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Ingegneria Biomedica della Natura

Nature Biomedical Engineering (2023)この記事を引用

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手術中の迅速かつ正確な病理組織診断は臨床上の意思決定に不可欠です。しかし、術中診察による病理診断という一般的な方法は、時間、労力、コストがかかり、訓練を受けた病理医の専門知識を必要とします。今回我々は、組織から解離した単一化された浮遊細胞の物理的表現型を連続的に評価することにより、生検サンプルを30分以内に分析できることを示す。この診断方法は、酵素を使用しない組織の機械的解離、100 ～ 1,000 細胞 s-1 の速度でのリアルタイム変形性サイトメトリー、および教師なし次元削減とロジスティック回帰によるデータ分析を組み合わせたものです。単一細胞の明視野画像から抽出された物理的表現型パラメーターは、さまざまな組織の細胞部分集団を識別し、分子マーカーの測定値を強化したり、さらにはそれを置き換えたりしました。我々はこの方法を使用して、結腸の炎症の程度を定量化し、マウスおよびヒトの結腸の生検サンプル中の健康な組織と腫瘍組織を正確に識別しました。この迅速かつラベル不要のアプローチは、固形生検における病理学的変化の手術中の検出に役立つ可能性があります。

細胞のサイズ、形状、変形性などの細胞の物理的特性の変化は、一部の疾患の病理にとって極めて重要であり、診断マーカーまたは予後マーカーとして大きな可能性を秘めています1、2。過去数十年にわたり、マイクロピペット吸引、原子間力顕微鏡、マイクロビーズレオメトリー、光トラップなど、細胞の機械的特性を調べるためのさまざまなツールが開発されてきました3,4。この分野では、敗血症 5,6、マラリア 7、糖尿病 8、鎌状赤血球貧血 9、がん 10,11,12 などの細胞機械的表現型と疾患状態との強い相関関係を示唆する論文が指数関数的に増加しています。残念なことに、これらの従来の技術には、セルのスループットが低く、操作には深い専門知識が必要であるため、診断ツールとしての使用が制限されています。リアルタイム蛍光および変形性サイトメトリー (RT-FDC)13,14 は、これらの欠点を克服し、物理的特性の評価を可能にするいくつかの新しいマイクロ流体技術 10,15,16,17,18,19,20,21,22 の 1 つです。ラベルフリーかつハイスループットな方法で単一細胞を分離し、臨床診断への新たな道を開きます。 RT-FDC は高速であるだけでなく (1 秒あたり最大 1,000 個の細胞を分析)、細胞の変形性に加えて、細胞画像から直接得られる多次元情報も提供します。 RT-FDC の診断可能性は、白血病から 2019 年のコロナウイルス病を含む細菌およびウイルス感染症に至るまで、多くのヒトの病状で実証されています (参考文献 23、24、25、26、27)。しかし、これまで、この技術の適用可能性は、培養細胞または血液または骨髄からのリキッドバイオプシーの分析に限定されていました。

固形組織生検は、悪性腫瘍を特徴付けるための最も一般的な方法であり、癌患者の術中および周術期管理において外科医を指導する上で基本的なものです。固形組織生検の診断評価は通常、凍結生検切片の組織病理学的分析に依存する術中の病理診断を通じて行われます28。術中診断の従来のワークフローには、多数の処理ステップ、染色試薬、および専門家による分析のための経験豊富な病理医による組織切片の顕微鏡検査が含まれます。さらに、サンプルの準備には時間、リソース、労力がかかります。誘導ラマン分光法 29,30、光コヒーレンス断層撮影法 31、蛍光顕微鏡法 32,33 など、代替ワークフローが提案されています 28。しかし、まだ実装されていません。したがって、サンプルの準備と診断までの時間を短縮するアプローチの必要性が差し迫っています。

この記事では、固形組織生検のための標識を使用しない迅速な診断方法を紹介します。このアプローチは、生存可能な単一細胞を迅速かつ簡単に単離するための組織グラインダー (TG) を使用した、酵素を使用しない組織の機械的解離 34,35 と、RT-FDC を使用した数千の個々の細胞の細胞の物理的表現型の逐次評価を組み合わせたものです。まず、さまざまなマウス組織のパネルをスクリーニングし、細胞収量、生存率、組織の機械的解離時の RT-FDC 測定の実現可能性を評価します。我々は、予備知識や追加の分子標識を必要とせずに、純粋に画像由来の物理的パラメータに基づいて組織細胞の部分集団を区別できることを説明します。これにより、細胞を識別するためにマーカーのマルチカラーパネルに依存する従来のフローサイトメトリーを強化できます。また、我々のアプローチが、マイクロ流体システムにおける細胞変形能の測定に基づいて、結腸組織における炎症性変化を判定できることも示す。さらに、マウスとヒトの結腸から採取した凍結生検サンプルと新鮮生検サンプルを調べ、主成分分析 (PCA) と多次元データの機械学習を使用することで、RT-FDC が健康な組織と癌性組織を区別できることを示します。この発見は、RT-FDC を使用して組織由来の単一細胞の物理的表現型を評価することが、炎症または悪性状態を検出するための代替戦略であることを示しています。 30 分以内に結果をもたらすことができる私たちの手順は、生検の病理学的変化を高感度に検出し、より一般的には公平かつマーカーを使用しない方法で組織内の細胞集団を特定して特徴付けるための術中診断パイプラインとしての可能性を秘めています。

細胞の物理的表現型を評価する前に直面した最初の課題は、細胞部分集団の不均一性を最大限に正確に表現することを目指しながら、数分のタイムスケールで固形組織から単一細胞を迅速に抽出することでした。このために、Falcon チューブに組み込まれた逆回転する研削歯の列 (図 1) に基づいた機械的分離装置である TG を使用しました 35。この装置は、あらかじめ定義された一連の切断と研削のステップを交互に実行して、固形組織から単一細胞を単離します。合計で、10 の異なるマウス組織を、比較のために TG または従来の酵素プロトコルを使用して処理しました (補足表 1 および 2)。生存率はほとんどの組織で 70 ～ 90% でした。細胞収量は酵素解離と同様であり、組織に依存していました (拡張データ図 1)。機械的解離の主な利点は、酵素プロトコルでは処理時間が数十分、場合によっては数時間かかるのに対し、サンプルあたりの処理時間が 5 分未満で済むことです。抽出速度はおそらく、生化学的および生物物理学的表現型を現場に近い条件で保存するのに役立ちます。

組織サンプルは小片に切り分けられ、培地を含む TG ユニットのインナーローターに配置されます 35。機械的解離は、事前にプログラムされ、自動的に実行される時計回りおよび反時計回りの回転シーケンスによって実行されます。解離した細胞は遠心分離され、測定バッファーに再懸濁されます。サンプルはマイクロ流体チップにロードされ、RT-FDC を使用して分析されます。通常 10,000 個の細胞のすべての明視野画像がキャプチャされます。画像からさまざまな特徴を抽出し、多次元解析に使用します。組織から結果が得られるまでの手順は、合計で 30 分未満かかります。

次に、抽出した単一細胞を RT-FDC を使用して解析しました。 RT-FDC 測定では、高粘度のメチルセルロースバッファーに懸濁された 1 秒あたり数百個の細胞がマイクロ流体チャネルの狭窄部を通過し、そこでせん断応力と圧力勾配によって細胞が変形し、各細胞の画像が取得されます。いくつかの物理パラメータ、すなわち、変形、セルサイズ、明るさ、明るさの標準偏差、アスペクト比、面積比がリアルタイムで画像から計算されました（詳細については、補足表3を参照）。さらに、蛍光モジュール 14 を使用して細胞表面マーカーの発現を検出しました。

肝臓、結腸、腎臓から抽出した細胞の物理的パラメーターの分布の例を図 2 に示します。これらのクラスターのそれぞれは、同様の物理的表現型 (密度プロットに従ってゲート制御) および表面マーカー発現 (拡張) を持つ細胞で構成されていました。データ図２）。たとえば、同様の物理的特性（この場合は平均輝度と細胞サイズによって定義される）を持つ細胞のクラスターは、主に上皮細胞接着分子（EpCAM）陽性細胞で構成されており（図2a）、上皮細胞のきれいな集団が存在することを示しています。画像由来の物理パラメータのみを使用して、ラベルを使用せずに細胞を区別できます。

a、肝臓から単離された細胞の輝度平均と細胞サイズの散布図であり、細胞の多数のクラスターが示されています。顕著な細胞集団 (細胞サイズ 25 ～ 50 μm2、輝度平均 100 ～ 115 のクラスターを形成) には EpCAM 陽性 (上皮) 細胞が豊富ですが、CD31 陽性 (内皮) 細胞や CD45 陽性細胞 (白血球) は含まれていません。）。 FITC、フルオレセインイソチオシアネート。 PE、フィコエリトリン。 APC、アロフィコシアニン。 b、EpCAMおよびCD45細胞表面マーカーについて染色された結腸細胞の例示的な散布図。 EpCAM 陽性集団内では、明るさや細胞サイズなどの物理的パラメーターの密度プロットに基づいて、細胞の 7 つの部分集団を同定できます。 c、EpCAMおよびCD45について染色された腎臓細胞の例示的な散布図。 CD45 集団内では、細胞サイズと変形の類似性に基づいて 4 つの部分集団が特定されます。散布図のカラーマップはイベント密度を表します。

図 2b、c は、従来の蛍光ベースのフローサイトメトリーのみを使用することに加えて、画像ベースの物理表現型解析を使用する利点を示しています。従来のフローサイトメトリーでは、既知の事前定義された細胞型に対する蛍光抗体の追加パネルを使用しない限り、上皮 (EpCAM+) 細胞の個々の部分集団を区別することはほとんど不可能です。 RT-FDC では、物理的表現型パラメーターによって提供される追加の情報深さにより、さまざまな部分集団の区別が可能になりました。結腸の上皮細胞内で、純粋に明るさとサイズに基づいて細胞の 7 つのクラスターを特定しました (図 2b)。同様に、腎臓の白血球 (CD45+) 集団内で、細胞サイズと変形パラメーターに基づいて 4 つの異なるクラスターが見つかりました (図 2c)。 RT-FDC36用に最近開発された選別モダリティを使用すると、これらの細胞集団のいずれも画像から得られたパラメータに従って単離でき、その後のRNAシーケンスなどによって分子の同一性を分析できることに注目します。

RT-FDC は細胞相互作用を捕捉するためにも使用できます。アスペクト比と細胞サイズのパラメーターを使用して、胸腺、脾臓、腎臓のサンプル内の細胞ダブレットを特定しました。細胞表面マーカーによると、多くのダブレットは 2 つの異なる細胞タイプで構成されていました (拡張データ図 3)。チャネル内の細胞の位置と蛍光ピークの位置を組み合わせることで、たとえば、ダブレットが白血球 (CD45+) と内皮細胞 (CD31+) で構成されていることを特定することができました (拡張データ図 3b、 d、f)。 RT-FDC 選別モジュール 36 を使用すると、細胞ダブレットをラベルフリーで単離し、組織内の物理的に相互作用する免疫細胞の研究など、さらなる分子分析や下流のアプリケーションに使用できます 37。

組織の機械的解離や物理的表現型によるラベルフリー分析を使用する際に考慮すべき重要な問題は、このアプローチが組織内に存在する細胞型の分布を忠実に表すかどうかです。一般に、これをすべての組織およびアプリケーションについて評価することは不可能ですが、特定の組織として肝臓を詳しく調べることは有益です (拡張データ図 4a ～ c)。機械的解離は、細胞死を起こしやすく標準的な単離手順で失われることが多い肝細胞などの敏感な細胞にとってはそれほど破壊的ではないと思われます38。マウス肝臓組織を解離すると、細胞断面積（半径約 7 μm）が 150 μm2 を超える細胞は、その形態とサイズに従って肝細胞として決定されました 39。肝臓の主要な実質細胞タイプとして、肝細胞は肝細胞集団の 70% を占め、肝臓容積のほぼ 80% を占めます 40。 TG を使用して得られた細胞懸濁液では、全細胞に対する肝細胞の割合は平均 52.5% であり、酵素消化の場合の 7.7% と比較して、組織内の実際の表現にはるかに近づきました。さらに、肝細胞の異なる部分集団を細胞サイズに従って同定することができた。 DNA 含有量は細胞体積と強く相関しているため、これらの集団は異なる倍数性の肝細胞に対応すると仮説を立てています 41。たとえば、各細胞のDNA量の定量的蛍光分析との相関によって確認されれば、私たちの方法は、倍数体の割合に関連する肝臓の老化および病態生理学的プロセスをラベルフリーでモニタリングするためのツールとして機能する可能性があります。肝細胞42．肺などの他の組織では、機械的解離と酵素的解離の違いはそれほど顕著ではなく、どちらの技術も特定の細胞集団に対する偏りを与えませんでした（拡張データ図4d）。ただし、組織分析に開かれた多様な可能性に対する私たちのアプローチの一般的な適用性のためには、もちろん、さらなる実験作業が必要です。

私たちのアプローチには、組織内に元々存在する細胞数を忠実に測定することがあまり重要ではない、特定の、特に診断用途があります。結局のところ、検出された物理的表現型は、サンプル処理に対する多様な細胞反応、細胞同士や細胞外マトリックスへの接着、組織内の結合性や機械的強度も反映しています。これらの側面はすべて、病理学的状態で変化する可能性があり、私たちのアプローチで検出されます。私たちは、結腸に関連する 2 つの特定の臨床的に関連する使用例における診断の有用性を実証します。

クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（IBD）は、上皮/粘膜バリアの損傷と免疫細胞の活性化/補充に関連する腸の慢性炎症性疾患です43。 IBD の病因はまだ完全には理解されていませんが、IBD に関する私たちの理解の多くは、腸炎症の実験動物モデルから得られています。そのようなモデルの 1 つは、実験的大腸炎を誘発するための Rag1 欠損マウスへのナイーブ T 細胞の養子移入です (慢性大腸炎の T 細胞移入モデル、以降、移入性大腸炎と呼ばれます)。重症度は、結腸組織のヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) 染色スライドから生成される組織病理学的スコアを介して定量化されるのが一般的です。

私たちの目標は、転移性大腸炎中の結腸細胞の物理的表現型の変化を調査することでした。変形対細胞サイズの散布図は、疾患組織と健康な組織の違いを示唆しており（図3a）、疾患組織の細胞は健康な組織の細胞よりも変形が少ないように見えます。 CD45+細胞を検査したところ（図3b、c）、転移性大腸炎サンプルは、変形の少ない白血球、おそらくリンパ球が豊富に含まれていることを特徴とすることが明らかになりました。全体として、養子移入されたリンパ球の浸潤に応じて、移入大腸炎サンプルにおける強い効果量を伴う中央値変形の大幅な減少と、白血球の割合の大幅な増加が見出されました（N = 14;図3d）。細胞の変形中央値は白血球の割合と強く負の相関があり、ピアソンの相関係数はr（12）= -0.69（ P = 0.0065;図3e）でした。さらに、細胞サイズと変形の中央値は、専門家のH&Eスコアリングと関連付けられていました（補足図1）。ただし、線形フィッティングによる相関は不可能でした。 H&E スコアが高い移植大腸炎サンプルは、健康な組織と比較して、より大きな細胞サイズとより低い変形を示しました。注目すべき観察は、健康な組織は病気の組織よりも機械的に単一細胞に分解することが困難であるため、より多くの分析イベントが得られるということでした。

a、健康なマウス結腸組織（対照）と比較した、転移大腸炎組織サンプル（TC）から単離された細胞の細胞サイズ対変形散布図。対応するセルサイズと変形ヒストグラムを表示します。 b. 同じ 2 つの結腸サンプルを CD45 陽性細胞に対してゲートし、物理的表現型パラメーターの変化を伴う転移性大腸炎サンプル中の白血球の濃縮を示しています。散布図のカラーマップはイベント密度を表します。 c、a および b に示されているサンプルのカーネル密度推定プロット。等高線は 0.5 (明るい陰影、外側の輪郭) および 0.95 (暗い陰影、内側の輪郭) レベルをマークします。 d、変形中央値およびCD45陽性細胞の割合の定量化（3回の独立した実験にわたるn = 14の生物学的に独立した動物）。ボックスは 25 パーセンタイルから 75 パーセンタイルまで伸びており、中央値に線が引かれています。ひげは四分位範囲の 1.5 倍に及びます。統計的比較は、両側マンホイットニー U 検定を使用して実行されました。変形中央値 *P = 0.0227 および r = 0.55、% CD45+ **P = 0.0041 および r = 0.7 (r、効果サイズ)。 e、全細胞の変形中央値と白血球（CD45+細胞）の割合の両側ピアソン相関。 P = 0.0065 および r = −0.69。

細胞の物理的表現型が炎症により変化するという我々の観察は、慢性炎症が悪性腫瘍と関連しているという証拠の増加とともに44,45、我々のアプローチが腫瘍からの生検サンプルの変化を検出する可能性があると推測するに至った。私たちは、マウスとヒトの両方のサンプルについてこの可能性を確認しました。

これまでの研究では、がん細胞とその健康な細胞の機械的特性の違いが発見されています 11、12、46、47、48、49。これらの研究の主な欠点は、サンプル調製に手間がかかり、測定スループットが低いため、これらの研究から実際の診断アプローチへの変換が制限されることです。固形組織から単一細胞の機械的表現型を取得して分析するための私たちのアプローチの迅速性を考慮して、結腸直腸癌を検出するその可能性を調査しました。我々は、上皮の完全性において重要な役割を果たす腸上皮細胞特異的タンパク質を欠損したマウスを使用した。これらの動物は自然に結腸腫瘍を発症します。私たちは合計16匹のマウスを検査し、腫瘍から単離した細胞と、同じ動物の結腸から採取した健康な部分の細胞を比較しました。この閾値を下回るサンプルは主に免疫細胞と小さな破片で構成されていたため、60μm2を超える細胞（断面積によって決定）を分析しました（補足図2）。

我々の結果は、腫瘍組織由来の細胞の物理的表現型が対照サンプルとは大きく異なることを示しました。図4a〜cの1匹のマウスの代表的なプロットは、腫瘍由来の細胞が健康な対応物よりも細胞サイズが大きく、変形が大きいことを示しています。 32 サンプルすべての分析により、腫瘍由来の細胞は平均細胞サイズ (図 4d)、変形 (図 4e)、面積比 (図 4g) が著しく大きく、エフェクトサイズが中程度から強いことが明らかになりました。腫瘍サンプルはまた、図4cのより広い分布と、細胞サイズと面積比の有意に高い標準偏差によって示されるように、より大きな不均一性を示しました（図4d、g）。

a、b、腫瘍組織（b）と比較したマウス結腸組織の対照サンプル（a）の細胞サイズ対変形散布図。散布図のカラーマップはイベント密度を表します。 c、a および b に示されているサンプルのカーネル密度推定プロット。等高線は 0.5 (明るい陰影、外側の輪郭) および 0.95 (暗い陰影、内側の輪郭) レベルをマークします。細胞サイズと変形のヒストグラムは、対照組織 (紫) と比較して、腫瘍 (緑色) での細胞サイズと変形の不均一性が大きいことを示しています。 d – g、16個の対照サンプル（紫色）と16個の腫瘍サンプル（緑色）の物理的表現型パラメータの平均値と標準偏差（6回の独立した実験にわたるn = 16匹の生物学的に独立した動物）。ボックスは 25 パーセンタイルから 75 パーセンタイルまで伸びており、中央値に線が引かれています。ひげは四分位範囲の 1.5 倍に及びます。統計的比較は、両側ウィルコクソン符号順位検定を使用して実行されました。 r、効果サイズ：セルサイズ（**P = 0.0019、r = 0.55）、セルサイズの標準偏差（***P = 0.0005、r = 0.61）（d）; 変形 (*P = 0.026、r = 0.39)、変形の標準偏差 (NS、有意ではない) (e); アスペクト比 (NS)、アスペクト比の標準偏差 (NS) (f); 面積比（**P = 0.0023、r = 0.54）、面積比の標準偏差（*P = 0.013、r = 0.44）（g）。 h、マウス結腸組織サンプルの PCA。緑色の点は腫瘍サンプルを表し、紫色の点は対照サンプルを表します。 PC1 と PC2 に対して線形回帰分析を実行し、結果として得られた 2 つのカテゴリーを背景色が紫色 (対照) と緑色 (腫瘍) で示しました。

次に、腫瘍組織と健康な組織を確実に区別するために物理的表現型の違いを利用できるかどうかを調査しました。このため、セルサイズに応じてセルを 3 つのカテゴリ (60 ～ 90、80 ～ 120、120 ～ 400 μm2) に分類しました。サイズカテゴリごとに、セルサイズ、変形、アスペクト比、面積比の平均値、中央値、標準偏差の 12 個のパラメータが導出されています。各サンプルのパラメータは合計で 36 個になります (補足図 3)。これらのパラメータは PCA に使用されました (図 4h)。 2 つの主成分、PC1 (39.8%) と PC2 (18.7%) は、分散の 58.5% を説明します。主成分を決定する際の物理的特徴の相対的な重要性を補足図3に示します。PC1の最も支配的な特徴は60〜120μm2のセルの変形でしたが、PC2の場合はセルサイズパラメータが優勢でした。 PCAに対して実行されたロジスティック回帰（図4hの線形除算で示されている）は、主成分によって表される凝縮された物理的表現型情報が健康な組織と腫瘍組織を区別するのに十分であることを実証しました。 32 個のサンプルのうち 29 個が正しい領域にありました。最後に、変形とセルサイズの相関関係を分析したところ、それが弱いか存在しないことがわかりました（補足図4）。このことから、変形と細胞サイズはマウス結腸サンプルの腫瘍の独立した予測因子であるとの結論に至り、RT-FDC を介して測定された変形が診断マーカーとして付加価値があることがさらに実証されました。

私たちは次に、ヒト生検サンプルから腫瘍を検出する方法に挑戦しようとしました。最初のステップとして、結腸直腸癌の凍結保存された 13 個の生検サンプルと、同じ患者からの健康な周囲組織の 13 個のサンプルから単離された細胞に対して RT-FDC 分析を実行しました。 PCAは45のパラメータ（図5aおよび補足図5）で実行され、分散の41.7％が2つの主成分（PC1とPC2でそれぞれ25.3％と16.4％）によって説明されました。 RT-FDC パラメータの選択は、健康な組織と腫瘍組織を適切に分離できるように最適化されました。 PCAは、主に100μm2を超える細胞の変形と輝度の標準偏差によって、腫瘍サンプルと健康なサンプルがPC2に沿ってよく分離していることを示しました（図5a）。 100 µm2 未満の細胞の細胞サイズパラメータもサンプルの分離に寄与しました。最も重要なパラメータ（100μm2を超える細胞の変形）を除外すると、健康なサンプルと腫瘍サンプルの分離が悪化しました（補足図6）。ロジスティック回帰は PCA に対して実行され (PCA プロットの線形除算で示されます)、6 つのブラインドサンプルの分類を予測するために使用されました (図 5a では十字で示されています)。 6 つのサンプルはすべて、それぞれ健康組織または腫瘍組織のいずれかに正しく分類されました。これらのブラインドサンプルを正しく分類するために必要な細胞の最小数を調べました（補足図7）。正しく分類するには、サンプルから約 1,500 個の細胞を分析する必要がありました。これは、RT-FDC 測定時間約 5 分に相当します。

左側の PCA プロットでは、各緑色の点は 1 人の患者からの腫瘍サンプルを表します。紫色の点は、同じ患者の対応する健康な周囲組織を表します。各 PCA に対してロジスティック回帰が実行され、結果として得られた 2 つのカテゴリが紫 (健康) と緑 (腫瘍) の背景色で示されました。バツ印は、トレーニングされたモデルの検証に使用されるブラインド実験を表します。 PCA プロットの右側の特徴重要度分析は、特定の組織の PC1 と PC2 を決定するための各特徴の重要性を色分けして示します。 X 軸はセルサイズのカテゴリをリストします。 y 軸には、RT-FDC パラメータと、対応するサイズカテゴリ (括弧内) のセル全体から導出されたそれらの統計的特徴がリストされます。 sd、標準偏差。 a、32の凍結結腸サンプル（16の腫瘍生検と健康な周囲組織の16サンプル、16の独立した実験にわたるn = 16の生物学的に独立したサンプル）のRT-FDCパラメータのPCA。 b、28の新鮮な結腸生検サンプル（腫瘍14、健康14、n = 14の独立した実験にわたる生物学的に独立したサンプル14）のRT-FDCパラメータのPCA。 c、18の新鮮な肺生検サンプル（腫瘍9、健康9、n = 9の独立した実験にわたる生物学的に独立したサンプル9）のRT-FDCパラメータのPCA。

処理と分析を合わせた時間が短く (<30 分)、凍結組織生検切片で得られた肯定的な結果は、術中病理、つまり手術中の患者の生検サンプルの検査にこの方法を使用することを示唆しています。凍結ステップさえも省略できるかどうかを検討するために、結腸直腸がん患者（N = 14）から新たに切除した生検を分析しました。凍結結腸組織で訓練されたアルゴリズムは、おそらく凍結組織と新鮮組織の間の物理的表現型の違いにより、新鮮な組織ではうまく機能しませんでした（拡張データ図 5）。したがって、2つのサイズカテゴリ（20〜50および50〜600μm2）の新鮮な結腸生検からのデータに対して新しいPCAが実行されました（図5b）。分散の68.5％は2つの主成分（36.5％と50〜600μm2）によって説明されました。 PC1 と PC2 ではそれぞれ 32%)。ここで、細胞の変形は PCA に大きく寄与しており、細胞サイズは他の物理的表現型パラメーターほど重要ではありません。ロジスティック回帰では、PCA に使用された 22 サンプルのうち 3 サンプルとブラインドサンプルのうち 6 サンプルのうち 1 サンプルのみが正しく分類されませんでした。これは腫瘍間または腫瘍内の不均一性に起因すると考えられます。それにもかかわらず、ブラインドサンプルに対する当社のアプローチを使用すると、凍結生検サンプルからの健康サンプルと腫瘍サンプルの分類において 100% の精度を達成し、新鮮な生検サンプルについては 83% の精度を達成しました。

異なる臓器からの組織に対する私たちの方法を検証するために、9人の癌患者から新たに切除した肺生検サンプルにそれを適用しました。 PCAとロジスティック回帰を組み合わせると、7つの健康なサンプルと7つの腫瘍サンプルが容易に分離され、さらに4つの盲検サンプルが正しく分類されました（図5c）。 PCA では、分散の 46.9% が PC1 と PC2 (それぞれ 31.2% と 15.7%) によって説明されました。変形パラメーターは PC1 に大きく寄与しており、細胞変形性測定によってもたらされる固有の情報が腫瘍組織と健康な組織を区別するのに役立つことが再び実証されました。

また、入手可能な組織サンプル中にがん細胞がほとんど存在しない状況（腫瘍細胞性が低く、線維形成性腫瘍間質含有量が広範である腫瘍）、または残っている状況（ほぼ完全寛解を示す化学療法または放射線化学療法後の腫瘍）に対するアプローチの感度もテストしました。。この側面は、手術断端にがんがないかどうか（いわゆる凍結切片）を判断するために術中分析が使用される臨床状況では特に重要ですが、存在する腫瘍細胞が非常に少ない場合には特に困難になる可能性があります。新鮮な腫瘍サンプルと健康な肺組織サンプルの混合物をさまざまな比率で分析する実験を実行しました（補足図8）。 50% の健康な組織と 50% の腫瘍組織からなるサンプルは腫瘍サンプルとして分類されました。もちろん、すべての腫瘍組織ががん細胞で構成されているわけではないため、がん細胞を検出する実際の感度はここで見かけよりも高くなります。実際、結腸腫瘍サンプルの中には、間質含有量が比較的高いものもありました。極端な場合（補足表 5、凍結結腸組織サンプル 7 および 11）では、間質含有量は 98% および 80% であり、術前放射線化学療法後の患者には腫瘍がほとんど残存していなかったことを意味します。それでも、これらのサンプルは腫瘍として正しく分類されました。この結果は、従来の病理組織学的分析、特に凍結切片のシナリオに存在するサンプリングの問題に対する解決策の可能性を示しているため、注目に値します。後者の結果は、病理学者が癌細胞がまだ存在する正しい組織位置を検査して選択するかどうかに大きく依存します。時間の制約と凍結切片シナリオでのスライド作製の技術的制限により、視覚化できるのは切除組織標本全体のごく一部のみです。組織を単一細胞に解離し、そのランダムなサブセットを分析することで、特定の組織サンプル中に存在する癌細胞の 20%、さらには 2% の存在を高感度に検出できる場合、これは次のようになります。最先端技術を上回る明らかな進歩。これをしっかりと確立するには、より具体的な研究が必要です。最後に、私たちの方法は、高悪性度のがんよりも物理的パラメーターの違いを検出するのが難しいと予想される低悪性度のがんも検出できます。分析されたサンプルの大部分は、G2 (中程度に分化) または G3 (低分化/未分化、多くの場合「高グレード」とも呼ばれます; 補足表 5 ～ 10) でした。肺組織データセットでは、サンプルの 1 つが最低グレードの G1 として分類されました (高分化型; 補足表 10)。したがって、この方法は高悪性度のがんに限定されません。

生検ベースの診断に適した、固形組織からの細胞の処理と分析のための迅速かつ簡単な方法を示しました。組織の機械的解離に続いて、変形流動における細胞のハイスループット分析が行われます。数分以内に数千の細胞が画像化され、各細胞画像からさまざまな物理的表現型の特徴が抽出されます。この方法はラベルフリーであり、高価な試薬や蛍光マーカーが必要な分子診断ツールや従来のフローサイトメトリーとは対照的に、単純に明視野画像に依存します。重要なのは、生検切除後 30 分以内に情報が得られることです。これは、病状を迅速に検出する必要がある場合に利点となります。これは、がん手術中に診断情報を提供し、その後の手術の方針を決定する術中コンサルテーションの場合に当てはまります。標準的なワークフローでは、生検サンプルを病理部門に輸送する必要があります。生検サンプルは封入剤 (最適な切断温度の化合物) に埋め込まれ、冷凍され、クライオスタットを使用して薄いスライスに切断されます。次に、スライドは H&E 染色で準備され、病理学者は顕微鏡を使用して病変の性質 (つまり、その悪性度) を含む多数の特徴を評価します 30,50。当社のワークフローは凍結と染色のステップを回避し、現場で直接実行でき、単一細胞の物理的パラメーターの自動評価に基づいて悪性腫瘍を検出できます。

術中診断を超えて、この方法が IBD サンプルの迅速な検査に役立つことを示します。 IBD の臨床診断には、ほとんどの場合、血液検査、便検査、内視鏡検査、粘膜生検の組織学的分析など、さまざまな検査の組み合わせが必要です 51,52。炎症の組織学的レベルは疾患の再発、手術の可能性、癌のリスクと相関しているため、IBD では組織学的スコアリングの重要性が高まっています。結腸生検サンプルにおける組織炎症の程度は、染色や専門家による評価の必要性を回避し、RT-FDC を介して細胞の物理的表現型をモニタリングすることで取得できることを示します。我々は、この方法を使用して一時的な炎症変化をモニタリングして疾患の進行と治療への反応を評価し、現在IBDには欠けている客観的な診断スコアリングシステムを日常の臨床診療に提供できると考えています。

がん細胞に関するこれまでの研究では、悪性度と細胞の機械的特性との間に強い相関関係があることが示されています10、11、12、46、49、53。今回我々は、この相関関係をヒト組織生検における悪性腫瘍の検出に利用します。 RT-FDC は、細胞をマイクロ流体チャネル内のせん断流にさらすことにより、ハイスループットで細胞の変形性を調査します。また、解析モデルと数値シミュレーションを使用して、単一細胞の機械的な表現型解析が可能になります54,55。通常の（応力のない）条件下で初期の球状セルを仮定すると、RT-FDC はセルの剛性の定量的尺度として弾性率を提供できます。しかし、この研究で使用したような不均一な組織サンプルでは、細胞はマイクロ流体チャネルに入る前に球形ではないことが多く、弾性率を得ることができません。それにもかかわらず、この標準的な変形アッセイにおける変形の程度は、変形能の定性的な尺度として解釈でき、画像に固有の変形情報は貴重な診断マーカーであることが示されています。マウス結腸サンプルとヒト結腸直腸生検の PCA により、標準化されたチャネル流条件における細胞の変形が、検査された生検タイプの健康な組織と腫瘍組織を区別するための鍵となることが明らかになりました。これは、この方法によってもたらされる情報の独自性を強調していますが、これまでのところ主に組織学的評価に依存している日常的な診断業務には現在欠けている情報です。この概念実証研究に続いて、この方法がさまざまな種類の癌または組織に適用できるかどうかを調査する必要があります。私たちは、特定の種類の癌では、他の種類の癌よりも細胞の変形能の変化がより多く現れる可能性があると予想しています。この方法が診断実践を改善する可能性がある特定の応用分野が存在する可能性があります。

実際の臨床用途には、組織処理と単一細胞の表現型分析を単一の自動パイプラインに統合することが有益です。 TG を使用した機械的解離は、診断用途のために組織から単一細胞を取得する効率的な方法ですが、細胞の濾過や濃縮などの手動操作の手順を減らすことが重要です。ただし、現在の状態でも、組織の酵素処理よりも速く、費用対効果が高くなります。機械的解離の主な利点は、酵素的解離プロトコルでは数十分、場合によっては数時間かかるのに対し、サンプルあたりの処理時間が 5 分未満で済むことです。さらに、酵素プロトコルでは通常、高価で特別な保管条件を必要とするサンプル依存の試薬が必要ですが、機械的解離は標準的な培地で実行できます。さまざまな酵素プロトコルにより特定の細胞タイプが濃縮されることがよくありますが 56、機械的解離による単一細胞懸濁液は組織内の実際の集団をより代表している可能性があり、したがって細胞状況の公平な検査に適していると我々は考えています。高速解離は、細胞の生化学的および生物物理学的特性を原位置に近い状態で保存する可能性もあります。これらの特性は、他のアプローチでは処理時間が長くなると悪化する可能性があります。機械的解離の速度により、細胞は酵素処理中に起こることが知られているプロテオーム変化や転写変化が少なくなる可能性があります 34,57,58,59,60。これらの仮定を評価するには、さらなる比較研究と分子研究が必要です。

将来的には、より大規模な患者コホートの調査により、診断または予後の意思決定に機械学習を活用できるようになるでしょう。人工知能はすでに、病理学者による組織学的スライド全体画像の検査、がんの診断、腫瘍の分類を支援しています 61,62,63。 RT-FDC 分析によって得られた大規模なデータセットは、数千の細胞画像と多次元情報で構成されており、このような人工知能のアプローチに役立ちます。この研究では、画像からリアルタイムで計算されるパラメーターに焦点を当てましたが、追加の物理表現型パラメーターは取得後に計算でき、形状やテクスチャの特徴など、機械学習のさらなる入力として使用できます。今後の研究では、物理的表現型データと腫瘍の悪性度スコア、転移の可能性、生存率との相関関係にも焦点を当てます。

最後に、この方法の重要な側面は、完全にラベルフリーの方法で、または分子マーカーと相乗的に、細胞の物理的表現型を使用して組織内の細胞集団を識別し、蛍光測定を強化できることです。さらに、RT-FDC36 に最近追加された選別モダリティにより、リアルタイムで、または訓練されたニューラルネットワークを使用して画像から計算されたパラメータに従って、特定の細胞集団を分離できます64,65。これは、下流のオミクス解析のための組織内の未特徴の細胞集団の濃縮や、組織由来幹細胞のラベルフリー単離などの再生医療目的にも利用できる可能性があります。

全体として、我々の発見は、酵素を使用しない機械的組織解離後のRT-FDCを介した細胞の物理的表現型判定が、組織生検における病理学的状態の診断に使用できる迅速かつ簡単な方法であることを示しています。特に、炎症状態および悪性腫瘍における病状を迅速かつ公平に予測できる可能性があります。

すべての動物実験は、すべての施設および倫理ガイドラインに従って、エルランゲン大学病院第 1 内科と協力して実施され、適切な動物ライセンス (Tierversuchsantrag no. 55.2.2-2532-2-1032/55.2. 2-2532-2-473）。動物実験は、各実験で同腹子を使用し、性別と年齢を一致させた方法で実施されました。雄と雌の両方の動物を使用した。すべてのマウスは特定の病原体のない条件下で飼育されました。欧州実験動物科学連合のガイドラインに従って、マウスの病原体を定期的にスクリーニングした。マウスは、20 ～ 23 °C、湿度 40 ～ 60% で、12 時間の明暗サイクルで飼育されました。実験は、ミッテルフランケン州政府の施設内動物管理使用委員会のガイドラインに従って行われました。動物は頚椎脱臼により屠殺され、臓器が外科的に除去された。酵素処理と TG 処理の比較のために、8 ～ 19 週齢の雌および雄の C57BL/6J マウスを使用しました。肺および肝臓組織の灌流は、酵素による解離プロセスに先行しました。 TG を使用した機械的解離では、臓器をリン酸緩衝液 (PBS) で十分に洗浄した後、2% ウシ胎児血清 (FBS) を補充したダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) に置き、さらに処理するまで氷上に置きました。酵素プロトコルは文献から入手し、補足表 1 にまとめます。酵素プロトコルと TG の両方について、使用した組織の重量を記録しました。解離手順の最後に、LUNA セルカウンターを使用して総細胞収量をカウントしました。

免疫不全 Rag1-/- マウスには、腹腔内注射により 100 万個の CD4+ CD25- T 細胞が投与されました。単核細胞は、以前に記載されているように免疫不全マウスに注射される前に、C57/BL6 ドナーマウスの脾臓から単離され、磁気活性化セルソーティング技術を使用して精製されました 66,67。細胞移植の 3 週間後に動物を屠殺し、結腸組織を「組織解離と単一細胞の調製」のセクションに記載されているように処理しました。

上皮の完全性にとって重要な役割を持つ腸上皮細胞特異的タンパク質の特異的欠失を生成するために、特定のタンパク質を隣接させた LoxP-Cre を保有するマウスと VillinCre マウスを交配しました。自然発生的な腫瘍形成が結腸内で 100% の浸透率で観察されました。

腫瘍または健康な組織から外科的に切除されたヒト生検サンプル (エルランゲンの病理学研究所から入手) を、10% FBS、1% GlutMAX、1% HEPES、および 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したアドバンスト DMEM 培地に直ちに入れ、4°で保存しました。 C、すぐに処理するか、後で使用するために液体窒素で凍結します。各患者に由来する 2 つのサンプル、つまり腫瘍サンプルと腫瘍周囲の健康な組織に由来する対照サンプルを使用して、サンプルの対応するペアを分析しました。

生検サンプルはこの研究のために特別に収集されたものではなく、患者ケアの標準的な実践の一部でした。サンプルを提供した患者からインフォームドコンセントを得て、すべての実験はヘルシンキの宣言に従って実施されました。この研究のためのヒト生検サンプルを取得するためのプロトコールは、フリードリヒ・アレクサンダー大学エアランゲン・ニュルンベルク大学病院の倫理投票によって承認された（2005年1月24日、2012年1月18日；フリードリヒ・アレクサンダー大学病院の治験審査委員会）エアランゲン-ニュルンベルク承認番号: Re.-No. 4607)。

補足表 5 ～ 10 は、分析されたすべてのヒトサンプルの集団特性と病理学的情報を示しています。リンパ球に浸潤している間質腫瘍と腫瘍の間質内容は、以前に記載されているように病理学者によってスコア化されました68。

参考文献に記載されているように、TG (Fast Forward Discoveries GmbH) を使用した組織解離を実行しました。 34、35。簡単に説明すると、組織サンプルを約 1 ～ 2 mm の小片に切断し、2% FBS を補充した DMEM 800 μl を含む TG のローターユニットに置きました。ローターユニットは 50 ml Falcon チューブの蓋の中に配置されました。 100 μm のセルストレーナーを備えたステーターインサートをローターユニットの上に置きました。 50 ml ファルコンチューブを蓋の上に置き、ネジを締めて TG デバイス上に配置しました (図 1)。各組織タイプの粉砕プロセスパラメータを補足表 2 にまとめます。TG プロトコルは、いくつかの小さな変更を加えて製造業者によって提供されました 34,35。粉砕手順に続いて、ファルコンチューブをラック上に逆さまにして開け、セルストレーナーを５ｍｌのＤＭＥＭ、２％ＦＢＳで洗浄した。フロースルーを１５ｍｌファルコンチューブに移し、３００ｇで８分間遠心分離した。続いて、上清を吸引し、細胞ペレットを２ｍｌのＰＢＳ、２％ＦＢＳで洗浄し、セルストレーナーキャップを備えたフローサイトメトリー丸底チューブに通し、３００ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを、カルシウムとマグネシウムを含まない PBS で希釈した 0.6% (wt/wt) メチルセルロース (4,000 cPs; Alfa Aesar) を使用して調製した高粘度測定バッファーに再懸濁し、重量オスモル濃度 270 ～ 290 mOsm kg-1 に調整しました。そしてpH7.4。粘度計 (HAAKE 落球粘度計 Type C、Thermo Fisher Scientific) を使用して、バッファーの粘度を 24 °C で (25 ± 0.5) mPa s-1 に調整しました。

RT-FDC 測定は、AcCellerator 機器 (Zellmechanik Dresden GmbH) を使用して、前述のように 13,14 実行されました。細胞懸濁液を、シリンジポンプに取り付けられた1 ml Luer-Lokシリンジ（BD Biosciences）に引き込み、カバーガラス上に結合されたポリジメチルシロキサンでできたマイクロ流体チップにPEEKチューブ（IDEX Health & Science LLC）によって接続しました。純粋な測定バッファーで満たされた 2 番目のシリンジをチップに取り付け、流体力学的に狭窄チャネル内の細胞を集中させるために使用しました。マイクロ流体チップは、20×20、30×30、または40×40μmの正方形の断面と300μmの長さの中央チャネルくびれによって接続されたサンプル入口、シース入口および出口で構成されていました。使用した対応する総流量は、20 μm-1 チャネルの場合は 0.06 μl s-1、30 μm チャネルの場合は 0.12 μl s-1、40 μm チャネルの場合は 0.2 μl s-1 でした。シースとサンプルの流量比は 3:1 でした。このチップは、相補型金属酸化物半導体高速カメラを備えた倒立型高速顕微鏡のステージ上に搭載された。各蛍光団のレーザー出力は、単一の染色コントロールと未染色のサンプルに基づいて、それに応じて調整されました。すべての細胞の画像は、2,000 fps のフレームレートで 250 × 80 ピクセルの関心領域内にキャプチャされました。形態学的、機械的および蛍光パラメータをリアルタイムで取得しました。各抗体の蛍光閾値は、同じ組織から得られた細胞の未染色サンプルに従って調整されました。補足表 3 には、リアルタイムおよび後処理分析中に取得された特徴がリストされています。以前の出版物69、70で詳細に説明されています。データは、ShapeIn ソフトウェア (ShapeIn2; Zellmechanik Dresden GmbH) を使用して取得されました。

必要に応じて、単細胞懸濁液を、0.5％ウシ血清アルブミン（Sigma-Aldrich）およびFc受容体ブロックを添加したPBSで希釈した200μlの対応する抗体（抗体希釈については補足表4を参照）とともに室温で20分間インキュベートした。対応する種の試薬 (Miltenyi Biotec、ヒト: 130-059-901; マウス: 130-092-575)。１ｍｌのＰＢＳおよび２％ＦＢＳを添加することによって抗体を洗浄し、５００ｇで５分間遠心分離した。次に、最終的な細胞調製物を測定バッファーに再懸濁してから、RT-FDC 分析のためにマイクロ流体チップにロードしました。凍結生検サンプルの場合、組織を予熱した DMEM に置き、10% FBS を 10 分間補充し、上記のように処理する前に解凍させました。

RT-FDC データは、Python 3.7 のパブリックパッケージを使用して分析されました。 Dclab 0.32.3 ライブラリは、データの初期ロード、前処理、およびフィルタリングに使用されました71。破片、損傷した細胞、赤血球の画像を除去するために、最小断面積 (20 µm2)、面積比 (1:1.1)、およびアスペクト比 (1:2) のゲートを適用しました。面積比 1:1.05 およびアスペクト比 1:2 を追加でゲートすることにより、60 µm2 未満の小さなセルが特定されました。これらのゲートの外側のイベントおよび 25 µm2 未満のすべてのイベントはデブリとみなされました。 RT-FDC パラメータの散布図では、色分けは 0 と 1 の間で正規化されたカーネル密度推定に従っています。

統計分析は SciPy 1.3.0 パッケージを使用して行われました。 Wilcoxon 符号付き順位検定を使用して、一対のサンプル (健康なマウス対腫瘍サンプル、およびヒトの新鮮な結腸組織サンプル対凍結サンプル) を評価しました。マン・ホイットニー U 検定が転移性大腸炎データに適用されました。グラフでは、P 値は * P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001 で表されます。効果量は r = |z|/√N として計算されました。ここで、z は検定の z 統計量、N はサンプル数です。効果の大きさは、コーエン基準に従って次のように判断されました: 0.1 ～ 0.3 の小さな効果、0.3 ～ 0.5 の中程度の効果、および > 0.5 の大きな効果。ピアソン相関を実行して、細胞変形とCD45+細胞数との相関関係、および細胞サイズと健康なマウスサンプルおよび腫瘍サンプルの面積との相関関係を判断した。

Scikit learn 0.23.2 パッケージは、さらなるデータ処理と分析に使用されました72。 RT-FDC から取得したパラメーターは、各特徴を 0 から 1 までの範囲にスケーリングすることによって変換されました。PCA は、データの特異値分解を使用して 2 次元空間 (PC1 対 PC2) に投影し、線形次元削減に使用されました。ロジスティック回帰は、健康なサンプルと腫瘍サンプルの分類に使用されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

図1〜3に関して生成および分析されたRT-FDCデータセットは次のとおりです。 2 ～ 5 および拡張データ図。 3 ～ 5 は、変形性サイトメトリーオープンリポジトリ (https://dcor.mpl.mpg.de/organization/soteriou-kubankova)73 で入手できます。各データセットの個々の識別子は、補足表 11 に提供されています。拡張データ図 1 のソースデータもこの文書に提供されています。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

RT–FDC データの処理と視覚化のための Python コードは、https://github.com/marketakub/physical_phenotyping_tissues で入手できます。

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生検サンプルを提供してくださった R. Grützmann 氏と K. Bende (Universitätsklinikum Erlangen) に感謝します。また、この論文を批判的にレビューしてくれた J. Kayser と M. Urbanska にも感謝します。我々は、DFG からの財政的支援に感謝します（SFB/TRR241「IBDome」から R.LP.、MW、RA、MN へ、FOR2438 から MN、DI 1537/20-1、DI 1537/22-1、SFB CRC1181 および SFB TR221 からJD）、IZKF エアランゲン（JD への研究助成金 A79、ME への臨床医科学者プログラムステップ 2）、マックスプランク協会の中核的資金提供（JG へ）。

マックス・プランク協会が提供するオープンアクセスの資金提供。

Despina Soteriou、Markéta Kubánková などの著者も同様に貢献しました。

マックス・プランク光科学研究所およびマックス・プランク物理医学センター（ドイツ、エアランゲン）

デスピナ・ソテリオウ、マルケタ・クバンコバ、クリスティーン・シュバイツァー、ヨッヘン・グック

医学部 1 - 消化器科、呼吸器科、内分泌科、フリードリヒ・アレクサンダー大学エアランゲン・ニュルンベルク (FAU) およびエルランゲン大学病院、ドイツ、エアランゲン

デュー・ロペス＝インズ、ラシュミタ・プラダン、オアナ＝マリア・トーマ、マクシミリアン・ワルドナー、ラジャ・アトレヤ、マーカス・F・ノイラス

ドイツ免疫療法センター (DZI)、フリードリヒ・アレクサンダー大学エアランゲン・ニュルンベルク (FAU) およびエアランゲン大学病院 (ドイツ、エアランゲン)

デュー・ロペス＝ポサダス、ラシュミタ・プラダン、オアナ＝マリア・トーマ、アンドレア＝ヘルミナ・ジェルフィ、アレクサンドル＝エミル・マテイ、マクシミリアン・ワルドナー、ジョージ・H・W・ディストラー、ラジャ・アトレヤ、マーカス・F・ノイラート

総合がんセンターエルランゲン-EMN (CCC ER-EMN)、ドイツ、エアランゲン

オアナ＝マリア・トーマ、マクシミリアン・ワルドナー、マルクス・エクスタイン、レギーネ・シュナイダー＝ストック、ラジャ・アトレヤ、マーカス・F・ノイラート、アルント・ハルトマン

内科 3 - リウマチ学および免疫学、フリードリヒ・アレクサンダー大学エアランゲン・ニュルンベルク (FAU) およびエアランゲン大学病院、ドイツ、エアランゲン

アンドレア=ヘルミナ・ジェルフィ、アレクサンドル=エミル・マテイ、ヨルク・H・W・ディストラー

Clinical Health Technologies、フラウンホーファー IPA、マンハイム、ドイツ

ステファン・ショイアマン & イェンス・ランゲユルゲン

フリードリヒ・アレクサンダー大学エアランゲン・ニュルンベルク大学病院病理学研究所（FAU）、エアランゲン、ドイツ

マルクス・エクスタイン、レギーネ・シュナイダー＝ストック、アルント・ハルトマン

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MK、DS、JG が調査を考案し、プロジェクトの進行を管理しました。 DS と MK は実験と分析を調整しました。 DS は実験プロトコルを開発し、CS と共同で実験を実行しました。データ分析と視覚化は MK によって実行されました。他の著者は実験を支援し、批判的な議論に参加しました。 MK と DS が論文を執筆し、著者全員がフィードバックを提供しました。

ヨッヘン・グックへの手紙。

SS、JL、および JG は、TG テクノロジーを商業化する会社 Fast Forward Discoveries GmbH の共同創設者です。 DS、MK、および JG は、固形生検診断のための TG と RT-DC の組み合わせに関する特許出願の発明者として指名されました。 MK と JG は、変形性サイトメトリーの診断アプリケーションを商業化する会社 Rivercyte GmbH の共同創設者です。他の著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Biomedical Engineering は、この研究の査読に貢献してくれた Dino Di Carlo 氏、Per Uhlen 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a、b、組織グラインダー (TG; 赤でマーク) または標準解離 (青でマーク) を使用して解離した、さまざまな臓器の生存細胞のパーセンテージ。細胞生存率は、(a) ヨウ化プロピジウムおよび RT-FDC、および (b) トリパンブルー排除アッセイを使用して評価されました。 c. 処理された組織 1 mg あたりの細胞数 (細胞計数装置を使用して取得)。酵素解離で処理された肺、肝臓、腎臓、膵臓および胃は、実験前に重量測定されなかった。線は平均を表し、ボックスは最小値から最大値まで伸びます。 TG データ腎臓および脾臓: n = 5、他のすべての臓器 n = 5。酵素解離の場合、腎臓、膵臓、胃: n = 3。他のすべての臓器 n = 4; 生物学的に独立した繰り返しは独立した実験として実行されます）。

ソースデータ

a、RT-FDC の 3 つの異なる検出チャネルにおける蛍光強度の代表的な散布図。蛍光細胞表面マーカーを使用して細胞を特徴付ける可能性を示しています。プロットは、内皮マーカー (CD31-PE) と白血球マーカー (CD45-FITC) の発現を示します。上皮マーカー (EpCAM-APC) と CD45-FITC の比較。 b、細胞とそれに対応する蛍光トレースの代表的な画像。蛍光ピークの時間的形状は、蛍光色素分子の細胞内局在に対応します。左上から右へ: すべてのマーカーが陰性の細胞、CD45 が陽性の細胞。下段左から右: EpCAM のみ陽性の細胞、および CD31 のみ陽性の細胞。

マウスa、胸腺、c、脾臓およびe、腎臓から単離された細胞のアスペクト比対細胞サイズの代表的な散布図は、細胞ダブレットを識別するためのゲーティング戦略を示しています。 b、胸腺、d、脾臓、f、腎臓で同定された細胞ダブレット。対応する蛍光トレース（b、d）は内皮細胞（CD31）に結合した白血球（CD45）、または（f）2つの白血球の相互作用を示しています。

a、ティッシュグラインダー（TG）または酵素的解離を使用してマウス肝臓組織から単離された細胞の変形と細胞サイズの散布図。3つの独立した生物学的反復に対する機械的解離後の肝細胞の濃縮を示します。 b、異なるサイズの肝細胞に対応する3つの細胞クラスターを示す変形対細胞サイズの散布図。対応するカーネル密度推定 (KDE) プロットと代表的な画像 (r = セルの半径)。 c、5つの独立した生物学的リピートについてRT-DCによって検出された、肝細胞の総数に対する肝細胞の割合。 d、3つの独立した生物学的リピートについて、組織グラインダーまたは酵素解離を使用してマウス肺組織から単離された細胞の変形対細胞サイズの散布図。

新鮮（紫色）または凍結（緑色）の結腸生検サンプルから抽出された単一細胞の細胞サイズと変形の散布図。 a、健康なサンプル。 b、腫瘍サンプル。スケールバー = 10 μm2 の各プロットの 3 つの代表的な細胞画像を含みます。右側のカーネル密度推定 (KDE) プロットは左側の散布図に対応します。ヒストグラムは、セルのサイズと変形の分布を示します。 c、新鮮（N = 6）および対応する凍結（N = 6）サンプルの細胞サイズ、変形、面積比およびアスペクト比の中央値と標準偏差。ボックスは 25 パーセンタイルから 75 パーセンタイルまで伸びており、中央値に線が引かれています。ひげは四分位範囲の 1.5 倍に及びます。統計的比較は、両側ウィルコクソン符号順位検定、標準偏差セルサイズ (*p = 0.0277、r = 0.64)、中央面積比 (*p = 0.0277、r = 0.64)、および標準偏差面積比 (*p) を使用して実行されました。 = 0.0277、r = 0.64); r: 効果量。 NS: 有意ではありません。

図、表、参考文献。

ソースデータ。

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転載と許可

Soteriou, D.、Kubánková, M.、Schweitzer, C. 他機械的に解離された組織生検の迅速な単一細胞の物理的表現型解析。ナット。バイオメッド。工学 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41551-023-01015-3

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受信日: 2021 年 12 月 1 日

受理日: 2023 年 2 月 22 日

公開日: 2023 年 4 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01015-3

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