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Mar 18, 2023

高い

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 14、記事番号: 2734 (2023) この記事を引用

7711 アクセス

20 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織は、病歴と追跡データのための膨大で貴重な患者材料バンクを構成します。 FFPE 組織で単一細胞/核 RNA (sc/snRNA) プロファイルを達成することは依然として困難です。 ここでは、ランダムプライマーを使用して完全長の全RNAを捕捉することにより、FFPE組織向けの液滴ベースのsnRNAシーケンス技術（snRandom-seq）を開発します。 snRandom-seq は、最先端のハイスループット scRNA-seq テクノロジーと比較して、ダブレット率がわずか (0.3%) で、RNA のカバー率がはるかに高く、より多くの非コード RNA と初期の RNA を検出します。 snRandom-seq は、核ごとに中央値 > 3000 個の遺伝子を検出し、25 の典型的な細胞型を識別します。 さらに、臨床 FFPE ヒト肝がん標本に snRandom-seq を適用し、高い増殖活性を持つ核の興味深い部分集団を明らかにしました。 私たちの方法は、臨床 FFPE 検体に強力な snRNA-seq プラットフォームを提供し、生物医学研究における膨大な応用を約束します。

通常のホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織は、最も一般的なアーカイブ可能な標本であり、病歴や経過観察データなどの膨大で貴重な患者資料バンクを構成します1。 FFPE 組織の組織形態と細胞の詳細は、DNA、RNA、およびタンパク質間のホルムアルデヒド架橋により、組織病理学的によく保存されています。 必然的に、FFPE サンプル中の巨大分子のホルマリン固定によって引き起こされる不可逆的な修飾は、分子生物学の応用にとって常に困難な課題となります。 最近の研究では、最適な RNA 抽出法 2 または空間 in situ プロファイリング 3 による FFPE サンプルの転写プロファイリングが大きく進歩しました。 ここ数年、ハイスループットの単一細胞/核 RNA シーケンス (scRNA/snRNA-seq) 法が生物医学研究の分野全体に革命をもたらしました 4,5,6。 私たちは、カスタマイズされたハイスループット scRNA-seq プラットフォームを使用して、最初のヒトおよびマウスの細胞アトラスを構築しました 7,8。 臨床 FFPE 検体中のすべての単一細胞の正確なトランスクリプトミクス特性評価は、細胞の不均一性と集団動態をより深く理解し、それによってヒト疾患の正確な診断、治療、および予後を向上させる能力があると考えられています。 ただし、単一の無傷の細胞/核の単離と FFPE 組織からの RNA の捕捉はどちらも、RNA の架橋、修飾、分解により依然として困難です。

現在、10X Genomics Chromium Single Cell 3' Solution などの最も一般的なハイスループット sc/snRNA-seq プラットフォームは、ポリ (A)+ RNA の捕捉にオリゴ (dT) に依存しています。分析対象となる非ポリアデニル化 RNA ではなく、検出される可能性があります。 さらに、オリゴ (dT) プライマーは通常、分解した RNA では機能しないため、これらのオリゴ (dT) ベースの sc/snRNA-seq メソッドは、主に新鮮なサンプルまたは新鮮な凍結サンプルに限定されます。 これらの課題をさまざまな観点から克服するために、さまざまな方法が開発されています。 SMART-seq-total9 および VASA-seq10 は、すべての RNA 分子をポリ (A) でテーリングする追加のステップを導入することにより、ポリアデニル化転写物と非ポリアデニル化転写物の両方を捕捉します。 一方、SPLiT-seq11 は、トータル RNA を捕捉するためにより効率的かつ広範囲なランダムプライマーを使用して固定細胞で使用することに成功したことが報告されています 12,13。 ただし、これらの方法は FFPE 組織にはまだ使用できませんでした。 最近 bioRxiv に投稿された 2 つの方法、snPATHO-Seq14 および snFFPE-seq15 は、snRNA-Seq を実行するために FFPE 組織から単一の無傷の核を単離するための最適化された方法を提供しました。これは、FFPE 組織における snRNA-Seq の実現可能性を実証し、次元のロックを解除します。これらの使いにくいサンプル。 snPATHO-Seq はプローブベースの 10X Genomics テクノロジーに依存しているため、限られた遺伝子のみを検出できます14。 snFFPE-seq は、ポリ (A) ベースの 10X ゲノミクス プラットフォームを利用しますが、FFPE 組織からの低品質 RNA を捕捉するには感度が十分ではありません 15。 実際には、予測バイオマーカーや希少細胞タイプを特定するには、臨床検体の大規模かつ包括的なトランスクリプトームプロファイリングが常に必要です。 したがって、最も重要な目標は、FFPE 組織に対するハイスループット、高感度、高カバー率の snRNA-seq のニーズを満たすことができるアプローチを持つことです。

この研究では、FFPE 組織に対する液滴ベースの高感度かつ完全長 snRNA シーケンス手法である snRandom-seq を開発します。 snRandom-seq では、逆転写用のランダム プライマーを使用してトータル RNA を捕捉し、第一鎖 cDNA に対してポリ (dA) テーリングを実行して第二鎖を合成します。 単一核内の cDNA は、当社の以前のマイクロ流体バーコーディング プラットフォーム 16,17 によってさらに特異的にタグ付けされ、その後増幅および配列決定されます。 一方、我々は、穏やかな条件下で脱パラフィン、再水和、および核抽出を実行することにより、FFPE組織から単一の無傷の核を単離するためのプロトコルを開発します。 さらに、ゲノム汚染の影響を回避するために、一本鎖 DNA をブロックするステップを設計します。 私たちはヒトとマウスの混合サンプルを使用して snRandom-seq のパフォーマンスを検証しました。その結果、わずかなダブレット率 (0.3%) と最先端のハイスループット scRNA-seq テクノロジーと同等の感度が示されました。 FFPE マウス組織では、snRandom-seq は snRNA シークエンシングと細胞型アノテーションに関して適切な結果を示し、snRandom-seq は約 20,000 個の単核について核あたり 3000 個を超える遺伝子の中央値を検出し、25 の典型的な細胞型 (肝細胞、生殖細胞、線維芽細胞) を識別します。 、心筋細胞など）。 さらに、臨床 FFPE ヒト肝がん標本に snRandom-seq を適用し、がん研究の潜在的な標的となる可能性のある、高い増殖活性を持つ興味深い核の部分集団を明らかにしました。 簡単に言うと、snRandom-seq は実験室および臨床の FFPE 標本に強力な snRNA プラットフォームを提供し、生物学研究や臨床実践における将来のさまざまなアプリケーションに関係します。

snRandom-seq の主なワークフローを図 1 に示します。FFPE 組織の単核単離では、バンクされた FFPE 組織ブロックの対象領域が最初に選択され、チューブに配置されます。 脱パラフィンと再水和は、標準的なキシレンとアルコール洗浄を使用して実行されました。 その後、核は解離され、透過化されました。 包括的かつハイスループットの単核トータル RNA 配列決定のために、完全長のトータル RNA を捕捉するためのランダムプライマーベースの化学反応と、単核をタグ付けするための操作が簡単な液滴ベースのプラットフォームを備えた戦略を提供しました。 裸の一本鎖 DNA は、複数回のアニーリングとブロッキング プライマーの伸長によって in situ でブロックされました。 逆転写におけるランダムプライマーとオリゴ(dT)プライマーの多重アニーリングにより、トータルRNAのcDNAをその場で変換しました。 ダブレット率を下げるために、公開されている scifi-RNA-seq18 に従って、逆転写ステップにプレインデックス戦略を組み込みました。 核は、事前にインデックス付けされたランダムプライマーによる逆転写のために異なるチューブに分割され、その後の反応のためにプールされました。 ターミナルトランスフェラーゼ (TdT) によって、ポリ (dA) テールが cDNA の 3' ヒドロキシル末端に in situ で付加されました。 また、以前の研究に基づいて、ハイスループットの単核バーコーディングのためのマイクロ流体プラットフォームを確立しました。 液滴中でのバーコード反応中に、酵素による切断によってポリ(dT)プライマーがビーズから放出され 19 、同時に RNA 分解によって cDNA が核から放出されました。 次に、ポリ (dT) プライマーが cDNA の末端のポリ (dA) テールと結合し、伸長して各液滴内の cDNA に特定のバーコードを追加します。 バーコード化後、液滴を破壊し、バーコード化された cDNA を増幅し、ペアエンド シーケンシング用の次世代シーケンシング (NGS) ライブラリを準備しました。

FFPE 組織の snRandom-seq のワークフローには、FFPE サンプルの選択、パラフィン溶解、単核の単離、透過処理、一本鎖 DNA のブロッキング、逆転写、dA テーリング、液滴バーコーディング、プライマーの放出と伸長、液滴の切断、PCR 増幅が含まれます。そしてシーケンス。 FFPE 組織ブロック内の赤い破線の円: 対象領域。 青色の破線ボックス: 一本鎖 DNA ブロッキング、逆転写、dA テーリングを含む 3 つの in situ 反応。 AAA: cDNA の 3' の dA テール。 TTT: ポリ(dT) バーコード化プライマーのポリ(dT)。 灰色の矢印: 延長方向。

snRandom-seq は、ランダム プライマーを利用して単一核内の全 RNA を捕捉します (図 1)。これは、現在のポリ (A) ベースおよびプローブベースの単一細胞 RNA-seq 法とは異なります。 したがって、snRandom-seq の忠実度を評価するために、培養ヒト (293T) およびマウス (3T3) 細胞株を使用して標準的な混合種実験を実行しました。 新たに採取した 293T 細胞と 3T3 細胞を核に溶解し、固定のために混合しました。 固定された核は snRandom-seq に使用されました (図 1)。 マイクロ流体カプセル化に進む前に、核を画像化して単核の形態を確認し、計数しました（補足図1a）。 ハイスループットのマイクロ流体プラットフォームは、snRandom-seqにおける単一細胞/核バーコーディングのために確立されました（図2a、補足図1b）。 バーコードビーズ合成の場合、ヒドロゲルビーズ生成デバイスと細胞カプセル化デバイスは、前述のように設計および製造されました20（補足図2a）。 直径40μmのヒドロゲルビーズが正確に製造されました（補足図2b）。 DNAバーコード合成のために、これらのヒドロゲルビーズに対して3ラウンドのスプリットアンドプールベースのライゲーションを実行しました（補足図2c、補足表2）。 各ライゲーションステップの高い反応効率は、放出されたバーコードプライマーのエレクトロフェログラムの鋭いピークに反映されました（補足図2d）。 核、バーコードビーズ、および試薬混合物は、マイクロ流体プラットフォームを使用して油中水型エマルション中で共同区画化され（図2a）、個々の核はバーコードビーズで液滴にカプセル化されました（図2b）。

核のバーコード化のためのマイクロ流体カプセル化デバイス。 b 1 つのビーズ、1 つの核、および試薬混合物を含むカプセル化された液滴の画像。 c Qsep100™ DNA フラグメント アナライザーの 293T (ヒト) および 3T3 (マウス) 核混合 cDNA ライブラリーの電気泳動図。 下位 (20 bp) と上位 (1 kb) のマーカーが表示されました。 d 真の核を表すバーコードを識別するためのバーコード プロット (赤線)。 293T-3T3 混合核のバーコードは、遺伝子数が最大のものから最小のものの順に並べられています。 e snRandom-seqの単核捕捉効率とダブレット率を示す種混合散布図。 f 293T-3T3 混合物における UMI の種特異性。 同定された 293T 核: n = 1157、同定された 3T3 核: n = 1086。293T における UMI の種特異性の中央値は 0.992 でした。 3T3 における UMI の種特異性の中央値は 0.986 でした。 g イントロンとエクソンにマッピングされたリードのパーセント。 ヴァイオリンプロットとボックスプロットは、それぞれの 293T 核と 3T3 核で検出された遺伝子 (h) と UMI (i) の数を示しました。 フィルタリングされた 293T 核: n = 1085、フィルタリングされた 3T3 核: n = 1066。箱ひげ図のデータは、第 1 および第 3 四分位数 (下部および上部ヒンジ) および中央値 (中央) に対応しました。 j 3 つの方法の飽和分析。 snRandom-seq は 293T および 3T3 核を使用しました。 10X クロムシングルセル 3' ソリューション V3 は 293 T および 3T3 セルを使用しました。 VASA-seqには293T細胞を使用しました。 k 3 つの方法で遺伝子本体に沿ったカバレッジを読み取ります。 snRandom-seq は 293T 核を使用しました。 10X クロムシングルセル 3' ソリューション V3 は 293T セルを使用。 VASA-seqには293T細胞を使用しました。 (f、h、i) のデータは中央値として表示されました。 (f、h、i) の箱ひげ図のデータは、第 1 四分位数 (下部ヒンジ)、第 3 四分位数 (上部ヒンジ)、中央値 (中央) に対応します。 上ヒゲはヒンジから最大値まで伸びており、ヒンジから 1.5 * IQR (四分位範囲) を超えていません。 下ヒゲはヒンジからヒンジの最大 1.5 * IQR の最小値まで伸びていました。 IQR は、第 1 四分位数と第 3 四分位数の間の距離です。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

バーコード化と増幅後、ヒトとマウスの混合物の cDNA ライブラリーの断片サイズは 300 ～ 800 bps の間でピークに達しました (図 2c)。これは断片化する必要はありませんが、NGS にはちょうど適しています。 データ処理後、バーコード遺伝子ランクプロットの顕著な急勾配によって2,250の高品質でユニークな核バーコードを特定しました（図2d）。これは、バックグラウンドノイズから真の核が明確に分離されていることを示唆しています。 核捕捉率は 42.2%、真の核にマッピングされたリードの割合は 76% でした。 すべての単一核でヒトとマウスの両方のゲノムにマッピングされたリードの比率を数えたところ、事前にインデックス付けされたプライマーがダブレット率を顕著に減少させる（2.9％から0.3％）ことがわかりました（図2e、補足1c）。 snRandom-seq のダブレット率は、他のドロップレットベースの sc/snRNA-seq 法のダブレット率よりも大幅に低くなります (sNucDrop-seq: ~2.6%、VASA-drop: 3.1%)。 一貫して、UMIの非常に高い種特異性（99％）が観察され（図2f）、snRandom-seqが高忠実度の単核ライブラリを生成したことを示唆しています。 同定されたヒトおよびマウスの核のエクソンまたはイントロンにマッピングされたリードの割合を計算したところ、イントロンにマッピングされたリードがエクソンにマッピングされたリードの3倍であることが結果からわかりました（図2g）。 さらに、核小体低分子RNA（snoRNA）、核内低分子RNA（snRNA）、マイクロRNA（miRNA）など、多くの長い非コードRNA（lncRNA）と短い非コードRNAが検出されました（補足図1d）。 これらの結果は、snRandom-seq が全長転写産物を包括的に捕捉したことを示唆しています。

遺伝子および UMI 数の分布は、snRandom-seq が 293T 核あたり平均約 29,000 リードのシーケンシングにより、単一 293T 核で 4141 個の遺伝子と 11,594 個の UMI の中央値を捕捉し（図 2h）、〜までに単一 3T3 核で 3427 個の遺伝子と 9795 個の UMI を捕捉したことを示しました。 3T3 核あたり 25k の読み取り (図 2i)。 その結果、snRandom-seq は報告されている他の 2 つの液滴ベースのハイスループット snRNA-seq 法よりも感度が高いことが示されました (DroNc-seq21: 平均 3,295 個の遺伝子と 4,643 個の UMI、5,636 個の 3T3 核の核あたり約 160,000 のリード; sNucDrop-seq22: 1984 3T3核の場合、平均2665個の遺伝子と5195個のUMI、核あたり約23kのリード）（補足図1e）。 飽和分析により、snRandom-seqで検出された遺伝子の数が、3T3および293T核あたり60kのユニークにアラインメントされたリードによる飽和点にまだ達していないことが示されました（図2j）。 また、snRNA-seq データを、広く使用されているハイスループット 10X Chromium Single Cell 3' Solution V323 および scRNA-seq 用に報告された最新のハイスループット VASA-drop10 と比較しました。 低いシークエンシング深度 (<10k) では、3T3 および 293T 核における snRandom-seq の感度は、3T3 および 293T 細胞における 10X Chromium Single Cell 3' Solution V3、および 293T 細胞における VASA-drop に匹敵します (図2j)。 明らかな 3' 末端バイアスのあるポリ (A) ベースの 10X クロム単セル 3' ソリューション V3 とは異なり、snRandom-seq と VASA-drop の両方は、遺伝子本体全体にわたって明らかな 3' または 5' 末端のバイアスを示しませんでした (図2k）。 予想どおり、snRandom-seq は、逆転写におけるオリゴ (dT) プライマーの追加により 3' 末端にわずかに偏っていました (図 2k)。

FFPE組織の場合、プロテイナーゼKによる消化は、コラゲナーゼよりもきれいな単一核を単離できます（補足図3a）。 最適化された手順（図1）により、複数のFFPEマウス組織とヒト肝がんの2年前のアーカイブ臨床FFPEサンプルから単一の無傷の核が効率的に単離されました（図3a、補足図4a）。形態とサイズ分布は、FFPEと新鮮なサンプルの間で同等でした（補足図4b）。

a 液滴バーコード化および DAPI による染色前の単一核の画像。 スケールバー、50μm。 b 異なる条件下で異なるゲノム領域にマッピングされたリードの割合。 c、Qsep100™ DNA フラグメント アナライザーの FFPE マウス腎臓 cDNA ライブラリーの電気泳動図。 下部マーカー: 20 bp; 上部マーカー: 1k bp。 d FFPE/フレッシュ比較および技術的再現実験の概要。 FFPE/新鮮サンプル (e) と技術的複製サンプル (FFPE1、FFPE2) (f) の間の正規化された遺伝子発現のピアソン相関係数 (R)。 各ドットは遺伝子の平均発現レベルを表します。 赤い線は線形回帰直線を示します。 p 値 (p) は両側順列検定から計算されました。 g FFPE サンプルで検出されたさまざまな RNA バイオタイプの数。 h snRandom-seq を使用したマウス組織 (心臓、腎臓、精巣、肝臓) とヒト肝臓の遺伝子検出の比較。マウス脳は snFFPE-seq15、乳房は snPATHO-seq14 による。 腎臓核: n = 5795、肝臓核: n = 4287、心臓核: n = 6732、精巣核: n = 3774、脳核: n = 7031、乳房核: n = 5721。データは中央値として表示されました。 箱ひげ図のデータは、第 1 四分位数 (下部ヒンジ)、第 3 四分位数 (上部ヒンジ)、および中央値 (中央) に対応します。 上ヒゲはヒンジから最大値まで伸びて、ヒンジから 1.5 * IQR を超えていませんでした。 下ヒゲはヒンジからヒンジの最大 1.5 * IQR の最小値まで伸びていました。 i FFPE マウス組織に基づく snRandom-seq の飽和分析。 j 3 つの異なる snRNA-seq メソッド (snRandom-seq、snFFPE-seq15、および 10X Chromiumfixed RNA Profiling) によって遺伝子本体に沿った分布を読み取ります。 k 3 つの方法で生成された遺伝子本体のカバー率データセットを示すヒストグラム。 l snRandom-seq および 10X クロム固定 RNA プロファイリングでヒト遺伝子 C1S にアライメントされた代表的な生リード。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

私たちのパイロットFFPE snRNA配列決定実験では、ゲノム汚染により、多くのリードが遺伝子間領域にマッピングされ、ユニークに整列されたリードはほとんどエクソンにマッピングされませんでした（図3b）。 FFPE組織のDNAの二重らせんは化学修飾を受けると破壊されやすいことを考慮して、snRandom-seqの最初の手順に一本鎖DNAのブロッキングステップを追加しました（図1、ボックス）。 単離されたFFPE単核内の裸の一本鎖DNAは、ゲノムの一本鎖DNA上のブロッキングプライマーの複数のアニーリングおよび伸長によってその場でブロックされた。 DNA ブロッキング後、遺伝子間領域の割合は劇的に減少しました (図 3b)。 マッピング領域の分布は、DNAブロックされたFFPEサンプル、新鮮なサンプル、およびsnFFPE-seq（10X Chromium Single Cell 3' Solution V3）の間で同等であり、snRandom-seqデータの高品質をさらに裏付けています（図3b）。 上記の手順を統合することにより、複数のFFPE組織からsnRandom-seqによって高品質のcDNAライブラリーが生成されました（図3c、補足図4c、d）。 FFPE および新鮮なサンプルからの cDNA ライブラリーの断片サイズは、両方とも 300 ～ 800 bps の間でピークに達しました (図 3c、補足図 4e)。

snRandom-seqが新鮮なサンプルとしてFFPE組織から十分な情報を生成できるかどうかを判断するために、同じマウス組織からFFPEと新鮮なサンプルの両方を収集し、snRandom-seqを使用してそれらのRNAプロファイルを比較しました（図3d）。 FFPE と新鮮なサンプルの RNA の品質は、まず RNA フラグメントの分布と DV200 によって評価されました。 予想通り、FFPE サンプルの RNA の品質は新鮮なサンプルの RNA の品質よりも相対的に低く (補足図 5a)、FFPE サンプル内の RNA が分解されたことを示唆しています。 snRandom-seq結果のマージされたゲノムブラウザトラックは、FFPEと新鮮サンプルの読み取りカバレッジエリアが類似していることを示しました（補足図6a-g）。 一貫して、snRandom-seqによるFFPEと新鮮サンプルの総RNAプロファイルは良好な相関を示しました（Pearson R：〜0.9、p < 2.2e-16;図3e、補足図7a、b）。 一方、私たちの方法の再現性を証明するために、同じFFPEサンプルをsnRandom-seqで独立して配列決定し（図3d）、これらの遺伝子発現プロファイルの高い相関（Pearson R〜0.92、p < 2.2e-16）を示しました。 2 つのバッチも見られました (図 3f)。 これらの結果は、snRandom-seq が新鮮なサンプルと FFPE サンプルの両方で良好に機能することを示しました。

次に、FFPE の結果を他の報告されている FFPE snRNA-seq 結果と比較しました。 データ処理後、これらのFFPE組織の数千の真の核がsnRandom-seqデータから首尾よく特定されました（図3h、補足図8a）。 snRandom-seqは、FFPEサンプルの広範囲のRNAバイオタイプを特定し（図3g）、snFFPE-Seqの約8倍のlncRNAがあり、snoRNA、scaRNA、miRNAはsnRandom-seqでのみ検出されました（補足図3g）。 8b)。 不飽和 snRandom-seq データセットで核ごとに検出された遺伝子の中央値はすべて 3000 を超え、FFPE サンプルに対して報告されている他の 2 つのハイスループット snRNA-seq メソッド (snFFPE-Seq 10X Chromium Single Cell 3' Solution V3: 276) よりも大幅に高かった。遺伝子/核; snPATHO-Seq: 1850 遺伝子/核）（図3h）、およびUMIの中央値（補足図8c）。 私たちのデータは、核ごとに約30万のマップされたリードをシーケンスし、約10,000の遺伝子を検出したとしても、まだ飽和点に達していません（図3i）。

さらに、snRandom-seq の RNA カバレッジを他の 2 つの FFPE snRNA-seq メソッドと比較しました。 遺伝子本体上の平均リード分布のプロットでは、オリゴ(dT) プライマーを使用した snFFPE-Seq は明確な 3' 末端バイアスを示し、snPATHO-seq と同じプローブベース技術を使用した 10X クロム固定 RNA プロファイリングは軽度の 5' 末端バイアスを示しました。 -端バイアス(図3j)。 ただし、FFPE組織のsnRandom-seqデータでは遺伝子本体全体にわたる均一な分布が観察され（図3j）、ランダムプライマーが転写物に均一に結合しており、snRandom-seqの余分なオリゴ（dT）プライマーがFFPEサンプルでは無効であることを示唆しています（図3j）。 。 単核レベルでの RNA カバレッジについては、snRandom-seq は snFFPE-seq または 10X クロム固定 RNA プロファイリングよりもはるかに高いカバレッジを示しました (図 3k)。 単一遺伝子レベルでの RNA カバレージの場合、選択した 3 つの遺伝子 (C1S、EMG1、KLRG1) に沿ったリード分布は、プローブベースの技術とランダムプライマーベースの戦略の決定的な違いを示しました (図 3l、補足図 8d)。 10X クロム固定 RNA プロファイリングによるマッピングされたリードは、プローブのターゲット領域 (<100 bp) に限定されました。 対照的に、snRandom-seq によってマッピングされたリードは、エキソン領域とイントロン領域の両方に均等に分布していました。 これらの結果は、FFPE 組織の snRandom-seq が大量の高品質 RNA を捕捉し、最先端のプラットフォームよりもはるかに多くのトランスクリプトーム情報を抽出できることを示唆しました。

次に、FFPE で同定された細胞タイプと、snRandom-seq によって新鮮なサンプルを比較しました。 上記のフィルタリングされた高品質の単一腎臓核プロファイルの教師なしクラスタリングにより、10 を超える異なるクラスターが明らかになりました。 すべてのクラスターは、古典的な既知の細胞型マーカー 24、25 に基づいてさらに注釈を付けることができます（図 4a、b、補足図 9a）。 有足細胞のNphs1、内皮細胞のPecam1、メサンギウム様細胞のPdgfrbなど、古典的な既知の細胞型マーカー遺伝子22の遺伝子発現は、対応するクラスター上に確実にマッピングされました（図4b）。 哺乳類の腎臓の尿細管には、少なくとも 16 種類の異なる上皮細胞が含まれています 26。 ここでは、近位尿細管、近位直尿細管、遠位ネフロン、遠位尿細管、ヘンレのループ、集合管主細胞、有足細胞など、FFPE マウス腎臓サンプルにおける尿細管上皮細胞タイプの推奨用語のほとんどを snRandom-seq によって特定しました。 、近位尿細管細胞、集合管挿入細胞、および集合管細胞（図4a）。 集合管細胞のSlc14a2など、細胞型の既知のトップマーカーに加えて、これらの細胞型の潜在的なマーカーもいくつか発見しました（図4c）。 FFPE サンプルと新鮮なサンプル、および FFPE サンプルの他のバッチの snRandom-seq データをマージすることにより、t-SNE（t 分布確率的隣接埋め込み）による堅牢なセル クラスタリングが得られました（補足図 9b）。 ほとんどの細胞型は 3 つの snRandom-seq データセットで特定されました（図 4d、補足図 9c）。 予想どおり、FFPE と新鮮なサンプル (PTC など) の細胞タイプの割合には多少の違いがあります。これは、サンプリング エラーと、FFPE と新鮮なサンプルの核抽出方法の違いによって引き起こされる可能性があります。

遺伝子発現に基づいて snRandom-seq によって FFPE マウス腎臓サンプルから単離された核の t-SNE 分析。同定された細胞タイプによって色分けされます。 特定された 14 種類の細胞を色分けして以下に示します。 b FFPEマウス腎臓のt-SNEマップの単一核における選択された3つの細胞型マーカーの発現。 遺伝子発現レベルは赤色の濃淡で示されます。 c 14 種類の細胞のそれぞれにおける上位 2 つのマーカーの平均発現のドット プロット。 d snRandom-seqによるFFPE1、FFPE2、および新鮮サンプルの注釈付き細胞タイプの割合。 e snRandom-seqによるFFPEマウス精巣からのsnRNAのt-SNEおよびRNA速度分析。 速度は、異なるセルタイプの黒い矢印として色分けされて表示されます。 黒い矢印は RNA 成熟の軌跡を示します。 f さまざまな細胞タイプにおけるスプライスされた転写産物とスプライスされていない転写産物のパーセント。 g snRandom-seqによるFFPEマウス精巣の細胞周期分析。 t-SNE の点は、特定された細胞周期期 (G1、G2M、または S) によって色付けされました。 赤い破線の円: 活発な転写活性を持つ G2M 期の後期精母細胞の 2 つの部分集団。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

snRandom-seq データの生物学的有用性を実証するために、さらに多くの FFPE マウス組織を追加しました。 snRandom-seq を使用して、4 つの FFPE マウス組織 (心臓、腎臓、精巣、肝臓) から合計 19,258 個の単一核を配列決定して分析し、合計 25 種類の細胞型 (肝細胞、生殖細胞、線維芽細胞、心筋細胞など) を同定しました。 。）。 （補足図10a、b）。 免疫細胞の過小評価が見られ、これは単核 RNA-seq ライブラリーによる細胞型組成に関する以前の知見と一致しています 27。

FFPE サンプルで検出されたイントロン配列の大部分（図 3b）は、snRandom-seq データが、新たに転写された RNA（スプライスされていない）と成熟 RNA（スプライスされた）を区別することにより、RNA 速度分析により適していることを示唆しました 28。 次に、精子形成が細胞動態を研究するための優れたモデルである FFPE マウス精巣に snRandom-seq を適用しました。 scRNA-seq29,30による新鮮な精巣に関する他の研究と一致して、t-SNEは移行段階の生殖細胞（主に初期精母細胞と後期精母細胞）を連続的に連続するように配置しました。 対照的に、未分化の精原細胞と成熟した精細胞はクラスター内にあります（図4e）。 検出された新生転写物によって計算された速度は、t-SNEプロット上で視覚化され、さまざまな細胞タイプ、特に初期精母細胞と後期精母細胞の左側に位置する細胞における異なる速度ベクトルの方向が明らかになりました（図4e、f）。 遺伝子発現に基づく細胞周期状態分析と組み合わせると、RNA速度は、活発な転写活性を持つG2M期の後期精母細胞の2つの部分集団における明らかな細胞成熟軌跡を明らかにしました（図4g）。

最後に、ヒト大小柱塊状（MTM）肝細胞癌（HCC）サブタイプの約2年前の臨床FFPE標本にsnRandom-seqを適用しました（図5a）。 病理組織学的検査に従ってパラフィンブロック上の関心のある腫瘍領域を選択し（図5b）、snRandom-seqを実行しました。 snRandom-seqは、この臨床FFPE標本で5914個の真の核を特定し、中央値3220個の遺伝子と核あたり8182個のUMIの中央値を検出しました（補足図11a、図5b）。 配列決定の深さが増加するにつれて、snRandom-seqは飽和状態で約8000個の遺伝子を検出しました（補足図11b）。 lncRNA、snRNA、miscRNA、miRNA、snoRNA を含む広範囲の RNA バイオタイプがサンプルから検出されました (補足図 11c)。 ヒト肝臓単核の教師なしクラスタリングにより、いくつかの異なるクラスターが明らかになりました。 ヒト肝臓の主な細胞型は、肝細胞 (APOA1)、クッパー細胞 (CD163)、T 細胞 (CD3E)、線維芽細胞 (PDGFB)、形質細胞 (FCRL5) など、既知の細胞型マーカー 31 に基づいてヒト検体から特定できます。 ）（図5d、補足図11d）。 特に、肝細胞のサブクラスター（肝細胞-2）が主要な肝細胞集団から分離されており、増殖マーカー MKI67 および他の 2 つのマーカー（ASPM および TOP2A）が高発現しており、これらは HCC の進行に関連していると報告されています 32,33。 (図5e)。 一方、これらのsnRNAの細胞周期分析により、肝細胞-2クラスター内のほとんどの細胞がG2M期にあることが明らかになり（図5f）、肝細胞-2クラスターが分裂中の腫瘍細胞のグループである可能性があることが示唆されました。 クラスター間の細胞コミュニケーションをさらに調査した後（図5g）、肝細胞-1と肝細胞-2が異なる発信および着信シグナル伝達パターンを示すことがわかりました（図5h）。 肝細胞-2は主にBMPシグナル伝達経路を介して形質細胞からシグナルを受け取ります（補足図12a）。これはHCCにおける腫瘍の進行と相関していることが報告されています34、35。 リガンド-受容体ペア分析により、形質細胞はBMP6-(ACVR1 + ACVR2A)によって肝細胞-2に優先的にシグナルを送信し、形質細胞と肝細胞-2の間のコミュニケーションにはBMP6-(BMPR1B + BMPR2)を含む特定のリガンド-受容体ペアが存在することが判明した。 BMP6-(BMPR1B + ACVR2B)、BMP6-(BMPR1B + ACVR2A)、BMP6-(BMPR1A + ACVR2A)、および BMP6-(ACVR1 + ACVR2A) (図 5i)。 遺伝子発現は、BMPR1BおよびACVR2Aが肝細胞-2で特異的な発現を有することも示した（補足図12b）。 まとめると、snRandom-seq は、臨床 FFPE 検体から増殖および活性化された肝細胞の部分集団を発見しました。これは、将来の追加研究に貴重な手がかりを提供します。

snRandom-seq のヒト大小柱型大量肝細胞癌 (MTM-HCC) サブタイプの臨床 FFPE サンプルの実験概要。 b 低倍率 (左、スケール バー、5 mm) および高倍率 (右、スケール バー、200 μm) での MTM-HCC の組織学的外観。 赤い破線の円: 腫瘍領域。 青い破線の円と線: サンプリング領域。 白い破線の円と線: 拡大された領域。 c snRandom-seqによってFFPE臨床ヒトサンプルで検出された遺伝子とUMIの数を示すバイオリンプロットとボックスプロット。 MTM-HCC 核: n = 5914。データは中央値として表示されました。 箱ひげ図のデータは、第 1 四分位数と第 3 四分位数 (下部ヒンジと上部ヒンジ) および中央値 (中央) に対応しました。 箱ひげ図のデータは、第 1 四分位数 (下部ヒンジ)、第 3 四分位数 (上部ヒンジ)、および中央値 (中央) に対応します。 上ヒゲはヒンジから最大値まで伸びて、ヒンジから 1.5 * IQR を超えていませんでした。 下ヒゲはヒンジからヒンジの最大 1.5 * IQR の最小値まで伸びていました。 d 遺伝子発現に基づいてFFPEサンプルから単離された核のt-SNEマップ。 2 つの肝細胞サブタイプを含む 6 つの細胞タイプに注釈が付けられ、表示されました。 e 6 つの細胞タイプそれぞれの上位 3 つのマーカー。 f 6 つの細胞型における G1 期、G2M 期、または S 期の核の割合。 g 異なる細胞集団間の相互作用の総数。 円のサイズは各セル グループ内のセルの数を表し、エッジの幅は通信確率を表します。 h 各細胞クラスターの発信シグナル伝達パターン (左) と着信シグナル伝達パターン (右) を示すヒートマップ。 i BMPシグナル伝達ネットワークにおける受容体-リガンドペアの伝達確率と統計的有意性を示すバブル図。 ドットの色は通信確率を表し、ドットのサイズは計算された p 値を表します。 空白は通信確率がゼロであることを意味します。 p値は片側順列検定から計算されました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

snRandom-seqは、ヒト正常HCCサブタイプのFFPE標本に対しても実行されました（補足図13a）。 snRandom-seq データに基づいて、十分な遺伝子数と UMI 数が検出され、肝臓の主要な細胞クラスターが特定されました (補足図 13b、c)。 これまでの研究では、lncRNA が組織特異的な発現を示すことが示されています 36,37 が、発現が低いためルーチンの単一細胞 RNA-seq 解析では常に無視されています。 正常なHCCサブタイプの肝細胞クラスターでは、肝細胞-2のLINC02476およびLINC01151、肝細胞-3のLINC00540、LINC02307、およびLINC02109、肝細胞-4のLINC02384などのlncRNAの顕著な発現があることがわかりました（補足図13d）。 LINC02476 は miR-497 をスポンジングして HMGA2 発現を増加させることにより HCC の悪性表現型を促進し 38、LINC00540 は NKD2 依存性 Wnt/β-カテニン経路を介してヒト HCC の進行と転移に影響を与えることが報告されています 39。 これらの結果は、正常HCCサブタイプの肝細胞-2（LINC02476で発現）と肝細胞-3（LINC00540で発現）が異なる病因を示す可能性を示唆した。 総合すると、完全長転写産物をカバーするという利点を備えた snRandom-seq は、がん生物学における lncRNA 解析において有望であることがわかります。

さらに、同じ結腸直腸癌肝転移（CRLM）患者からの初回および再発の FFPE 臨床検体の一致するペアに対して snRandom-seq の適用を実行しました。 snRandom-seqは、初回および再発FFPE検体の両方で、〜1000の遺伝子数と〜2000のUMI数の中央値を検出しました（補足図14a）。 初回および再発の FFPE 検体からの細胞が包括的に統合され、主要な細胞タイプ (肝細胞、癌細胞、T 細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、内皮細胞、星細胞、マクロファージ、胆管細胞、B/形質細胞) が同定されました。両方のサンプル（補足図14b、c）。 再発したFFPEサンプルではT細胞の割合がより高いことが観察され（補足図14d）、再発したサンプルではより活性な抗腫瘍免疫反応が示唆されました。 一貫して、再発サンプルでは、​​支配的な癌クラスター（癌細胞-1、-2、および-3）の割合が減少しました（補足図14d）。 ただし、再発サンプルでは癌細胞-4の割合が増加しました（補足図14d）。 さらに、脂質組成調節因子（SCD）をコードする遺伝子と脂質に結合するタンパク質（APOA2、APOC3、およびAPOA1）が、再発サンプルのがん細胞-4クラスターで高い発現レベルを示すことを発見しました（補足図14e）。これは、脂質の増強を示唆しています。再発した CRLM の癌細胞サブクラスターにおける代謝。

我々は、ランダムプライマーを使用して単一核から全長トータルRNAを高感度かつ包括的に捕捉することにより、保存されたFFPE組織に対する液滴ベースのハイスループットsnRNA-seq法を開発しました。これにより、FFPE組織またはFFPE組織からの単一核トランスクリプトームのプロファイリングに重要な進歩がもたらされます。他の種類の低品質の生体サンプル。 snRandom-seq は、日常的な分子生物学手順と、現在人気のある 10X Genomics プラットフォームと同様の成熟したマイクロ流体液滴バーコーディング プラットフォームを使用していることは注目に値します。 したがって、snRandom-seq は操作が簡単で、大規模なアプリケーション向けに商品化することができます。

FFPE 組織の分子生物学的応用は、化学的に架橋された低品質の RNA のため常に困難でした。 単一核は FFPE 組織から単離でき、RNA 架橋は熱とプロテアーゼ消化によって元に戻すことができますが、一般的なオリゴ (dT) ベースの RNA 捕捉戦略は、次の snFFPE-seq で実証されているように、これらの低品質サンプルでは効率的ではありません。 10X Chromium Single Cell 3' Solution V3 platform15、および snRandom-seq 内の無効なオリゴ (dT) プライマー。 FFPE 核に 10X Genomics プローブベースの技術を採用した snPATHO-Seq14 は、対象遺伝子の遺伝子シグネチャを反映できますが、ターゲットとするのはトランスクリプトームのごく一部のみです。 ランダムプライマーベースのアプローチを使用しながら、FFPE サンプルに対して偏りのない単核転写プロファイリングを効率的に実行できます。 また、snRandom-seq 化学と空間バーコーディング技術 3,40 の統合も想定しています。これにより、日常的な組織学と組み合わせて、FFPE 組織における高感度かつ包括的な空間遺伝子発現解析が可能になります。 微生物は、scRNA-seq にとって困難なサンプルのもう 1 つのタイプであり、その mRNA 含有量は非常に低く、通常は 3' 末端ポリ (A) テールが欠如しています 41。 私たちは snRandom-seq を改変し、高スループットかつ高感度の単一微生物 RNA-seq への応用を拡大することを試みています。

FFPE サンプルに対する最先端のハイスループット snRNA-Seq メソッドと比較して 14、15、snRandom-seq は、細胞型の同定、差次的発現解析、および細胞周期に関する適切なパフォーマンスに裏付けられ、さまざまな観点からこれらのメソッドを上回っています。フェーズ分析。 snRandom-seq による臨床 FFPE 検体からの高品質かつ高感度の snRNA-seq データにより、細胞型特異的な標的遺伝子を明らかにしたり、ヒト疾患の正確な診断と治療の希少な部分集団を特定したりできます。 さらに、ランダム プライマーにより、snRandom-Seq はより多くの遺伝子本体領域をカバーできるようになり、大量の非コード RNA の検出と、RNA 速度分析における新生転写産物のさらなる利用が可能になります。 この研究では、RNA 速度解析に初期の転写産物を利用し、2 つの特定の部分集団における明らかな細胞成熟の軌跡を明らかにしました。 さらに、これらの完全長トータル snRNA-seq データセットにより、コピー数変異 (CNV)、選択的スプライシング、および単一細胞/核レベルでの変異の包括的な分析が可能になります。

結論として、この研究で説明した簡単な実験プロトコルとFFPE組織からの包括的なトランスクリプトーム情報により、将来的にsnRandom-seqを基礎研究および臨床研究で大規模に応用できるようになると期待されています。

この研究におけるマウスを含むすべての手順は、浙江大学動物管理使用委員会によって承認されました (承認番号: ZJU20170466)。 この研究で実施されたヒトサンプルの収集と研究は、浙江大学医学部第一付属病院の研究倫理委員会によって承認されました（承認番号：IIT20220893A）。 臨床情報は書面によるインフォームドコンセント後に収集されました。 この研究は、人類遺伝資源の審査と承認に関する科学技術省 (MOST) のガイダンス (承認番号: 2023BAT0303) に準拠しています。

HEK293T 細胞 (カタログ CL-0005) および 3T3 セル (カタログ CL-0006) は、会社 (Procell Life Science&Technology) に注文されました。 雄の野生型 C57BL6/J マウス (6 ～ 8 週齢) を Shanghai SLAC Laboratory Animal に注文しました。 研究では雄のマウスのみを使用しました。 性別は、この分野における同様の研究に基づいて決定されました。 マウスは、12 時間の明暗サイクル、温度 18 ～ 23 °C、湿度 40 ～ 60% などの標準的な実験室条件下で個別に飼育され、マウスの餌と水は自由に摂取できました。 すべての実験は、浙江大学実験動物センターの関連規制基準に準拠しました。 マウス組織の FFPE サンプルは、浙江大学医学部の中核施設によって調製されました。 臨床ヒト癌の FFPE 組織は、浙江大学医学部第一付属病院から提供されました。 大小柱塊状肝細胞癌と正常な HCC の FFPE 組織は、2 人の中国人男性患者 (それぞれ 43 歳と 45 歳) から外科的切除によって採取されました。 初回および再発の FFPE 臨床検体の対応するペアは、結腸直腸癌肝転移のある同じ中国人男性患者 (初発 62 歳、再発 64 歳) から採取されました。 臨床情報は、書面によるインフォームドコンセント後に収集されました。

HEK293T 細胞および 3T3 細胞は、10% (v/v) 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS、Gibco、カタログ番号 26010074) を補充したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM、Gibco、カタログ番号 11965092) で維持し、 5% CO2 インキュベーター (Thermo Heracell 240i) 内で 37 °C。 両方の細胞を 2 日ごとに継代しました。 種混合実験では、HEK293T 細胞と 3T3 細胞を収集し、4 °C、600 g で 3 分間遠心分離することにより PBS で 3 回洗浄しました。 細胞を、4°でインキュベートする前に冷やした核溶解バッファー (0.1% Nonidet P-40 (NP-40、Aladdin、カタログ番号 N274254) および 1 U/μL RNase 阻害剤 (Invitrogen、カタログ番号 N8080119) を含む 1X PBS) によって溶解しました。 Cで5分間。 次に、新鮮な核を 3 回洗浄し、PBS 中の 4% パラホルムアルデヒド (PFA、Aladdin、カタログ番号 P395744) 1 mL を加え、室温で 15 分間インキュベートすることによって固定しました。 次に、600gで3分間遠心分離することによってPFAを除去し、核を1mLの前冷した洗浄緩衝液(1U/μLのRNase阻害剤を含む1X PBS)で3回洗浄した。 事前に冷却した洗浄バッファーで希釈した500 μLの0.1% Triton X-100 (Aladdin、カタログ番号 T109027) を加えて核を透過処理し、4℃で5分間インキュベートしました。 次に、1 mL の洗浄バッファーを核に直接添加し、核を 1 mL の事前に冷却した洗浄バッファーで 3 回洗浄しました。 HEK293T 核と 3T3 核をそれぞれ計数し、均等に混合しました。 次に、混合物を以下の snRandom-seq プロトコールに従って単一核 RNA-seq に処理しました。

FFPE サンプルをパラフィンブロックから切り出し、室温で 5 分間、1 mL キシレン (Aladdin、カタログ番号 X112054) で 2 回洗浄してパラフィンを除去しました。 純粋な 100% エタノールから始めて 30% エタノールで終わる段階的な一連のエタノール溶液 (Aladdin、カタログ番号 E130059) にサンプルを浸漬することにより、サンプルを穏やかに再脱水しました。 次に、サンプルを予冷洗浄バッファーで 2 回洗浄し、予冷溶解バ​​ッファー (1X PBS バッファー、 0.1% Triton X-100、1 U/μL RNase Inhibitor) を氷上で加えます。 均質化後、追加の 1 mL の溶解バッファーを使用してダンサーをリンスし、100 μL の 10 mg/mL プロテイナーゼ K (Sangon Biotech、カタログ番号 A610451) を溶解バッファーに加え、37 °C で 5 分間インキュベートしました。 。 次に、単離された核を 20 μm セル ストレーナー (pluriSelect、カタログ番号 43-10020-40) で濾過し、洗浄バッファーで 2 回洗浄しました。 核のアリコートを DAPI (4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール) 染色溶液 (Abcam、カタログ番号 ab228549) で染色し、血球計にロードし、倒立蛍光顕微鏡 (Nikon Eclipse、Ts2-FL) で観察しました。 適格な単一核を、以下の snRandom-seq プロトコールに従って単一核 RNA-seq に処理しました。 溶解バッファーと透過化バッファーの量、反応システム、反応プログラムなどの詳細なプロトコルは、補足情報ファイル (補足注 1: snRandom-seq プロトコル 1.0) に記載されています。

成体マウス組織の新鮮なサンプルを、FFPE サンプルと同じマウスから採取しました。 新鮮なサンプルを事前に冷却した洗浄緩衝液で２回洗浄し、細かく切断し、氷上で事前に冷却した溶解緩衝液を用いてダウンスホモジナイザーを用いてホモジナイズした。 均質化後、単離された核を洗浄緩衝液で２回洗浄した。 細胞株プロトコルに従って、新鮮な単核を固定、透過処理、および適格化した後、次の snRandom-seq プロトコールに従って単核 RNA-seq に処理しました。

FFPE マウス腎臓の 2 つの同一サンプルを同じパラフィン ブロックから別々に切り出し、snRandom-seq プロトコルで処理しました。

適格な FFPE 核をカウントし、合計 100,000 ～ 1000,000 個の核を in situ DNA ブロッキングに使用しました。 以下の反応混合物を調製しました: 25.5 μL PBS 中の核、5 μL 10 μM ブロックプライマー、2 μL DNA ポリメラーゼ、10 μL 5X DNA 重合バッファー、5 μL 100 mM dNTP、2.5 μL RNase インヒビター。 ブロック プライマーの配列は補足情報ファイル (補足表 1: プライマー) に記載されています。 DNA ポリメラーゼ キットは、M20 Genomics に注文した VITAPilote-EFT1300 キット (カタログ番号 R20123124) に含まれていました。 反応混合物を 37 °C で 30 分間インキュベートしました。 インキュベーション後、核をＰＢＳＴ（０．０５％Ｔ－ｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳ）で３回洗浄して、残留ブロッキングプライマーおよびプライマーダイマーを洗い流した。

In situ では、以下の反応混合物を使用して逆転写を実行しました: 22.5 μL PBS 中の 100,000 ～ 1000,000 個の核、5 μL 10 μM ランダムプライマー、5 μL 10 μM オリゴ(dT) プライマー、2.5 μL 逆転写酵素、10 μL 5X 逆転写転写バッファー、2.5 μL 100 mM dNTP、2.5 μL RNase インヒビター。 ランダム プライマーとオリゴ (dT) プライマーの配列は、補足情報ファイル (補足表 1: プライマー) に提供されています。 逆転写キットは、M20 Genomics に注文した VITAPilote-EFT1300 キット (カタログ番号 R20123124) に含まれていました。 反応混合物を、8 °C から 42 °C まで昇温する複数のアニーリングと 42 °C で 30 分間の 12 サイクルでインキュベートしました。 逆転写後、核をPBSTで3回洗浄して、残留ランダムプライマーおよびプライマーダイマーを洗い流しました。

dA テーリングのために、以下の反応混合物を調製しました: 39 µL PBS 中に 100,000 ～ 1000,000 個の核、5 µL 10X TdT 反応バッファー、0.5 µL TdT 酵素、0.5 µL 100 mM dATP (NEB、カタログ番号 N0440S)、5 µL CoCl2 。 TdT 反応キットは NEB から注文しました (カタログ番号 M0315S)。10X TdT 反応バッファー、TdT 酵素、および CoCl2 が含まれています。 dA テーリング反応混合物を 37 °C で 30 分間インキュベートし、その後 0.05% Tween 20 を含む PBS で 3 回洗浄しました。

マイクロ流体デバイスは、以前の研究に従って AutoCAD (2021、AutoDESK、米国) を使用して設計されました17。 コンピュータ支援デザインはフォトマスクとして印刷され、シリコン ウェーハ上にマスターとして隆起したパターンを固定します。 デバイスの設計は補足 1a および補足 2a で提供されます。 デバイスのチャネル深さは、ヒドロゲルビーズの場合は 30 μm、細胞のカプセル化の場合は 50 μm です。 マイクロ流体デバイスは、記載されているプロトコルに従ってポリジメチルシロキサン (PDMS) を使用して製造されました 42。 PDMS ベースと硬化剤 (10:1、wt/wt) を Thinky Mixer で混合し、マスターを型として使用してチャネルにマークを付けました。 次に、PDMS スラブを取得し、入口ポートと出口ポートに穴を開けました。 チャネル側を酸素プラズマで処理し、PDMSスラブをスライドガラスに接着して、マイクロ流体デバイスを得た。 このデバイスを使用する前に、単分散で信頼性の高い液滴を生成するために、チャネル表面をペルフルオロドデシルトリクロロシランで親フッ素性コーティングで処理してください。

以前の研究16、17に基づいてバーコード付きビーズを設計し、M20 Genomics社とカスタマイズしました。 ヒドロゲルビーズは、アクリルアミド-プライマー混合物のマイクロ流体乳化および重合によって合成されました。 アクリルアミド-プライマー ミックスには、1 × アクリルアミド:ビス-アクリルアミド溶液 (Invitrogen、カタログ番号 AM9022)、50 μM アクリダイト修飾オリゴヌクレオチド、10% wt/vol 過硫酸アンモニウム (APS、Sangon Biotech カタログ番号 A100486-0025)、および 1 が含まれています。 ×トリス緩衝生理食塩水-EDTA-トリトン(TBSET)緩衝液。 この研究では、アクリダイト修飾オリゴヌクレオチドは、光切断性部分の代わりにデオキシウリジン塩基を含むように設計されました。 次に、2 段階の伸長反応ではなく 3 段階のライゲーションを行うため、ビーズを独自のバーコード プライマー内で 96 ウェル プレートに分割しました。 バーコード プライマーの配列は、補足情報ファイル (補足表 1: プライマー) で提供されています。

液滴バーコーディングは、以前の研究16、17に従って実行されました。 in situ反応後の単核の形態を光学顕微鏡で観察した。 単一核を計数し、30% 密度勾配溶液で希釈しました。 核、2X DNA 伸長反応混合物、およびバーコード付きビーズを、前述のようにマイクロ流体プラットフォームを使用して液滴にカプセル化しました。 2X DNA 伸長反応ミックスは M20 Genomics に注文しました。 次に、エマルジョンを 37 °C で 1 時間、50 °C で 30 分間、60 °C で 30 分間、および 75 °C で 20 分間インキュベートしました。 バーコーディング反応後、PFO バッファーと混合することで液滴を破壊しました。 水相を取り出し、Ampure XPビーズ(Beckmen、カタログ番号A63881)により精製した。 PCR を実行して、Primer1 および Primer2 プライマーを使用して精製産物を増幅しました (補足表 1)。 増幅産物をAmpure XPビーズで精製し、Qubit (Invitrogen)で定量した。

増幅および精製後、VAHTS Universal DNA Library Prep Kit for Illumina V3 (Vazyme、カタログ番号 ND607-01) を使用してライブラリーを構築しました。 インプット DNA は Qubit2.0 (Life Technologies) で定量化され、サイズは Qsep100™ DNA Fragment Analyzer (BIOptic) で測定されました。 次いで、末端修復およびアデニル化を行った。 断片化された DNA (50 ng)、末端修復バッファー、末端修復酵素、およびヌクレアーゼフリー水を含む反応混合物を 30 °C で 30 分間インキュベートし、65 °C で 30 分間不活化しました。 完成したエンドプレップ反応混合物に、機能するアダプターおよびライゲーション酵素を加え、20 °C で 15 分間インキュベートしました。 連結された DNA を精製し、AMPure XP ビーズ (Beckmen、カタログ番号 A63881) を使用してサイズを選択しました。 ライブラリーの増幅に続いて、AMPure XP ビーズを使用して精製を実行しました。 最終ライブラリは Qubit2.0 で定量され、ライブラリ サイズは Qsep100™ DNA フラグメント アナライザーで測定されました。 ライブラリーのシーケンスは、NovaSeq 6000 および S4 試薬キットを使用し、ペアエンド リード 150 で実行されました。

まず、プライマー配列と dA テーリング ステップによって生成された余分な塩基を、生の配列決定データからトリミングしました。 次に、各 Read1 について、UMI (8 nt) と細胞固有のバーコード (30 nt) を抽出し、2 nt 以下のハミング距離で同じ受け入れられたバーコードに一意に割り当てることができるシーケンス化されたバーコードをマージしました。 Read2 は、STAR (2.7.10a) の STARsolo モジュールによって適切なパラメーターを使用して遺伝子発現行列を生成するために使用されました。 有効な核は STARsolo によって同定されました。 Bedtools (2.26.0) を使用してトランスクリプトーム カバレッジを計算しました。 IGV(2.13.2) を使用してゲノム カバレッジ プロットを生成しました。 R (4.2.1) の ggplot2 (3.3.5) を使用して生のプロットを生成しました。

バーコード フィルター処理された遺伝子発現マトリックスは、ミトコンドリア RNA とリボソーム RNA が除去されて生成されました。 snRNA-seq データの分析と視覚化は、RStudio と Seurat 3 ツールキットを使用して行われ、前処理、統合、視覚化、クラスタリング、細胞型の同定、発現差のテストが含まれます。 検出された遺伝子が 200 個未満の核、および検出された遺伝子が 3 個未満の核をフィルターで除外しました。 snRNA-seq データセットの統合では、まず Seurat の sctransform 関数を使用してカウントを正規化し 43、正準相関分析 (CCA) を使用して統合しました 44。 統合は、FFPE/新鮮な比較サンプル (FFPE1、FFPE2、および新鮮) 全体で実行されました。 各サンプルについて、2000 個のアンカーが特定され、snRNA-seq データセットは 20 次元を使用して IntegrateData 関数で統合されました 44。 統合されたデータセットは、主成分分析 (PCA)、30 台の PC を使用した FindNeighbors、解像度 1 の FindClusters 関数を実行することにより、共有最近傍 (SNN) グラフを構築しました。クラスターは、t 分布確率的近傍埋め込み (t-SNE) を使用して視覚化されました。 Seurat で実装された主コンポーネントの一部。 各クラスターの細胞型の同一性は、公開されているマーカー遺伝子のリストを使用して手動で決定されました。 マーカー遺伝子は、Seurat の FindAllMarkers 関数を使用してテストで識別され、フィルター基準 (only.pos = TRUE、min.pct = 0.25、logfc.threshold = 0.25) に一致するマーカー遺伝子が維持されました。 細胞周期期は、S 期および G2/M 期の標準マーカー遺伝子の発現に基づいて各細胞をスコアリングする Seurat に含まれる機能を使用して予測されました。

FFPE と新鮮なサンプル間、および 2 つの技術的複製間の遺伝子発現レベルを比較するために、カウント データを Seurat (v3 および v4.1.1) にインポートし、デフォルト設定でデータを正規化し、スケーリングしました。 次に、Seurat の AverageExpression 関数を使用して、正規化された式の平均を計算しました。 その後、疑似カウントを 1 つ加えた平均式の自然対数をプロットし、R(4.2.1) の ggpubr (0.4.0) を使用して変動係数と p 値を計算しました。

snRandom-seq データの出力ファイルを scVelo (バージョン 0.2.4) で処理して、スプライスされた転写産物とスプライスされていない転写産物にタグを付け、その結果を R の velocyto.R 0.6 パッケージで分析しました。

セル通信分析は、R パッケージ CellChat (バージョン 1.6.1) をデフォルトのパラメーターで使用して実行されました。

各実験の統計的詳細は図の凡例に示されています。 マイクロ流体カプセル化実験、FFPE 単核単離実験、ビーズ合成実験、DNA 断片分析実験、プロテイナーゼ K とコラゲナーゼの比較実験、RNA 品質 (DV200) 比較実験を独立して 5 回以上繰り返しましたが、同様の結果が得られました。 293T-3T3 混合実験と DNA ブロック実験を独立して 3 回繰り返しましたが、同様の結果が得られました。 サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでした。 分析から除外されたデータはありません。 実験はランダム化されていませんでした。 研究者らは、実験と結果の評価中に割り当てについて知らされていませんでした。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で生成された snRandom-seq snRNA-seq データセットは、アクセッション コード「CRA010745」（293T-3T3 混合物およびマウス FFPE 組織）および「HRA003712」（MTM-HCC および正常 HCC FFPE サンプル）でゲノム配列アーカイブに寄託されています。 。 この研究で使用した 10X Chromium Single Cell 3' Solution V3 による 293T および 3T3 細胞混合物の公開 scRNA-seq データは、アクセッション コード「SRP073767」で Short Read Archive から入手できます。 VASA-drop による 293T 細胞の公開 scRNA-seq データは、Gene Expression Omnibus でアクセッション コード「GSE176588」で入手できます。 ソースデータはこの文書で提供されます。

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このプロジェクトは、中国国家自然科学財団（No. 32200073、YW、No. 82200977、ZX）および浙江省の革新的および起業家チーム紹介プログラム（No. 2021R01012、YW）によって支援されました。 浙江大学医療センターと良渚研究室の中核施設による技術支援に感謝します。 浙江大学医学部中核施設の Jingyao Chen 氏と Chengcheng Zhang 氏の技術サポートに感謝いたします。

Ziye Xu、Tianyu Zhang、Hongyu Chen の著者も同様に貢献しました。

中国杭州市の浙江大学医学部第一附属病院検査医学科

Ziye Xu、Yu Chen、Yongcheng Wang

中国、杭州、浙江大学医療センター、良渚研究室

Ziye Xu、Yuyi Zhu、Yuexiao Lv、Haide Chen、Guoji Guo、Yongcheng Wang

M20 ゲノミクス、杭州、中国

Tianyu Zhang、Shengyu Ni、Fangru Lu、Zhaolun Wang、Hao Yang、Ling Dong、Jiong Liu

杭州市立大学医学部、杭州、中国

ホンユー・チェン & ロンジャン・ファン

浙江大学生命情報学研究所、杭州、中国

ホンユー・チェン & ロンジャン・ファン

ジェームス D. ワトソンゲノム科学研究所、浙江大学、杭州、中国

ホンユー・チェン & ロンジャン・ファン

中国杭州の浙江大学生体医工学機器科学学部

張俊二、張ホン、王永成

米国ボストン、ハーバード大学医学部生物医療情報学部

チェン・ジアエ

中国杭州市の浙江大学医学部第一附属病院放射線科

リリー・ヤン & フェン・チェン

中国杭州市の浙江大学第一附属病院結腸直腸外科

ジャン・ウェイキン

中国杭州市の浙江大学医学部第二付属病院核医学科およびPET/CTセンター

ホン・チャン

中国浙江省杭州市の浙江大学医学部第二付属病院病理学科および腫瘍内科

ダンダン・チャン

中国杭州の浙江大学医学部、浙江省疾病プロテオミクス重点研究室病理学教室

ダンダン・チャン

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YW と ZX はこの研究を発案し、論文を執筆しました。 YW、GG、JL がプロジェクトを設計しました。 ZX、YZ、SZ、HDC、YL、HY、LD は snRandom-seq ケミストリーを開発しました。 ZX、TZ、LF、HYC、JC、SN、FL、ZW、DZ、YC がデータを分析しました。 YW、SZ、および YL はマイクロ流体プラットフォームを構築しました。 LY、WJ、FC、HZ は FFPE の人体実験に貢献しました。 YW、GG、LFがこのプロジェクトを監修しました。 すべての著者は最終原稿を改訂し、承認しました。

Longjiang Fan、Guoji Guo、Yongcheng Wang に相当します。

YW と ZX は、この研究方法に関する特許出願を中国特許庁に提出しました (出願番号: CN 114507711 A)。 複数の著者がこの技術の商品化に関与しており、M20 Genomics, Inc. と協力しています (LD と JL は共同創設者および従業員、YW と GG は共同創設者、株式保有者、およびコンサルタント、TZ と SN は従業員です)。残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Rui Chen と他の匿名の査読者に感謝します。 査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Xu、Z.、Zhang、T.、Chen、H. 他。 snRandom-seq によるホルマリン固定パラフィン包埋組織のハイスループット単核トータル RNA シーケンス。 Nat Commun 14、2734 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-38409-5

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受信日: 2022 年 11 月 10 日

受理日: 2023 年 4 月 27 日

公開日: 2023 年 5 月 12 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38409-5

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