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Oct 20, 2023

TRPV3

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 6、記事番号: 88 (2023) この記事を引用

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35 オルトメトリック

メトリクスの詳細

一過性受容体電位バニロイド 3 (TRPV3) は、TRP イオン チャネル スーパー ファミリーに属し、カルシウム透過性の高い非選択的カチオン チャネルとして機能します。 このチャネルは皮膚のケラチノサイトで強く発現され、温感、かゆみ、創傷治癒、およびいくつかのサイトカインの分泌に関与しています。 これまでの研究では、カルシウム活性化塩素チャネルであるアノクタミン1 (ANO1) が、TRPV1、TRPV4、またはTRPA1を介したカルシウム流入によって活性化されること、およびこれらのチャネル相互作用がTRPチャネル媒介の生理学的機能にとって重要であることが示されている。 私たちは、ANO1 が正常なヒト表皮角化細胞 (NHEK) によって発現されていることを発見しました。 我々は、NHEK およびマウス皮膚ケラチノサイトの TRPV3 活性化時に ANO1 が電流を媒介することを観察しました。 in vitro 創傷治癒アッセイを使用して、TRPV3 ブロッカー、ANO1 ブロッカー、または低塩化物培地のいずれかが、p38 リン酸化を介して細胞の移動と増殖を阻害し、細胞周期停止につながることを観察しました。 これらの結果は、ANO1 活性による塩化物流入がケラチノサイトによる創傷治癒を促進することを示しました。

一過性受容体電位 (TRP) チャネルは、哺乳動物の 6 つの関連タンパク質ファミリーで構成されています。 これらのファミリーには、TRPA (アンキリン)、TRPC (標準)、TRPM (メラスタチン)、TRPML (ムコリピン)、TRPP (ポリシスチン)、および TRPV (バニロイド) が含まれます。 ほとんどは非選択性陽イオンチャネルであり、カルシウムに対する透過性が高くなります1。 脈絡叢上皮細胞では、TRPV4 を介したカルシウムの流入により、アノクタミン 1 (ANO1 または TMEM16A) と呼ばれるカルシウム活性化塩素チャネル (CaCC) が活性化され、脳脊髄液の分泌につながると考えられています 2。 他の上皮細胞も、TRPV4 チャネルと ANO1 チャネルの両方を持つことが報告されています。 たとえば、これらのイオンチャネルは唾液腺房細胞と涙腺腺房細胞の両方によって共発現されており、唾液と涙の分泌はTRPV4とANO13の間の機能的相互作用によって促進される可能性があります。 したがって、各 TRP チャネルが独立して機能する場合でも、TRP チャネル/ANO1 複合体は異なる機能を持ちます。 結果として、TRP チャネルと ANO1 が同じ細胞によって共発現される場合、それらの相互作用を研究せずにチャネル機能を研究することはできません。

TRPV3 は温感受性 TRP チャネルであり、カルシウムの透過性はナトリウムの約 10 倍です4。 TRPV3 は全身で発現していると報告されていますが、その生理学的重要性は十分に理解されていません。 以前の研究では、TRPV3 がケラチノサイトのかゆみ、温感、創傷治癒に寄与していることが示されました 5、6、7、8、9。 さらに、上皮成長因子受容体の下流の細胞シグナル伝達によって強化された TRPV3 活性化は、口腔表皮細胞における温熱依存性の創傷治癒を促進します5。 皮膚ケラチノサイトでは、以前の研究で、TRPV3 が EGFR 依存性シグナル伝達経路を介して細胞増殖に寄与していることが示されました 5、6、7、8、9。

皮膚の創傷治癒は、細胞の遊走と細胞の増殖に依存します。 一部の成長因子とインターロイキンは創傷治癒に関与していますが9,10、ケラチノサイトの原形質膜上のイオンチャネルも重要である可能性があります。 たとえば、Ano1 は癌腫関連遺伝子であると報告されており 11,12、最近の研究では、ANO1 が前立腺肥大症における前立腺上皮細胞の増殖 13 およびケラチノサイトの特殊な細胞株である HaCaT 細胞の増殖に関与していることが明らかになりました 14。 さらに、ANO1 阻害により、一部のがん細胞における細胞遊走が減少しました 12、15、16。 しかし、多くの上皮細胞が ANO1 を発現しているにもかかわらず、正常な皮膚ケラチノサイトにおける ANO1 の生理学的機能は明らかではありません 17。 今回我々は、ANO1が正常なヒトケラチノサイトで発現されており、これらのチャネルが創傷治癒に関与していることを示す。 この研究は、正常なケラチノサイトにおける細胞遊走と増殖における ANO1 の重要性を示しています。

NHEK における TRP チャネルおよび ANO の内因性遺伝子発現レベルは不明です。 発現パターンを明らかにするために、培養NHEKのRT-PCR分析を実行しました（図1aおよび補足図11）。 以前の報告では、TRPV1、TRPV3、TRPV4、TRPV6 タンパク質がケラチノサイトで発現していることが示唆されています 18。 ここでは、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPV6、ANO1、ANO4、ANO9、およびANO10のmRNAを観察しました（図1aおよび補足図11）。 ANO2 は CaCC としても機能しますが、予測された分子量をもつ個別のバンドは NHEK では検出されませんでした。 対照的に、ANO1 タンパク質の発現はウェスタンブロッティングによって観察されました (図 1b)。 さらに、NHEK 細胞で高い細胞内カルシウム濃度 (500 nM の遊離カルシウム) を使用すると、電流は、ステップパルス中の遅い活性化速度論と、保持電位に戻ったときの遅い不活性化速度論、および ANO119 の特徴的な特性である外側への整流を示しました (補足) .図1）。 これらの結果は、NHEK における ANO1 の有意な発現を示唆しました。 さらに、TRP チャネルの機能発現を調査するために、Fura-2 を使用したカルシウムイメージング実験を実行しました。 カンファー (10 mM、TRPV3 アゴニスト) および GSK1016790A (300 nM、TRPV4 アゴニスト) はすべての細胞で細胞内カルシウムの増加を明らかに誘導しましたが、カプサイシン (300 nM ～ 3 μM、TRPV1 アゴニスト)、メントール (100 μM、TRPM8 アゴニスト) )、イソチオシアン酸アリル (AITC、100 μM または 1 mM、TRPA1 アゴニスト)、プロベネシド (100 μM、TRPV2 アゴニスト)、または 1-オレオイル-アセチル-sn-グリセロール (OAG、90 μM、TRPC6 アゴニスト) は生成しませんでした。明確な応答 (図 1c および補足図 2)。

NHEK における TRP および ANO の RT-PCR。 トリミングされていないゲル画像は、付録に示されています。 図 11. b NHEK における ANO1 のウェスタンブロット。 ANO1 の予測バンド サイズは 114 kDa です。 c、d NHEKのカルシウムイメージング。 Cam Camphor、TRPV3 アゴニスト。 GSK GSK1016790A、TRPV4 アゴニスト。 Ca2+ (−) カルシウムを含まない浴液。 e 電流と電圧の関係の比較。 赤い線は、標準バスとピペット溶液を使用した NHEK の基礎電流の電流と電圧の関係を示しています。 青い線は、標準バス溶液と NMDG-Cl ピペット溶液を使用した TRPV6 発現 HEK293T 細胞における電流と電圧の関係を示しています。 保持電位は-60 mVで、ランプパルスは-100から+100 mVまで5秒ごとに300ミリ秒の期間印加されました。

TRPV6を発現する細胞では細胞外カルシウムが除去されると細胞内カルシウム濃度が低下すると考えられるため、カルシウムを含まない細胞外培地を用いたカルシウムイメージング実験も行いました。TRPV6は恒常的に活性である可能性があります。 しかし、細胞内カルシウム濃度は、細胞外カルシウムの存在下でも非存在下でも差はありませんでした（図1d）。 さらに、NHEKでは、内向き整流を伴う典型的なTRPV6媒介電流は観察されませんでした（図1e）。 これらの発見に基づいて、我々は、TPRV6 が NHEK では機能的に発現していないと結論付けました。 これらの結果は、NHEK において最も活性な TRP チャネルが TRPV3 と TRPV4 であることを示しました。 しかし、RT-PCR 実験では他の TRP チャネルの発現が示唆されました。 したがって、ANO1 は、これらのイオンチャネルを共発現する細胞における TRPV3 または TRPV4 を介したカルシウム流入によって活性化される可能性があります。 したがって、TRPV3 と ANO1 の相互作用は文献で注目されていなかったため、この研究では TRPV3 と ANO1 の相互作用に焦点を当てることにしました。

TRPV3とANO1を異種発現するHEK293T細胞を用いて全細胞パッチクランプ実験を行い、それらの機能的相互作用を調査しました。 NMDG は陽イオンチャネルの細孔に浸透しないことが知られているため、NMDG-Cl バスおよびピペット溶液を使用して ANO1 を通る塩化物電流を特定しました。 以前の報告では、他の TRPV3 アゴニストである 2-APB およびカルバクロールが ANO1 電流を阻害することが示されていたため、TRPV3 アゴニストとしてカンフルを使用しました 20。 これらの条件下では、ヒトTRPV3（hTRPV3）とヒトANO1（hANO1）の両方を発現する細胞では塩化物電流が明確に観察されましたが、hTRPV3またはhANO1を単独で発現する細胞では観察されませんでした（図2a、b）。 この電流は、hTRPV3 を介して細胞に入るカルシウムによって活性化された hANO1 を通過する塩化物電流であると解釈されました。 この電流は、比較的速いカルシウムキレート剤である細胞内 1,2-ビス (o-アミノフェノキシ) エタン-N,N,N',N'-四酢酸 (BAPTA) (5 mM) を使用しても観察されました。 カルシウムは高濃度の BAPTA の存在下で急速にキレート化されるため、カルシウム濃度の増加はカルシウム チャネルの近傍でのみ発生します 21。 したがって、TRPV3-ANO1 相互作用は局所的なカルシウム ナノドメインで発生する可能性があります。 以前の研究では、TRPV1とTRPV4の両方がANO12、3、22と物理的に相互作用することが示唆されていたため、HEK293T細胞からの抽出物を使用した抗ANO1抗体および抗TRPV3抗体を使用した免疫沈降およびウェスタンブロッティング実験を実行しました（図2cおよび補足図11）。 。 TRPV3 および ANO1 タンパク質は、両方のタンパク質を発現する細胞では免疫共沈降しましたが、hANO1 cDNA、hTRPV3 cDNA、または pcDNA3.1 プラスミドのみをトランスフェクトした細胞からの抽出物には TRPV3 バンドは存在せず、hTRPV3 と hANO1 の物理的相互作用が示されました。 これらの結果は、異種発現系における hTRPV3 と hANO1 の間の機能的および物理的相互作用を示唆しました。

a hTRPV3 と hANO1 の両方、hANO1 単独、または hTRPV3 単独を発現する HEK293T 細胞におけるカンファー誘導電流の代表的なトレース。 すべてのデータは、NMDG-Cl バスとピペット溶液を使用して収集されました。 ピペット溶液中の遊離カルシウムは 100 nM でした。 保持電位は-60 mVで、ランプパルスは-100から+100 mVまで5秒ごとに300ミリ秒の期間印加されました。 b -60 mVでの（A）のピーク電流の比較（平均±SEM、N = 6）。 統計的有意性はマンホイットニー検定で決定されました。 c TRPV3およびANO1 cDNA、Ano1単独、TRPV4単独、またはpcDNA3.1をトランスフェクトしたHEK293T細胞におけるANO1またはTRPV3の免疫沈降およびTRPV3のウェスタンブロット。 トリミングされていないゲル画像は、付録に示されています。 図11。

樟脳を適用すると、すべてのNHEKで細胞内カルシウムの増加が観察されました（図1c）。 したがって、NHEK で全細胞パッチクランプ実験を実行しました。 樟脳によって誘導される塩化物電流が、148 mM 塩化物を含む浴溶液中で観察されました（図3a）。 細胞外塩素濃度が 4 mM に変化すると、塩素電流の逆転電位は正の電位にシフトしました (図 3b、c)。 この結果は、塩化物が樟脳誘導電流の主要なイオンキャリアであることを示しました。 さらに、カンファー誘導性の細胞内カルシウム増加に対する細胞内カルシウム貯蔵の寄与を評価するために、カルシウムフリーバス溶液中でカルシウムイメージングを実行しました（図3d）。 カルシウムを含まない浴溶液では細胞内カルシウム濃度の増加が小さかったため、小胞体からのカルシウムの放出は、NHEK の細胞内カルシウム濃度の増加に大きな寄与はしませんでした。 この解釈は、細胞外カルシウムを含まない溶液中での樟脳誘発電流が非常に小さかったパッチクランプ実験で確認されました（図3e）。 したがって、NHEK における ANO1 を通る TRPV3 アゴニスト誘発性塩化物電流は、主に細胞外領域からの TRPV3 を通るカルシウム流入に依存します。 さらに、TPRV4が樟脳誘導電流に寄与しているかどうかを調べたところ、10 mM樟脳はhTRPV4を活性化せず、TRPV4の選択的阻害剤であるHC067047はNHEKにおける10 mM樟脳誘導電流を抑制しないことが判明した（Suppl.図3）。 これにより、カンファーが非特異的に TPRV4 を活性化する可能性が排除され、TRPV3 の関与がさらに明らかになりました。 カンファー誘導性の塩化物電流は、強力なANO1阻害剤であるAni9（図3f）とTRPV3阻害剤であるジクロニンの両方によって阻害されました23、24（補足図4）。 さらに、樟脳誘導電流は、外向き整流特性とステップパルス後の遅い回復を備えた正電位での遅い活性化反応速度を示し、データはANO1チャネルと一致しました18（補足図5）。 これらの結果は、NHEK における TRPV3-ANO1 相互作用をさらに裏付けています。

a、b 148 mM 塩化物を含む NMDG-Cl 浴溶液 (a) または 4 mM 塩化物を含む NMDG-アスパラギン酸浴溶液 (b) を使用した、NHEK のカンファー誘導電流の代表的な痕跡。 ピペット溶液には、140 mM NMDG-Cl および 100 nM 遊離カルシウムが含まれていました。 保持電位は-60 mVで、ランプパルスは-100から+100 mVまで5秒ごとに300ミリ秒の期間印加されました。 c (a、b) の矢印の部分の電流の電流と電圧の関係の比較。 d (Ca2+ (-)) 細胞外カルシウムを使用した場合と使用しない場合の樟脳適用時の NHEK のカルシウムイメージング。 e 2 mM（Ca2+（+））または細胞外カルシウムなし（Ca2+（-））のNMDG-Clバス溶液における-60 mVでのカンファー誘発ピーク電流の比較（平均±SEM、N = 5）。 統計的有意性はマンホイットニー検定で決定されました。 f 148 mM 塩化物を含む NMDG-Cl 浴溶液を使用した、ANO1 阻害剤 Ani9 によるカンファー誘導電流。

TRPV3-ANO1相互作用をさらに確認するために、WTおよびTRPV3-/-マウスの尾皮膚ケラチノサイトを使用してパッチクランプ実験を実行しました。 WTケラチノサイトではカンフル誘発性の大きな塩化物電流が観察されましたが、NMDG /塩化物ピペットおよびバス溶液中のTRPV3欠損ケラチノサイトではそのような電流は決して観察されませんでした（図4a〜c）。 さらに、カンファー誘導電流は Ani9 によって阻害されました (図 4d)。 これらのデータは、TRPV3-ANO1 相互作用を明らかに裏付けています。

a、b WT (a) および TRPV3-/- (b) マウスから単離された初代ケラチノサイトにおける 10 mM カンファー誘導電流の代表的な痕跡。 すべての記録は、標準的な NMDG-Cl バスおよびピペット溶液 (ピペット内に 100 nM の遊離カルシウムを含む) を使用して実行されました。 保持電位は-60 mVで、ランプパルスは-100から+100 mVまで3秒ごとに300ミリ秒間印加されました。 c 電流と電圧の関係の比較。 Ｎは、ＷＴ（黒色）の場合は５、ＴＲＰＶ３−／−（灰色）ケラチノサイトの場合は４に等しい。 エラーバーはSEMを示します。 d +60および-60 mVでのWT（黒色）およびTRPV3-/-（灰色）ケラチノサイトにおけるカンファー誘導電流の密度の比較（平均±SEM）。 統計的有意性はマンホイットニー検定で決定されました。 e WTケラチノサイトにおけるAni9阻害による10 mMカンファー誘導電流の代表的なトレース。 WT ケラチノサイトにおける Ani9 阻害による 10 mM カンファー誘導電流の代表的なトレース。 保持電位は-60 mVで、ランプパルスは-100から+100 mVまで3秒ごとに300ミリ秒間印加されました。

以前の研究では、TRPV3 がかゆみや温感、ケラチノサイトによる創傷治癒に寄与していることが示されています 5、6、7、8。 TRPV3 の活性化が口腔内の創傷治癒を促進することが強く示唆されています 5。 さらに、口腔の基本的な組織学的特性は、体内の他の粘膜と比較して皮膚の特性と類似しています25。 さらに、ANO1 は出生後の組織発達に関与している可能性があり 26、がん細胞の遊走と増殖の正の制御因子であることがよく知られています 11、12、15、16。 したがって、我々は、TRPV3-ANO1相互作用がNHEKの移動および/または増殖、および創傷治癒のプロセスに影響を与える可能性があると仮説を立てました。

創傷治癒における ANO1 の関与を調査するために、別の ANO1 ブロッカーである T16Ainh-A01 (T16A) の効果を分析しました。 この評価には、細胞活性を定量化するための培養インサートが組み込まれています (図 5)。 これらの実験では、NHEK を培養インサート内でほぼ 100% コンフルエントになるまで培養し、細胞が細胞クラスター間の空間に移動しました 27 (図 5a)。 NHEK は通常、インサートが除去されてから約 12 時間、インサートによって分離された領域であるオープンスペースに移動しました。 このようにして、移動と増殖が 24 時間以内にその地域を 80% 以上満たしました。 細胞の移動および/または増殖は、TRPV3 の選択的阻害剤であるジクロニンによって有意に阻害されましたが (補足図 6)、TRPV4 の選択的阻害剤である HC067047 によっては阻害されませんでした (補足図 7)。 さらに、T16A（5μM）含有培地中での細胞遊走および/または増殖は、ANO1タンパク質レベルに影響を与えることなく明らかに阻害されました（図5b、cおよび補足図8、11）。 重要なのは、T16A のウォッシュアウト後に阻害が失われたことです。 これらの観察は、T16A の効果が細胞死や不可逆的な細胞損傷によるものではないことを示唆しました。 さらに、Ani9 は細胞の移動および/または増殖も阻害しました (補足図 9)。 細胞の移動および/または増殖が TRPV3 阻害剤と ANO1 阻害剤の両方によって減少したという事実は、TRPV3-ANO1 相互作用が NHEK の移動および/または増殖に関与していることを強く示しました。 共焦点顕微鏡によるタイムラプスイメージングを使用して細胞遊走速度を分析し、MTTアッセイを使用して細胞増殖を分析しました（図5d〜f）。 遊走速度は、T16A 適用後に減少し、この減少は ANO1 の阻害全体にわたって持続しました (図 5d)。 さらに、T16Aのウォッシュアウト後、移動速度は初期レベルに回復しました（図5d、e）。 細胞増殖も、T16A 適用によって減少しました (図 5f)。 これらの結果は、細胞の遊走と増殖における塩化物イオンの重要性を示唆しました。 したがって、低塩化物培地で培養インサートを使用してアッセイを実行しました (図 6)。 細胞外塩化物が枯渇すると、細胞内塩化物濃度は低下するはずです28。 培養インサートを除去した後、低塩化物含有培地では充填領域が大幅に減少しましたが、この効果は対照培地に戻すと失われました (図 6)。 これらの結果は、ANO1 を通る塩化物フラックスが細胞の遊走および/または増殖において重要な役割を果たしていることを示しました。

カルチャーインサートアッセイの概略図。 b 5 μM T16A を含むまたは含まない培地での培養インサートアッセイ。 0時間で明視野、24時間でカルセイン染色。 0 時間の白い点線は細胞の境界を示します。 ウォッシュアウトは、12 時間での T16A 含有培地から対照培地への培地の交換を示します。 スケールバーは 500 μm を示します。 c 5μM T16Aを含むまたは含まない培地中での12または24時間での増加面積（Δ面積）の測定。 データは平均値 ± SEM (N = 5) を表します。 統計的有意性はマンホイットニー検定で決定されました。 d カルチャーインサートアッセイにおける5μM T16Aの有無によるNHEKの遊走速度。 データは平均値 ± SEM (N = 50) を表します。 e (d) からの平均移動速度。 各列は、指定された期間中の平均速度を示します。 データは平均値 ± SEM (N = 50) を表します。 統計的有意性はマンホイットニー検定で決定されました。 f 示された培地で培養されたNHEKのMTTアッセイ。 ABS は吸光度を示します。 データは平均値 ± SEM (N = 6) を表します。 統計的有意性は、一元配置分散分析とそれに続くダネット補正によって決定されました。

低塩化物培地または対照培地でのカルチャーインサートアッセイ。 0時間の明視野および24時間のカルセイン染色。 0 時間の白い点線は細胞の境界を示します。 対照１２時間は、１２時間での低塩化物培地から対照培地への培地の交換を示す。 スケールバーは 500 μm を示します。 b 低塩化物培地または対照培地における 12 または 24 時間での増加面積 (Δ面積) の測定。 データは平均値 ± SEM (N = 6) を表します。 統計的有意性は、マン・ホイットニー検定または一元配置分散分析とそれに続くテューキー補正によって決定されました。

これまでの結果は、細胞の遊走および/または増殖における塩化物イオンの重要性を示唆していましたが、ケラチノサイトにおける塩化物イオンの実際の役割はほとんどわかっていません。 この疑問に対処するために、私たちは塩化物の移動方向を決定しようと試みました。 塩化物チャネルを通る塩化物の透過は、細胞内の塩化物濃度と膜電位に依存します。 塩素チャネルの機能は細胞内の塩素濃度に影響を与える可能性がありますが、それらはいくつかの塩素輸送体の機能によって維持されるはずです 29。 したがって、RT-PCR を使用して、Na-K-Cl 共輸送体 (NKCC) および K-Cl 共輸送体 (KCC) を含む塩素輸送体の発現パターンを調べました。 NKCC1、KCC1、KCC2、KCC3、およびKCC4をコードする遺伝子のmRNA発現が示唆された(図7aおよび補足図11)。 KCC2は神経細胞特異的なKCCであり、中枢神経系の細胞ではKCC2による塩素の流出により細胞内の塩素濃度が低く保たれ、塩素透過チャネルの開口により塩素の流入が引き起こされる。 そこで、塩化物指示薬 MQAE30、31、32 を使用して塩化物イメージング実験を実施しました。 計算されたNHEKの細胞内塩化物濃度は比較的低く(6.8±1.3mM)(図7b、c)、これはNHEKにおける少なくともmRNAレベルでのKCC2発現と一致している。 計算された塩化物イオンの平衡電位 (-75.7 mV) は、ANO1 を介した塩化物流入が NHEK で報告されている静止膜電位 (-24 ～ -40 mV) で起こることを示唆しています 33,34,35。

NHEK における陽イオン - 塩化物共輸送体遺伝子の RT-PCR 評価。 RT は逆転写を示します。 トリミングされていないゲル画像は、付録に示されています。 図 11. b NHEK 内の塩化物イオン消光蛍光指示薬 MQAE の代表的な画像。 スケールバーは10μmを示します。 c NHEK の検量線と計算された細胞内塩素濃度。 検量線は、Stern-Volmer プロット、F0/F = 1 + Kq[Cl] を使用して作成されました。 F0: 0 mM 塩化物における蛍光強度、各塩化物濃度における F 蛍光強度、Kq 吸光係数。

以前の研究では、細胞内塩素濃度が低いとマイトジェン活性化プロテインキナーゼ (MAPK) のリン酸化が誘導されることが示唆されていますが、その正確なメカニズムはよく知られていません。 MAPK カスケードは多くの細胞の生死に関与しています 36,37 (図 8a)。 たとえば、MAPK キナーゼ (MKK)1/2 によってリン酸化される細胞外シグナル関連キナーゼ (ERK) は、細胞の増殖と分化に関与します。 一方、p38 と c-Jun N 末端キナーゼ (JNK) は、それぞれ MKK3/4/6 と MKK4/7 によってリン酸化され、細胞周期停止とアポトーシスを誘導します。 したがって、ウェスタンブロット法を使用してMAPKリン酸化を調査しました（図8b、cおよび補足図11）。 ANO1 阻害剤である T16A は、p38 のリン酸化を増加させましたが、ERK や JNK のリン酸化は増加させませんでした。 これらの結果は、ANO1 が細胞周期停止および/またはアポトーシスに関与していることを示唆しました。 しかし、カルセイン-AM染色で視覚化された細胞の外観はANO1阻害の影響を受けなかったという事実に基づいて、ANO1阻害はカルチャーインサートアッセイにおいて細胞死を誘導しませんでした（図5）。 さらに、分化および未分化条件の両方において、KRT1、IVL、およびTGM1を含む分化関連遺伝子の発現に対するT16A処理の影響はなかった(補足図10、11)。 この結果は、分化に関連することが知られている（図８ａ）、ＥＲＫリン酸化に対するＴ１６Ａ処理の効果の欠如（図８ｂ）と一致している。 したがって、細胞周期の停止に焦点を当てることにしました。

a MAP キナーゼシグナル伝達の概略図。 b 総MAPキナーゼおよびリン酸化MAPキナーゼのウェスタンブロッティングの代表的な画像。 トリミングされていないゲル画像は、付録に示されています。 図 11.c リン酸化/総 MAP キナーゼのウェスタンブロッティングの定量分析。 データは平均±SEMを表します（pERKおよびpp38についてはN = 7、pJNKについてはN = 4。統計的有意性はマンホイットニー検定で決定されました。

MAPK 分析は ANO1 阻害による細胞周期停止を示唆したため、酸化還元色素を使用して細胞周期アッセイを実行しました (図 9)。 酸化還元条件は細胞周期と密接に関係しています38。 例えば、G0/G1 期の細胞内の酸化還元条件は比較的還元的ですが、G2/M 期に進むと酸化還元条件は徐々により酸化的なものに移行します。 このアッセイ系では、G0/G1期、S期、G2/M期の細胞をそれぞれ黄緑色、緑色、紺色で視覚化できます（図9a）。 色の変化を明確にするために、各細胞はシグナルレベルに応じて赤色として視覚化されました（図9b）。 T16A処理により、カルチャーインサートアッセイ中にG0/G1期の細胞集団が増加し、S期の細胞集団が減少しました（図9b、c）。 この結果は、G0/G1 から S 期への細胞周期の進行が ANO1 阻害によって抑制されることを示しました。

a 細胞周期分析用の酸化還元色素染色の代表的な画像。 スケールバーは100μmを示します。 b 細胞培養インサート中の 5 μM T16A の存在下または非存在下での細胞の代表的な画像。 赤でマークされたセルは、示されたフェーズにあります。 スケールバーは500μmを示します。 c 各フェーズのパーセンテージの比較。 データは平均値 ± SEM (N = 7) を表します。 統計的有意性は、一元配置分散分析とそれに続くダネット補正によって決定されました。

以前の研究とは対照的に、我々の結果は、NHEKでは他の多くのTRPチャネルのmRNA発現が観察されたものの、TRPチャネルの機能的発現がTRPV3およびTRPV4に限定されていることを示した（図1および補足図2）。 タンパク質の発現はケラチノサイトの分化条件に応じて変化すると報告されています39。 したがって、我々の実験では機能発現が確認されなかったTRPチャネルは、他の特定の分化条件下でも機能する可能性があります。 特に、TRPV6 および TRPC6 はケラチノサイトの分化に関与することが報告されており、TRPC6 の発現は分化刺激によって増加します 40,41。 この研究では TRPV3-ANO1 相互作用を観察し、私たちの研究室は上皮細胞における TRPV4-ANO1 についても同様の結果を報告しました 2,3。 ただし、ANO1 と、この研究では機能発現が確認されていない他の TRP チャネルとの間の相互作用は、分化した細胞で発生する可能性があります。

TRPV4 は ANO1 と相互作用することがよく知られており、TRPV3 は NHEK における ANO1 の新しいパートナー候補であることが判明しました。 パッチクランプ実験により、HEK293T細胞およびNHEKにおけるTRPV3-ANO1相互作用が示された(図2、3および補足図11)。 さらに、TRPV3 と ANO1 の両方を発現する HEK293T 細胞において、抗 ANO1 抗体を使用して TRPV3 を共免疫沈降させました。 これらの結果は、TRPV3 と ANO1 がカルシウムナノドメインと複合体を形成し、TRPV4 の場合と同様に、TRPV3 を介して細胞に侵入するカルシウムによって ANO1 が効果的に活性化されることを示唆しています。 カルシウム感知受容体（CaSR）の活性化の下流で細胞内カルシウム濃度が増加すると、ケラチノサイトの分化が誘導されることが知られています42。 したがって、細胞内カルシウム濃度の増加には 2 つの異なるタイプがある可能性があります。1 つは ANO1 を活性化する TRPV3 活性化による局所的なもの、もう 1 つは CaSR シグナル伝達などのいくつかの機構によって引き起こされる全体的なものです。

TRPV3-ANO1相互作用の生理学的機能を評価しました。 以前の研究では、TRPV3 がケラチノサイトの創傷治癒に関与していることが示されました 5。 実際、TRPV3 は、創傷治癒中に放出される EGF による刺激の後、上皮成長因子受容体 (EGFR) によって感作されます。 さらに、EGFR リガンドであるトランスフォーミング成長因子アルファ (TGFα) は、TRPV3 の活性化によってケラチノサイトから放出されます。 この自己分泌系は、TRPV3 活性を介した創傷治癒の分子機構の 1 つを表すと考えられています。 培養インサートを用いた我々のアッセイは、TRPV3 または ANO1 のいずれかの阻害により細胞の移動および/または増殖が減少することを示しています (図 5 および補足図 6、9)。 したがって、TRPV3-ANO1 相互作用は皮膚の創傷治癒の重要な分子機構である可能性があり、TRPV3 活性が関与する創傷治癒には 2 つのプロセスがあることが示唆されています。 以前の報告では、ANO1 の膜局在化が塩素チャネル活性とは無関係にがん細胞の遊走に重要であることが示唆されています 43。 その実験では、使用したいくつかの ANO1 阻害剤 (T16A を含む) の中で、CaCCinh-A01 のみが細胞増殖を減少させ、ANO1 タンパク質分解を誘導しました。 しかし、我々の実験では、T16A処理はANO1タンパク質レベルに影響を与えることなくNHEK増殖を減少させた(図5および補足図8、11)。 さらに、低塩化物条件も培養インサートアッセイにおける細胞の移動および/または増殖を阻害するという我々の発見（図6）は、創傷治癒におけるANO1を介した塩化物移動の重要性を裏付けています。

別の報告では、ANO1 がケラチノサイトの特殊な細胞株である HaCaT 細胞の過剰増殖を誘導することが明らかになり、この結果は我々の結果と一致しています。 しかし、著者らは、ANO1 の阻害により MAPK の 1 つである ERK のリン酸化が減少することを示し、p38 の関与については議論していません。 私たちの実験では、ANO1 阻害は ERK リン酸化に影響を与えませんでしたが、p38 リン酸化は誘導されました。 この違いは、HaCaT が通常のケラチノサイトとは異なる特別なカルシウム要件を持つ細胞株であるという事実によるものと考えられます。

塩素イオンの移動方向は、細胞内の塩素イオン濃度と膜電位のバランスによって厳密に制御されます。 例えば、細胞内塩化物濃度は、中枢神経系の成熟ニューロンにおける KCC2 活性によって低レベルに維持され 29、塩化物流入時に過分極を引き起こします。 我々は、ケラチノサイトの基礎細胞内塩素濃度が低く、KCC2の発現と一致していることを示した（図7および補足図11）。 皮膚ケラチノサイトの静止膜電位は -24 ～ -40 mV の範囲であると報告されているため 33,34,35、ANO1 の開口により塩化物流入が誘導され、その阻害によりケラチノサイト内の細胞内塩化物イオンが減少すると考えられます。 KCC2 は一般にニューロン特異的であると考えられていますが 44、最近の報告では膵臓 β 細胞も KCC245 を発現していることが示されており、KCC2 が予想よりも広範囲に発現している可能性があることが示唆されています。 ケラチノサイトとニューロンはどちらも元は外胚葉細胞であるため 46,47 、ニューロン特異的な KCC2 がニューロンとケラチノサイトの両方の細胞内塩化物濃度を制御できることは合理的です。

がん細胞では、細胞内塩素濃度の低下により、p38 と JNK のリン酸化が誘導されます。 その変化は次に、p21 発現を増加させ、CDK2/サイクリン E 複合体機能の阻害につながり、その後、G1 期の細胞周期の停止につながります 48,49。 癌細胞における以前の報告と一致して、p38リン酸化はNHEKにおけるANO1阻害によって誘導された(図8および補足図11)。 p38 は細胞周期を負に制御することが知られています 36。 この発見は、ANO1阻害によって達成される細胞増殖の減少と合わせて（図5f）、ANO1阻害が細胞周期停止を引き起こすことを示唆しています。 予想どおり、T16A処理により、カルチャーインサートアッセイにおいてG0/G1期内の細胞の割合が増加し、S期内の細胞が減少しました（図9b、c）。 結果は、細胞周期の停止が G0/G1 期と S 期の間に起こることを示しています。 この発見は、がん細胞の細胞内塩素濃度が低下すると細胞が G1/S チェックポイントで停止することを示した以前の研究と一致しています 48,49。 したがって、これらの観察は、ケラチノサイトの細胞周期も、TRPV3-ANO1 シグナル伝達の下流の細胞内塩素濃度の変化によって制御されていることを示唆しています。

私たちの研究は、TRPV3 が ANO1 を介した塩化物の流入を誘導することを示唆しています。 この塩化物流入は、p38 リン酸化の阻害を通じて細胞周期を適切に維持することができます。 したがって、T16Aによって引き起こされる細胞増殖の減少（図5f）は、ANO1阻害による細胞周期停止によって部分的に説明できる可能性があります。 我々のデータは、ANO1阻害が細胞遊走を遅らせることも示しました（図5d、e）。 ANO1 による遊走速度の制御機構は不明ですが、以前の報告では、p21 などの細胞周期を阻害する分子が ROS 媒介経路を通じて細胞骨格を再構成し、それによって細胞遊走を制御することが示されました 50。 したがって、塩化物は、細胞周期を阻害するのと同じ分子を介して細胞移動を制御する可能性もあります。 塩化物が MAPK リン酸化を制御する正確な機構は不明ですが、ホスファターゼ活性の制御について報告されているように、細胞内塩化物濃度はリン酸化レベルを直接制御する可能性があります 51。 ケラチノサイトの細胞シグナル伝達経路における塩化物の役割を明らかにするには、さらなる研究が間違いなく必要です。 それにもかかわらず、この研究で見つかったTRPV3とANO1の相互作用は、それらが創傷治癒中のケラチノサイトの増殖と移動を積極的に調節できることを示唆しています。

この研究は、塩化物イオンがケラチノサイトの細胞周期の調節因子であることを実証しています。 これらのデータは、創傷治癒を促進するための新しいアプローチを示唆しています。 ケラチノサイトの過剰増殖は、毛包部位のざ瘡の原因です。 この過剰増殖を正常化することは、座瘡の重要な治療戦略です52。 しかし、このような治療環境における塩化物イオンの重要性は強調されていません。 TRPV3-ANO1相互作用の我々の分析は、細胞内塩素濃度の根底にある詳細なメカニズムについての将来の研究の有望な出発点となる。 したがって、私たちの研究は、皮膚の恒常性における塩化物イオンの重要性を明らかにすることができました。

ホモ接合型 TRPV3 欠損 (TRPV3-/-) マウスは Patapoutian 博士から提供されました。 C57BL/6 バックグラウンドの野生型 (WT) および TRPV3-/- マウスを、制御された環境 (餌と水に自由にアクセスできる 12 時間の明暗サイクル、25 °C、50 ～ 60) の SPF 条件下で維持しました。湿度%)。 ７週齢の雄マウスを使用した。 すべての手順は、国立自然科学研究所の施設内動物管理使用委員会によって承認され、国立衛生研究所および国立生理学研究所のガイドラインに従って実行されました。

T16Ainh-A01 (T16A、Calbiochem) および Ani9 (Sigma-Aldrich) を Ano1 阻害剤として使用しました。 ジクロニン (MedChemExpress) を TRPV3 阻害剤として使用しました。 以下の抗体を使用しました: ウサギ抗 ANO1 抗体 (Abcam、ab53213、ウェスタンブロッティング用 1:5)、(Abcam、ab53212、免疫沈降用 1:100)、ウサギ抗 phospho-ERK (細胞外シグナル関連キナーゼ) 抗体(Cell Signaling Technology、#4370、1:1000)、ウサギ抗リン酸 p38 抗体 (Cell Signaling Technology、#4511、1:1000)、ウサギ抗リン酸 JNK (c-Jun N 末端キナーゼ) 抗体 ( Cell Signaling Technology、#4668、1:1000)、ウサギ抗 ERK 抗体 (Cell Signaling Technology、#4695、1:1000)、ウサギ抗 p38 抗体 (Cell Signaling Technology、#8690、1:1000)、ウサギ抗-JNK 抗体 (Cell Signaling Technology、#9252、1:1000)、マウス抗 β-アクチン抗体 (Abcam、ab6276、1:2500)、ウサギ抗 TRPV3 抗体 (Cell Signaling Technology、#3484、1:1000)ウェスタンブロッティング、免疫沈降では 1:50）、抗ウサギ HRP 抗体（Cell Signaling Technology、#7074、1:2000）、および抗マウス HRP 抗体（Cell Signaling Technology、#7076、1:2000）。

HEK293T 細胞 (ATCC CRT-3216) を、10% ウシ胎児血清 (BioWest)、50 単位/mL ペニシリン、50 μg/mL ストレプトマイシン (Life Technologies) を含むダルベッコ改変イーグル培地 (Wako) 中で 5% CO2 中で 37 °C で維持しました。 ）、および2 mM/Lグルタミン（GlutaMAX、Life Technologies）。 正常ヒト表皮角化細胞 (NHEK、成人、KURABO) を Humedia-KG2 (KURABO) 中で 5% CO2、37 °C で維持しました。 低塩化物実験には、NaCl を欠くカスタム MCDB153 培地 (機能性ペプチド研究所) を使用しました。 カスタム MCDB153 培地には、130 mM NaCl または 130 mM アスパラギン酸ナトリウムおよび 0.1 mM O-ホスホリルエタノールアミン (Sigma)、0.1 mM エタノールアミン (Sigma)、0.5 μg/mL ヒドロコルチゾン (Sigma)、5 ng/mL 上皮成長因子 (EGF) を添加して使用しました。 、Miltenyi Biotec）、および 5 μg/mL インスリン（Sigma）。

皮膚ケラチノサイトは、わずかな変更を加えた以前の説明に基づいて単離されました53。 簡単に言うと、ケラチノサイトを調製するためにマウスの尾を使用した。 解離した尾を、5 ug/mL インスリン (Sigma、I1882)、0.4 ug/mL ヒドロコルチゾン (Sigma) を含むカスタマイズされた MCDB153 培地 (CSR) 中の 4 mg/mL DISPASE II (Wako、383-02281) 中で 4 °C で一晩インキュベートしました。 、H0888)、10 ug/mL トランスフェリン (Sigma、T8158)、14.1 ug/mL ホスホリルエタノールアミン (Sigma、P0503)、10 ng/mL 上皮成長因子 (Sigma、E4127)、25 ug/mL ゲンタマイシン (Gibco、15710064)、 50単位/mLのペニシリン、50μg/mLのストレプトマイシン、および40μg/mLのウシ下垂体抽出物（極東、20200）。 16時間のインキュベーション後、表皮を剥がし、基底層を下にして室温で20分間、0.25%トリプシン(Gibco、15050065)とともにインキュベートした。 次にケラチノサイトを解剖鉗子で機械的に解離させ、100μmのセルストレーナーで濾過した。 次に、パッチクランプ実験のために細胞をカバースリップ上に播種しました。 すべての記録は隔離後 3 日目と 4 日目に実行されました。

Sepasol-RNA I Super G (Nacalai Tesque) または RNeasy Micro (QIAGEN) を使用して、NHEK から全 RNA を精製しました。 逆転写は、Super Script III 逆転写酵素 (Invitrogen) を使用して 50 °C で 50 分間実行しました。 NHEK における一過性受容体電位 (TRP)、アノクタミン (ANO)、およびカチオン-塩化物-共輸送体 (CCC) の mRNA 発現を調べるために、表 1 に示す PCR プライマーを使用して EmeraldAmp PCR Master Mix (TAKARA) を使用して DNA 断片を増幅しました。 PCR産物は、臭化エチジウムを含む2%アガロースゲルでの電気泳動によって確認されました。

10μM T16Aまたは対照培地で13時間処理したNHEKからタンパク質を抽出しました。 細胞を冷 PBS で洗浄し、溶解バッファー (150 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、1 mM Na3VO4、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル cOmplete (Roche) を含む 1% Triton X-100、 pH 7.5)。 10,000×gで30秒間遠心分離した後、上清を0.5M Tris-HCl、10%ドデシル硫酸ナトリウム、6%β-メルカプトエタノール、10%グリセロール、0.01%ブロモフェノールブルー、100mMジチオスレイトールを含むSDS緩衝液で処理することにより変性させた。 、90℃で5分間。 タンパク質サンプルは SDS-PAGE で使用されました。

HEK293 細胞の一過性トランスフェクションは、リポフェクタミン トランスフェクション試薬 (Life Technologies)、PLUS 試薬 (Life Technologies)、および Opti-MEM I 還元血清培地 (Life Technologies) を使用して達成されました。 プラスミド DNA (hTRPV6/pcDNA3.1、hTRPV3/pcDNA3、hANO1/pcDNA3.1、または pcDNA3.1) を pGreen Lantern 1 で HEK293T 細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞をパッチクランプ記録と免疫沈降に使用しました 16-30トランスフェクションの時間後。

カバースリップ上のNHEKを、5μM Fura-2-アセトキシメチルエステル（Molecular Probes）を含むHumedia-KG2中で37℃で30分間インキュベートしました。 カバースリップを、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１０ｍＭ ｄ−グルコースを含むｐＨ７．４の標準浴溶液で洗浄し、ＮａＯＨで調整した。 標準浴溶液から 2 mM CaCl2 を省略し、5 mM EGTA を添加することにより、カルシウムを含まない浴溶液を調製しました。 Fura-2 は 340 nm および 380 nm の波長光で励起され、発光は CCD カメラ Cool Snap ES (Roper Scientific/Photometrics) を使用して室温で 510 nm で監視されました。 IP lab ソフトウェア (Scanalytics) を使用してデータを取得し、ImageJ ソフトウェア (National Institutes of Health) で分析しました。 イオノマイシン (5 μM、Sigma-Aldrich) を適用して、各細胞の最大応答を確認しました。 高Ｋ＋浴溶液は、６５ｍＭ ＮａＣｌ、８０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１０ｍＭ ｄ−グルコースを含み、ｐＨ７．４で、ＮａＯＨで調整された。

トランスフェクトされた HEK293T 細胞、NHEK、または単離されたマウスケラチノサイトを全細胞記録に使用しました。 パッチ ピペットは、P-2000 (Sutter Instrument) を使用した 5 段階のプロトコルでホウケイ酸ガラス (タイプ 8250、King Precision Glass) から作成されました。 ピペットの抵抗は 3 ～ 8 MΩ でした。 電流は、Axopatch 200B 増幅器 (Molecular Devices) を使用して 10 kHz で記録され、ローパス フィルターを使用して 5 kHz でフィルター処理されました。 電流は、Digidata 1440 Aまたは1550 (Axon Instruments)を使用してデジタル化されました。 データ収集は、pCLAMP 10ソフトウェア(Axon Instruments)を用いて達成された。 全細胞記録用の 4 つの細胞外溶液は次のとおりです。 (1) 標準浴溶液 (140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2、10 mM HEPES、および 10 mM d-グルコース、pH 7.4、 NaOHで調整)。 （２）ＮＭＤＧ−Ｃｌ浴溶液（１４０ｍＭ ＮＭＤＧ、１４０ｍＭ ＨＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１０ｍＭ ｄ−グルコース、ｐＨ７．４、ＨＣｌで調整）； (3) NMDG-Cl 浴溶液から 2 mM CaCl2 を省略し、5 mM EGTA を添加して調製したカルシウムフリーの NMDG-Cl 浴溶液、および (4) I-を使用して調製した NMDG-アスパラギン酸浴溶液HClの代わりにアスパラギン酸を使用します。 ピペット溶液は次のとおりでした: (1) 標準ピペット溶液 (140 mM KCl、5 mM EGTA、2 mM MgCl2、および 10 mM HEPES、pH 7.3、KOH で調整)、または (2) NMDG-Cl ピペット溶液 ( 140 mM NMDG、140 mM HCl、5 mM BAPTA、2 mM MgCl2、および 10 mM HEPES (pH 7.3、HCl で調整)。 遊離カルシウム濃度が 100 または 500 nM になるように、CaCl2 をピペット溶液に添加しました。 遊離カルシウム濃度は、スタンフォード大学の MAXC プログラムを使用して計算されました。

トランスフェクション後の HEK293T 細胞からタンパク質を抽出しました。 ウェスタンブロッティングで説明されているように細胞を溶解しました。 16,100×gで30分間遠心分離した後、上清をプロテインG Magセファロース(GE Healthcare)とともに回転装置内で2時間インキュベートした。 磁気ビーズを除去した後、上清を抗 TRPV3 抗体または抗 ANO1 抗体とともに回転装置内で一晩インキュベートしました。 インキュベーション後、プロテイン G Mag Sepharose を添加し、溶液を回転装置内で 2 時間インキュベートしました。 インキュベーション後、磁気ビーズを洗浄緩衝液(50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、pH 7.5)ですすいだ。 タンパク質を 95 °C で 5 分間 SDS バッファーで変性させました。 タンパク質サンプルを SDS-PAGE によって評価しました。 抗TRPV3抗体および抗ウサギHRP抗体を用いてブロッティングを行った。

NHEKをガラス底ディッシュ(matsunami)上の2ウェル培養インサート(ibidi)にコンフルエントに播種した。 一晩インキュベートした後、培養インサートを除去し、続いてＰＢＳで洗浄した。 次に、細胞を Humedia-KG2、MCDB153 培地、または低塩化物 MCDB153 培地で培養しました。 12 時間または 24 時間の培養後、細胞を可視化するためにカルセイン AM (Dojindo) を培地に添加しました。 データ分析にはImageJソフトウェアを使用しました。 タイムラプス分析では、細胞を共焦点レーザー走査顕微鏡 (IX83 Olympus) の Stage Top Incubator (TOKAI HIT) で培養し、10 分ごとに画像を撮影しました。

NHEKを96ウェルプレート(Falcon)に播種した。 細胞を対照培地、10、5、または2.5μMのT16A含有培地中で24または48時間培養した。 培養後、MTT細胞増殖アッセイキット(Cayman)を使用してMTTアッセイを行った。 ホルマザンの吸光度は、マイクロプレートリーダー（Multiskan Spectrum、Thermo Fisher）を用いて570 nmで測定した。

NHEK をガラス底ディッシュ (松波) に播種しました。 細胞を、共焦点レーザー走査顕微鏡（LSM 510META、Carl Zeiss）上のStage Top Incubator（TOKAI HIT）内で、10 mM MQAE（塩化物イオン消光蛍光指示薬、Dojindo）とともに37℃で60分間インキュベートしました。 MQAE は、2 光子励起レーザー システム (Mai Tai、Spectra-Physics) を使用して 780 nm で励起され、発光は 458 ～ 479 nm でした。

0 mM 塩化物校正溶液には、10 mM NaNO3、140 mM KNO3、0.5 mM Ca(NO3)2、0.5 mM Mg(NO3)2、10 mM HEPES、および 5 mM d-グルコースが含まれており、CsOH で調整された pH 7.4 でした。 100 mM 塩化物校正溶液には、10 mM NaNO3、100 mM KCl、40 mM KNO3、0.5 mM Ca(NO3)2、0.5 mM Mg(NO3)2、10 mM HEPES、および 5 mM d-グルコースが含まれており、pH 7.4 に調整されました。 CsOHで。 50 mM 塩化物校正溶液は、0 および 100 mM 塩化物校正溶液を 1:1 で混合して作成しました。 各校正液には、ナイゲリシン（一価カチオンイオノフォア）、バリノマイシン（カリウムイオノフォア）、トリブチルスズ（塩化物イオノフォア）を最終濃度がそれぞれ5、10、10μMとなるように添加して使用した。 すべての実験は 37 °C で行われました。

NHEK は、創傷治癒アッセイと同じ方法で播種されました。 12時間で培養インサートを取り外した後、細胞をCell-Clock細胞周期アッセイキット(Biocolor)で染色した。 データ分析にはImageJソフトウェアを使用しました。 細胞周期相の分布を閾値色として定義した。 G2/M 期 (濃青色) 細胞は、Hlu 0 ～ 255、彩度 40 ～ 255、輝度 0 ～ 90 として定義されました。 S 期 (緑色) 細胞は、Hlu 70 ～ 255、彩度 40 ～ 255、明るさ 90 ～ 255 として定義されました。 G0/G1 期 (黄緑色) 細胞は、Hlu 0 ～ 70、彩度 40 ～ 255、明るさ 90 ～ 255 として定義されました。

データは平均値±SEMとして表した。 両側マンホイットニー検定または一元配置分散分析を使用して統計分析を実行し、2 つのグループ間の差異の有意性を計算しました。 ボンフェローニ補正またはダネット検定を使用して、複数の比較間の差異の有意性を計算しました。 p < 0.05 を有意であるとみなしました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

分析に使用されたすべてのデータと資料は、図と補足情報とともに本文で入手できます。 すべてのトリミングされていないゲル画像は、Suppl で入手できます。 図。 11. 統計分析データは、補足データ 1 で入手できます。この研究の結果を裏付けるその他のデータまたは情報は、要求に応じて責任著者 MT (トミナガ@nips.ac.jp) から入手できます。

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本研究は、文部科学省科学研究費補助金（第21H02667号および第20H05768号；新学術領域研究「熱生物学」）によるMTへの助成により支援されました。 。

〒444-8787 愛知県岡崎市明大寺東山5-1 生命生命創成研究センター（ExCELLS） 熱生物学グループ

Yu Yamanoi, Jing Lei & Makoto Tominaga

〒444-8787 愛知県岡崎市明大寺東山5-1 生理学研究所 細胞シグナル伝達部門

Yu Yamanoi, Jing Lei & Makoto Tominaga

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Yu Yamanoi

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Yasunori Takayama

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Shigekuni Hosogi

立命館大学総合科学技術研究機構、〒525-8577 草津市

Yoshinori Marunaka

京都府労働衛生協会医学研究所、京都府、604-8472

Yoshinori Marunaka

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YY、YT、JL、MT は実験を計画し、データを解釈しました。 YYとJLは実験を行い、データを分析しました。 SH と YM は塩化物のイメージング実験に貢献しました。 原稿は YY、YT、MT によって作成されました。著者全員が結果について議論し、原稿についてコメントしました。

富永誠さんへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Viktorie Vlachova 氏、KeWei Wang 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 主な編集者: Janesh Kumar と Zhijuan Qiu。 査読者レポートが利用可能です

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

山野井 裕也、レイ ジェイ、高山 裕 他 TRPV3-ANO1 相互作用は、ケラチノサイトの創傷治癒を正に制御します。 Commun Biol 6、88 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04482-1

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受信日: 2022 年 4 月 3 日

受理日: 2023 年 1 月 13 日

公開日: 2023 年 1 月 23 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04482-1

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