単一がん細胞における染色体外環状 DNA とトランスクリプトームの並行シーケンス

Genetica della natura, volume 55,

Nature Genetics volume 55、pages 880–890 (2023)この記事を引用

8449 アクセス

159 オルトメトリック

メトリクスの詳細

染色体外 DNA (ecDNA) はがんによく見られますが、その起源、構造力学、腫瘍内不均一性への影響に関する多くの疑問はまだ未解決です。ここでは、単一細胞からの環状 DNA と完全長 mRNA の並行シーケンスのための方法である、単一細胞染色体外環状 DNA およびトランスクリプトームシーケンス (scEC&T-seq) について説明します。 scEC&T-seq をがん細胞に適用することで、構造的不均一性と転写への影響を調査しながら、ecDNA 含有量の細胞間差異を明らかにします。癌遺伝子を含む ecDNA は癌細胞内にクローン的に存在し、細胞間の癌遺伝子発現の差異を引き起こしました。対照的に、他の小さな環状 DNA は個々の細胞に排他的であり、それらの選択と増殖の違いを示しています。 ecDNA 構造の細胞間の違いは、ecDNA 進化のメカニズムとして環状組換えを示唆しています。これらの結果は、scEC&T-seq が癌細胞内の小さい環状 DNA と大きい環状 DNA の両方を系統的に特徴付けるアプローチであることを示しており、これにより癌およびその他の領域におけるこれらの DNA 要素の分析が容易になります。

同じ細胞内の複数のパラメータを測定することは、生物学的システムと疾患中のその変化を正確に理解するための鍵となります1。環状 DNA の場合、DNA 配列情報と転写出力測定値を統合して、細胞に対する機能的影響を評価することが重要です。ヒト細胞では、少なくとも 3 種類の環状 DNA を区別することができます 2、3、4、5: (1) 小さな環状 DNA (<100 kb)6。これらは、eccDNA 6、microDNA 4、アポトーシス環状 DNA 6、小環状 DNA などのさまざまな名前で記載されています。多分散環状 DNA7 およびテロメア環状 DNA または C サークル 8。 (2) T 細胞受容体切除サークル (TREC)9。 (3) 大きな (>100 kb)、発癌性の、コピー数増幅された環状染色体外 DNA 10、11 (ecDNA と呼ばれ、中期中に二重微小染色体として表示されます 12)。単一細胞の複数の特徴を特徴付ける能力が高まっているにもかかわらず 13、単一細胞の環状 DNA 含有量、構造、および配列の詳細な特徴付けは、現在のアプローチでは依然としてとらえどころがありません。

がんでは、ecDNA 上のがん遺伝子の増幅が、有糸分裂中に複製され不均等に分離される独自の能力を通じて細胞間のコピー数の不均一性を強力に促進するため、特に興味深いです 14、15、16、17、18、19。この不均一性により、腫瘍は治療法に適応して回避することができます 2,20,21,22。実際、ecDNA を保有するがん患者は有害な臨床転帰を示します 11。最近の研究では、エンハンサーを含む ecDNA が核ハブ内で相互作用し 17,23、トランス内の離れた染色体位置に影響を与える可能性があることが示されています 23,24。これは、癌遺伝子を持たない ecDNA であっても機能する可能性があることを示唆しています 23,24。さらに、我々は最近、機能的関連性がまだ知られていない、より小さいコピー数中立の環状 DNA の予期せぬレパートリーが腫瘍に存在することを明らかにしました 3。

この研究では、単一細胞染色体外環状 DNA およびトランスクリプトームシーケンス (scEC&T-seq) について報告します。これは、サイズ、内容、コピー数に関係なく、すべての環状 DNA タイプと単一の完全長 mRNA の並行シーケンスを可能にする方法です。細胞。我々は、構造的に複雑な多断片ecDNAと小さな環状DNAの両方を含む単一癌細胞のプロファイリングへのその有用性を実証します。

現在の最先端の環状 DNA 精製アプローチには、DNA の単離、続いてエキソヌクレアーゼ消化による直鎖状 DNA の除去、およびローリングサークル増幅による環状 DNA の濃縮という 3 つの連続したステップが含まれます 3,6,25。我々は、このアプローチは単一細胞にスケールダウンでき、Smart-seq2 (参考文献 26) と組み合わせることで環状 DNA と mRNA の並行配列決定が可能になる可能性があると推論しました。単一細胞における私たちの方法のベンチマークを行うために、以前にバルク集団で特性を調べた神経芽腫癌細胞株を使用しました3。 FACSを使用して細胞を96ウェルプレートに分離しました（図1a、補足図1a、b、および補足表1）。 DNA は、以前のアプローチと同様に、デオキシチミジン (オリゴ dT) プライマーの一本鎖配列に結合した磁気ビーズ上に捕捉されたポリアデニル化 RNA から分離されました 27。過去にバルク細胞集団で成功裏に実施されたように、DNA をエキソヌクレアーゼ消化に供し、環状 DNA を濃縮しました 3,6,25 (図 1b)。エキソヌクレアーゼ消化の前に PmeI エンドヌクレアーゼに供した DNA は、ネガティブコントロールとして機能しました 3。一部のケースでは、追加のコントロールとして DNA が未消化のまま残されました (図 1b)。さまざまな消化レジメン後に残った DNA が増幅されました。増幅されたDNAはIlluminaペアエンドシーケンシングに供され、場合によってはロングリードナノポアシークエンシングに供されました（図1a）。環状 DNA 解析用に以前に確立された計算アルゴリズムを使用して、環状 DNA の配列組成が分析され、環状領域のゲノム起源が推定されました 3。

a、scEC&T-seq 法の概略図。 b、実験条件と期待される結果の概略図。 c、試験した各実験条件について、3つの例示的なCHP-212細胞におけるmtDNA（chrM）の読み取り密度を比較するゲノムトラック。上から下へ、消化なし (紫)、1 日間のエキソヌクレアーゼ消化 (薄緑色)、5 日間のエキソヌクレアーゼ消化 (濃い緑色)、および 5 日間のエキソヌクレアーゼ消化前の PmeI によるエンドヌクレアーゼ消化 (灰色)。 d、CHP-212 (赤) および TR14 (青) 細胞における各実験条件で mtDNA にマッピングされたシーケンシングリードの割合。 e、CHP-212およびTR14細胞における各実験条件においてscEC&T-seqによって同定された環状DNA領域にマッピングされたシーケンシングリードの割合。 f、CHP-212およびTR14細胞における各実験条件においてscEC&T-seqによって同定された配列を標的とするエンドヌクレアーゼPmeIによる環状DNA領域にマッピングされたシーケンシングリードの割合。 d – f、サンプルサイズは条件全体で同じです：消化なし（n = 16 TR14細胞、n = 28 CHP-212細胞）。 1 日間のエキソヌクレアーゼ消化 (TR14 細胞 n = 37、CHP-212 細胞 n = 31)。 5 日間のエキソヌクレアーゼ消化 (n = 25 TR14 細胞、n = 150 CHP-212 細胞)。 5 日間のエキソヌクレアーゼ消化の前に PmeI によるエンドヌクレアーゼ消化 (TR14 細胞 n = 6、CHP-212 細胞 n = 12)。すべての統計分析は、両側ウェルチ t 検定に対応します。 P値を示します。すべての箱ひげ図で、ボックスは 25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルを表し、中央のバーが中央値で、ひげはボックスから 1.5 × 四分位範囲 (IQR) の範囲内にある最も遠い外れ値を表します。

ソースデータ

scEC&T-seq メソッドのパフォーマンスを評価するために、最初にミトコンドリア DNA (mtDNA) の検出と濃縮を評価しました。これは、mtDNA はすべての細胞に存在し、PmeI によって消化され、その環状性と染色体外の性質によりポジティブコントロールとして機能するためです。単一細胞の DNA をエキソヌクレアーゼに長時間曝露した後、mtDNA にマッピングされるリードの割合が大幅に高かったことが検出されました（P < 2.2 × 10−16、両側ウェルチ t 検定、図 1c、d および補足図 1c、 d)。これは、他のすべての環状DNAエレメントにも当てはまり（P < 2.2×10−16、両側ウェルチt検定、図1e）、環状DNAの有意な濃縮を示しています。 ecDNA領域、つまり癌遺伝子を含む大きな（>100 kb）環状DNAの大幅な濃縮が、1日間のエキソヌクレアーゼ消化後に観察されました（P = 2.10×10−5、両側ウェルチt検定;補足図1e）。。この濃縮は、5 日間の長時間のエキソヌクレアーゼ消化後のより小さい環状 DNA ほど顕著ではありませんでした。これは、ecDNA がより小さい環状 DNA と比較してエキソヌクレアーゼの存在下で安定性が低い可能性があること、または小さい環状 DNA が φ29 ポリメラーゼによってより効率的に増幅されることを示唆しています。 (補足図1e、f)。 5日間のエキソヌクレアーゼ消化前のPmeIエンドヌクレアーゼインキュベーションは、mtDNAへのリードマッピングを404.8倍大幅に減少させました（ P < 2.2×10−16、両側ウェルチt検定;図1c、dおよび補足図1c）。 PmeI 認識部位を含む環状 DNA にマッピングされたリードでも同様の枯渇が観察され、scEC&T-seq プロトコルを通じて環状 DNA の特異的な濃縮が確認されました（P < 2.2 × 10−16、両側ウェルチ t 検定。図 1f および補足図） .1g、h）。イルミナベースの環状 DNA とナノポアベースの環状 DNA 検出間の有意な一致は、シーケンス技術に依存しない再現性のある検出を示唆しました（両側ピアソン相関、R = 0.95、P < 2.2 × 10−16、補足図 2a〜d）。したがって、scEC&T-seq により、単一細胞からの環状 DNA の単離と配列決定が可能になります。

同じ細胞から分離された mRNA は、Smart-seq2 を使用して処理されました (参考文献 26、27) (図 1a および補足注 1)。細胞ごとに異なる遺伝子から平均9,058±1,163（平均±sd）の完全なmRNA転写物を検出しました（補足図3a〜cおよび補足表2）。教師なしクラスタリングにより、両方の細胞株集団が分離されました（補足図3d、e）。 scEC&T-seq が高品質の mRNA 配列データを提供するかどうかをテストするために、細胞周期サイン遺伝子発現を評価し、単一細胞を 3 つの細胞周期期 (G1、S、G2/M; 補足図 3f) に分類しました。 scEC&T-seq から推定された細胞周期分布は、FACS ベースの細胞周期解析を使用して測定されたものと一致し、その精度が確認されました (補足図 3g)。したがって、scEC&T-seq は、環状 DNA の濃縮と検出を可能にするだけでなく、単一のがん細胞における高品質の完全転写 mRNA の並行測定も可能にします。

適応度の利点をもたらす環状 DNA のみが癌細胞集団にクローン的に存在すると予想されます 22。私たちは最近、腫瘍には平均して 1,000 個を超える個々の環状 DNA が存在し、そのほとんどが小さく (100 kb 未満)、がん遺伝子が欠如し、がん遺伝子の増幅に寄与しないことを発見しました 3。しかし、それらの細胞間の違いは未調査のままであり、小さな環状 DNA が適応性の利点をもたらし、がん細胞内でクローン的に増殖するかどうかはまだ不明です 10。バルク集団における以前の報告と一致して、scEC&T-seq を使用して同定された個々の環状 DNA 領域の平均数は、神経芽腫細胞株の単一細胞あたり 97 から 1,939 (中央値 = 702) の間で変化しました (図 2a)。環状 DNA サイズ分布とゲノム起源は単一細胞間で類似しており、バルクシーケンスで観察された分布を反映していました 3 (最小 = 30 bp、最大 = 1.2 Mb、中央値 = 21,483 kb;図 2a および補足図 4a、b)。分析されたすべての細胞は選別時に生存しており（補足図1a、b）、単一細胞で検出されたほとんど（>95％）の環状DNAはアポトーシス環状DNAよりも大きく、ほとんどの環状DNAがアポトーシスの結果ではないことを示唆しています。他のレポート6で示唆されているように（図2aおよび補足図4a）。したがって、各がん細胞には、さまざまなゲノム状況からの広範囲の個々の環状 DNA が含まれています。

a、CHP-212 および TR14 神経芽腫単細胞における scEC&T-seq によって同定された個々の環状 DNA 領域 (<100 kb) の数と長さを表示するヒートマップ (n = 150 CHP-212 細胞、n = 25 TR14 細胞; ビンサイズ = 500 bp）、環状 DNA サイズ（上）と全体の環状 DNA 数（右）の密度分布。 b、CHP-212 および TR14 神経芽腫単一細胞におけるゲノム全体の環状 DNA 密度のヒートマップ (上: n = 150 CHP-212 細胞、ビンサイズ = 3 Mb; 下: n = 25 TR14 細胞、ビンサイズ = 3 Mb) 、およびバルク細胞集団における WGS からのゲノム全体の読み取り密度を表示するゲノムトラック。染色体 2 内の MYCN 遺伝子の位置が示されています。 c、d、CHP-212（n = 150）（c）およびTR14（n = 25）（d）細胞での再発分析。各環状DNAタイプから検出された環状DNAを含む細胞の画分として表示されます。 ecDNA は、バルクシーケンシング (緑色) および mtDNA または chrM (赤色) で同定されたコピー数増幅領域と重複する環状 DNA として定義されました。「その他」は、その他すべての小さな環状 DNA (青) として定義されます。データは平均値±標準誤差として表示されます。

予想通り、ほとんどの小さな環状 DNA には癌遺伝子が含まれていませんでした 10。細胞内で繰り返し検出される小さな環状DNAの全体的な割合は低かった（図2b〜dおよび補足図4c）。これは、小さな環状 DNA の小さなサブセットのみが癌細胞内でクローン的に増殖することを示しています。がんにおける既知の発がん性の役割と積極的な選択的利点と一致して、増幅された発がん遺伝子を含むecDNAが細胞内で繰り返し検出され（図2b〜d）、これはFISHによって検証されました（図2bおよび補足図5a〜c））。たとえ小さな環状 DNA の機能的関連性を排除することはできないとしても、観察された高いサブクローン性は、それらがクローン癌遺伝子増幅 ecDNA と同程度に癌細胞の適合性に寄与しないことを示唆しています。

私たちと他の研究者は、ecDNA が複雑な構造であり、異なる染色体からの再構成された断片を含む場合があることを最近示しました 23、28、29、30。 scEC＆T-seqががん遺伝子MYCN、CDK4、またはMDM2を保有するメガベースサイズのecDNAを繰り返し検出できたことを考慮して（図2b）、scEC＆T-seqがecDNA構造についての洞察を提供できるかどうかを尋ねました。実際、scEC&T-seq は、バルク集団に見られる前述の要素構造を再現するほぼすべての単一細胞のマルチフラグメント ecDNA を捕捉しました 23,28 (図 3a、b)。 ecDNA ブレークポイントごとに少なくとも 1 つのバリアントをサポートするリードが、単一細胞の約 30% で検出可能でした (補足表 3)。 ecDNAジャンクションスパニングリードのさらなる定量化と、ショートリードシーケンシングとロングリードシーケンシングの両方からの計算による構造バリアント（SV）検出により、セグメントの相互接続性が確認されました（補足図6a〜p、補足表4および5）。このような SV は、ecDNA3 上で融合転写産物の発現を引き起こす可能性があります。実際、融合転写物は、scEC&T-seqを使用して単一細胞で同定できました（図3cおよび補足図7）。したがって、scEC&T-seq は、単一細胞における ecDNA 関連 SV およびその結果生じる融合遺伝子発現を検出するのに十分な感度を持っています。

a、b、バルク細胞集団の WGS データから得られたロングリードおよびショートリードベースの ecDNA 再構成と、CHP-212 (n = 150) (a) および TR14 (n = 25) の単一細胞にわたる ecDNA 断片のリードカバレッジ）細胞（ｂ）ｓｃＥＣ＆Ｔ−ｓｅｑによって検出される。上から下に、ecDNAアンプリコンの再構築、コピー数プロファイル、遺伝子アノテーション、マージされた単一セルのecDNA領域の読み取り密度、および単一セルのecDNA領域のカバレッジ（行）。 c、TR14のCDK4 ecDNAの染色体セグメントの再構成から生じるscEC&T-seqによって検出された例示的な融合転写物。上から下に、マージされた TR14 単一細胞のブレークポイント領域にわたる scCircle-seq リードカバレッジ (対数スケール)、転写物のアノテーション、マージされた TR14 単一細胞の融合転写物にわたる scRNA-seq リードカバレッジ、ネイティブな転写産物の表現、および融合転写産物の表現。融合遺伝子を生じさせる CDK4 ecDNA 内の相互接続されたゲノムセグメントは、赤い破線で示されています。

ecDNA の不均等な有糸分裂分離は、ecDNA コピー数が単一細胞間で大きく異なる可能性があることを意味します 17,22。ほとんどの単一細胞では、マルチフラグメントecDNAの構造と組成に違いはありませんでした（図3a、b）。これは、ecDNAが培養細胞株中で構造的に安定していることを示唆しています。二項有糸分裂分離と強い適応度の利点によって予測されたように、ほとんどの単一の TR14 細胞には、バルク集団でも検出された 3 つの独立した癌遺伝子を保有する ecDNA がすべて含まれていました（図 3b および図 4a）。ただし、少数の細胞には独立した ecDNA のサブセットしか含まれていませんでした（図 4a ～ c）。これは、ecDNA 含有量の変動が集団の不均一性の原因として機能することを示唆しています。興味深いことに、MDM2を保有するecDNAはすべての単一細胞で検出されましたが、CDK4およびMYCNを保有するecDNAは一部の細胞で欠如しており（図4b、c）、ecDNA分離のまだ未定義の生物学的原理が存在する可能性があることを示唆しています。次に、ecDNA のコピー数の不均一性が ecDNA にコードされている遺伝子の発現に影響を与えるかどうかを調べました。相対的なecDNAコピー数の分布が、FISHを使用して測定されたコピー数分布と一致していることを確認しました（補足図8a〜h）。 SNP の段階は、ecDNA が各単一癌細胞の単一対立遺伝子起源であることを示唆し (補足図 9a、b)、バルク細胞集団における以前の観察を確認しました。遺伝子発現におけるコピー数による差異と一致して、相対的なecDNAコピー数は、同じ単一細胞内のecDNAに含まれる遺伝子のmRNA読み取り数と正の相関がありました（図4d–h）。クラスター化された ecDNA におけるエンハンサー相互作用も細胞間 ecDNA 発現変動に寄与する可能性がありますが 23、我々は ecDNA コピー数の不均一性が癌遺伝子発現における細胞間差異の主要な決定要因であるという証拠を提供します。

a、TR14 で同定された 3 つの独立した ecDNA の概略図: MYCN ecDNA (黄色)。 CDK4 ecDNA (青); および MDM2 ecDNA (赤)。 b、単一細胞（n = 25 TR14 細胞）における TR14 で同定された 3 つの ecDNA（MDM2、CDK4、MYCN）の共起を示す UpSet プロット。 c、3つの例示的なTR14細胞における再構成されたecDNA領域にわたる読み取り密度(対数スケール)によるゲノム追跡は、異なるecDNAが検出されたことを示している。 d、TR14およびCHP-212単一細胞におけるmRNA発現レベルのバイオリンプロット（両側ウェルチt検定; P = 0.0038（MYCN）、P < 2.2×10−16（LPIN1、TRIB2、CDK4、MDM2、MYT1L）） ); n = 171 CHP-212 細胞、n = 42 TR14 細胞。 e、f、CHP-212単一細胞の再構成されたMYCN ecDNA領域にわたるscEC＆T-seqからのecDNAとmRNAリードカウント間のペアワイズ比較（両側ピアソン相関、P < 2.2 × 10−16、R = 0.86、n = 150）細胞）（e）およびTR14単一細胞（両側ピアソン相関、P = 0.0056、R = 0.54、n = 25細胞）（f）。 g、h、TR14 単一細胞における再構成された CDK4 (g) および MDM2 (h) ecDNA に対する scEC&T-seq からの ecDNA と mRNA リード数のペアワイズ比較 (CDK4 および CDK4 については両側ピアソン相関、P = 0.0046、R = 0.55) MDM2 の P = 0.0019、R = 0.59、n = 25 TR14 セル）。

ソースデータ

一塩基変異体（SNV）は、細胞間の不均一性と腫瘍の進化の重要な推進力です 31。さらに、SNV は細胞内で追跡できるため、系統追跡アプリケーションへの使用が可能になります 32。 scEC&T-seq を使用して SNV を検出できるかどうかをテストするために、結合した単一細胞 scEC&T-seq データに SNV 検出アルゴリズムを適用し、検出された SNV をバルク集団の全ゲノム配列で同定された SNV と比較しました。 scEC&T を使用して検出されたほとんどの SNV は、全ゲノムでも検出されました (>69.5%)。 scEC&T-seqはmtDNAも検出するため（図2c、d）、過去の他の単一細胞アッセイで実証されたように、ヘテロプラズミックミトコンドリア変異により系統追跡が可能になる可能性があると仮説を立てました32（図1c、dおよび補足図1c）。実際、ホモプラズミックmtDNA変異体による教師なし階層クラスタリングにより、細胞の遺伝子型が正確に特定されました（補足図10a）。 mtDNA 上のヘテロプラズミック SNV は高い細胞間不均一性を明らかにし、個々の単一細胞上の教師なし階層クラスター化によりそれらがグループ化されました。これはサブクローン性を示し、系統追跡が可能になる可能性があります（補足図10bおよび補足図11a、b）。したがって、scEC&T-seq は mtDNA および ecDNA のヘテロプラズミックバリアントを検出できるため、系統推論を含む幅広い SNV ベースのアプリケーションと分析が可能になります。

大きな癌遺伝子を含む ecDNA 要素の起源と機能的影響は過去にある程度詳細に研究されてきましたが 33,34 、小さな環状 DNA がどのように形成され、それらが細胞の挙動にどのような影響を与えるのかはほとんど不明です。最近の研究では、アポトーシス中にいくつかの小さな円形要素が形成されることが示唆されています6。他の報告では、彼らの世代における異常な DNA 損傷修復の関与の証拠を提供しています 35。以前の報告36と同様に、我々は小さな環状DNAの環状切断点にマイクロホモロジーの存在を特定し、マイクロホモロジーを介した修復がそれらの生成に関与している可能性があることを示唆しました（補足図12）。単一細胞で確認された二峰性のサイズ分布（図2a）は、細胞内に少なくとも2種類の小さな環状DNAが存在することを示唆しました。非常に小さな環状 DNA (<3 kb) が、分析されたすべての単一細胞で見つかりました (図 2a および図 5a)。異なる細胞周期期の細胞間で非常に小さな環状DNAの割合に差は観察されず（図5b）、そのような小さな環状DNAが複製できるかどうかという疑問が生じました。これらの非常に小さな環状DNAの高い含有量に関連する経路を特定するために、このような小さな環状DNAの相対量が多い細胞のRNA発現と、相対含有量が低い細胞のRNA発現を比較しました（図5a）。 20の経路は、非常に小さな環状DNA含有量が高い細胞トランスクリプトームで有意に陽性に濃縮されました（図5c〜eおよび補足表6）。以前の研究と一致して、DNA損傷と修復経路35、37、38、アポトーシス6、およびテロメア維持39は、この小さな環状DNAサブタイプの相対含有量が高い細胞で著しく濃縮されていました（図5c〜e）。これは、scEC&T-seq が、小さな環状 DNA の起源と機能的影響に関する長年の疑問の解決に役立つことを示しています。

a、CHP-212 単一細胞中の比較的小さな環状 DNA (<3 kb) 含有量の密度プロット (n = 129)。発現差分析では、細胞を「低」(オレンジ色の領域、下位 40%) と「高」(紫色の領域、上位 40%) の 2 つのカテゴリーに分類しました。 b、CHP-212 (赤、n = 129) および TR14 (青、n = 20) の単一細胞におけるさまざまな細胞周期フェーズにおける小さな環状 DNA (<3 kb) の相対数を比較するヴァイオリンプロット。示された条件の間で両側ウェルチ t 検定が使用されました。 P値を示します。 c、相対的に非常に小さい環状DNA含量が高いCHP-212細胞が著しく豊富な細胞プロセス。調整された P 値と遺伝子数が表示されます。 d、DNA修復に関与する遺伝子の遺伝子セット濃縮分析（GSEA）プロット（調整済みP = 0.0415）。 e、DNA損傷刺激に対する細胞応答に関与する遺伝子のGSEAプロット（調整済みP = 0.0008）。 P 値は、Bejamini-Hochberg 法を使用して調整されました。

クロマチンの立体構造とアクセスしやすさは、DNA 損傷の感受性に影響を与える可能性があります40。我々は、小さな環状 DNA は、クロマチンのアクセス可能性または立体構造が異なる部位での DNA 損傷の産物である可能性があると仮説を立てました。この仮説を検証するために、CCCTC 結合因子 (CTCF) クロマチン免疫沈降の相対濃縮を測定し、その後シーケンス (ChIP – seq) を行い、比較した小さな環状 DNA の領域におけるシーケンス (ATAC – seq) ピークを使用してトランスポザーゼにアクセス可能なクロマチンをアッセイしました。それぞれゲノム内の他の部位に。単一の CHP-212 細胞で scEC&T-seq を使用して検出された小さな環状 DNA、およびバルク細胞集団で Circle-seq を使用して検出された小さな環状 DNA をこの分析に使用しました（補足図 13a-d）。興味深いことに、単一細胞とバルク細胞集団の両方で、環状 DNA 切断点が CTCF 結合部位で大幅に濃縮されました。小さな環状DNAが由来する領域が高いATAC-seqシグナルの部位で大幅に枯渇していたことを考慮すると、この濃縮はさらに顕著でした（補足図13e）。これは、CTCF 結合部位と、CTCF 結合部位に豊富に存在するアクセスできないクロマチン 41 が、切断や環状 DNA 形成を受けやすい可能性があることを示唆しています。バックグラウンド ChIP-seq シグナルを制御するために、小さな環状 DNA 形成部位での H3K4me1、H3K27ac、および H3K27me3 ChIP-seq ピークの濃縮を測定しました。すべての場合において、これらの部位では、ランダムに分布した領域で予想されるよりもかなり低い頻度で小さな環状DNAが見つかりました（補足図13f-h）。CTCF濃縮の特異性が確認され、H3K4me1、H3K27ac、およびH3K27me3でマークされた部位が存在する可能性があることを示しています。破損や循環から保護されます。クロマチンループ形成の媒介によるクロマチンの三次元構造の調節におけるCTCFの役割41を考慮すると、我々のデータは、CTCF媒介ループ押し出し中のDNA切断が小さな環状DNA形成のメカニズムを表している可能性を提起する。

次に、2つの神経芽腫からの単一核と2人の患者の血液サンプルから分離された生きたT細胞にscEC＆T-seqを適用しました（図6a、補足図14a、b、および15a〜t、および補足注1）。がん細胞で同定された個々の環状 DNA 要素の数は、正常な T 細胞や細胞株の細胞と比較して有意に多く、これは DNA 環状化が非形質転換細胞や培養細胞よりも腫瘍でより頻繁に起こっていることを示唆しています (図 6b)。環状DNAのサイズ分布と相対的なゲノム含有量は細胞株で観察されたものと同等であり、入力材料に関係なくscEC＆T-seqが環状DNAを再現性よく捕捉することを示唆しています（図6bおよび補足図4aおよび16a）。細胞株での我々の観察と一致して、繰り返し同定された小さな環状DNAの割合は低かった（補足図16b-d）。一方、大きな癌遺伝子を含むecDNAは腫瘍核内で繰り返し同定されましたが、T細胞では同定されませんでした（図6cおよび補足図16b〜d）。これは、それらの発癌性の役割と一致しています。 MYCN 含有 ecDNA は、両方の患者のほぼすべてのがん核で検出可能であり、FISH で確認されました（補足図 16e-g）。細胞株で観察されたように、MYCN転写の細胞間の差異は、相対的なecDNA含有量と正の相関がありました（補足図16h、i）。したがって、scEC&T-seq はヒト腫瘍にうまく適用できます。

a、腫瘍と血液サンプルの処理を説明する概略図。 b、原発腫瘍核（患者番号 1 では n = 93 核、患者番号 2 では n = 86 核）、神経芽腫細胞株単細胞（n = 25 TR14 細胞、n = 150 CHP-212 細胞）および非悪性単一 T 細胞（n = 38 患者番号 3、n = 41 患者番号 4）。 P 値は両側ウェルチ t 検定を使用して計算され、示されています。箱ひげ図のボックスは 25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルを表し、中央の棒は中央値で、ひげはボックスから最も遠い外れ値 ≤ IQR の 1.5 倍を表します。 c、神経芽腫原発腫瘍および正常T細胞におけるゲノム全体の環状DNA密度のヒートマップ（n = 93人の患者番号1、緑色; n = 86人の患者番号2、紫色; n = 38人の患者番号3、黄色; n = 38人の患者番号3、黄色。 n = 41 患者番号 4、オレンジ色、ビンサイズ = 3 Mb)。 chr2 内の MYCN 遺伝子の位置が示されています。

がんゲノムの最近の研究では、構造的に複雑な ecDNA が報告されています 3、11、18、19、28、29、42。しかし、バルク細胞集団の分析のため、構造的な ecDNA の不均一性を推測する能力には限界がありました。同じ単一核のロングリードナノポアシーケンシングを使用して、およびバルク細胞集団の全ゲノムシークエンシング（WGS）によって確認されたように、分析された両方の神経芽腫には、大きくて構造的に複雑なMYCN含有ecDNAが含まれていました（図7aおよび補足図17a）。一方、患者番号 1 の ecDNA 構造は 1は非常に複雑だったので、コンピューターで完全に再構築できませんでした（補足図17b）、他の患者（患者番号2）のMYCN含有ecDNAは構造的に5つの個別のゲノム断片で構成されており、すべて染色体2に由来していました。単一セルで確実に再構築できるほど単純な方法で、4つのSV（番号1〜4）によって接続されています（図7a）。我々は、この患者における細胞間ecDNA構造の不均一性の評価により、ecDNA構造動態の推論が容易になる可能性があると仮説を立てた。実際、ecDNAは単一細胞のサブセット間で構造的にかなり異なっていました（図7a、b）。 SV番号 1はすべての単一細胞に存在し、他のSVよりも前に発生し、環状化につながる初期変異体を表している可能性があることを示唆しています（図7b-d）。 SV 番号一方、2 ～ 4 は一部の細胞では検出されませんでした。また、SV No. 2とSV No. ３は６ｋｂの欠失の存在を示し、ＳＶｎｏ．図４は、ecDNA上のより大きな欠失（約180kb）の存在を裏付けており、両方ともすべてではないがほとんどの単一細胞に存在した（94.2％；図7c、d）。 SV 番号のブレークポイントでのスプリットリードの分析２および３、すなわち６ｋｂ欠失の端、および単一細胞におけるこの欠失にわたる範囲は、サブクローン番号２と名付けた３つの異なるサブクローン細胞集団の存在を示唆した。 1～3。クローン番号 1 には、欠失を欠いた完全な ecDNA が含まれていました。クローン番号 2には、欠失のあるecDNAと欠失のないecDNAの混合集団が含まれていました（図7b〜e）。クローンNo. 図3に示すように、検出されたSVと配列決定範囲は、欠失とすべてのSVの両方を含むecDNAの純粋な集団の存在を示しました（図7c〜e）。観察された細胞間構造的ecDNAの不均一性をもたらす最も単純な突然変異シーケンスは、MYCNおよび隣接する染色体領域を含むecDNA、すなわち、ecDNA変異体no.1を生成するSV no.1の単純な切除から始まる。クローン番号 1 で見つかりました。 1 (図7e、f)。これに続いて、2 つの単純な ecDNA の融合が行われます。 1 より複雑な再構成された ecDNA バリアントを生成するバリアント no. 2 には小さな 6 kb の欠失と SV 番号が含まれます。 SV 番号に加えて 2 と 3 1 (図7e、f)。このような循環組換えは、WGS43 に基づく最近のモデルと一致します。この ecDNA にさらに大きな欠失を追加すると、すべての SV 番号を持つ ecDNA バリアント 3 が作成されます。 1〜4および両方の欠失（図7e、f）。これらの神経芽腫細胞における ecDNA バリアント 3 の優勢は、それが正の選択的利点を与える可能性があることを示唆しています。 scEC&T-seq が ecDNA の構造動態の推論に役立つという我々の原理実証は、scEC&T-seq が ecDNA の起源と進化に関する重要な未解決の疑問に対処する将来の研究を促進する可能性があることを示しています。

a、バルク集団の WGS データから得られたロングリードベースの ecDNA 再構成と、患者 1 番の単一核にわたる ecDNA フラグメントのリードカバレッジ。ロングリードまたはショートリード scEC&T-seq によって検出された 2 (n = 86 核)。上から下へ、ecDNA アンプリコン再構成 (ecDNA 上の SV は色付けされています。SV 番号 1 ～ 4)、遺伝子アノテーション、バルクロングリード Nanopore WGS データの ecDNA 領域の読み取り密度、マージされた単一データの ecDNA 領域の読み取り密度ロングリードまたはショートリード scEC&T-seq によって検出される、核および単一核 (行) 内の ecDNA 領域にわたるカバー率。 6 kb の欠失は赤色で強調表示されます。単一のアスタリスクは、参照ゲノム (hg19) のマッピング不可能な領域を示します。 b、患者番号 1 の単一核にわたる ecDNA 上の同定された 6 kb 欠失にわたる 500 bp ウィンドウ内のリードの総数 (対数スケール) のヒートマップ。 2 (n = 86 核)。ｃ、患者番号１０２において同定された３つのクローン変異体のゲノムトラックの例。 2は、ecDNA要素上の6 kbの欠失の有無に基づいています。対数スケールの総読み取り密度は青で示され、円のエッジをサポートする読み取り密度は灰色で示されます。ｄ、ＳＶ番号の検出。図 1 ～ 4 は、3 つの特定されたクローン変異体グループを表す 8 つの例示的な単一細胞における多重断片化 ecDNA エレメントをサポートしています (SV をサポートする 1 リード以上、灰色、SV をサポートする 0 リード、白色)。 e、dで検出されたecDNAバリアント1〜3の概略図。 f、患者番号 1 の ecDNA 構造の進化の概略的解釈。 2は、scEC&T-seqデータで特定されたecDNAバリアントに基づいています。各 ecDNA バリアントにおける MYCN 癌遺伝子とその局所エンハンサー要素 (e1 ～ e5) の位置が単一のアスタリスクで示されています。

調節エレメントは通常、ecDNA 上で増幅され、ecDNA 上のがん遺伝子の転写調節に重要な役割を果たしており、強力なポジティブ選択下にあると考えられています 28,29。実際、最近記載されたMYCN特異的エンハンサーエレメント28,29の少なくとも1つが、神経芽腫単細胞の82.7％を超えるMYCNを有するecDNA上で繰り返し検出された（図7fおよび補足図18a）。興味深いことに、患者番号 2 で欠失が検出されました。 2、すなわちecDNAバリアント3は、ecDNAバリアント2に存在する調節要素e2およびe3を含む、2つのMYCN遺伝子コピーのうちの1つの喪失をもたらすと予測される（図7f）。これは、エンハンサー：がん遺伝子の化学量論の変化（バリアント 3 では 6:1、バリアント 2 では 8:2）、つまり ecDNA 上のがん遺伝子のコピーが 2 つではなく 1 つ存在することが、がん遺伝子の発現に有益である可能性を高める可能性があります。それは、ecDNA 上のエンハンサーをより効率的に使用できる可能性があるためです。このようなメカニズムは、ecDNA 変異体番号 2 が観察された優位性を説明できる可能性があります。腫瘍細胞集団では3番目。

最近の報告では、癌遺伝子を持たないがエンハンサー要素を含む ecDNA が存在し、線状染色体上または ecDNA ハブの一部としてトランスで他の ecDNA 上の転写出力を増強できることが示唆されています 17,23。このような ecDNA 要素を同定するために、神経芽腫細胞からの H3K4me1、H3K27ac、H3K27me3 ChIP-seq および ATAC-seq データを分析し、これらの領域を含むが癌遺伝子を含まない ecDNA を検索しました。単一の神経芽腫細胞では、エンハンサー要素のみを含む ecDNA が繰り返し同定されることはありませんでした。繰り返し検出されたすべての ecDNA には、少なくとも 1 つの癌遺伝子が含まれていました。ただし、調節要素を含むゲノム領域のみを含む、非再発性の小さな環状DNAの大規模なセットが同定されました（補足図18b）。しかし、これらの環状 DNA エレメントが再発しないことは、それらがこれらの癌細胞内で維持されていないか、または積極的な選択的利点を与えていないことを示唆しています。したがって、scEC&T-seq により非コード環状 DNA の検出が可能になり、がんにおける転写制御におけるそれらの役割の将来の研究が可能になります。

我々は、単一癌細胞由来の環状 DNA と mRNA の並行配列決定により、scEC&T-seq が ecDNA による細胞間癌遺伝子のコピー数の不均一性の転写の影響を容易に識別するだけでなく、ecDNA の構造進化の原理を明らかにする可能性があることを示しました。私たちは、scEC&T-seq による細胞の環状 DNA 含有量とトランスクリプトームの統合分析により、がんおよびそれ以降の環状 DNA の範囲、機能、不均一性、進化をより完全に理解できるようになると信じています。

scEC&T-seq は、最近発表された単細胞 DNA および単細胞 RNA シークエンシング (scRNA-seq) の方法を補完します 23,27 が、染色体内環状アンプリコンと染色体外環状アンプリコンを容易に区別することはできません。 scEC&T-seq は自動化に対応していますが、複雑な環状 DNA 濃縮手順ではスループットが低いため、細胞あたりのコストが上昇し、現時点ではこの方法の限界となっています。ただし、液滴ベースのマイクロ流体単一細胞技術と比較して、プレートベースの scEC&T-seq は細胞あたり均一な数のリードを生成し、選択と再シーケンスに利用できる独立したシーケンスライブラリを生成します。これは、高いシーケンスカバレッジが必要な場合に有利です。実際、我々は、scEC&T をさまざまなシーケンス技術と組み合わせることができることを示しました。 scEC&T-seq によって提供される詳細レベルは、ハイスループット手法の詳細レベルをはるかに上回ります。私たちの方法を、Strand-seq 44 などの他の単一細胞技術や、単一細胞トライチャネル処理 45 などの処理アプローチと組み合わせることで、scEC&T-seq によって検出される体細胞変異のスペクトルが増加する可能性があります。

単一癌細胞で scEC&T-seq を実行すると、コピー数や環状 DNA サイズとは関係なく、その環状 DNA 含有量をプロファイリングすることができました。小さな環状 DNA が生きた単一細胞で同定されたことは、アポトーシスがその生成の唯一のメカニズムではないことを示唆しています。癌遺伝子を含む ecDNA は単一細胞にクローン的に存在していましたが、小さな環状 DNA は単一細胞にのみ存在していました。これは、小さな環状 DNA がおそらく癌細胞に選択的な利点を与えていないことを示すだけでなく、これらの環状 DNA の選択、増殖、維持のためのまだ知られていない前提条件の存在も示唆しています。

単一のがん細胞における環状 DNA および mRNA シーケンシングの統合の強力な実証は、同じアプローチをさまざまな生物学的システムに適用して、単一細胞における環状 DNA の多様性と不変性をさらに調査できることを示しています。したがって、我々は、我々の方法が癌生物学を超えた多くの分野における将来の研究のリソースとなることを期待しており、環状 DNA に関する現在未解決の生物学的疑問の多くを解決する可能性があることを示唆しています。

scEC&T-seq の詳細な段階的なプロトコルは、Nature Protocol Exchange 46 で入手でき、以下に説明されています。プロトコールの期間は、96 ウェルプレートあたり約 8 日間です。

ヒト腫瘍細胞株は、ATCC (CHP-212) から入手するか、JJ Molenaar (TR14; Princess Maxima Center for Pediatric Oncology) から提供されました。すべての細胞株の同一性は、ショートタンデムリピートジェノタイピング (Genetica DNA Laboratories および IDEXX BioResearch) によって検証されました。マイコプラズマ属の不在汚染は、Lonza MycoAlert 検出システムで判定されました。細胞株は、1% ペニシリン、ストレプトマイシンおよび 10% FCS を補充した Roswell Park Memorial Institute 1640 培地 (Thermo Fisher Scientific) で培養しました。生存細胞の数を評価するために、細胞をトリプシン処理(Gibco)し、培地に再懸濁し、500 gで5分間沈降させた。次に細胞を培地に再懸濁し、0.02% トリパンブルー (Thermo Fisher Scientific) と 1:1 の比率で混合し、TC20 セルカウンター (Bio-Rad Laboratories) で計数しました。

細胞を15 cmディッシュで80%コンフルエントになるまで増殖させ、KaryoMAX Colcemid (10 μl ml-1、Gibco)を1～2時間添加して中期を停止させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理（Ｇｉｂｃｏ）し、２００ｇで１０分間遠心分離した。 37 °C に予熱した 0.075 M KCl 10 ml を一度に 1 ml 加え、途中で最大速度でボルテックスしました。その後、細胞を 37 °C で 20 分間インキュベートしました。次に、5 mlの氷冷した3:1 MeOH:酢酸(-20℃に維持)を一度に1 mlずつ加え、続いてチューブをはじいて細胞を再懸濁した。サンプルを200gで5分間遠心分離しました。固定液の添加とその後の遠心分離を４回繰り返した。 200μlのMeOH:酢酸中の細胞を2滴、予熱したスライド上に15cmの高さから滴下しました。スライドを一晩インキュベートした。

スライドをMeOH:酢酸中で-20℃で10分間固定し、続いてスライドを室温で5分間PBS中で洗浄した。スライドを、10μlのペプシン(1g 50ml-1)を添加したペプシン溶液(0.001N HCl)中で37℃で10分間インキュベートした。スライドを0.5×生理食塩水-クエン酸ナトリウム(SSC)緩衝液で5分間洗浄し、70%、90%および100%冷エタノール(-20℃で保存)で3分間洗浄することにより脱水した。乾燥スライドを 10 µl の Vysis LSI N-MYC SpectrumGreen/CEP 2 SpectrumOrange プローブ (Abbott)、ZytoLight SPEC CDK4/CEN 12 デュアルカラープローブ (ZytoVision) または ZytoLight SPEC MDM2/CEN 12 デュアルカラープローブ (ZytoVision) でカバーし、染色しました。カバースリップを貼り、ゴム糊で密封します。変性は、ThermoBrite システム (Abbott) で 72 °C で 5 分間、その後 37 °C で一晩インキュベートして行われました。スライドを2×SSC/0.1% IGEPAL中で室温で5分間洗浄し、続いて0.4×SSC/0.3% IGEPAL (Sigma-Aldrich)中で60℃で3分間洗浄し、さらに2×SSC/0.1%で洗浄した。 % IGEPAL を室温で 3 分間混合します。乾燥したスライドを 12 μl の Hoechst 33342 (10 μM、Thermo Fisher Scientific) で 10 分間染色し、PBS で 5 分間洗浄しました。乾燥後、カバースリップをスライド上に取り付け、マニキュアで密封した。画像は、Leica SP5 共焦点顕微鏡 (Leica Microsystems) を使用して撮影されました。

間期 FISH 用の CHP-212 細胞と TR14 細胞を 8 チャンバースライド (Nunc Lab-Tek、Thermo Scientific Scientific) で 80% コンフルエンスまで増殖させました。ウェルをMeOH:酢酸中で-20℃で20分間固定し、続いて室温で5分間PBSで洗浄した。ウェルを除去し、スライドをペプシン溶液(0.001 N HCl)中で10μlのペプシン(1g 50ml-1)を加えて37℃で10分間消化した。 0.5×SSCで5分間洗浄した後、スライドを、-20℃で保存した70％、90％、および100％の冷エタノールで洗浄することによって脱水した（各溶液で3分間）。乾燥したスライドを 5 μl の Vysis LSI N-MYC SpectrumGreen/CEP 2 SpectrumOrange プローブ、ZytoLight SPEC CDK4/CEN 12 デュアルカラープローブ、または ZytoLight SPEC MDM2/CEN 12 デュアルカラープローブのいずれかで染色し、カバースリップで覆い、ゴム糊で密封しました。。変性は、ThermoBrite システム内で 72 °C で 5 分間、続いて 37 °C で一晩行われました。スライドを2×SSC/0.1% IGEPAL中で室温で5分間洗浄し、続いて0.4×SSC/0.3% IGEPAL中で60℃で3分間洗浄し、さらに室温の2×SSC/0.1% IGEPAL中で3分間洗浄した。。乾燥したスライドを12μlのHoechst 33342 (10μM)で10分間染色し、PBSで5分間洗浄した。乾燥後、カバースリップをスライド上に取り付け、マニキュアで密封した。画像は、Leica SP5 共焦点顕微鏡で撮影されました。 ecDNA コピー数の推定では、関数 find maxima を備えた FIJI v.2.1.0 を使用して病巣をカウントしました。核境界は関心領域としてマークされました。対象領域内の信号検出の閾値は手動で決定され、1 つのグループ内で分析されたすべての画像に使用されました。

この研究には、1991年から2022年の間に神経芽腫と診断された患者の腫瘍サンプルと血液サンプルが含まれています。患者はドイツ小児腫瘍血液学会（GPOH）の治験プロトコルに従って登録され、治療されました。この研究は、世界医師会ヘルシンキ宣言（2013 年版）および適正臨床慣行に従って実施されました。すべての患者またはその保護者からインフォームドコンセントが得られました。患者検体の収集と使用は、ベルリン慈善大学医学部の治験審査委員会とケルン大学医学部によって承認されました。検体と臨床データはアーカイブされ、ベルリン慈善大学または GPOH の国立神経芽腫バイオバンクおよび神経芽腫試験登録簿 (ケルン大学小児病院) によって利用可能になりました。 MYCN コピー数は FISH を使用して決定されました。病理学者による評価では、腫瘍サンプルには少なくとも 60% の腫瘍細胞が含まれていました。

組織サンプルは、1 mlの氷冷EZ PREPバッファー（Sigma-Aldrich）中で予冷したガラスダウンス組織ホモジナイザー（カタログ番号357538、Wheaton）を使用してホモジナイズしました。緩い乳棒を使用した 10 回のストロークに続いて、きつい乳棒を使用した追加の 5 回のストロークを組織の均質化に使用しました。摩擦によって生じる熱を減らすために、均質化中はダンサーを常に氷上に置きました。ホモジネートを、35μmセルストレーナーキャップを備えたFalconチューブ(Becton Dickinson)を通して濾過した。無傷の核の数は、1:1 の比率で混合した 0.02% トリパンブルー (Thermo Fisher Scientific) で染色および計数することによって推定されました。

末梢血単核球 (PBMC) は、Ficoll-Plaque PLUS (Cytiva) を用いた密度勾配遠心分離を使用して単離されました。全血サンプルをカルシウムを含まない PBS に 1:1 で再懸濁し、12 ml の Ficoll-Plaque PLUS にゆっくりと加えました。サンプルを破壊することなく 200g で 30 分間遠心分離しました。ＰＢＭＣの上層を単離し、４０ｍｌのＰＢＳ中で洗浄した。５００ｇで５分間の遠心分離によってＰＢＭＣを収集し、ＦＣＳ中の１０％ジメチルスルホキシドに再懸濁した。 PBMC 懸濁液は、使用するまで -80 °C で保管されました。

単一細胞ソーティングでは、100 万～1,000 万個の神経芽腫細胞または PBMC を 1× PBS 中のヨウ化プロピジウム (PI) (Thermo Fisher Scientific) で染色しました。生細胞は、前方散乱特性と側方散乱特性、および PI 染色に基づいて選択されました。ＰＢＭＣ懸濁液をさらに、１：４００希釈の抗ヒトＣＤ３（Ａｘ７００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。核懸濁液を DAPI (最終濃度 2 μM、Thermo Fisher Scientific) で染色しました。生細胞、CD3+ PBMCS または DAPI+ 核を、FACSAria Fusion Flow Cytometer (BD Biosciences) を使用して、ホイルで密封した低結合 96 ウェルプレート (4 時間) 内の 2.5 μl の RLT Plus バッファー (QIAGEN) に選別し、保存しました。処理までは−80℃。

ゲノム DNA (gDNA) と mRNA の物理的分離は、Macaulay et al.27 による G&T-seq プロトコールで以前に記載されているように実行されました。すべてのサンプルは、Biomek FXP Laboratory Automation Workstation (Beckman Coulter) を使用して処理されました。簡単に説明すると、ストレプトアビジン結合磁気ビーズ (Dynabeads MyOne Streptavidin C1、カタログ番号 65001、Invitrogen) に結合した修飾オリゴ dT プライマー (補足表 7) を使用して、ポリアデニル化 mRNA を捕捉しました。結合ビーズを細胞溶解物に直接添加し(10μl)、800rpmで混合しながら室温で20分間インキュベートした(MixMate、Eppendorf)。磁石 (Alpaqua) を使用して、捕捉された mRNA を gDNA を含む上清から分離しました。 gDNAを含む上清を新しい96ウェルプレート(4titude)に移した。 mRNA捕捉ビーズを、200μlの50mM Tris-HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mMジチオスレイトール(DTT)、0.05% Tween 20および0.2×RNase阻害剤中で室温で3回洗浄した。 (SUPERase・In、Thermo Fisher Scientific)。各洗浄ステップで、ビーズを MixTape (Eppendorf) で 2,000 rpm で 5 分間混合しました。 DNA 損失を最小限に抑えるために、各洗浄後に上清を収集し、同じチップを使用して元の上清と一緒にプールしました。

ビーズ上に捕捉された mRNA を、10 U μl-1 SuperScript II 逆転写酵素 (Thermo Fisher Scientific)、1 U μl-1 RNase インヒビター、1 × Superscript II First-Strand Buffer を含む逆転写マスターミックス 10 μl に溶出しました。 (Thermo Fisher Scientific)、2.5 mM DTT (Thermo Fisher Scientific)、1 M ベタイン (Sigma-Aldrich)、6 mM MgCl2 (Thermo Fisher Scientific)、1 μM テンプレートスイッチングオリゴ (補足表 7)、デオキシヌクレオシド三リン酸ミックス (1各 mM の dATP、dCTP、dGTP、および dTTP) (Thermo Fisher Scientific) およびヌクレアーゼフリー水 (Thermo Fisher Scientific) を最終容量 (10 μl) まで加えます。逆転写は、サーモサイクラーで 42 °C で 60 分間実行し、続いて 50 °C で 2 分間と 42 °C で 2 分間のサイクルを 10 サイクル行い、60 °C で 10 分間のインキュベーションを 1 回行って終了しました。 PCRによる相補的DNA（cDNA）の増幅は、0.1μM ISPCRプライマー（10mM;補足表7）を含む1×KAPA HiFi HotStart ReadyMixを含むPCRマスターミックス12μlを、逆転写後直ちに10μlの逆転写反応混合物。反応はサーモサイクラーで次の 7 サイクルで実行されました: 98 °C で 3 分間、次に 98 °C で 15 秒間、67 °C で 20 秒間、72 °C で 6 分間を 18 サイクル、最後に 72 °C で 1 分間5分。増幅されたｃＤＮＡを、１：０．９の体積比のＡｍｐｕｒｅＢｅａｄｓ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を使用して精製し、２０μｌの溶出緩衝液（ＢｕｆｆｅｒＥＢ、ＱＩＡＧＥＮ）中に溶出した。

単離された DNA は、1:0.8 の体積比の Ampure Beads を使用して精製されました。 800 rpm (MixMate) で混合しながら、サンプルをビーズとともに室温で 20 分間インキュベートしました。環状 DNA 単離は、バルク集団で以前に記載されているように実行されました 3,25。簡単に説明すると、DNA をビーズからエキソヌクレアーゼ消化マスターミックス (20 ユニットの Plasmid-Safe ATP 依存性 DNase (Epicentre)、1 mM ATP (Epicentre)、1 × Plasmid-Safe Reaction Buffer (Epicentre)) に直接溶出しました。 96ウェルプレート。サンプルのサブセットに、1μlのエンドヌクレアーゼMssI/PmeI(20Uμl、New England Biolabs)を添加した。直鎖状 DNA の消化は、10 U の Plasmid-Safe DNase および 4 μl の ATP (25 mM) を用いて 37 °C で 1 または 5 日間行い、24 時間ごとに再度添加して酵素消化を続けました。 1 または 5 日間の酵素消化後、70 °C で 30 分間インキュベートしてエキソヌクレアーゼを熱不活化しました。メーカーの指示に従って、REPLIg Single-Cell Kit (QIAGEN) を使用して、エキソヌクレアーゼ耐性 DNA を精製および増幅しました。この精製ステップでは、32 μl のポリエチレングリコール緩衝液 (18% (w/v) (Sigma-Aldrich)、25 M NaCl、10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA、0.05% Tween 20) を添加しました。混合し、室温で 20 分間インキュベートします。インキュベーション後、ビーズを80%エタノールで2回洗浄し、REPLIg Single-Cell Kit (QIAGEN)を用いた多重置換増幅により、エキソヌクレアーゼ耐性DNAを反応混合物中に直接溶出させた。増幅された環状DNAを、1:0.8の体積比のAmpure Beadsを使用して精製し、100μlの溶出緩衝液(Buffer EB、QIAGEN)で溶出した。

合計20 ngの増幅cDNAまたは環状DNAを、NEBNext Ultra II FS (New England Biolabs)を製造業者のプロトコールに従って使用してライブラリー調製に使用した。サンプルは独自のデュアルインデックスプライマーペア (New England Biolabs) を使用してバーコード化され、ライブラリーはプールされ、HiSeq 4000 機器 (Illumina) または環状 DNA ライブラリーの 2 × 150 bp ペアエンドリードと 2 つの NovaSeq 6000 機器で配列決定されました。 × cDNA ライブラリーの 75 bp ペアエンドリード。

gDNA ライブラリーからの配列されたリードは、TrimGalore (v.0.6.4)47 を使用してトリミングされ、ヒトゲノムビルド 19 (GRCh37/hg19) にマッピングされました。アライメントは、Burrows-Wheeler Aligner (BWA)-MEM (v.0.7.17)48 を使用して実行されました。 Human Cell Atlas プロジェクト 49 (v.2.2.1)50 の推奨に従って、Smart-seq2 (参考文献 26) から取得した RNA-seq データを、hg19 および ENCODE アノテーション v.19 から作成されたトランスクリプトーム参照と照合するために使用されました。 (参考文献51)。その後、単一細胞を使用して rsem (v.1.3.1)52 を使用して遺伝子とアイソフォームを定量しました。

ナノポアシークエンシングの前に、単一細胞から増幅された環状 DNA を T7 エンドヌクレアーゼ消化に供して、DNA 分岐を減少させました。次に、増幅した環状 DNA 1.5 μg を、3 μl の NEBuffer 2 およびヌクレアーゼフリー水中の 1.5 μl T7 エンドヌクレアーゼ I (10 U μl-1、New England Biolabs) と最終容量まで 37 °C で 30 分間インキュベートしました。 30μl。エンドヌクレアーゼで消化した DNA を、1:0.7 の体積比の Ampure Beads を使用して精製し、25 μl のヌクレアーゼを含まない水で溶出しました。ライブラリは、ONT Rapid Barcoding Kit (カタログ番号 SQK-RBK004、Oxford Nanopore Technologies) を製造元の指示に従って使用して調製し、R9.4.1 MinION フローセル (FLO-MIN106、Oxford Nanopore Technologies) で配列決定しました。実行ごとに最大 4 つのサンプルが多重化されました。

scCircle-seq Nanopore データは、Guppy (v.5.0.14; dna_r9.4.1_450bps_hac モデルを使用して guppy_basecaller を実行し、FLO-MIN106 およびデフォルトパラメーターを使用して guppy_barcoder を実行) を使用してベースコールされ、逆多重化されました。得られたリードは、NanoFilt53 (v.2.8.0) (-1100--headcrop 50--tailcrop 50) を使用してクオリティフィルター処理され、ngmlr54 (v.0.2.7) を使用して GRCh37/hg19 参照ゲノムに対してアラインメントされました。 SV を呼び出すために、Sniffles54 (v.1.0.12) (--min_homo_af 0.7--min_het_af 0.1--min_length 50--min_support 4) を適用しました。ビン化されたカバレッジを取得するには、deepTools55 (v.3.5.1) bamCoverage を使用しました。これらすべての手順は、Snakemake パイプライン (https://github.com/henssen-lab/nano-wgs) として利用できます。

バルク集団におけるサークルシーケンスは、前述のように実行されました3。詳細な段階的なプロトコルは、Nature Protocol Exchange サーバーにあります。

前述のプロトコルに従って、CHP-212 の H3K27me3 ChIP-seq データを生成しました28。簡単に説明すると、500 ～ 1000 万個の CHP-212 細胞を、1% パラホルムアルデヒドを含む 10% FCS-PBS 中で室温で 10 分間固定しました。クロマチンは前述のとおりに調製され 28、断片サイズが 200 ～ 500 bp になるまで断片化されました。 H3K27me3 – DNA 複合体を、抗 H3K27me3 ポリクローナル抗体 (カタログ番号 07-449、Sigma-Aldrich) を使用して 4 °C で 15 時間免疫沈降しました。合計 10 ～ 15 μg のクロマチンと 2.5 μg の抗体を免疫沈降に使用しました。シーケンス用のライブラリは、提供された推奨事項に従って Illumina Nextera アダプターを使用して準備されました。ライブラリーは、Illumina HiSeq 4000 シーケンサーの 50 bp シングルリードモードでシーケンスされました。 FASTQ ファイルは FASTQC (v.0.11.8) で品質管理され、アダプターは BBMap (v.38.58) を使用してトリミングされました。デフォルトのパラメーターを備えた BWA-MEM48 (v.0.7.15) を使用して、リードを hg19 に合わせました。重複したリードは Picard (v.2.20.4) を使用して削除されました。

我々は、公開されている CHP-212 コピー数バリエーション、ChIP-seq (H3K27ac、H3K4me1、CTCF)、および ATAC-seq データを入手しました 28,56。さらなる分析のために、我々は処理された大物トラックを使用し、ENCODE Data Analysis Center (DAC) のブラックリスト領域を除外するためにフィルター処理され、10 bp ビンの 100 万あたりの読み取り数 (CPM) と Helmsauer らによって提供されたピークコールに正規化されました。エピジェネティックマークと円領域の相関を評価するために、CHP-212 または ENCODE DAC のブラックリスト領域のコピー数変動と重複しない円領域のみを考慮しました。 H3K27ac、H3K4me1、H3K27me3 ChIP-seq および ATAC-seq データについては、それぞれの円サイズで重み付けされた、すべての円領域にわたる平均 CPM シグナルを計算しました。統計的関連性をテストするために、regioneR57 (v.1.24.0) を使用して、CHP-212 および ENCODE DAC ブラックリスト領域のコピー数変動をマスクしたゲノム内のランダム化された円の位置を含む 1,000 個のデータセットを作成しました。ランダム化された円領域全体の平均 CPM 信号の分布から経験的な P 値を導き出しました。 CTCF ChIP-seq データについては、CTCF ピークと重複する円エッジの割合を計算し、上記と同じランダム化戦略を使用して統計的有意性を評価しました。

染色体外環状 DNA 分析は、以前に記載されているように実行されました 3。リードは品質配列とアダプター配列の両方で 3' トリミングされ、長さが 20 ヌクレオチド未満の場合はリードが削除されました。デフォルトパラメータを備えた BWA-MEM (v.0.7.15) を使用して、リードをヒト参照アセンブリ GRCh37/hg19 に合わせました。 PCR および光学的重複は Picard (v.2.16.0) で削除されました。推定円は 2 段階の手順で分類されました。まず、すべての分割リードと外向きのリード方向を含むリードペアが新しい BAM ファイルに配置されました。次に、Homer v.4.11 findPeaks (http://homer.ucsd.edu/) の可変幅ウィンドウを使用して、「すべての読み取り」BAM ファイルで、誤検出率 < 0.001 でバックグラウンドよりもシグナルが豊富な領域が検出されました。これらの濃縮された領域の端は、サークルをサポートするリードと交差していました。次に、バルク配列決定データからの環状 DNA のポジティブコントロールセットに基づいて、円検出の閾値を経験的に決定しました。少なくとも 2 つの円をサポートするリードが交差する濃縮領域のみが円領域として分類されました。

環状 DNA の適切な濃縮を評価するために、内部対照として mtDNA に対するカバレッジを使用しました。 mtDNA 上の塩基対配列読み取り深さあたりの読み取り数が 10 未満、または mtDNA に捕捉されたゲノム塩基の 85% 未満の細胞は、さらなる解析から除外されました。カットオフ値は、エンドヌクレアーゼコントロールで検出された最大読み取り深度値に基づいて選択されました（PmeIあり、補足図1c）。すべての下流解析では、5 日間エキソヌクレアーゼで消化された細胞からの配列データのみを考慮しました。 mtDNA は核には存在しないため、RNA の品質管理に基づいて単核の Circle-seq データのみをフィルタリングしました。

推定サークルからの読み取り数は、ゲノムアセンブリ GRCh37/hg19 のすべての標準染色体にわたる 100 kb ビン内の単一細胞 BAM ファイルから bedtools multicov (https://bedtools.readthedocs.io) を使用して定量化されました。カウントは各セルのシーケンス深度に対して正規化され、バックグラウンドリード分布と比較して P < 0.05 でサークルリード濃縮が含まれる場合、各ビンは陽性とマークされました。次に、ビンをゲノム座標に基づいて 3 つのグループに分類しました。(1) 領域がバルクシーケンスデータから組み立てられたアンプリコンと重複している場合は ecDNA。 (2) chM; (3) 他のすべてのサイト。次に、3 つのカテゴリのそれぞれで検出された円を含む細胞の割合をプロットすることによって再発を分析しました。

参照フェーズを使用して、バルク WGS データに基づいて各 SNP を 2 つの対立遺伝子の 1 つに割り当てました。次に、単一細胞の遺伝子型を特定して、すべての細胞で同じ対立遺伝子が獲得されているかどうかを比較しました。この分析では、1000 ゲノムプロジェクト 58 によって特定された既知の SNP を使用し、注釈が付けられた各位置のカバレッジとヌクレオチド数を抽出しました。 ecDNA 遺伝子座でコピー数が増加するなど、対立遺伝子の不均衡がある領域では、ヘテロ接合性 SNP の B 対立遺伝子頻度は 0.5 とは大きく異なります。したがって、これらの領域の各 SNP を獲得または非獲得対立遺伝子のいずれかに割り当てることができます。次に、既知の各 SNP 位置ですべての単一細胞の遺伝子型を特定し、バルク WGS データからの対立遺伝子割り当てを維持しながら、結果として得られる B 対立遺伝子頻度値を視覚化しました。

すべての注釈付き遺伝子の平均カバー率が計算され、ゲノムの位置が細胞ごとに同定された ecDNA 領域と重複するかどうかに基づいて、遺伝子がアンプリコン遺伝子と非アンプリコン遺伝子に分割されました。すべてのアンプリコン遺伝子のカバー率は、バックグラウンドカバー率、つまりすべての非アンプリコン遺伝子のウィンザー化された平均カバー率によって正規化されました。 ecDNA 領域の同定が不完全であった可能性があるという事実を考慮して、ウィンザー化された平均が選択されました。したがって、値の上位 5% と下位 5% は背景範囲から削除されました。結果の値は log2 変換され、ecDNA コピー数の代用として使用されました。

scCircle-seq の SV 呼び出しは、lumpy-sv55 (v.0.2.14) と SvABA(v.1.1.0) を使用して実行されました。私たちの知る限り、単一細胞 DNA データの専用の SV 呼び出し元は利用できません。ただし、ecDNA のコピー数が多いため、バルク法が機能します。

SAMtools59 (v.1.11) を使用して、同じ細胞株のすべてのアライメントファイルを 1 つの擬似バルクアライメントにマージしました。標準のバルクシーケンスに近いカバレッジを達成するために、結果として得られた BAM ファイルは、SAMtools を使用して元のサイズの 10% にダウンサンプリングされました。 WGS 内の SV の同定と、TR14 および CHP-212 細胞株の統合された scCircle-seq データは、lumpy-sv60 (v.0.3.1) と SvABA61 (v.1.1.0) を使用して、両方とも標準パラメーターで実行されました。低サイズ (<20 bp) および低品質リード (MAPQ < 5) のフィルタリングを含む BAM ファイルの前処理、およびリードカウントと VAF 計算のサポートは、SAMtools59 (v.1.10) を使用して実行されました。すべての分析ステップは、GRCh37/hg19 参照ゲノムを使用して完了しました。 SV ブレークポイントをサポートするリードの特定とカウントは、分割リードと異常にマッピングされたリードを考慮し、重複リードとセカンダリアラインメントを除外して実行されました。

標準的なミトコンドリア変異レポート 62 との互換性を確保するために、BWA-MEM63 (v.0.7.17) を使用して、各単一細胞シーケンシングサンプルを GRCh37/hg19 に置き換え、改訂版 Cambridge Reference Sequence ミトコンドリアリファレンス (GenBank no. NC_012920) で再調整しました。重複したリードは Picard (v.2.23.8) を使用して削除されました。デフォルトパラメータを備えた GATK4/Mutect264 (v.4.1.9.0) を使用して、全ゲノムバルク内のバリアントを呼び出し、scCircle-seq シーケンスデータ (擬似バルク) をマージしました。正規染色体（chrMを含む）および通過するGATK4 / FilterMutectCalls上のバリアントのみが保持され、その後、flag-rを備えたbcftoolsフィルターを使用して、それぞれの細胞株に対して以前に再構成された領域についてフィルター処理されました（図3a）。

単一細胞におけるミトコンドリア SNV 同定の場合、ミトコンドリアモードの GATK4/Mutect2 (参考文献 64) (v.4.1.9.0) と、デフォルトのパラメータを使用して、ミトコンドリア配列データ内のヘテロプラズミック部位を検出します。まず、バリアントは両方の呼び出し元によって単一セルごとに個別に呼び出されます。次に、バリアントは 2 段階のプロセスでフィルタリングされました。(1) バリアントは、同じ呼び出し元によって少なくとも 2 つのサンプルで呼び出された場合にのみ保持されます。 (2) 残りのバリアントは、両方の呼び出し元によって呼び出された場合にのみ保持されます。 Mutserve によって「ブラックリスト」とラベル付けされた亜種は削除されました。最終セットの各バリアントの対立遺伝子頻度を推測するために、各単一細胞は alleleCount (v.4.0.2) (https://github.com/cancerit/alleleCount) を使用してジェノタイピングを受けました。ミトコンドリア参照に一意にマッピングされ、マッピング品質 ≥ 30 のリードのみが保持されました。位置 x で呼び出された代替対立遺伝子 b ごとに、対立遺伝子頻度 (AF) が次のように計算されました。

得られた単一細胞 x バリアント AF マトリックスを、各細胞株ごとに手動で個別にさらにフィルター処理しました。 3 つ未満のバリアントを含む単一細胞、および最大カラム対立遺伝子頻度 < 5%、CHP-212 の平均 AF (MAF) > 30% および MAF < 0.1%、TR14 の MAF > 30% および MAF < 0.1% のバリアントクラスタリングには有益ではないと考えられ、スポットチェックに基づいて削除されました。

フィルター処理された単一セル x バリアント AF マトリックスのヒートマップ視覚化は、R パッケージ ComplexHeatmap66 (v.2.6.2) を使用して生成されました。次に、凝集法パラメータ「complete」を指定した R パッケージ hclust を使用して、階層的クラスタリングを単一セルに適用しました。系統樹は、R パッケージ dendextend (v.1.15.2) を使用してレンダリングされました。

ミクロ相同性解析は、NCBI BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) を使用し、次のパラメーターを使用して実行されました: blastn -task megablast -word_size = 4 -evalue = 1 -outfmt '6 qseqid length evalue ' -subject_besthit -報酬 = 1 -ペナルティ = -2。これらのパラメーターは、4 bp の最小マイクロホモロジー長、およびヌクレオチドの一致および不一致に対する標準のリワードおよびペナルティ値を探します。さらに、期待値が 1 未満の有意な結果のみを考慮しました。環状 DNA 接合部の周囲の微小相同性の存在を評価するために、環の開始点と終了点の周囲 100 bp (環状 DNA および環状 DNA の内側の 50 bp) を含むファイルを生成しました。 50 bp の直鎖状 DNA)。この分析を実行できるようにするために、長さが 100 bp 未満のすべての円を除外しました。次に、開始と終了の各ペア (1 つの環状ジャンクション) の配列を比較し、環状ジャンクションの周囲の微相同配列を評価して検索しました。この分析を、CHP-212 および TR14 細胞株の個々の円ごとに繰り返しました。

細胞と核を Seurat67 (v.4.10) にロードしました。少なくとも 3 つの細胞で検出された特徴が含まれていました。続いて、細胞株では 5,000 以上の特徴、T 細胞と核では 2,000 以上の特徴を持つ細胞が、さらなる分析のために選択されました。ミトコンドリア遺伝子の発現が高い細胞または核（単細胞では >15%、核では >2.5%）も除外されました。データは 10.000 のスケール係数で正規化され、デフォルトの ScaleData 設定を使用してスケーリングされました。各細胞の遺伝子長と総リード数を考慮するため、Smart-seq2 データは 100 万あたりの転写産物を使用して正規化されました。次に、擬似カウント 1 が追加され、自然対数変換が適用されました。最初の 4 つの主成分は重要でした。したがって、最初の 5 つの主成分は、Seurat の著者が推奨するように、できるだけ多くの変動を捕捉するために FindNeighbors と RunUMAP に使用されました。 FindClusters の解像度は 0.5 に設定されました。

細胞周期期は、Seurat CellCycleScoring 関数を使用して、G2/M 期および S 期マーカーの発現に基づいて単一細胞に割り当てられました。

非常に小さな環状 DNA は、3 kb より短い円として定義されました。細胞当たりのこのサブタイプの小さな環状 DNA の相対数を計算するために、3 kb 未満の環状 DNA の数を細胞内の環の総数で割りました。セルは相対数によってランク付けされ、ランク付けされたリストの上位 40% と下位 40% を取得してグループ化され、それぞれ「高」および「低」と定義されます。 2 つのグループ間の遺伝子発現の対数変化倍数は、Seurat R パッケージ 67 (v.4.10) の FindMarkers 機能を使用して、対数倍数変化閾値および遺伝子あたりの最小検出率 0.05 を使用せずに計算されました。 R パッケージのclusterProfiler68 (v.4.0.5) を使用して、gseGO を使用し、少なくとも 3 つの遺伝子、最大 800 個の遺伝子を含む遺伝子セットを含む遺伝子オントロジー用語の教師なし GSEA を実行しました。

scCircle-seq および scRNA-seq BAM ファイル内の ecDNA アンプリコン領域のカバー率は、CPM 正規化を使用して bamCoverage55 で計算されました。 Circle-seq と RNA-seq カバレッジ間の相関関係は、線形モデルをフィッティングすることによって分析されました。

シングルセル、ペアエンド、RNA-seq FASTQ ファイルがマージされました (TR14 については 96 セル、CHP-212 については 192 セル)。取得されたマージされたデータは、GENCODE 19 遺伝子アノテーションを使用して、STAR69 (v.2.7.9a) と参照デコイ GRCh37/hs37d5 でアライメントされ、キメラアライメント (--chimOutType WithinBAM SoftClip) が可能になりました。融合遺伝子を呼び出して視覚化するために、Arriba70 (v.2.1.0) をカスタムパラメーター -F 150 -U 700 とともに適用しました。最終的な信頼できる呼び出しセットには、(1) ブレークポイント ≥ 50 倍の合計カバレッジを持つ融合のみが含まれていました。 (2) マッピングされたリードの 30% 以上が分割リードまたは不一致リードです。アンプリコン境界の近傍（±10 Mb）にある融合遺伝子のみが下流解析の対象とされました。

我々は、CHP-212 については Helmsauer ら 28、TR14 については Hung ら 23 によって提供されたアンプリコン再構成を使用しました。簡単に言うと、これらの再構成は、gGnome71 (v.0.1) (ノードとしてのゲノム間隔およびエッジとしての参照または SV) を使用して、フィルター処理された Illumina WGS (CHP-212) および Nanopore WGS (TR14) SV コールのセットをゲノムグラフとして整理することによって得られました。次に、これらのグラフを通る円形の経路が特定され、これには増幅されたがん遺伝子が含まれており、それぞれの細胞株で観察される主要なコピー数ステップを説明できる可能性があります。研究に追加された 2 人の患者については、患者 no. 1と患者No. 2、浅い全ゲノムナノポアデータは、Helmsauer et al.28 の記載に従って生成されました。ベースコール、読み取りフィルタリング (NanoFilt -1 300)、マッピングおよび SV コールは、方法 (「Nanopore scCircle-seq データ処理」) で前述したように実行されました。 ecDNA 再構築のために、一連の信頼できる SV コールをコンパイルしました (バリアント AF > 0.2 およびサポートリード ≥ 50x)。 CHP-212 と TR14 に関しては、gGnome61 (v.0.1) を使用してゲノムグラフが構築され、手動でキュレーションされました。患者サンプルのアンプリコン構造の正確性をチェックするために、PBSIM2 (参考文献 72) (https://github.com/madagiurgiu25/pbsim2) の適応バージョンを使用して、インシリコでシミュレートされたナノポアリードが再構成されたアンプリコンからサンプリングされ、オリジナルの患者サンプル。最後に、元のサンプルとインシリコシミュレーション間の SV プロファイルを比較しました。 GRCh37/hg19 参照ゲノムおよび GENCODE 19 トラックを含む、すべての再構成されたアンプリコンは、gTrack (v.0.1.0; https://github.com/mskilab/gTrack) を使用して視覚化されました。

前述の円分類アルゴリズムを使用して、単一細胞内の環状 DNA が豊富な領域を定義しました。各単一細胞について、R パッケージ GenomicRanges73 (v.1.44.0) の関数 findOverlaps を使用して、TR14 バルクシーケンスデータから組み立てられた ecDNA アンプリコン (MYNC、CDK4、MDM2) と環状 DNA 濃縮領域が重複するかどうかを定義しました。重複の有無は、MYCN および CDK4 ecDNA によって共有されるアンプリコン領域を除き、3 つの MYNC、CDK4、MDM2 ecDNA のそれぞれについて独立して定義されました。

サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでした。分析から除外されたデータはありません。実験はランダム化されておらず、研究者は実験と結果の評価中に割り当てについて知らされていませんでした。 FISH 実験は、細胞株および原発腫瘍ごとに 1 回実行されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で生成された配列決定データは、European Genome-phenome Archive でアクセッション番号 2 で入手できます。 EGAS00001007026。 ChIP–seq のNarrowPeak および bigwig ファイルは、https://data.cyverse.org/dav-anon/iplant/home/konstantin/helmsaueretal/ からダウンロードされました。他のすべてのデータは、合理的な要求に応じて対応著者から入手できます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

この出版物に関連するデータ分析コードは、https://github.com/henssen-lab/scEC-T-seq にあります。

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AGH は、ドイツ財団財団 (DFG) (助成金番号 398299703) によってサポートされています。このプロジェクトは、欧州連合の Horizon 2020 Research and Innovation Program (助成金番号 949172) に基づいて欧州研究評議会から資金提供を受けています。 AGH は、ドイツクレブシルフェミルドレッドシェール教授制度プログラム no.1 によって支援されています。 70114107。このプロジェクトはベルリン保健研究所 (BIH) の支援を受けました。計算は、BIH の研究クラスター用 HPC 上で実行されました。これらの結果をもたらしたプロジェクトは、「la Caixa」財団 (番号 100010434) からのフェローシップの支援を受けました。フェローシップコードはLCF/BQ/EU20/11810051です。 ER-F. アレクサンダー・フォン・フンボルト財団によって支援されています。 RX はドイツクレブシルフェによってサポートされています。 RPK は、Stiftung Chalité から資金提供を受けている BIH 客員教授です。 MCS は、DFG が資金提供する Research Training Group 2424/CompCancer から資金提供を受けています。 RFS は、ノルトラインヴェストファーレン州の文化科学省から資金提供を受けているケルンエッセンがん研究センターの教授です。この研究は、ドイツ教育研究省から BIFOLD (ベルリン学習データ基礎研究所) として資金の一部を提供されました (参照番号 01IS18025A および 01IS18037A)。この研究は、Cancer Research UK (HYC no. CGCATF-2021/100012、AGH no. CGCATF-2021/100017) および National Cancer Institute (HYC no. OT2CA278688、AGH 番号 OT2CA278644)。

この作品は、Richard P. Koche と Anton G. Henssen の著者が共同で監修しました。

ベルリン・フンボルト大学、ベルリン自由大学の法人会員、ベルリン・シャリテ大学小児腫瘍血液学部門

ロシオ・チャモロ・ゴンサレス、ロビン・スー、マダリナ・ジュルジュ、エリアス・ロドリゲス＝フォス、エリック・ヴァン・リーン、コンスタンティン・ヘルムザウアー、ヒースクリフ・ドラド・ガルシア、イー・ベイ、カリン・シュメルツ、マルコ・ロドリーニ、ヘドウィグ・E・ドゥブザー、アンジェリカ・エガート、ヨハネス・H・シュルテ、ケルスティン・ハーセ& アントン・G・ヘンセン

MDC およびシャリテベルリンの実験および臨床研究センター、ベルリン、ドイツ

ロシオ・チャモロ・ゴンサレス、ロビン・スー、マダリナ・ジュルジュ、エリアス・ロドリゲス＝フォス、ロッテ・ブルックナー、エリック・ヴァン・リーン、コンスタンティン・ヘルムザウアー、ヒースクリフ・ドラド・ガルシア、イー・ベイ、ヘドウィグ・E・ドゥブザー、ケルスティン・ハース、アントン・G・ヘンセン

ゲノミクス技術プラットフォーム、ヘルムホルツ協会マックス・デルブリュック分子医学センター、ベルリン、ドイツ

トーマス・コンラッド

ベルリン医療システム生物学研究所、ヘルムホルツ協会マックス・デルブリュック分子医学センター、ベルリン、ドイツ

マヤ・C・シュテーバー、サーシャ・ザウアー、ローランド・F・シュワルツ

シャリテ - ベルリン大学、ベルリン、ドイツ

マヤ・C・ストゥーバー

ベルリン・フンボルト大学生命科学部、ベルリン、ドイツ

マヤ・C・ストゥーバー

ベルリン自由大学、ベルリン、ドイツ

マダリナ・ジュルジュ

フラウンホーファー細胞療法・免疫学研究所、生物分析およびバイオプロセス IZI-BB 支部、ポツダム、ドイツ

カタリーナ・カサック

マックス・デルブリュック分子医学センター、ベルリン、ドイツ

ロッテ・ブルックナー & アントン・G・ヘンセン

RG の発生と疾患、マックス・プランク分子遺伝学研究所、ベルリン、ドイツ

マリア・E・ステファノヴァ & ステファン・ムンドロス

医療遺伝学研究所、シャリテ - ベルリン大学、ベルリン、ドイツ

マリア・E・ステファノヴァ & ステファン・ムンドロス

個人動的レギュロームセンター、スタンフォード大学医学部、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

キング・L・フン＆ハワード・Y・チャン

ベルリン・ブランデンブルク再生療法センター、シャリテ - ベルリン大学、ベルリン、ドイツ

ステファン・マンドロス

ハワード・ヒューズ医学研究所、スタンフォード大学医学部、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

ハワード・Y・チャン

ドイツがんコンソーシアム、パートナーサイトベルリン、およびドイツがん研究センター（ドイツ、ハイデルベルク）

ヘドウィグ・E・ドゥブザー、アンジェリカ・エガート、ヨハネス・H・シュルテ、ケルスティン・ハーセ、アントン・G・ヘンセン

ベルリン保健研究所、ベルリン、ドイツ

ヘドウィグ・E・ドゥブザー、アンジェリカ・エガート、ヨハネス・H・シュルテ

計算癌生物学研究所、統合腫瘍学センター、癌研究センターケルンエッセン医学部およびケルン大学病院、ケルン大学、ケルン、ドイツ

ローランド・F・シュワルツ

ベルリン学習とデータ基礎研究所、ベルリン、ドイツ

ローランド・F・シュワルツ

エピジェネティクス研究センター、メモリアル・スローン・ケタリングがんセンター、ニューヨーク州ニューヨーク州、米国

リチャード・P・コッシェ

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RCG、TC、RPK、AGH は研究デザイン、データ収集と解釈に貢献しました。 RCG、TC、KK は単一細胞実験を実施しました。 RPK、RCG、K.Haase は scCircle-seq データと WGS の解析を実行しました。 ER-F. MG は単一細胞データと WGS データの SV 解析を実行しました。 EV と MCS は scRNA-seq データ解析を実行しました。 MG は融合遺伝子検出分析を実行しました。 RX は、単一セルデータと WGS データで SNV 解析を実行しました。 LB は FISH を実行して分析しました。 K.Helmsauer と MG はアンプリコン再構築解析を実行しました。 MES は ChIP-seq を実行しました。 K.Helmsauer は ChIP-seq 解析を実行しました。 HDG、KS、YB、ML、KLH が実験を実施し、データ分析に貢献しました。 SM、HYC、HED、SS、AE、JHS、RFS が研究デザインに貢献しました。 RCG、RPK、AGH が研究デザインを主導し、データ分析を実行して原稿を執筆し、著者全員が貢献しました。

アントン・G・ヘンセンへの通信。

RPK と AGH は Econic Biosciences Ltd の創設者です。

Nature Genetics は、この研究の査読に貢献してくれた Andrea Ventura、Jan Korbel、およびその他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

補足図。 1 ～ 18、表 7、および注 1。

補足表 1 ～ 7。

図1の統計元データ。

図4の統計ソースデータ。

図5の統計ソースデータ。

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転載と許可

チャモロ・ゴンザレス、R.、コンラッド、T.、Stöber、MC 他単一癌細胞における染色体外環状 DNA とトランスクリプトームの並行配列決定。 Nat Genet 55、880–890 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41588-023-01386-y

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受信日: 2021 年 12 月 20 日

受理日: 2023 年 3 月 28 日

公開日: 2023 年 5 月 4 日

発行日：2023年5月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-023-01386-y

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