert を使用して RAW ファイルを .mzml ファイルに変換し、LipidXplorer32 を使用して分析しました。 標識脂質の同定と定量のために、特徴的なニュートラルロスと組み合わせた標識脂質クラスの予想質量に対応するピークの存在によって種を同定する mfql ファイルが作成されました。 詳細と例については、補足情報と参考資料を参照してください。 12. 1 回の完全な検索には、単一電荷種の 44 個の mfql ファイル、二重電荷種の 69 個、および三重電荷種の 18 個の mfql ファイルが含まれていました。 TG;Y 種における FA 修飾の検索には、別の 20 mfql ファイルのセットを使用しました。 その後のデータ処理は、標準的な MS Excel 計算を使用して行われました。

実際のパルスチェイス実験は、FA;Y の代わりに重同位体標識 FA を使用したことを除いて、アルキン標識 FA について上記で説明したのとまったく同じ方法で実行されました。 脂質抽出物は、クリック反応や多重化を行わずに、MS1/MS2 によって直接分析されました。 すべての同位体標識 TG について、MS1 のアンモニウム付加物の未フラグメント質量と MS2 の同位体標識 FA とアンモニアの結合ニュートラルロスの組み合わせによって TG を特定する mfql 検索アルゴリズムが作成されました。 これらの MS2 ピークは、内部標準 TG 50:1[D4] の対応する MS2 フラグメントと比較した定量化にも使用されました。 FA 組み合わせ 11:0[D3]/16:0[13C16]/18:2[13C18] の場合、検索には 40 ～ 56 個の C 原子の単一および二重標識種が含まれ、FA 16:0[13C16] の場合は検索に含まれます。 ]/18:2[13C18]/19:1[D8]、48 ～ 57 個の C 原子の種。 三重標識種は、個別のターゲット検索ファイルを使用して特定されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

一次 MS データ .raw ファイル、LipidXplorer インポート .sc ファイル、および Excel 計算シートは、論文の公開日から、公的にアクセス可能なアーカイブ (https://doi.org/10.22000/925) で入手できます。 注釈付きの LipidXplorer 出力ファイルには、図と図を生じさせる時間分解実験のすべての一次識別、生の強度、および pmol 計算が含まれています。 3、4a ～ f および 6a、c、e は補足データ 1 として提出されます。

この出版物で使用されている検索アルゴリズムを含む LipidXplorer .mfql 検索ファイルは、論文の発行日から、公的にアクセス可能なアーカイブ (https://doi.org/10.22000/925) で入手できます。

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この研究は、Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG、ドイツ研究財団) によって資金提供されました。プロジェクト ID: SFB 1454 プロジェクト番号 432325352、TH 780/4-1 マルチパラレル脂質トレース、TH 780/5-1 SPP 2306 フェロプトースから CT。 KU 2374/3-1 から LK; ドイツのエクセレンス戦略（EXC2151）による助成金番号 390873048 コネチカット州へ

ドイツ、ボン、ボン大学、LIMES 生命医科学研究所

クラウス・ワンダーリング、エレナ・ズルコヴィッチ、ファビアン・ジンク、ラース・キュルシュナー、クリストフ・ティーレ

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KW、JZ、FZ は実験を設計、実行し、データを分析しました。 LK は図をデザインし、原稿の構成とテキストの執筆に貢献しました。 CT はプロジェクトを概念化し、化学合成を実行し、mfql コードを作成し、データを分析し、図を設計し、テキストを作成しました。

クリストフ・ティーレへの手紙。

ボン大学 (所有者) と CT (発明者) は、この出版物の方法論の中核であるアルキン脂質 MS トレース技術の主要部分をカバーする特許 (EP3587382、米国特許出願 17/254,922) を申請しました。

Nature Metabolism は、この研究の査読に対する Guanghou Shui、Douglas Mashek、Zheng Ouyang の貢献に感謝します。 主な取り扱い編集者: Isabella Samuelson、Nature Metabolism チームと協力。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

この例は、多重化サンプルからの FA 13C9-16:0;Y を含む TG 50:2;Y1 です。 関連する C175-7x 試薬の 1 つによる個々のサンプルのクリック反応後 (Thiele et al., 2019)、プールされたサンプルを m/z 1010.92 の前駆体ピークの MS2 によって分析しました。 この共通の前駆体は、4 つの同位体トリアルキルアミンの中性損失によって断片化され、m/z 937.83 で一連のピークが得られます。 脱離による脂肪酸の追加の中性損失により、m/z 683.61 および 655.58 の 2 つのピークシリーズが生じます。 937.83 の系列との差により、TG 分子内の 2 つの未標識 FA が特定されます。 研究中の TG 分子に 2 つの同一の未標識 FA が含まれている場合、この質量範囲では 1 つのピーク系列のみが見られます (例として図 5b、c を参照)。 挿入図は、73、75、76、および 77 Da のトリアルキルアミン損失によって生成される典型的な多重ピーク構造を示しており、これにより多重プール内の個々のサンプルへの明確な割り当てが可能になります。 m/z 363.34 の一連のピークは、TG 分子から遊離 FA として放出された 73.09 のニュートラルロス後のクリック反応した FA;Y のシグナルです。 このピーク系列には、元の入力 FA;Y が未変化の形で TG 合成に使用されたか、または伸長、不飽和、または部分的な分解などの事前の変更が加えられたかどうかの情報が含まれています。

円は、分化した 3T3-L1 脂肪細胞を含む 24 ウェル プレートのウェルを表しています。 番号 11/16/18 は、50 μM で 2 時間使用した上記の入力 FA;Y を指します。 インキュベーション後、培地を除去し、細胞を洗浄し、内部標準の存在下で脂質を抽出しました。 抽出された脂質は、右に示されている C175-7x レポーター分子とクリック反応しました。 反応後、1 つのプールに入力は同一だが異なるクリック レポーターを持つ 4 つの多重複製が含まれるようにサンプルをプールし、MS1 および MS2 で分析し、続いて LipidXplorer (Herzog et al., 2011) ソフトウェアを使用してデータ処理しました。

この図は、FA 鎖の 35 ～ 58 炭素 (#C) の FA 11:0;Y または FA 18:2;Y を含むすべての標識された TG;Y1 種を、pmol (a) または相対量 (b) とともに示しています。エンコードされた。 各行は 1 つの種を表します。 最初のステップでは、各種が FA 11:0;Y (たとえば 1 →) または FA 18:2;Y (2 →) または混合パターン (3 →) の予想される典型的な標識パターンを示すかどうかを分析しました。 2 番目のステップでは、種がそれぞれの入力 FA;Y に割り当てられるか、または割り当てられませんでした (c)。 三重標識サンプルから得られたこれらの割り当ての pmol 量は右下に合計されており、標識物質の約 95% が割り当てられていることを示しています。 当初の予想に反して、多数の偶数番号の種が FA 11:0;Y に割り当てられ、多数の奇数番号の種が FA 18:2;Y に割り当てられたことに注意してください。 その理由は、3T3-L1 脂肪細胞では内因性の奇数番号の FA が比較的豊富に存在し、主に 15:0、15:1、17:0、および 17:1 であるためです (Crown et al., 2015)。 数値は、平均値から導出された色の強度 (データ ブロックごとの最小値と最大値) によってエンコードされます (n = 4)。

100 個の二重標識 TG;Y2 のピコモル量 (左) と相対量 (右) が示されています。各ブロック AF は種検索アルゴリズムの FA;Y の 1 つの組み合わせを表し、各列は入力 FA;Y の 1 つの組み合わせを表します。トップ。 各行は 1 つの定義された TG;Y2 種を表します。 数値は、平均値から導出された色の強度 (データ ブロックごとの最小値と最大値) によってエンコードされます (n = 4)。

4 つのスペクトルはニュートラルロス m/z 73.1 スペクトルで、パネルに示されているパルス時間とチェイス時間について C175-73 で標識された中性脂質を示します。 上のパネルでは、TG;Y1、TG;Y2、および TG;Y3 のピークを含むスペクトル領域が黒いバーで示されています。 TG;Y3 および TG;Y2 の信号が徐々に減少し、同時に TG;Y1 が増加していることに注意してください。 TG;Y1 内では、FA 11:0;Y を含む種の選択的損失が明らかに見られます。

3T3-L1 細胞をアルキン FA (11:0;Y、16:0;Y、18:2;Y、それぞれ 50 μM) で 1 時間標識し、脂質抽出物を C175-7x 試薬でクリックしました。 MS2 スペクトルを記録し、Themo Xcalibur ソフトウェアのイオン マップ機能を使用してフラグメンテーション スペクトルを再構築しました。 パネル a は、ニュートラルロス 0 Da の MS2 スペクトルです。 これらの実験では、断片化は 3 つの異なるエネルギーで発生し、そのうち最も低いエネルギーでは断片化が発生しません。 したがって、すべての MS2 スペクトルには、フラグメント化されていない前駆体イオンの強いピーク (NL 0 ピーク) が含まれています。 主要な内因性非標識種は青色で、アルキン標識種は赤色で標識されています。 事実上、パネル a は合計 MS1 スペクトルです。 パネル b は、アルキン標識された中性脂質が C175-73 にクリックされたことを示すニュートラルロス m/z 73.1 スペクトルです。 パネル c は、FA 11:0;Y を含む TG;Y1 に特異的な、[FA 11:0;Y + (C175-73) – NL 73.1] であるフラグメント m/z 284.23 の前駆体イオン スペクトルを示します。

3T3-L1 細胞を重同位体標識 FA (11:0、16:0、18:2、それぞれ 50 μM) で 1 時間標識し、脂質を抽出しました。 スペクトルを記録し、Themo Xcalibur ソフトウェアのイオン マップ機能を使用して、フラグメンテーション スペクトルを再構築しました。 パネル a は、ニュートラルロス 0 Da の MS2 スペクトルで、全 MS1 スペクトルに相当します。 パネル b は、FA 11:0[D3] を含む TG に特異的な、FA 11:0[D3] + NH3 であるフラグメント m/z 206.2 のニュートラルロススペクトルを示しています。 コメント: 拡張データ図 7 の同位体標識データが、対応する拡張データ図 6 のクリック標識の品質に達していないことは明らかです。同位体標識の標識ピークは背景に消える傾向があり、パネル b の NL スペクトルの強度は、実際には同じ情報を 4 回含む多重サンプルであるにもかかわらず、対応する拡張データ図 6c の NL スペクトルの強度の 12 % にすぎません (m/z NL 75.1、76.1、および77.1）。 さらに、拡張データ図 7b のデータは、単一標識種だけでなく、FA 11:0[D3] とそれ自体および他の標識種のすべての組み合わせも含まれているため、拡張データ図 6c のデータよりも複雑です。標識された脂肪酸。 対照的に、拡張データ図 6c は、二重標識種と三重標識種が異なるスペクトル範囲にあり、異なる断片化優先性を示すため、FA 11:0;Y を含む TG;Y1 のきれいなスペクトルです。

パルスチェイス実験のサンプルからの生の MS2 スペクトルで、TG;Y1 における FA 20:4;Y の存在の特徴であるフラグメント m/z 398.28、許容誤差 0.01 Da を検索しました。 パネルは、結果として生じる前駆体イオンのスペクトルを示しています。 すべてが最大強度に対して同じスケールでプロットされています。 主な種は次のとおりです: TG 52:6;Y at m/z 1021.8、TG 52:5;Y at m/z 1023.8、TG 54:6;Y at m/z 1049.8、TG 54:5;Y m/z 1051.8 。

パルスチェイス実験のサンプルからの生の MS2 スペクトルで、TG;Y1 における FA 18:2;Y の存在の特徴であるフラグメント m/z 374.27、許容誤差 0.01 Da を検索しました。 パネルは、結果として生じる前駆体イオンのスペクトルを示しています。 すべてが最大強度に対して同じスケールでプロットされています。 主な種は次のとおりです: TG 50:4;Y at m/z 997.8、TG 50:3;Y at m/z 999.8、TG 50:2;Y at m/z 1001.8、TG 52:4;Y at m/z 1025.8、TG 52:3;Y at m/z 1027.8。

分化した 3T3-L1 脂肪細胞を、示されているように FA の組み合わせで 1 時間標識し、その後、示されているように追跡期間を設けました。 細胞を洗浄し、脂質を抽出し、C175-7x レポーターとクリック反応させ、多重化 MS1/MS2 によって分析しました。 a、FA 鎖内に 2 ～ 5 個の二重結合 (# db) および 34 ～ 38 個の C 原子 (# C) を含む標識種の存在量を計算し、18:2;Y 標識脂質の合計に対するパーセントとして表します。それぞれのリン脂質クラスの。 数値は、平均値から導出された色の強度によってエンコードされています。n = 12。 b、c、TG;Yn のラベル付きクラスにわたる合計 FA;Y の相対パーセント分布。 データは平均です。 +/- 標準偏差、n = 11-12。 パネル b のデータは図 4d のデータと同じであることに注意してください。

補足表 1 ～ 3、スペクトル 1 および方法。

図 3 および図 1、2、3 の一部のソース データを含む、処理および注釈付きの質量分析データ ファイル。 4、5、6。

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転載と許可

Wunderling, K.、Zurkovic, J.、Zink, F. 他トリグリセリドの循環により、貯蔵された脂肪酸の修飾が可能になります。 Nat Metab 5、699–709 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42255-023-00769-z

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受信日: 2022 年 4 月 13 日

受理日: 2023 年 2 月 27 日

公開日: 2023 年 4 月 3 日

発行日：2023年4月

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00769-z

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自然代謝 (2023)