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Oct 25, 2023

TREM2+ とインタースティシャル

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 14、記事番号: 1914 (2023) この記事を引用

1262 アクセス

10 オルトメトリック

メトリクスの詳細

重篤な新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の発症を促進する免疫病理学的メカニズムは、依然として十分に解明されていない。 ここでは、急性SARS-CoV-2感染のアカゲザルモデルを利用して、自然免疫系の混乱を描写します。 SARS-CoV-2 は、IFNA 産生、ナチュラルキラー細胞の活性化、および血中 CD14 ～ CD16+ 単球の大幅な増加に応じて、下気道への形質細胞様樹状細胞の急速な浸潤を開始します。 気道炎症に対する肺骨髄性サブセットの寄与を分析するために、気道細胞の縦方向の scRNA-Seq データセットを生成し、これらのサブセットをヒト肺の対応する集団にマッピングします。 SARS-CoV-2 感染は、炎症性サイトカインの主な供給源である CD163+MRC1- 集団と TREM2+ 集団という 2 つのマクロファージ サブセットの急速な動員を引き起こします。 JAK1/2阻害剤であるバリシチニブ（オルミアント®）による治療は、炎症性サイトカインを減少させ、非肺胞マクロファージの流入を排除するのに効果的です。 この研究では、SARS-CoV-2感染時に気道炎症を引き起こす主要な肺マクロファージのサブセットを概説した。

新型コロナウイルス感染症（COVID-19）のパンデミックは、2019 年 12 月に中国の武漢で新型コロナウイルス SARS-CoV-2 による局所的な肺炎の発生が一連の報告で始まった1,2。 2023 年初頭の時点で、感染者数は 6 億 7,200 万人を超え、新型コロナウイルス感染症の後遺症による死亡者数は 700 万人近くに上るとされています。 SARS-CoV-2 感染に対する効果的なワクチン 3,4,5 の急速な開発と利用可能化により、感染率は低下し、人口レベルでのウイルスの封じ込めは可能であるという、切望されていた楽観的な見方がもたらされました。 これらの画期的な成果にもかかわらず、潜在的な画期的な変異株から身を守り、ワクチンの普及が続く間に罹患した人々のための治療法を開発し、将来のウイルス流行の影響を予防または最小限に抑えるには、継続的な研究努力が不可欠です。 この観点から、SARS-CoV-2に対する自然免疫応答および適応免疫応答に関する基礎研究は、新型コロナウイルス感染症パンデミックの終結または死亡率の低下を目的としたワクチンおよび治療アプローチに情報を提供するために、引き続き重要である。

新型コロナウイルス感染症（COVID-19）のパンデミックが発生して以来、ウイルス学、免疫反応、SARS-CoV-2感染の病因に関する研究が前例のない速度で蓄積され、重症化した新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の根本的なメカニズムを説明するための多くの仮説が生ま​​れている。 これらのうち、最も支持的な証拠が蓄積されている概念は、(1) 初期 I 型インターフェロン (IFN) 反応の回避または障害 6、(2) 凝固亢進症候群から生じる血管合併症 7、および (3) 顆粒球および骨髄系の混乱です。炎症性サイトカイン産生を示す下気道および血液のコンパートメント8、9。 免疫学的には、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）患者の重篤な疾患は、一般に炎症と呼ばれる血漿および気管支肺胞洗浄（BAL）液中の炎症性メディエーター（CXCL10、IL-6、TNFαなど）レベルの広範な増加と関連している。 「サイトカインストーム」10、および下気道のマクロファージ、好中球、リンパ球の拡大8。 この目覚ましいデータの蓄積にもかかわらず、下気道の炎症を引き起こす正確な初期免疫学的事象および免疫細胞浸潤は依然として特徴づけられていない。

SARS-CoV-2感染の非ヒト霊長類（NHP）モデル（主にマカク属とアフリカミドリザル（AGM））は、主に感染後の初期事象を縦断的に、そして感染していない組織で検査できるため、重要なツールであることが証明されている。ほとんどの人体研究で利用可能11。 NHP は、上気道および下気道における高レベルのウイルス複製をサポートし 12、13、14、ACE2 および TMPRSS2 の組織分布をヒトと共有し 15、ワクチン 16、17、18 および治療薬 19、20 の貴重な前臨床モデルとなっています。 さらに、SARS-CoV-2 に感染した NHP では軽度から中等度の COVID-19 が再現されることが示されており 11、通常は感染後 10 ～ 15 日 (dpi) までに回復します 11,20,21。 NHP における SARS-CoV-2 感染のメカニズム研究では、さまざまなハイスループット技術が利用されており、(1) I 型 IFN 応答が感染後の非常に早い段階で血液および下気道で強力に誘導される 20,22、(2) 上昇することが報告されています。ヒトで見られる「サイトカインストーム」と一致する炎症誘発性サイトカインは血漿およびBALで検出可能23、(3) 凝固亢進と一致する血管病理および遺伝子発現は下気道で明らかであり22、(4) 骨髄性による炎症性サイトカインの産生の増加起点セル20、24。

現在の研究では、SARS-CoV-2に感染したアカゲザル（RM）を使用し、高次元フローサイトメトリー、多検体サイトカイン検出、バルクおよび単細胞RNAを使用して、血液および下気道で発生する初期炎症事象を調査しました。 -Seq (scRNA-Seq)。 SARS-CoV-2 による炎症における骨髄画分内の個別の免疫サブセットの役割を詳しく分析するために、scRNA-Seq およびバルク RNA-Seq 参照データセットを使用してマクロファージ/単球集団を分類し、識別する 2 つの異なる戦略を使用しました。人間の気道データセット内の類似集団。 このアプローチにより、我々は、SARS-CoV-2感染後に拡大し、気道における炎症性サイトカインの主な供給源である炎症誘発性マクロファージの主要なサブセットを特定した。 また、IFN シグナル伝達のピークと一致する、血中および下気道における形質細胞様樹状細胞 (pDC) の早期誘導も観察されました。 最後に、我々は、SARS-CoV-2 に感染した RM を JAK1/2 阻害剤であるバリシチニブで治療すると、重篤な COVID-19 患者の入院期間と死亡率が減少することが最近証明され 25、炎症誘発性マクロファージの浸潤を阻止することで気道の炎症を抑制したことを説明した。肺胞空間。 まとめると、この研究は、pDC動員とI型IFN応答の初期動態を明らかにし、浸潤マクロファージの個別のサブセットがSARS-CoV-2感染における炎症促進性サイトカイン産生の主な供給源であることを同定した。

研究デザインの概要を図 1a に示します。 私たちはマカクザルの 3 つの別々のコホート、コホート 1、バリシチニブ治療群、コホート 2 を分析しました。コホート 1 とバリシチニブ治療群では、合計 8 人の RM (平均年齢 14 歳、範囲 11 ～ 17 歳) に鼻腔内および気管内に接種しました。 SARS-CoV-2 (2019-nCoV/USA-WA1/2020) の 1.1 × 106 プラーク形成単位 (PFU) を使用。 2 dpi で、8 匹中 4 匹にバリシチニブ 20 の投与を開始しました。 この研究では、感染前のベースラインおよび超急性時点（1 ～ 2 dpi）には n = 8 の RM が含まれており、すべて未治療であり、SARS-CoV-2 感染の病因を決定するために評価された残りの長期的な時点は、n で構成されています。 = 未処理のまま残った RM のうち 4 個。 SARS-CoV-2の接種により、ゲノムおよびサブゲノムqPCRアッセイによって上気道および下気道で検出可能な再現可能な高いウイルス力価が得られました（図1b）。 鼻道、喉、BAL におけるウイルス血症のピークは 2 ～ 4 dpi でした（図 1b）。 scRNA-Seq およびフローサイトメトリー実験の能力を高めるために、同じ用量および株の SARS-CoV-2 (2019-nCoV/USA-WA1/2020) に感染したさらに 6 頭のマカクザル (平均年齢 10.5 歳) を分析しました。コホート 2 の動物は、インターフェロン阻害の影響を試験する大規模研究の一部において、SARS-CoV-2 に感染した未治療の対照として使用されました 26。

研究デザイン; RMは鼻腔内および気管内にSARS-CoV-2に感染し、縦断的に追跡された（コホート1：n = 4、バリシトニブコホート：n = 4、コホート2：n = 6）。 バリシチニブは、2 dpi から開始して 4 つの RM (バリシチニブ コホート) に毎日投与されました。 コホート 1 の 4 RM とコホート 2 の 6 RM は未治療でした。 (BioRender.com で作成)。 b SARS-CoV-2接種後、鼻、喉、および気管支肺胞洗浄液（BAL）を収集し、総gRNAおよびsgRNAについてqRT-PCRによってウイルス量を定量しました。 c BALおよび血液内の単球の縦方向のレベルをCD45+細胞の%として示します。 p 値: CD14 − CD16+ 単球 血液: 1 dpi 対 −5 dpi = 0.03 および 2 dpi 対 −5 dpi = 0.004。 CD14+CD16+ 単球血液 2 dpi 対 -5 dpi = 0.004。 d BALおよび血液内の形質細胞様樹状細胞（pDC）の縦方向のレベルをCD45+細胞のパーセンテージとして示します。 pDC の p 値 血液 2 dpi 対 -5 dpi = 0.02。 e BALおよび血液中のグランザイムBを発現するNK細胞の長期レベル。 グランザイム B+ NK 細胞の p 値 2 dpi 対 -5 dpi BAL = 0.01 および血液 = 0.008。 コホート 1 およびバリシチニブ コホートからの n = 8 RM。 赤いバーは平均を表します。 統計分析は、Graphpad Prism v7.02 の片側 Wilcoxon 符号付き順位検定を使用して実行され、各時点を -5 dpi と比較しました。 *p 値 <0.05、**p 値 <0.01。 ソース データ (b ～ e) は、ソース データ ファイルとして提供されます。

SARS-CoV-2感染後の自然免疫応答を特徴付けるために、感染の最初の2dpi、つまり「超急性」期の血液およびBALサンプルのマルチパラメトリックフローサイトメトリーを使用して、先天性集団の変化を分析しました（図1c〜e）および補足図1）、および感染の全過程にわたって（補足図2）。 血液では、2 dpi（図1c）でも、延長された時点でも（補足図2a、d）、古典的単球（CD14 + CD16-）の割合の有意な増加は観察されませんでした。 ヒトでの報告と同様に9、血中CD14-CD16+およびCD14+CD16+単球の急速ではあるが一時的な増加が観察されました（図1cおよび補足図2a、d）。 血液単球サブセットのこれらの従来のマーカーを使用して、BAL内のCD14-CD16+、CD14+CD16+、またはCD14-CD16+の有意な変化は観察されませんでした（図1cおよび補足図2a）。

2 dpiで血中のpDCのレベルが大幅に上昇し、同様にBALサンプルでもpDCの上昇傾向が観察されました（図1dおよび補足図2c、f）。 pDC 数は 4 dpi でベースラインに戻ったため、この拡大は一時的なものでした。 ナチュラルキラー細胞（NK）の全体的な頻度は血液またはBAL中で変化しませんでしたが（補足図2b、e）、グランザイムB + NK細胞の割合と絶対数は血液中で2 dpiで4から25に大幅に増加しました。 %（図1e）、感染の過程を通じて上昇したままでした（補足図2b、e）。 同様に、NK細胞活性化の増加もBALで観察され、2 dpiで12から33％に上昇し（図1e）、10/11 dpiで研究が終了するまでこのレベルで持続しました（補足図2b、e） ）。 まとめると、これらのデータは、SARS-CoV-2 感染の超急性期中に、I 型 IFN 系のエフェクター応答を開始および調整できる自然免疫細胞の顕著な動員が存在することを示しています。

SARS-CoV-2 感染によって引き起こされる免疫学的混乱の程度を理解するために、PBMC および BAL サンプルの大規模な遺伝子発現プロファイリングを実行しました。 超急性期の間、BAL は自然免疫と炎症に関連する経路を広範囲に誘導しました (図 2a)。 特に、1または2 dpiで始まるPBMCおよびBALコンパートメントにおけるインターフェロン刺激遺伝子（ISG）の迅速かつ強力な誘導が観察されました（図2bおよび補足図3a）。 ISG 応答は広範囲に及んでいましたが、10/11 dpi までにほぼベースラインに戻りました (図 2b および補足図 3a)。 また、BALおよび血漿においてそれぞれ4/6および5/8の動物でIFNαタンパク質の上昇傾向が検出され（図2c、d）、BALの2 dpiでIFNA遺伝子にマッピングされるRNA-Seqリード数の大幅な増加が検出されました。 （図２ｅ）、これは気道および血液におけるｐＤＣの拡大と一致した（図１ｄ）。 NK細胞の細胞毒性を表す遺伝子の有意な濃縮（図2a）がBALの2 dpiで観察され、フローサイトメトリーによるグランザイムB + NK細胞の上昇の観察と一致しました（図1e）。 総合すると、これらのデータは、検出可能なIFNA転写物およびタンパク質、およびSAR-CoV後の下流のIFN誘導性エフェクター機能（ISG、NK細胞活性化）と一致する、I型IFN（すなわち、pDC）を産生できる初代細胞の存在を実証している。 -2 感染、およびこれらの反応は一時的であり、10/11 dpi までにほぼ治まったと考えられます。

(c) を除き、-5 dpi および 2 dpi のコホート 1 およびバリシチニブ コホートからの n = 8 RM、2 dpi で n = 6 (3 RM コホート 1 + 3 RM バリシチニブ コホート)。 4 dpi から開始するコホート 1 からの n = 4 RM。 a 遺伝子セットの正規化された濃縮スコアと公称 p 値を示すドット プロット。 濃縮はドットの色で示され (赤: プラスの濃縮 vs. -5 dpi; 青: マイナスの濃縮)、ドット サイズは有意性を示します。 正規化された濃縮スコアと公称 p 値は、GSEA65 を使用して決定されました。 正確な公称 p 値は補足データ 1 に含まれています。 b ISG 遺伝子セットの縦方向の応答のヒートマップ。 カラー スケールは、-5 dpi サンプルの中央値に対する log2 発現を示します。 c 2 dpi 対 -5 dpi の BALF p 値でのサイトカイン評価 (メソスケール):IL6 = 0.02 および IP-10 = 0.03、および d 血漿。 重要なサイトカインのみを示しています (2 dpi 対 -5 dpi の p 値: IP-10 = 0.008、MCP-1 = 0.008、MCP-2 = 0.004)。 e BAL におけるすべての IFNA 遺伝子の正規化された発現の合計。 *p 値 = 0.04。 f GSEA濃縮プロットは、4 dpiから-5 dpiのバルクBAL RNA-Seqサンプルを比較した場合のAM遺伝子シグネチャ（SingleRに由来）の負の濃縮を示します（公称p値= 0）。 赤いバーは平均を表します。 (c)〜(e)の統計分析は、R v4.2.2の片側Wilcoxon符号付き順位検定を使用して実行され、各時点を-5 dpiと比較しました。 *p 値 <0.05、**p 値 <0.01。 ソース データ (c ～ e) は、ソース データ ファイルとして提供されます。

われわれは、SARS-CoV-2感染が、RMのPBMCとBALの両方において、いくつかの炎症性サイトカインシグナル伝達経路、すなわちIFNA、IL4、IL6、IL10、IL12、IL23、TNFとケモカイン経路CXCR4とCXCR3の有意な濃縮を誘導することを観察した。 BAL ではより大きな振幅を示します（図 2a および補足データ 1 ～ 3）。 これらの経路の多くについて、タンパク質レベル、mRNA レベル、またはその両方で上流調節因子の大幅な増加を定量化することができました。IL6 タンパク質レベルは BAL 液 (BALF) 中で大幅に増加しました (図 2c)。 BAL の RNA 転写物（補足図 3b）。 同様に、CXCR3経路シグナル伝達の誘導は、BALFにおけるIP10/CXCL10タンパク質の増加およびBALにおける2 dpiのRNAの検出と一致していた（図2cおよび補足図3b）。 血液および気道における炎症経路の出現は、多数の人体研究で報告されています (参考文献 27 で総説)。 しかし、我々は、SARS-CoV-2感染がBALにおけるいくつかの免疫調節/免疫抑制経路、すなわちPD1およびCTLA4シグナル伝達、ならびにMAPキナーゼおよびDDX58/RIG-Iシグナル伝達の負の調節因子の初期発現も促進することに注目した（図2a）。 。 以前に、我々はBALの骨髄画分が主に炎症誘発性メディエーターの産生に関与していることを報告しましたが、特定の免疫表現型は定義されていませんでした。 SARS-CoV-2感染後の下気道内のさまざまなマクロファージサブセットの存在をさらに調査するために、RM肺マクロファージに特異的なAM遺伝子シグネチャ（SingleR28から取得）を使用してバルクBALデータに対してGSEAを実行しました。 肺胞マクロファージ（AM）に特異的な遺伝子が、4 dpiと比較してベースライン（-5 dpi）で大幅に濃縮されていることを観察しました。これは、SARS-CoV-2感染後のこの遺伝子セットの下方制御を示しています（図2f）。 まとめると、これらのバルク RNA-Seq データは、SARS-CoV-2 感染後に下気道のマクロファージ集団のバランスが急速かつ大幅に変化していることを示しています。

RMに関する我々の以前の研究では、骨髄起源の細胞がSARS-CoV-2感染後の下気道における炎症性サイトカインの産生を担う主要なサブセットであることを実証した20。 我々の以前のscRNA-Seq分析では、感染後のBAL内の細胞の大部分が単球/マクロファージ起源であり、好中球または顆粒球が比較的少ないと判断されましたが、下気道の炎症を引き起こす骨髄細胞の正確な免疫表現型は正確に描写されていませんでした。 。

scRNA-Seq データでは、細胞表面マーカー遺伝子に基づく細胞分類は、この技術に固有の遺伝子ドロップアウトにより通常問題が発生します。 アカゲザルモデルシステムでは、正確な分類はさらに複雑になります。ゲノム参照の注釈が不完全であり、他のモデル種のマーカーが表現模写できない場合があります。 最近、肺に常在する組織マクロファージのサブセットとウイルス感染および炎症時のそれらの機能を解明するいくつかの重要な進歩が見られました29、30、31、32。 しかし、定常状態のRM肺懸濁液およびBALからのscRNA-Seqデータの分析により、マウス肺のマクロファージを区別するために使用されるいくつかの重要なマーカー(例、Lyve1)が、アカゲザル肺骨髄系の集団を区別するのに十分なレベルで発現されていないことが示された。人口（補足図7）。 したがって、scRNA-Seq データで SARS-CoV-2 感染後の RM 気道内の組織マクロファージと単球由来/浸潤マクロファージを正確に分類するために、2 つの重複する代替戦略を使用しました。 最初の戦略は、BAL 細胞をマッピングして注釈を付けるための参照として、未感染 RM からの既存の肺 scRNA-Seq データを使用することに基づいていました。 私たちは、スーラ パイプライン 34 を介して 3 つの未感染 RM (NCBI GEO: GSE149758) 33 からの肺の 10 倍データを処理し、報告されている 4 つのマクロファージ/単球サブセットを再現しました。 CD163+MRC1+TREM2+ マクロファージ、浸潤単球と同様。 CD163+MRC1-、間質性マクロファージに類似。 およびCD16 +非古典的単球（補足図4a〜d）。 私たちはSeuratを使用して、SARS-CoV-2に感染したRMからBALマクロファージ/単球をマッピングし、肺参照からアノテーションを転送しました。 2 番目の戦略では、CD206/MRC1 および CD163 の発現に基づいて、Cai ら 36 によって定義された表現型に従って、3 人の未感染 RM の肺から採取した選別された AM および IM に対するバルク RNA-Seq を使用して、SingleR28 Supplementary を使用して細胞にアノテーションを付けることが含まれていました。図4e、f)。 合計で2069個の遺伝子がIMとAMの間で差次的に発現することが判明した（FDR < 0.05、倍率変化> 2）（補足図4e）。 注目すべきことに、CX3CR1はIMで上方制御されており、このサブセットのマウスとヒトの両方の定義と一致しています（補足図4f）。 RNA編集シチジンデアミナーゼであるAPOBEC3Aも、炎症促進性COX-2シクロオキシゲナーゼ酵素であるPTGS2、結合組織の破壊を介して細胞の遊走を可能にするTIMP1、免疫抑制制御因子であるVCAN、およびPDE4BとともにIMにおいて上方制御されていた。 、TNFαの発現を調節します（補足図4f）。 バルクソートされたAMおよびIMデータセットを使用して肺マクロファージ/単球サブセットに注釈を付けたところ、CD163 + MRC1 +クラスターのほとんどすべてと一部のCD163 + MRC1 + TREM2 +細胞がAMとして注釈が付けられ、残りはIMとして注釈が付けられたことがわかりました（補足図4g）。 したがって、肺の scRNA-Seq ベースのリファレンスを基本的なバルク トランスクリプトーム シグネチャーに対してベンチマークすることにより、定常状態条件で AM 表現型を非 AM から分離する精度が実証されました。

次に、これらのシグネチャを、USA-WA1/2020 の 1.1 × 106 PFU を鼻内および気管内に感染させたアカゲザルの 2 つの独立した scRNA-Seq データセットに適用することにより、SARS-CoV-2 感染後の RM の BAL 内の骨髄系集団の変化を分析しました。 SARS-CoV-2株：コホート1はn = 3（ベースラインおよび4 dpi）20のデータセットで構成され、コホート2はn = 5（ベースライン）およびn = 6（4 dpi）26で構成されます。 肺/scRNA-Seqリファレンスを使用して、BALマクロファージ/単球の大部分が、CD163+MRC1+TREM2+マクロファージサブセットの一部の細胞とともに、-5dpiでAM様CD163+MRC1+マクロファージサブセットに属していることを発見しました（図1）。 3a、bおよび補足図5a）。 4 dpi では、CD163+MRC1+TREM2+ マクロファージと IM 様 CD163+MRC1- マクロファージの両方が流入し、CD16+ 非古典的単球として注釈が付けられた細胞はほとんどありませんでした。 MARCO、FABP4、CHIT1などの遺伝子マーカーの発現は、細胞サブセットの注釈をさらに裏付けました（図3c）。 また、バルクRNA-Seqによって分析したBALサンプルでは、​​APOBEC3Aの同様の増加と肺胞マクロファージ関連遺伝子MARCOおよびCHIT1発現の減少が観察され、CD163 + MRC1 +細胞の損失を示しました（図3d）。 sc-RNA-Seq データセットを分析することにより、4 dpi と比較したベースラインでの CD163+MRC1+ マクロファージの合計パーセンテージは、コホート 1 および 2 の BAL 内のすべてのマクロファージ/単球の 93.3% から 55% に減少し、89.3% から 63.1% に減少しました。 、それぞれ（図3e、f）。 プールされた scRNA-Seq データセットにおける細胞頻度の推定値は、個々のサンプルの不均衡な細胞数によって決まる可能性があります。 この潜在的な偏りを説明するために、我々は個々の動物による骨髄集団の変化を調べました。 コホート 1 では、CD163+MRC+ 細胞が平均 90.2% (sd = 5.2%) から平均 65.4% (sd = 32%) (p = ns) に減少し、コホート 2 では平均 92% から大幅に減少したことが観察されました。 (sd = 5.1%) から 65.7% (sd = 16.4%) の平均 p = 0.0087 (図 3g、h)。 逆に、CD163 + MRC1 + TREM2 + マクロファージの割合の全体的な増加が6.5から36.8％（コホート1）、10.3から19.8％（コホート2）に見られました（図3e、f）。 個人レベルでは、コホート 1 (p = ns) では CD163+MRC1+TREM2+ 細胞のレベルが平均 9.7% (sd = 5.3%) から平均 28.6% (sd = 25.2%) に増加し、平均 7.7% に増加したことが観察されました。 (sd = 4.9%) は 20.0% (sd = 10.4%) を意味します (p = 0.03) (図 3g、h)。 さらに、IM様CD163+MRC1-マクロファージの増加が観察されました：プールされたscRNA-Seqデータでは、コホート1では0.2から8％、コホート2では0.4から17％でした（図3e、f）。 個々の動物を考慮すると、CD163+MRC1- 細胞はコホート 1 で平均 0.15% (sd = 0.19%) から平均 5.9% (sd = 6.9%) に増加し、平均 0.28% (sd = 0.18%) から平均 14.2% に有意に増加しました。 (sd = 9.1%) (p = 0.004) (図 3g、h)。 したがって、SARS-CoV-2感染により、4dpiでBALに単球由来およびIM様マクロファージが流入した。

a 3頭のSARS-CoV-2感染アカゲザル（コホート1）から得られた-5 dpi（緑）および4 dpi（マゼンタ）の10X BALサンプルからの単細胞マクロファージ/単球の、肺マクロファージ/単球の参照UMAPへの投影。非感染アカゲザル (NCBI GEO: GSE14975833)。 b サンプル収集時間ごとに分割された非感染肺参照に基づいて予測された細胞型の注釈を示す UMAP 投影 (コホート 1)。 c SARS-CoV-2感染BALサンプル（コホート1）におけるさまざまなマクロファージ/単球サブセットのマーカー遺伝子の発現を示すドットプロット。 d バルクBAL RNA-Seqデータ（コホート1）におけるAPOBEC3A、CHIT1およびMARCOの-5 dpiと比較したLog2倍率変化。 有意性は DESeq2 を使用して決定されました。 デフォルトの Benjamini および Hochberg 法によって補正された p 値を使用しました。*adj p value <0.05、***adj p value <0.001。 正確な p 値は補足データ 2 に含まれています。プールされた 3 匹すべての動物からの -5 dpi および 4 dpi でのすべてのマクロファージ/単球サブセットのうちの特定のサブセットの割合 (コホート 1) (e)、および -7 dpi および 4 dpi でプールされた6匹の動物すべてからのもの（コホート2）（f）。 コホート 1 (n = 3) の -5 dpi および 4 dpi (g)、および -7 dpi (n = 5) および 4 dpi (n = 6) での各動物のすべてのマクロファージ/単球サブセットのうちの特定のサブセットの割合) コホート 2 (h)。 黒い線は中央値を示します。 4 dpi 対 -7 dpi のコホート 2 (f) の p 値: CD163+MRC1+ = 0.009、CD163+MRC1+TREM2+ = 0.03、および CD163+MRC1- = 0.004。 炎症誘発性遺伝子および ISG の産生に対する各マクロファージ/単球サブセットの寄与 - コホート 1 プール (i)、コホート 2 プール (j)、コホート 1 個体 (k) およびコホート 2 個体 (l)。 (l) の p 値: * = 0.03。 寄与率は、マクロファージ/単球サブセットにおける特定の遺伝子の正規化された発現の合計を、すべてのマクロファージ/単球サブセットにおける遺伝子の正規化された発現の合計で割ることによって計算されました。 a–c、e、g、i、k コホート 1: -5 dpi と 4 dpi の両方で n = 3、d コホート 1: 2 dpi で n = 8、4 dpi で n = 4、f、h、j、 l コホート 2: -7 dpi の場合は n = 5、4 dpi の場合は n = 6。 黒い線は中央値を示します。 R v4.2.2 では、(g、k、l) については両側 Wilcoxon 単一順位検定、(h) については両側 Mann-Whitney U 検定を使用して統計分析を実行しました。 *p 値 <0.05、**p 値 <0.01。 ソース データ (d ～ l) は、ソース データ ファイルとして提供されます。

我々の細胞分類をさらに検証し、数が増加し、炎症性メディエーターを主に産生するのは浸潤細胞であるという観察を裏付けるために、バルク選別されたAMおよびIM細胞の遺伝子発現を使用してBALマクロファージ/単球を分類するという2番目の戦略を使用しました。 この定義を使用して、非 AM 人口の割合が増加し、それに対応して AM 人口が減少していることを確認しました（補足図 5b、d）。 非AM集団は、炎症誘発性サイトカインのより高い発現を示すことも判明した（補足図5e）。

4 dpi および -5 dpi BAL マクロファージ/単球の差次的発現解析により、CHIT1、MARCO、および MRC1 が BAL で下方制御を示す上位遺伝子の 1 つである一方、単球由来マクロファージに関連する ADAMDEC137 や S100A838 などの遺伝子は、最もアップレギュレートされているものの一つです（補足データ 4）。 これらのデータは、4 dpi での BAL への浸潤マクロファージの流入の観察が、この表現型の複数の定義にわたって一貫していたことを示しています。

初期のSARS-CoV-2感染時の肺胞腔内の肺マクロファージの動態の観察を考慮して、各マクロファージ/単球集団（図3）、および従来の骨髄系樹状細胞における転写変化を特徴付けました。 骨髄性 DC は非常に低い頻度 (<2%) で存在し、感染後に TNF、IL6、または IL10 からの mRNA を保持している細胞は合計 70 個以下でした。 IL1B発現はわずかに高かったが、4 dpiでBAL内のIL1B発現細胞の2.5％未満を占めました（補足図6a〜e）。 いくつかのケモカイン (CCL4L1、CCL3、CXCL3、CCL2)、複数の ISG、NFKB1A、S100A8、および GZMB は、BAL 集団の 4 dpi で最も上方制御された遺伝子の 1 つでした (補足データ 4)。 IL6、TNF、IL10、IL1Bを含む複数の炎症性遺伝子の発現上昇が、コホート1とコホート2の両方のCD163+MRC1+TREM2 MacおよびCD163+MRC1-サブセットで観察されました（図3i-lおよび補足図7）。 ）感染後。 浸潤マクロファージは、好中球（CXCL3、CXCL8）、マクロファージ（CCL2、CCL3、CCL5、CCL4L1）、および活性化T細胞（CXCL10）の動員に特異的なケモカイン、および複数のISGを含む複数のケモカインを上方制御することも観察されました（補足図）。 7と8）。 CD163 + MRC1 + マクロファージを調べたところ、浸潤マクロファージに見られる同じ炎症性サイトカインと遺伝子セットの多くが、はるかに低い大きさではあるものの、4 dpiで上昇しました（補足図7および8）。 CD163 + MRC1 + マクロファージと比較して浸潤マクロファージにおける炎症性サイトカインの平均発現が有意に高いことが観察されたため、各サブセットから検出されたシーケンスリードの割合を比較して、炎症性サイトカイン産生への全体的な寄与を評価しました（図3i）。 コホート 1 では、4 dpi で、CD163+MRC1+TREM2+ マクロファージが IL6 の 55%、TNF の 57%、IL10 発現の 86% を占め、CD163+MRC1- マクロファージが IL6 の 20% を占めていることが観察されました。 TNF 発現は 21%、IL10 発現は 6% (図 3i)。 コホート 2 では、浸潤マクロファージが肺胞マクロファージよりもほとんどの炎症性サイトカインの発現に寄与していることも観察しました。CD163+MRC1+TREM2+ 細胞および CD163+MRC1- 細胞での発現は、IL10 で 39.2% と 47%、IL10 で 17.4% でした。 IL6では74.9%、TNFではそれぞれ22.4%と46.6%でした(図3j)。 プールされたデータにおける細胞数の潜在的な偏りを説明するために、個々の動物におけるBAL発現に対するサイトカインの寄与も調べました（図3k、l）。 コホート 1 では、プールされたデータで見られた浸潤マクロファージ集団における炎症性発現への寄与がより高いという全体的な傾向は、主に細胞数の不均衡と低い統計検出力により、IL10 と CCL4L1 についてのみ観察されました (図 3k)。 しかし、コホート 2 では、浸潤性 CD163+MRC1+TREM2+ および CD163+MRC1- マクロファージ集団のレベルが一貫して上昇していることが観察されました (図 3l)。 IL10 の場合、CD163+MRC1+ の平均±sd 発現は 17.3 ± 12.4% でしたが、CD163+MRC1+TREM2+ 細胞では 40.4 ± 12.1% (p = 0.03)、CD163+MRC1- では 42.3 ± 21.2% (ns) (図3l)。 IL6 の場合、CD163+MRC1+ における平均±sd 発現は 9.4 ± 12.2% であったのに対し、CD163+MRC1+TREM2+ 細胞では 12.2 ± 24.5% (ns)、CD163+MRC1- では 78.4 ± 28.8% (p = 0.065) でした。 さらに、IL6 の観察は有意な傾向にありましたが、CD163+MRC1- 細胞のパーセンテージには大きなばらつきがあることがわかりました。 これに対処するために、我々は、SARS-CoV-2 感染の 2 dpi 後に BAL マクロファージの scRNA-Seq 発現を得た別のデータセット 26 を分析しました。これらのデータは、CD163+MRC1- 細胞における IL6 の発現がはるかに高い傾向もありました ( CD163 + MRC1 + マクロファージ（27.7 ± 29.5％）と比較して、67.1 ± 32.4％）（補足図9）。 CCL4L1 の場合、CD163+MRC1+ は発現の 9.6 ± 6.3% に寄与しましたが、これに対し、CD163+MRC1+TREM2+ 細胞では 23.7 ± 13.5% (p = 0.03)、CD163+MRC1- 細胞では 66.7 ± 18.2% (p = 0.03) でした。 CXCL10 発現に対するさまざまなサブセットの寄与は、CD163+MRC1+ 集団からは 19.2 ± 16.7% であったのに対し、CD163+MRC1+TREM2+ 集団からは 15.3 ± 9.3%、CD163+MRC1- 集団からは 65.4 ± 15.2% でした。 全体として、これらのデータは、浸潤マクロファージ集団が急性 SARS-CoV-2 感染中の下気道炎症性サイトカイン産生の大部分を担っていることを示しています。

浸潤性骨髄性集団の増加を検証するために、追加の6頭のSARS-CoV-2に感染したアカゲザルの末梢血およびBALにおけるCCR2+骨髄性集団の頻度をフローサイトメトリーによって定量しました（補足図10）。 CCR2 は、SARS-CoV-2 感染マウスの肺実質への単球浸潤を調節することが実証されており 39、その発現はインフルエンザウイルスに感染した NHP の浸潤マクロファージの BAL で上方制御されています 35。 scRNA-Seq による浸潤性骨髄細胞の増加の観察と一致して、2 dpi で CCR2+ CD14-CD16+ および CD14+CD16+ 単球の頻度が同時に増加していることがわかりました。 これらの結果は、SARS-CoV-2感染後のBALにおける炎症性単球の浸潤をさらに裏付けるものである。

NHP モデルでの発見をヒト SARS-CoV-2 感染に翻訳するために、アカゲザル骨髄性の定義に使用されたものと同様のバイオインフォマティクス アプローチを使用しました。 我々は、公開されている6人の健康なヒトドナーからの肺のscRNA-Seqデータセット（GEO: GSE13589340）からのマクロファージ/単球を使用し、最近の分類に基づいてこれらをFABP4hi、SPP1hi、FCN1hiおよび増殖性マクロファージに分類しました41（図4a）。 ヒトとアカゲザルの健康な肺マクロファージ/単球の間で標準マーカー遺伝子を比較したところ、両者の間に同等の集団が存在することがわかりました（図4a-c）。 すなわち、CD163+MRC1+アカゲザルサブセットはFABP4hiヒトサブセットと非常に類似していた。 CD163+MRC1+TREM2+アカゲザルサブセットはSPP1hiヒトサブセットと一致した。 そして、CD163+MRC1-マクロファージとCD16+単球アカゲザルは、FCN1hiヒトサブセットと転写的に類似していた。 次に、6つの健康なヒトサンプルからのすべてのマクロファージ/単球細胞のデータと3つの健康なアカゲザルサンプルを組み合わせ、ヒトサンプルを参照として使用してスーラで参照ベースの統合を適用しました（補足図11a、b）。 各クラスター内の異なるヒトおよびアカゲザル細胞タイプの分布を調べたところ、標準マーカーに基づくサブセットの類似性に関する以前の観察が、これらの細胞の全体的な遺伝子発現によってさらに裏付けられることがわかりました（補足図11c）。 最後に、種間のマクロファージのサブセットを正確に識別するための細胞分類の堅牢性をテストするために、サブセット/種の組み合わせごとに遺伝子シグネチャを生成し、反対の種の濃縮についてテストしました。 すべての比較において、署名は対応する反対側のサブセットで最も高いスコアを獲得しました（補足図11d）。

6 人の健康な人間のドナーからの肺のマクロファージ サブセットの UMAP (GEO: GSE135893)。 b 3 頭の健康なアカゲザルの肺におけるマクロファージ サブセットの UMAP (GEO: GSE149758)。 c マーカー遺伝子の発現を示すドットプロット。 色のグラデーションは発現レベルを表し、ドットのサイズは特定の遺伝子を発現している細胞の割合を表します。 d 健康な (n = 3)、または中等度 (n = 3) または重度 (n = 6) の新型コロナウイルス感染症 (n = 6) に罹患しているヒトドナーからの BAL サンプルの UMAP (GEO: GSE145926) を、スーラを使用して健康な肺参照にマッピングマップクエリ関数。 e 各ヒト BAL サンプル中のすべてのマクロファージ/単球のうち、予測された細胞型のパーセント。 黒いバーは中央値を示します。 統計分析は、R v4.2.2 のペアワイズ両側マンホイットニー U 検定を使用して実行されました。 p 値 * = 0.02。 炎症誘発性遺伝子および ISG の産生に対するヒト BAL の予測された各マクロファージ/単球サブセットの寄与 - プール (f) および個別 (g)。 寄与率は、マクロファージ/単球サブセットにおける特定の遺伝子の正規化された発現の合計を、すべてのマクロファージ/単球サブセットにおける遺伝子の正規化された発現の合計で割ることによって計算されました。 黒いバーは中央値を表します。 統計分析は、R v4.2.2 の両側 Wilcoxon 符号付き順位検定を使用して実行されました。 *FABP4 を除くすべての p 値 0.03、IL6、IL1B、TNF、CXCL3、CXCL8、および SPP1hi の増殖対 CCR2 の増殖: p 値 = 0.04。 ソース データ (e ～ g) は、ソース データ ファイルとして提供されます。

健康なヒトのデータセットを参考として使用して、健康なドナーまたは中等度または重度の新型コロナウイルス感染症患者からのヒトBALサンプルの公的に利用可能なscRNA-Seqデータセット内の骨髄クラスターからのマクロファージ/単球を分類しました（補足図11e、f）。 (図4dおよび補足図11g)。 元の研究8で報告されているように、新型コロナウイルス感染症ではSPP1hiおよびFCN1hiサブセットが大幅に増加している一方、常在肺胞マクロファージを主に代表するFABP4hi集団は中等度および重度の両方で大幅に減少していることが判明した。 COVID-19 感染 (図 4d、e)。 さらに、これらのさまざまな集団の炎症への寄与も調べたところ、非常在型SPP1hiおよびFCN1hiサブセットが重度の新型コロナウイルス感染症患者における炎症促進性メディエーターの発現に主に関与していることが判明した（図4fおよび補足）図12）。 それぞれ（FABP4hi、SPP1hi、およびFCN1hi）全体の発現に対する各集団の寄与は、IL10（1.3%、56.7%、42%）、IL1B（6.6%、37%、56%）、IL6（2.4%、40.8%）でした。 ％、56.7％）、TNF（1.6％、44.1％、54.1％）、CXCL10（1.8％、36.5％、61.7％）およびCXCL8（2.6％、48.1％、49.1％）（図4f）。 注目すべきことに、ISG発現(IFI27、ISG15、ISG20、MX2)は、重度の疾患ではFABP4hiと比較してSPP1hiおよびFCN1hi集団において有意に上方制御されていたが、中等度の症例では上方制御されなかった。 最後に、これらのデータセットで個々の患者によるサイトカイン発現の寄与を調べたところ、重症の COVID-19 では浸潤集団の IL10 発現が有意に高いことが観察されました (平均 ± sd SPP1hi 50.9 ± 8.7%、p = 0.03; FCN1hi 46.9 ± 8.3%、p = 0.03)、IL1B (平均 ± sd SPP1hi 31.7 ± 14.9%、p = 0.03; FCN1hi 63.3 ± 20.1%、p = 0.03)、TNF (平均 ± sd SPP1hi 43.4 ± 9. 3% 、p = 0.03; FCN1hi 53.7 ± 13.7%、p = 0.03)、CXCL10 (平均 ± sd SPP1hi 27.3 ± 9.5%、p = 0.03; FCN1hi 69.8 ± 11.1%、p = 0.03)、CXCL3 (平均 ± sd SPP1hi 55. 9± 9.6%、p = 0.03; FCN1hi 37.6 ± 13%、p = 0.06) および CXCL8 (平均 ± sd SPP1hi 42.7 ± 14%、p = 0.03; FCN1hi 53.4 ± 17.4%、p = 0.03) と FABP4hi 集団 (平均) IL10の±sd 2.2±2.8%、IL1B 4.7±8.2%、TNF 2.7±4.5%、CXCL10 2.6±2.9%、CXCL3 6.4±9.5%およびCXCL8 3.8±5.9%)(図4g)。 まとめると、これらの分析は、RMで転写的に定義された骨髄系サブセットがヒト肺にも類似の集団を持ち、それらの拡大と下気道におけるSARS-CoV-2誘発性炎症への寄与が全体的に一致していることを実証している。

バリシチニブは、活動性関節リウマチの治療薬として承認された JAK1/2 阻害剤で、最近 FDA によって一部の入院成人における COVID-19 治療薬として承認され 42、単剤療法として 43 またはレムデシビルと併用した場合に死亡率が低下することが報告されています 25。 コホート1とバリシチニブ治療動物のデータを用いた我々の以前の研究（図1a）では、バリシチニブがSARS-CoV-220に感染したRMのBALにおける炎症誘発性サイトカインの発現を抑制できることが判明した。 ここで、我々はこの研究を拡張して、感染前（-5 dpi）の5つのRMと4 dpiでの気道の骨髄集団に対するバリシチニブの影響をさらに特徴付けました。3つのRMは未治療のままで、2つのRMはバリシチニブを投与されました。 バリシチニブ投与動物ではCD163+MRC1-またはCD163+MRC1+TREM2+集団の増加が検出されなかったため、2日間のバリシチニブ投与により4 dpiで肺胞腔への浸潤マクロファージの流入が実質的に阻止されたことがわかりました（図1）。 .5a–d)。 この観察は、10X肺参照へのマッピングに基づくマクロファージの分類、またはバルクソートされたAM/IM細胞を使用したマクロファージの分類を使用して一貫していました（図5a〜dおよび補足図5a〜d）。 浸潤マクロファージの流入を防ぐことに加えて、バリシチニブ治療により炎症性サイトカインとケモカインの発現が大幅に低下しましたが、ISG発現は未治療の動物と同等のままでした（図5e-gおよび補足図5e）。 要約すると、これらのデータは、バリシチニブ治療が肺胞区画への個別の炎症誘発性マクロファージ集団の浸潤をブロックする能力を実証することにより、バリシチニブ治療がSARS-CoV-2感染症における気道炎症を抑制する作用機序をさらに解明している20。 フローサイトメトリーを使用した我々の観察と同様に、scRNA-Seqデータによって検出されたBALの4 dpiでpDCの存在量の増加がありましたが、この増加はバリシチニブ処置動物では無効でした（図5h、i）。

a 3匹の未処理アカゲザルと2匹のバリシチニブ処理アカゲザルからの-5 dpiおよび4 dpiの10X BALサンプルからのマクロファージ/単球の、未感染肺マクロファージ/単球の参照UMAPへの投影(NCBI GEO: GSE149758)。 b 治療および時点ごとに分割された UMAP は、参照肺マクロファージ/単球へのマッピングに基づいて予測された細胞アノテーションを示しています。 BAL サンプル内のすべてのマクロファージ/単球の特定のマクロファージ/単球サブセットのパーセンテージ (プールされたサンプル (c) および個別のサンプル (d))。 バリシチニブ処理サンプルおよび未処理サンプルの BAL 10X サンプルにおけるさまざまなマクロファージ/単球サブセットにおける炎症誘発性サイトカイン (e)、ケモカイン (f)、および ISG (g) の発現を示すバイオリン プロット。 h scRNA-Seq からの BAL サンプル中の pDC の絶対数、および i scRNA-Seq からの BAL サンプル中の全細胞中の pDC のパーセンテージ。 ソースデータ (c、d、h、i) は、Source Data ファイルとして提供されます。

SARS-CoV-2 感染が重篤な疾患を引き起こすメカニズムはまだほとんどわかっていませんが、依然として、新型コロナウイルス感染症のパンデミックによる被害を軽減するための重要な優先事項です。 症状の出現は SARS-CoV-2 感染後 2 ～ 14 日の範囲であるため、臨床サンプルを使用した初期の免疫学的事象の特徴付けは困難です。 ここでは、SARS-CoV-2感染のRMモデルと統合システム分析を利用して、超急性感染時の免疫反応を詳しく分析しました。 我々の所見は次のとおりである。(1) SARS-CoV-2 感染により、血中および下気道で 1 ～ 2 dpi で明らかな強力な I 型 IFN 応答が開始された。 (2) SARS-CoV-2 は、2 つの浸潤マクロファージ集団の気管支肺胞腔への急速な流入を誘導し、炎症性サイトカイン産生の大部分を生成しました。 (3) 一部の入院成人に対する新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の治療に使用することが最近 FDA によって認可された薬剤 42 であるバリシチニブの作用機序は、これらの炎症細胞の気道への浸潤を阻止することです。 私たちのデータは、これまでのところ、超急性 SARS-CoV-2 感染中に発生する免疫病理学的事象の最も包括的な分析を示しています。

RM 肺マクロファージの参照データセットを使用して、SARS-CoV-2 感染後に気道に浸潤し、下気道炎症性サイトカインとケモカインの主な生産者である 2 つの骨髄細胞サブセットを特定しました。これらはどちらも肺胞マクロファージとは明らかに異なります。 CD163+MRC1+TREM2+細胞として定義される1つの集団は、マウスの浸潤性CCR2+単球の定義と非常に類似していた。 2 番目の CD163+MRC1- は、間質性マクロファージによく似ていました。 我々のデータは、フローサイトメトリーを使用した、RM の BAL における IM の急速な (3 dpi) 増加の最近の観察と一致しています 21。 同様に、感染したRMおよびAGMのBALおよび肺では、非AM（CD16+CD206-HLA-DR+/CD11b+と定義される）の蓄積とAMの相互減少が観察されている23。 私たちは、NHP で転写的に定義されたこれらの骨髄性サブセットが、ヒトの肺にも類似した集団を持っていることを発見しました。 最後に、我々のデータは、SARS-CoV-2 が循環単球の肺実質への動員を誘発したが、CCR2 欠損マウスでは有意に抑制されたというマウスモデルにおける我々の最近の発見と一致している 39。 CD163+MRC1+Mac/AM 様サブセットも炎症環境に寄与し、量は大幅に少ないにもかかわらず、IL6、TNF、および IL10 を生成しました。

私たちの観察は超急性感染の最中であり、私たちの動物は重篤な疾患を発症しなかったことに注意することが重要です。そのため、これらの浸潤集団が初期の炎症を調整し、気道の病因に寄与する可能性があることを私たちのデータは示していますが、これを正式に結び付けることはできません。 しかし、このモデルは、Renらによる最近のデータと一致している44。彼らは、我々の観察と同様に、中等度の疾患を持つ患者と比較して、重度の新型コロナウイルス感染症患者のBAL常駐骨髄集団においてMARCO発現が有意に減少していることを観察した。これは、浸潤マクロファージの出現により MARCO+ マクロファージの集団が希釈されたことを示しています。 これらの観察結果を我々のデータと併せて考えると、今回我々が特定した炎症性マクロファージの表現型が、重症の新型コロナウイルス感染症患者の下気道に優先的に保持されている可能性があることが示唆される。 さらに、重篤な疾患を軽減する効果が実証されているJAK1/2阻害剤バリシチニブによるin vivo治療が、これらの炎症性マクロファージの気道への動員を事実上阻止でき、新型コロナウイルス感染症の発症とのさらなる機構的関連性を提供することを実証した。 -19 関連の病因。

炎症性サイトカインに加えて、浸潤マクロファージサブセットが高レベルのIL10を産生し、IL10シグナル伝達経路が豊富であることを観察しました。 肺 IM は、定常状態と先天性刺激 (LPS、非メチル化 CpG) に応答して IL10 を産生する「プロフェッショナル IL10 産生細胞」であると考えられています 45。 これまでのデータの大部分は、喘息、肺線維症、およびアレルゲン誘発炎症のマウスモデルにおける IM の免疫調節、保護的役割を実証しています 30。 しかし、IM の炎症誘発性の可能性は比較的研究が進んでいませんが、IM は TLR リガンドに応答して IL6 および TNF を効率的に産生することが証明されています 46。 浸潤マクロファージにおける高いIL10産生の観察を考慮すると、このサブセットの潜在的な免疫調節の役割を除外することはできず、実際、気管支肺胞腔への浸潤IMマクロファージとTREM2+マクロファージのバランスが気管支肺胞腔の病原性転帰を決定するという興味深い仮説を提示しています。 SARS-CoV-2感染。 最後に、最近の出版物では、肺 IM は、Lyve1、MHC、CD169、および CD11c29、30、31、32 の発現軸によって定義される、機能的に異なる 2 つまたは 3 つの集団で構成されている可能性があると報告されています。 BAL IM 間の個別のクラスタリングも、これらのマーカー間の発現差も観察されませんでした。マカク マクロファージ サブセットとマウス モデルで同定されたマクロファージ サブセットの一致性を理解するには、さらなる研究が必要です。

我々は、気道および血液中のpDCの上昇、IFNAおよびIFNBの転写物およびタンパク質、上方制御されたISG、およびNK細胞におけるグランザイムBの増加を特徴とする、1〜2 dpiでI型IFN経路の非常に迅速かつ強力な誘導を観察した。 SARS-CoV-2 感染における I 型 IFN 応答は熱心に研究されており、気道上皮細胞の in vitro 感染では一貫して ISG 応答の変異が生じており 47、重度の COVID-19 を発症している患者では IFN 応答の変異発生率が高いことが報告されている。 IFN応答遺伝子、またはIFN応答遺伝子に対する自己抗体レベルの上昇（参考文献6、48、49、50、51、52、53、54、55で概説）。 IFN 応答が 2 dpi でピークに達し、10/11 dpi までに大幅に減少したという我々のデータは、ISG 応答の明確に定義された動態を提供しており、同様の観察が他の NHP 研究でも報告されています 21,22。 IFN 応答の急速かつ短命な性質は、臨床サンプルにおける IFN 応答の解釈の困難さを強調しています。

我々のマルチパラメトリック解析では、ISG産生、IFNA/B検出、NK細胞活性化のピークと一致する2 dpiでのpDCの増加が実証されたため、pDCが下気道におけるIFN応答を調整する主要な細胞であることが示唆されました。 我々は以前、ヒトSARS-CoV-2感染における末梢血pDCの頻度と活性の低下を観察しており56、他の研究者はIFN-I反応の低下を予測するpDCのアポトーシスの兆候を報告している57。 これらの臨床所見を踏まえると、BAL における pDC の蓄積に関する我々の観察は、pDC が血液から下気道へ急速に動員されることを示しており、これはそれらが初期の防御自然免疫応答を駆動する可能性が高いことを示唆しています。 ただし、pDC は病理学的炎症にも寄与する可能性があります。 これらの仮説を検証するには、動物モデルにおける pDC/IFN 軸をターゲットとした将来の介入研究が必要となるでしょう。

私たちの以前の研究では、バリシチニブが I 型 IFN 応答を維持しながら、SARS-CoV-2 に感染した RM における気道炎症誘発性サイトカイン産生をブロックする能力を実証しました 20。 重篤な COVID-19 を治療するバリシチニブの有効性は、最近 2 つの第 3 相臨床試験 (ACTT-2 および COV-BARRIER) で試験され、酸素補給または人工呼吸器を必要とする患者における COVID-19 を治療するための単剤療法として最近承認されました 42。 現在までに、100万人近くの患者が重篤な新型コロナウイルス感染症の治療のためにバリシチニブの投与を受けており、その作用機序を理解することの重要性が浮き彫りになっている。 ここで、我々は当初の発見を拡張して、バリシチニブが気管支肺胞腔への炎症性マクロファージの流入をブロックすることを実証しました。 これらのデータは、バリシチニブの作用の機構的理解をさらに深め、薬剤投与のタイミングを考慮した場合の、IFN 対 IL6/TNF シグナル伝達に対するバリシチニブの影響の不一致に対する潜在的な説明を提供します。 本発明者らは、ｐＤＣの流入のピーク後であるが、炎症性マクロファージが出現する可能性が高い３〜４ｄｐｉより前の２ｄｐｉでバリシチニブを投与した。 進行中の ISG 反応と抑制された TNF/IL6 反応は、バリシチニブが気道を保護する主なメカニズムが、気管支肺胞腔への炎症細胞の動員をブロックすることであることを示唆しています。 注目すべきことに、バリシチニブの存在下および浸潤単球/マクロファージの同時除去では、BAL 内のウイルス量は対照と比較して変化せず、これらの集団がウイルスレベルの最小限の制御しか発揮していないことが示唆されました。 しかし、SARS-CoV-2のアカゲザルモデルは、大部分の研究において軽度の新型コロナウイルス感染症（COVID-19）と一致する傾向があるため、重篤な疾患のモデルにおけるバリシチニブの機序を調べることが重要となる。 バリシチニブの今後の臨​​床応用の指針に関して、我々のデータはタイミングが重要であり、より早期の薬剤投与が有利であることを示唆しています。 さらに、SARS-CoV-2の蔓延と再感染能力の増大を考慮すると、二次感染の治療へのバリシチニブの応用に関する将来の研究は有益となるだろう。

私たちの研究にはいくつかの限界がありました。 まず、RM/SARS-CoV-2 モデルは、抗 COVID 薬やワクチンの前臨床試験のためにいくつかのグループで急速に採用されていますが、明白で再現性のある症候性疾患を実証したグループはありません 11。 したがって、初期の免疫学的事象を重症の新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の発症と結び付けるには、上記の重症の新型コロナウイルス感染症（COVID-19）患者の気道骨髄集団におけるMARCO発現の減少の観察など、人体研究での検証が必要である44。 さらに、マクロファージにおける炎症性サイトカイン産生への全体的な寄与を推定するために、サブセットに割り当てられた特定の mRNA 転写物のシーケンシングリードの割合を計算しましたが、単一細胞レベルでのタンパク質量の測定は行わず、その代わりに、 BALF の全体的なレベルを評価します。 以前の研究では、サイトカイン mRNA と分泌タンパク質レベルの相関関係を推定することが試みられており、TNF、IL6、CXCL10、および CXCL8 については良好な一致が報告されていますが、IL10 および IL1B58 については一致が低いことが報告されています。 もう一つの欠点は、私たちの研究の検出力が比較的低いことでした。 0、1、2 dpi での観察は n = 8 でしたが、4 ～ 10 日目の観察では n = 4 に制限されました。 scRNA-Seq 実験では、合計 9 匹の動物の 2 つの独立したコホートで分析を行う際の検出力の問題に対処しました。 全体として、私たちの主要な観察には統計的検出力が不足していませんでした。

SARS-CoV-2 感染の伝播と重症化を軽減するために世界的なワクチンの普及は大きく前進しましたが、依然として数百万の人々が脆弱な状態にあります。 SARS-CoV-2 感染の初期事象と、臨床的に承認された薬剤が防御を提供するメカニズムを理解することは、依然として世界的な優先事項です。 この研究では、急性 SARS-CoV-2 感染症における気道炎症の優勢の原因となる炎症性骨髄細胞の 2 つの集団を特定しました。 また、2022年1月に世界保健機関が重篤な新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の治療に推奨したバリシチニブによる治療が、これらの炎症細胞の肺胞腔への浸潤をブロックしたことも実証した。 これらのデータは、重要な創薬可能標的（気道浸潤マクロファージ）と、気道の炎症を軽減する効果的なメカニズムの両方を特定し、重篤な新型コロナウイルス感染症の発生率と死亡率を低下させる追加の薬剤を特定するのに役立つことが証明されるはずである。

ENPRC の動物管理施設は、実験動物管理評価認定協会 (AAALAC) および米国農務省 (USDA) によって認定されています。 エモリー大学の施設内動物管理使用委員会 (IACUC) は、許可 PROTO202000035 に基づいてすべての動物実験を審査し、承認しました。 すべての手順は、NIH の実験動物の管理と使用に関するガイド (第 8 版) に定められた施設の規制とガイドラインに従って実行され、動物の苦痛を最小限に抑えるために麻酔と適切なフォローアップの疼痛管理の下で行われました。 特定病原体を持たないインド由来のアカゲザル 8 頭（雌 4 頭、雄 4 頭、年齢 11 歳以上）に、前述のように 1.1 × 106 プラーク形成単位（PFU）の SARS-CoV-2 を鼻腔内および気管内経路で感染させた。 YNPRC の ABSL3 で維持されました (IACUC 許可 PROTO202000035)。 鼻咽頭スワブ、BAL、および単核細胞の処理は、以前に記載されているように実行されました20。 特定病原体を持たないインド起源のアカゲザル 6 頭（メス 2 頭、オス 4 頭、年齢 > 6 歳）を研究に追加し（IACUC は PROTO202100003 を許可）、鼻腔内および気管内経路を介して 1.1 × 106 個のプラーク形成菌に感染させた。全血および BAL における CCR2 発現の特徴付けのための SARS-CoV-2 単位 (PFU)。

IACUC許可PROTO202000035に基づく8匹の動物は、未治療対照群とバリシチニブ治療実験群の間で年齢と性別が一致し、雌2匹と雄2匹がそれぞれの群に割り当てられた。 コホート 2 (IACUC 許可 PROTO202100003) は 2 人の女性と 4 人の男性で構成され、全員が未治療の対照として機能しました。 コホート 2 に同数の女性と男性を含める努力が行われました。 ただし、繁殖需要のため、コホート 2 動物の割り当て時にはメスのマカクザルは限られていました。 コホート 1 とコホート 2 の間で、合計 4 人の女性と 6 人の男性の未治療対照がこの研究に含まれました。

IACUC 許可 PROTO202000035 の 8 つの RM を感染させるために使用されるウイルス ストックは以前に記載されています 20。 SARS-CoV-2 (NR-52281: BEI Resources、バージニア州マナサス、USA-WA1/2020、ロット番号 70033175) は、Vero E6 細胞株 (アフリカミドリザル腎臓細胞株; CRL-1586、ATCC) で継代されました。 MOIは0.01。 TCID50 法を使用して SARS-CoV-2 を増殖および滴定し、その後アリコートを -80 °C で保存しました。 送達された感染量は、プラークアッセイによるウイルスストックの逆滴定によって決定されました。 ウイルスストックの配列を決定して、フリン切断モチーフの存在を確認した。 使用されたウイルスストックには、フューリン切断を無効にする可能性のある突然変異を含むゲノムが 6% 未満含まれていました。 IACUC 許可 PROTO202100003 の 6 つの RM は、ウイルス株 NR-53899 に感染していました。BEI Resources、バージニア州マナサス。 米国-WA1/2020。

SARS-CoV-2 ゲノムおよびサブゲノム RNA は、以前に記載されているように、鼻咽頭スワブ、喉スワブ、および BAL で定量されました 18,20。 スワブは、１ｍｌのウイルス輸送培地（ＶＴＭ－１Ｌ、Ｌａｂｓｃｏｏｐ、ＬＬＣ）中に保存した。 ウイルス RNA は、製造元のプロトコールに従って QiaAmp Viral RNA ミニ キットを使用して、鼻咽頭 (NP) ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、および BAL の新鮮な標本から手動で抽出されました。 ゲノム RNA については、CDC が N2 プライマーおよびプローブ セットを設計しました: CoV2-N2-F: 5'-TTACAAACATTGGCCGCAAA-3'、CoV2-N2-R: 5'-GCGCGACATTCCGAAGAA-3'、および CoV2- N2-Pr: 5'- FAM-ACAATTTGCCCCCCAGCGCTTCAG-BHQ-3'59 を定量的 PCR (qPCR) に使用しました。 サブゲノム RNA の場合、E 遺伝子のサブゲノム mRNA 転写物 60 のプライマーおよびプローブ配列を使用しました: SGMRNA-EF: 5'-CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTC-3'、SGMRNA-ER: 5'-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3'、および SGMRNA-E -Pr: 5'-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-3'。 qPCR 反応は、TaqMan Fast Virus 1 ステップ マスター ミックスを使用し、メーカーのサイクル条件、200 nM の各プライマー、および 125 nM のプローブを 2 回使用して実行しました。 合計 257 コピー/ml VTM/血漿/BAL がこのアッセイの検出限界でした。 アカゲザル特異的多型用に改変された CDC RNase P p30 サブユニット qPCR を使用して、以下のプライマーおよびプローブ配列を使用してサンプル品質を検証しました: RM-RPP30-F 5'-AGACTTGGACGTGCGAGCG-3'、RM-RPP30-R 5'- GAGCCGCTGTCTCCACAAGT-3'、および RPP30-Pr 5'-FAM-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ1-3'。 RNA の完全性とサンプルの品質は、各抽出から単一のウェルを分析することによって検証されました。

NP 綿棒は、鼻孔の約 2 ～ 3 cm に配置された清潔なレーヨン先端綿棒 (Thermo Fischer Scientific、BactiSwab NPG、R12300) を使用して、麻酔下で収集されました。 口腔咽頭スワブは、両側（喉／咽頭）の扁桃腺および喉の奥に線状に塗布するために、ポリエステル先端付きスワブ（ピューリタン標準ポリエステル先端付きアプリケーター、ポリスチレンハンドル、25-806 2PD、VWR International）を使用して、麻酔下で採取した。 スワブを1 mlのウイルス輸送媒体（ウイルス輸送媒体、VTM-1L、Labscoop、LLC）に浸漬し、30秒間ボルテックスし、溶出液を収集した。

BAL を収集するには、光ファイバー気管支鏡 (Olympus BF-XP190 EVIS EXERA III ULTRA SLM BRNCH および BF-P190 EVIS EXERA 4.1 mm) を気管内で操作し、一次気管支に向けて、35 ～ ５０ｍｌの生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を気管支に投与し、再吸引して最低２０ｍｌの洗浄液を得た。 BAL を 70 μm セル ストレーナーで濾過し、ウイルス負荷のために複数のアリコートを収集しました。 次に、残りの BAL を 2200 rpm で 5 分間遠心分離し、メソスケール分析のために BAL 液の上清を収集しました。 ペレット化した BAL 細胞を R10 に再懸濁し、下流の分析に使用しました。

トリパンブルー染色を用いた Countess II Automated Cell Counter (Thermo Fisher) を使用して単核細胞の生存率を計測し、熱不活化 FBS 中の 10% DMSO 中で最大 2 × 107 細胞のアリコートで凍結保存しました。 組織セグメント全体 (0.5 cm3) を瞬間凍結乾燥するか、化合物分布、RNA-seq、および組織ウイルス定量の分析のために、RNAlater (Qiagen) または Nuclisens 溶解バッファー (Biomerieux) に保存しました。

合計 23 パラメーターのフローサイトメトリー分析は、前述のように抗ヒトモノクローナル抗体 (mAb) を使用して、SARS-CoV-2 に感染した RM からの新鮮な EDTA 全血 61 と BAL 単核細胞に対して実行されました 20。 NHP 試薬リソース (MassBiologics) によって維持されているデータベースを含む、RM では交差反応性があることが示されています。

以下の mAb のパネルを使用して、全血 (500 μl) 中の自然免疫細胞、およびコホート 1 およびバリシチニブ処置動物の BAL 由来の単核細胞 (106 細胞) の縦断的表現型解析を行いました: 抗 CD20-BB700 (クローン) 2H7; 2.5 μl; カタログ番号 745889)、抗 Ki-67-BV480 (クローン B56; 5 μl; カタログ番号 566109)、抗 CD14-BV605 (クローン M5E2; 2.5 μl; カタログ番号 564054)、抗-CD56-BV711 (クローン B159; 2.5 μl; カタログ番号 740781)、抗 CD115-BV750 (クローン 9-4D2-1E4; 2.5 μl; カタログ番号 747093)、抗 CD3-BUV395 (クローン SP34-2; カタログ番号 747093) 2.5 μl; カタログ番号 564117)、抗 CD8-BUV496 (クローン RPA-T8; 2.5 μl; カタログ番号 612942)、抗 CD45-BUV563 (クローン D058-1283; 2.5 μl; カタログ番号 741414)、抗-CCR2-BUV661 (クローン LS132.1D9; 2.5 μl; カタログ番号 750472)、抗 CD16-BUV737 (クローン 3G8; 2.5 μl; カタログ番号 564434)、抗 CD69-BUV805 (クローン FN50; 5 μl; カタログ番号 750472) . # 748763)、Fixable Viability Stain 700 (2 ul; カタログ番号 564997) はすべて BD Biosciences 製。 STEMCELL Technologies 製の抗 CD38-FITC (クローン AT1; 5 μl; カタログ番号 60131FI)。 抗CD161-BV421 (クローン HP-3G10; 5 μl; カタログ番号 339914)、抗 HLA-DR-BV650 (クローン L243; 5 μl; カタログ番号 307650)、抗 CD11c-BV785 (クローン 3.9; 5 μl;カタログ番号301644）、抗CD11b-PE（クローンICRF44;2.5μl;カタログ番号301306）、および抗CD123-APC-Fire750（クローン315;2.5μl;カタログ番号306042）はすべてBiolegendから入手。 抗ＧｒａｎｚｙｍｅＢ−ＰＥ−ＴｅｘａｓＲｅｄ（クローンＧＢ１１；２．５μｌ；カタログ番号ＧＲＢ１７）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから； 抗ＣＤ６６ａｂｃｅ−ＰＥ−Ｖｉｏ７７０（クローンＴＥＴ２；１μｌ；カタログ番号１３０−１１９−８４９）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから； Beckman Coulterからの抗CD27-PE-Cy5（クローン1A4CD27; 2.5μl;カタログ番号6607107）および抗NKG2A-APC（クローンZ199;5μl;カタログ番号A60797）（補足図4）。

コホート 2 動物については、参考文献に記載されているように、全血 (500 μl) 中の自然免疫細胞の長期的表現型解析に以下の mAb の異なるパネルを使用しました。 26、および BAL 由来の単核細胞 (2 × 106 細胞): 抗 CD20-BB700 (クローン 2H7; 2.5 μl; カタログ番号 745889)、抗 CD11b-BV421 (クローン ICRFF44; 2.5 μl; カタログ番号 562632) 、抗 Ki-67-BV480 (クローン B56; 5 μl; カタログ番号 566109)、抗 CD14-BV605 (クローン M5E2; 2.5 μl; カタログ番号 564054)、抗 CD56-BV711 (クローン B159; 2.5 μl) ; カタログ番号 740781)、抗 CD163-BV750 (クローン GHI/61; 2.5 μl; カタログ番号 747185)、抗 CD3-BUV395 (クローン SP34-2; 2.5 μl; カタログ番号 564117)、抗 CD8 -BUV496 (クローン RPA-T8; 2.5 μl; カタログ番号 612942)、抗 CD45-BUV563 (クローン D058-1283; 2.5 μl; カタログ番号 741414)、抗 CCR2-BUV661 (クローン LS132.1D9; 2.5 μl) ; カタログ番号 750472)、抗 CD16-BUV737 (クローン 3G8; 2.5 μl; カタログ番号 564434)、抗 CD101-BUV805 (クローン V7.1; 2.5 μl; カタログ番号 749163)、抗 CD169-PE (クローン 7-239; 2.5 μl; カタログ番号 565248)、抗 CD206-PE-Cy5 (クローン 19.2; 20 μl; カタログ番号 551136) および Fixable Viability Stain 700 (2 μl; カタログ番号 564997) すべてBDバイオサイエンス社より。 抗ＡＣＥ２－ＡＦ４８８（クローンポリクローナル；５μｌ；カタログ番号ＦＡＢ９３３２Ｇ－１００ＵＧ）Ｒ＆Ｄ； 抗 HLA-DR-BV650 (クローン L243; 5 μl; カタログ番号 307650)、抗 CD11c-BV785 (クローン 3.9; 5 μl; カタログ番号 301644)、および抗 CD123-APC-Fire750 (クローン 315; 5 μl; カタログ番号 301644) 2.5 μl; カタログ番号 306042) すべて Biolegend から入手。 抗GranzymeB-PE-TexasRed（クローンGB11; 2.5μl; カタログ番号GRB17）、Thermo Fisherから入手。 Miltenyi Biotec の抗 CD66abce-PE-Vio770 (クローン TET2; 1 μl; カタログ番号 130-119-849)。 抗ＮＫＧ２Ａ－ＡＰＣ（クローンＺ１９９；５μｌ；カタログ番号Ａ６０７９７）、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒから入手。 ケモカイン受容体（すなわち、CCR2）に対するmAbを37℃で15分間インキュベートし、固定/透過処理溶液キット（BD Biosciences;カタログ番号554714）を用いて細胞を室温で15分間固定および透過処理した。 各サンプルについて、最小 1.2 × 105 個のストップ ゲート イベント (生 CD3+ T 細胞) が記録されました。 すべてのサンプルは 4% パラホルムアルデヒドで固定され、固定後 24 時間以内に取得されました。 データの取得は、FACS DiVa バージョン 8.0 ソフトウェアによって駆動される FACSymphony A5 (BD Biosciences) で実行され、FlowJo (バージョン 10.7; Becton, Dickinson, and Company) で分析されました。 ゲート戦略を補足図1に示します。

バルク BAL サンプルの -5 dpi、2 dpi、および 4 dpi のデータは、以前の研究から得られました 20。 ここでは、BAL の場合は 7 dpi および 10 dpi/11 dpi のサンプル、PBMC の場合は -5 dpi、1 dpi、2 dpi、4 dpi、6 dpi、7 dpi、8 dpi、および 10/11 dpi のサンプルを含めるように研究を拡張しました。 バルク RNA-Seq 用に細胞懸濁液を BSL3 で調製し、250,000 細胞 (PBMC) または 100,000 細胞 (BAL) を 700 μl の QIAzol 試薬に直接溶解しました。 オンカラム DNase 消化を備えた RNeasy Mini または Micro キット (QIAGEN) を使用して RNA を単離しました。 RNAの品質はAgilent Bioanalyzerを使用して決定し、cDNA合成はClontech SMARTSeq v4 Ultra Low Input RNAキット(Takara Bio)を使用してメーカーの指示に従って全RNAを使用して実行しました。 NexteraXT DNA Library Preparation kit (Illumina) を使用して断片化した後、二重インデックス付きバーコードを増幅 cDNA に付加しました。 Agilent 4200 TapeStation を使用してキャピラリー電気泳動によってライブラリを検証し、ライブラリを等モル濃度でプールしました。 ライブラリーは Illumina NovaSeq6000 で 100SR でシーケンスされ、サンプルあたり 2,000 ～ 2,500 万のリードが得られました。

BCL ファイルは、bcl2fastq v2.20.0.422 を使用して Fastq に変換されました。 アカゲザル (Mmul10 Ensembl release 100)、SARS-CoV-2 (MN985325.1 株 - NCBI)、および ERCC 配列のゲノム配列を組み合わせて、前述のように STAR インデックス (v2.7.3a) を構築し、リードをアライメントしました。この参考文献20へ。 ReadsPerGene ファイルは htseq 形式に変換され、DESeqDataSetFromHTSeqCount 関数を使用して DESeq2 v1.24.064 にインポートされました。 使用したデザインは次のとおりです: 〜 被験者 + グループ * 時間経過中に未処理のサンプルとバリシチニブで処理されたサンプルをグループが区別した時点。 BAL および PBMC の差次的に発現する遺伝子は、padj <0.05、倍率変化 >2 の閾値を使用し、特定の時点でのすべてのサンプルが正規化リード >0 によって検出可能な発現を有することが必要な低発現遺伝子をフィルタリングして除去して決定されました。遺伝子。

GSEA v4.1.065 の入力は、DESeq2 から取得された正規化されたログ式の値でした。 GSEA 解析には次の遺伝子セットを使用しました:ホールマーク経路およびカノニカル経路 (MsigDB)、NHP ISG66、および関節リウマチ (KEGG map05323)。 遺伝子名はアカゲザルとヒトのゲノム参照間でほぼ一致しているため、それらを変更せずにヒト MsigDB 遺伝子セットで使用しました。 デフォルトのパラメーターは、gene_set 順列タイプで GSEA を実行するために使用されました。 各時点での差次的発現のボルケーノ プロットは、EnhancedVolcano (v1.8.0) R ライブラリーを使用して生成されました67。 DESeq2 からの正規化されたログ表現値は、ComplexHeatmap (v2.0.0) R ライブラリ 68 を使用してヒートマップを生成するために使用されました。

BAL のフィルター処理されたカウント行列は、GEO GSE15921420 から取得しました。 SARS-CoV-2 に感染したアカゲザルからの各 BAL サンプルについて、タンパク質をコードする遺伝子のみを含むようにカウント マトリックスがフィルター処理されました。 Y染色体上にコードされている遺伝子、ミトコンドリア遺伝子、RPSおよびRPL遺伝子、B細胞受容体遺伝子およびT細胞受容体遺伝子、およびHBBが濾別された。 分析の実行には、Seurat ライブラリ v4.0.434 を使用しました。 以下のパラメータを使用して細胞をフィルタリングしました: (1) nFeature_RNA ≥ 200 かつ ≤4000、(2) HBB 遺伝子の % <10、(3) ミトコンドリア遺伝子の % <20、(4) RPS/RPL 遺伝子の % <30 (5) log10(nFeature_RNA) / log10(nCount_RNA) ≥ 0.8。 QC メトリクスを通過した各サンプルの細胞数は補足データ 5 に含まれています。 次に、サンプルを正規化した後、デフォルトの CCA メソッドを使用して、-5 dpi および 4 dpi での各動物からのすべての BAL サンプルをスーラ統合パイプライン 69 に従って統合しました。 SCTransformメソッドを使用します。 最初の 30 次元は RunUMAP 関数と FindNeighbors 関数で使用されました。

DCを同定するために、処理済みおよび未処理のアカゲザルの両方の-5 dpiおよび4 dpiのすべてのBALサンプルをCCAを使用して統合しました。 クラスターは、Seurat の FindClusters 機能を使用して決定され、セルには SingleR (v1.4.0) を使用して注釈が付けられました (補足図 10a、b)。 スーラクラスター11は、標準マーカーの発現に基づいてpDCとして分類されました（補足図10c）。 クラスター 17 および 22 は、以前に報告されたマーカー遺伝子の発現に基づいて、mDC および活性化 mDC として分類されました 70。

マクロファージ/単球のサブセットを取得するために、SingleR (BluePrintEncode データベース) によって注釈が付けられたマクロファージ/単球から主に構成される最大のクラスターが選択されました。 このクラスター内の別の細胞タイプとして注釈が付けられた細胞はフィルターで除外されました。 次に、すべての BAL サンプルからのマクロファージ/単球を個々のサンプルに分割し、SCTransform メソッドを使用して正規化し、30 次元を使用して再度統合しました。 Seurat の FindMarkers 関数を使用して、MAST (v1.16.0) メソッド 71 を使用して差分発現をテストしました。

BAL サンプルからのマクロファージ/単球は 2 つのアプローチを使用してサブセットにアノテーションが付けられました。(1) Seurat を使用して肺参照からマクロファージ/単球にマッピングする方法と、(2) SingleR28 を使用してバルクソートされた細胞を参照として使用する方法です。 3 頭の未感染マカクザルからの 10X 肺 scRNA-seq データは、公開された研究 (NCBI GEO: GSE149758) から得られました 33。 以下のパラメータを使用して細胞をフィルタリングしました: (1) nFeature_RNA ≥ 200 かつ ≤4000、(2) ミトコンドリア遺伝子の% <20、(3) RPS/RPL 遺伝子の% <50、および (4) log10(nFeature_RNA) / log10 (nCount_RNA) ≥ 0.8。 サンプルは SCTransform を使用して正規化され、統合されました。 最初の 40 次元は最初のクラスタリングに使用されました。 次に、SingleR によって注釈が付けられたマクロファージ/単球細胞が選択され、個々のサンプルに分割され、30 次元を使用して再度統合されました。 Louvain クラスタリングの結果、マーカー遺伝子の発現に基づいて注釈が付けられた 4 つのクラスターが得られました。 この統合データセットは、FindTransferAnchors と MapQuery を使用し、reference.reduction を pca に設定し、umap をduction.model として使用して、SARS-CoV-2 に感染した BAL からのマクロファージ/単球をマッピングするための参照として機能しました。

BAL サンプルには、IM および AM バルクソートセルを参照として SingleR ライブラリを使用してアノテーションも付けられました。 単一細胞データで細胞型を割り当てるための参照を取得するために、3 匹の未感染カニクイザル 35 から得た間質 (IM) および肺胞マクロファージ (AM) のバルク RNA-Seq データを DESeq2 を使用して分析しました。 正規化された対数式の値は、パラメータ Blind = FALSE および filtType = "parametric" を指定した rlog 関数を使用して取得されました。 重要な遺伝子は、以下の基準に基づいてフィルタリングされました:padj <0.05; IM または AM サンプルのいずれかで倍数変化 >2 および正規化平均発現 >5000。

ヒト肺データの分析のために、GEO GSE13589340 の rds オブジェクトを取得し、マクロファージ、単球、増殖マクロファージとして注釈が付けられた細胞を除くすべての細胞を対照サンプルからフィルター処理しました。 2 つの異なる部位から合計 10 個の対照サンプルがありました。 UMAP で潜在的なバッチ効果を観察し、「Vanderbilt」サイトから 7 つのサンプルのみを選択しました。 マクロファージ/単球の数が少なかったため、さらに 1 つのサンプルを削除し、合計 6 つの健康なサンプルが得られました。 オブジェクトは Sample_Name に基づいて分割され、Seurat の CCA メソッドを使用して再統合されました。 Morse et al.41 に記載されているマーカー遺伝子の発現に基づいて、15 次元および解像度 0.1 を使用して得られた 4 つのスーラ クラスターに、FABP4hi、SPP1hi、FCN1hi、および増殖マクロファージとして注釈が付けられました。 次に、健常人由来のアカゲザルとヒトのマクロファージ/単球を、ENSEMBL に従って GRCh38 と Mmul10 の間で 1 対 1 オルソログとして分類され、同じ遺伝子名を共有する遺伝子を使用して、ヒトサンプルを参照として参照ベースのアプローチを使用して統合しました。 。 UCell (v1.3.1)72 パッケージを使用して、アカゲザルとヒトのマクロファージ/単球サブセット間のマーカー遺伝子発現の濃縮スコアを取得しました。 各サブセットのマーカーは、MAST 法を使用して種ごとに Seurat の FindMarkers 関数を使用して取得し、調整された p 値 < 0.05 および倍率変化 > 1.5 を持つマーカーを含むようにフィルター処理しました。 これらはさらにフィルタリングされ、1 対 1 オルソログとして分類され、GRCh38 と Mmul10 の間で同じ遺伝子名を共有する遺伝子のみが含まれるようになりました (補足データ 6)。

ヒト BAL の場合、GEO の一部として入手可能なサンプルを使用しました: GSE1459268。 細胞は次の基準に基づいてフィルタリングされました: nFeature_RNA > 100、nFeature_RNA < 3500、およびpercent.mito < 10、サンプルは相互PCAを使用して統合されました。 SingleRのBPEncodeデータベースを使用して細胞に注釈が付けられ、マクロファージ/単球で構成される最大のクラスター内のマクロファージ/単球として注釈が付けられた細胞のみがさらなる分析に使用されました（補足図8d、e）。 次に、スーラの FindTransferAnchors および MapQuery 関数を使用して、健康な肺のマクロファージ/単球を参照としてこれらの細胞に注釈を付けました。 マーカー遺伝子の発現を使用して、予測の精度を評価しました（補足図8f）。

遺伝子発現に対する各細胞タイプの寄与を計算するために、スケールファクター 1e6 の RC 正規化法を使用して CPM 値を取得しました。 合計 CPM 値は遺伝子ごとに計算され、特定の細胞タイプの CPM 値の合計を合計で割ってパーセンテージ値を取得しました。

U-PLEX アッセイ (Meso Scale MULTI-ARRAY Technology) を、製造元の指示に従って、入力として 25 マイクロリットルを使用して、血漿および BALF サイトカイン検出に使用しました。

サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでした。 サンプルサイズは主に、(1) 研究時点 (2020 年 3 月) で SARS-CoV-2 に感染し、BSL-3 に収容されている可能性のある NHP の入手可能性、および (2) バリシチニブの強い影響が予想されることによって決定されました。 SARS-CoV-2 が誘発する炎症をブロックします。 コホート 1 からの 8 つの RM は、感染の 2 日後に、それぞれ 4 つの RM からなる治療群と未治療群に無作為に割り当てられました。 コホート 2 は、6 人の SARS-CoV-2 感染 RM で構成されていました26。 2 dpi での鼻 sgRNA ウイルス量は、4 匹の動物 (n = 2 コホート 1 および n = 2 バリシチニブ コホート) では測定されず、6 dpi および 8 dpi での喉 sgRNA ウイルス量は、RNA が限られているため、1 匹のコホート 1 動物では測定されませんでした。 全血は、コホート 1 動物 1 匹とバリシチニブ動物 2 匹では 1 dpi、コホート 1 動物 1 匹では 6 dpi でフローサイトメトリーでは染色されませんでした。 BAL 液の上清は、2 dpi で 1 匹のコホート 1 および 1 匹のバリシチニブ動物では収集されず、その後メソスケール分析には実行されませんでした。 コホート 2 からの 1 つの scRNA-Seq ベースライン サンプルは、上皮細胞の割合が大きいため除外されました。 研究者らは、実験と結果の評価中に割り当てについて知らされていませんでした。 統計テストは R (バージョン 4.2.2) または GraphPad Prism v7.02 を使用して実行され、それに応じてリストされています。 使用された特定の検定: 片側/両側検定、Mann-Whitney U/Wilcoxon 符号付き順位検定は、比較ごとに示されています。 バルクおよび単一細胞 RNA-Seq データの差次的遺伝子発現解析には、DESeq2 および MAST 解析の一部として決定された複数のテスト補正後の調整された p 値が使用されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で生成されたバルク RNA-Seq データは、BAL の場合は 7 dpi および 10 dpi/11 dpi サンプル、BAL の場合は -5 dpi、1 dpi、2 dpi、4 dpi、6 dpi、7 dpi、8 dpi、および 10/11 dpi のサンプルです。 PBMC は NCBI GEO (GSE198882) に寄​​託されています。 SARS-CoV-2 に感染したアカゲザルからの BAL の scRNA-Seq データ、およびバルクの -5 dpi、2 dpi、および 4 dpi のバルク RNA-Seq データは、GEO GSE15921420 から取得しました。 10X 単細胞非感染アカゲザル肺サンプルは GEO GSE14975833 から入手しました。 カニクイザルからの選別された間質マクロファージおよび肺胞マクロファージのバルク RNA-Seq データは、GEO GSE22531635 から取得しました。 単細胞非感染ヒト肺サンプルおよびヒト BAL サンプルは、それぞれ GEO GSE13589340 および GSE1459268 から入手しました。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

分析に使用されるスクリプトは、https://github.com/BosingerLab/NHP_COVID-19_273 で入手できます。

周、Ｐ．ら。 コウモリ由来と考えられる新型コロナウイルスに関連した肺炎の発生。 ネイチャー 579、270–273 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu, N. et al. 中国の肺炎患者からの新型コロナウイルス、2019年。N. Engl. J.Med. 382、727–733 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

バーデン、LRら。 mRNA-1273 SARS-CoV-2 ワクチンの有効性と安全性。 Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. https://doi.org/10.1056/nejmoa2035389 (2020)。

マリガン、MJ 他成人を対象とした新型コロナウイルス感染症 RNA ワクチン BNT162b1 の第 I/II 相研究。 ネイチャー 586、589–593 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

ポラック、FP 他。 BNT162b2 mRNA Covid-19 ワクチンの安全性と有効性。 Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 383、2603–2615 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Carvalho, T.、Krammer, F.、Iwasaki, A. 新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の最初の 12 か月: 免疫学的洞察のタイムライン。 ナット。 イミュノール牧師。 21、245–256 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wichmann、D. et al. 新型コロナウイルス感染症患者における剖検所見と静脈血栓塞栓症：前向きコホート研究。 アン。 インターン。 医学。 173、268–277 (2020)。

論文 PubMed Google Scholar

Liao、M.ら。 新型コロナウイルス感染症患者における気管支肺胞免疫細胞の単一細胞の状況。 ナット。 医学。 26、842–844 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

シルビン、A.ら。 カルプロテクチンの上昇と異常な骨髄細胞サブセットにより、重症の新型コロナウイルス感染症と軽度の新型コロナウイルス感染症が区別されます。 セル 182、1401–1418.e18 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

JB ムーアと CH ジューン 重度の COVID-19 におけるサイトカイン放出症候群。 サイエンス 368、473–474 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Muñoz-Fontela、C. et al. 新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の動物モデル。 ネイチャー 586、509–515 (2020)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

マンスター、VJら。 SARS-CoV-2を接種したアカゲザルの呼吸器疾患。 ネイチャー 585、268–272 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ロックス、B.ら。 非ヒト霊長類モデルにおける COVID-19、MERS、および SARS の病因の比較。 サイエンス 368、1012–1015 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

チャンドラシェカール、A. et al. SARS-CoV-2 感染はアカゲザルの再感染を防ぎます。 サイエンス 369、812–817 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ziegler、CGK et al. SARS-CoV-2 受容体 ACE2 は、ヒト気道上皮細胞のインターフェロン刺激遺伝子であり、組織全体の特定の細胞サブセットで検出されます。 セル 181、1016–1035.e19 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Corbett, KS et al. 非ヒト霊長類における SARS-CoV-2 に対する mRNA-1273 ワクチンの評価。 Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 383、1544–1555 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

メルカド、NB 他単回接種の Ad26 ワクチンは、アカゲザルの SARS-CoV-2 を防御します。 ネイチャー 586、583–588 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Routhu, NK et al. 改変ワクシニア アンカラ ベクターベースのワクチンは、サルを SARS-CoV-2 感染、免疫病理、肺の機能不全から保護します。 免疫 54、542–556 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウィリアムソン、BNら。 SARS-CoV-2に感染したアカゲザルにおけるレムデシビルの臨床的利点。 ネイチャー 585、273–276 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ホアン、テネシー州ら。 バリシチニブ治療は、SARS-CoV-2に感染したアカゲザルの下気道マクロファージ炎症と好中球動員を解消する。 セル 184、460–475.21 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

シン、DKら。 アカゲザル、ヒヒ、マーモセットの肺におけるSARS-CoV-2の急性感染に対する反応。 ナット。 微生物。 6、73–86 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

エイド、M.ら。 SARS-CoV-2に感染したアカゲザルにおける血管疾患と血栓症。 セル 183、1354–1366.e13 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ファールバーグ医学博士ら。 SARS-CoV-2に感染した非ヒト霊長類における急性、回復または進行性の新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の細胞イベント。 ナットコミューン。 11、6078 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

スペランザ、E. et al. 単一細胞 RNA 配列決定により、アフリカミドリザルの肺における SARS-CoV-2 感染動態が明らかになりました。 科学。 翻訳。 医学。 13、eabe8146 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kalil、AC et al. 新型コロナウイルス感染症で入院中の成人向けのバリシチニブとレムデシビル。 Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 384、795–807 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ホアン、テネシー州ら。 I 型インターフェロン応答の調節は、アカゲザルにおける SARS-CoV-2 の複製と炎症を強力に阻害します。 bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.10.21.512606 (2022)。

Schultze、JL & Aschenbrenner、AC 新型コロナウイルス感染症とヒトの自然免疫システム。 セル 184、1671 ～ 1692 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アラン、D. et al. 肺単一細胞配列決定の参照ベースの分析により、移行性線維化促進性マクロファージが明らかになりました。 ナット。 イムノール。 20、163–172 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ギビングス、SL et al. 定常状態のマウス肺における 3 つの独特の間質マクロファージ。 午前。 Ｊ．レスピア． 細胞モル。 バイオル。 57、66–76 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

チャカロフ、S.ら。 2 つの異なる間質マクロファージ集団が、組織全体の特定の組織下ニッチに共存します。 サイエンス 363、eaau0964 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ウラル、BB 他明確な局在性と免疫調節特性を持つ、神経に関連し肺に存在する間質性マクロファージのサブセットの同定。 科学。 イムノール。 5、eaax8756 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schyns、J. et al. マウスの肺には、非古典的組織単球と機能的に異なる 2 つの間質性マクロファージ集団が存在します。 ナット。 共通。 10、3964 (2019)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Esaulova、E. et al. 結核における免疫状況は、疾患と潜伏期間に関連する集団を明らかにします。 細胞宿主微生物 29、165–178.e8 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Hao、Y.ら。 マルチモーダルな単一細胞データの統合分析。 bioRxiv 184、3573–3587.e29 (2020)。

Google スカラー

コリー、J.ら。 炎症性マクロファージと好中球の浸潤と肺の広範なピロトーシスは、ヒト以外の霊長類のインフルエンザ致死率を高めます。 PLoS 病巣。 18、e1010395 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cai、Y.ら。 アカゲザルの肺胞および間質性肺マクロファージの in vivo 特性評価: ヒトの肺疾患の理解への意義。 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 192、2821–2829 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kumagai, T.、Fan, S. & Smith、AM ADAMDEC1 と炎症性疾患および癌におけるその役割。 メタロプロテイナーゼ Med. 7、15–28 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Coillard, A. & Segura, E. ヒト単球の生体内分化。 フロント。 イムノール。 1907 年 10 日 (2019 年)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ヴァンダーハイデン、A. et al. CCR2依存性単球由来細胞はSARS-CoV-2感染を制限する。 bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.05.03.442538 (2021)。

ハーバーマン、AC et al. 単細胞 RNA 配列決定により、肺線維症における異なる上皮系と間葉系の線維化促進の役割が明らかになります。 科学。 上級 6、eaba1972 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

モース、C.ら。 特発性肺線維症におけるSPP1/MERTK発現マクロファージの増殖。 ユーロ。 呼吸してください。 J. 54、1802441 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rubin, R. Baricitinib は、初めて承認された COVID-19 免疫調節治療薬です。 JAMA 327、2281 (2022)。

CAS PubMed Google Scholar

ブロンテ、V. et al. バリシチニブは、重篤な新型コロナウイルス感染症患者の免疫調節不全を抑制します。 Ｊ．クリン． 投資する。 130、6409–6416 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

レン、Ｘら。 大規模な単一細胞トランスクリプトーム アトラスによって明らかになった、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の免疫特性。 セル 184、1895 ～ 1913 e1819 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liegeois, M.、Legrand, C.、Desmet, CJ、Marichal, T. & Bureau, F. 間質性マクロファージ: 肺免疫のパズルにおける長い間無視されてきたピース。 細胞。 イムノール。 330、91–96 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Hoppstädter、J. et al. ヒト肺胞および肺の間質性マクロファージにおけるToll様受容体4および9活性化時の示差的な細胞反応。 呼吸してください。 解像度 11、124 (2010)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Blanco-Melo, D. et al. SARS-CoV-2 に対する宿主の反応の不均衡が、新型コロナウイルス感染症の発症を促進します。 セル 181、1036–1045.e9 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

浅野 徹 ほか生命を脅かす新型コロナウイルス感染症に感染した60歳未満の男性の約1％にX連鎖劣性TLR7欠損症がある。 科学。 イムノール。 6、eabl4348 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

バスタード、P. 他 I型IFNを中和する自己抗体は、70歳以上の未感染者の約4%に存在し、新型コロナウイルス感染症による死亡の約20%を占めています。 科学。 イムノール。 6、eabl4340 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

バスタード、P. 他 I 型 IFN に対する既存の自己抗体が、APS-1 患者における重篤な COVID-19 肺炎の根底にあります。 J.Exp. 医学。 218、e20210554 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

バスタード、P. 他生命を脅かす新型コロナウイルス感染症患者における I 型 IFN に対する自己抗体。 サイエンス 370、eabd4585 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ロペス、J. et al. I 型 IFN に対する自己抗体を持つ患者では、SARS-CoV-2 に対する初期の鼻 I 型 IFN 免疫が損なわれています。 J.Exp. 医学。 218、e20211211 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ソラニッチ、X.ら。 バルセロナの集中治療室に入院した新型コロナウイルス感染症患者のほぼ10％では、既存の自己抗体が高濃度のI型インターフェロンを中和していた。 Ｊ．クリン． イムノール。 41、1733–1744 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ファン・デル・ワイスト、MGP 他。 I 型インターフェロン自己抗体は、新型コロナウイルス感染症患者の全身性免疫変化に関連しています。 科学。 翻訳。 医学。 13、eabh2624 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang、Q.ら。 生命を脅かす新型コロナウイルス感染症患者におけるI型IFN免疫の先天異常。 サイエンス 370、eabd4570 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アルナーチャラム、PS 他。 ヒトにおける軽度または重度の新型コロナウイルス感染症に対する免疫のシステム生物学的評価。 サイエンス 369、eabc6261 (2020)。

記事 Google Scholar

リュー、C.ら。 時間分解システム免疫学により、致死性の新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) に関連する後期の分岐点が明らかになりました。 セル 184、1836 ～ 1857.e22 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

シェブル、FMら。 ヒトパピローマウイルス-16 L1ウイルス様粒子によるワクチン接種後のサイトカインのmRNAおよびタンパク質測定値の比較。 がんエピデミオール。 バイオマーカー 19、978–981 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ワゴナー、JJ 他重症急性呼吸器症候群コロナウイルスに対するトリプレックスリアルタイムRT-PCR 2. Emerg. 感染する。 ディス。 26、1633–1635 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウォルフェル、R. et al. COVID-2019 の入院患者のウイルス学的評価。 ネイチャー 581、465–469 (2020)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

クリ・セルバンテス、L. 他重篤な新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) に関連する免疫混乱の包括的なマッピング。 科学。 イムノール。 5、eabd7114 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マクゲイリー、CS 他。 CTLA-4(+)PD-1(-) メモリー CD4(+) T 細胞は、抗レトロウイルス療法が抑制され、SIV に感染したアカゲザルにおけるウイルスの持続に決定的に寄与しています。 Immunity 47、776–788.e5 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ミッチ、L.ら。 インターロイキン 21 と ART を組み合わせると、SIV に感染したマカクザルの炎症とウイルスの保有量が減少します。 Ｊ．クリン． 投資する。 125、4497–4513 (2015)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Love, MI、Huber, W. & Anders, S. DESeq2 を使用した RNA-seq データの倍数変化と分散の適度な推定。 ゲノムバイオル。 15, 550 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Subramanian、A. et al. 遺伝子セット濃縮分析: ゲノム全体の発現プロファイルを解釈するための知識ベースのアプローチ。 手順国立アカド。 科学。 USA 102、15545–15550 (2005)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

サンドラー、NG 他アカゲザルの I 型インターフェロン反応は SIV 感染を防ぎ、病気の進行を遅らせます。 ネイチャー 511、601–605 (2014)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blighe, K.、Rana, S. & Lewis, M. EnhancedVolcano: 強化された色分けとラベル付けを備えた出版準備ができた火山プロット。 https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano (2020)。

Gu, Z.、Eils, R. & Schlesner, M. 複雑なヒートマップは、多次元ゲノム データのパターンと相関関係を明らかにします。 バイオインフォマティクス 32、2847–2849 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Butler, A.、Hoffman, P.、Smibert, P.、Papalexi, E.、Satija, R. さまざまな条件、技術、種にわたる単一細胞トランスクリプトーム データの統合。 ナット。 バイオテクノロジー。 36、411–420 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang-Huau、TL 他。 ヒトの in vivo で生成された単球由来の樹状細胞とマクロファージは、空胞経路を通じて抗原を交差提示します。 ナット。 共通。 9、2570 (2018)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Finak、G. et al. MAST: 転写変化を評価し、単一細胞 RNA シーケンス データの不均一性を特徴付けるための柔軟な統計フレームワーク。 ゲノムバイオル。 16、278 (2015)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Andreatta, M. & Carmona, SJ UCell: 堅牢かつスケーラブルな単一細胞遺伝子シグネチャ スコアリング。 計算します。 構造体。 バイオテクノロジー。 J. 19, 3796–3798 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Upadhyay、AA & Tharp、GK TREM2+ および間質性マクロファージは、アカゲザルの SARS-CoV-2 感染症 NHP_COVID-19_2 における気道炎症を調整します。 https://github.com/BosingerLab/NHP_COVID-19_2; https://doi.org/10.5281/zenodo.7626608 (2023)。

リファレンスをダウンロードする

エモリー国立霊長類研究センター (ENPRC) 所長のポール・ジョンソン氏に心より感謝いたします。 動物資源部門、特にジョイス・コーエン、ステファニー・アーナート、ステイシー・ワイズマン、シェリー・ジーン、ジェニファー・S・ウッド、フォーン・コナー＝ストラウド、レイチェル・L・スタメン、ラケル・A・サンプソン＝ハーレー、デニス・ボーネンバーガー、ジョン・M・ワンブア、ドミニク・M . D'Urso と Sanjeev Gumber は、動物の世話と病理学の支援を提供してくれました。 さらに、生物学的安全性に関する指導については Kalpana Patel 氏と Maureen Thompson 氏、技術的、計算上、サイトメトリーのサポートについては Ernestine Mahar 氏、Kyndal Goss 氏、Christina Gavegano 氏、Sudhir Kasturi 氏に感謝します。 バリシチニブとウイルス、そして元のアイデアを提供してくれた Raymond F. Schinazi に感謝します。 スペースの都合上、主要な出版物が省略されていることをお詫び申し上げます。 NIH 研究基盤プログラム事務局 (ORIP) P51 OD11132。ENPRC および Emory NPRC Genomics Core に基本助成金を提供します。 および P51 OD11132-61S1 および P51 OD11132-60S4 から MPa エモリー大学の人口とパンデミックに対する新型コロナウイルス感染症の分子と病原体 (MP3) イニシアチブ シード助成金 (修道士、AP、および RFS へ) YNPRC コロナウイルス パイロット研究プロジェクト プログラム助成金 (賞 P51 OD11132 に基づいて修道士に)。 M.Pa への Fast Grant #2144 ウィリアム IH およびルーラ E. ピッツ財団の M.Pa への助成金 NIH 助成金 5R01-MH-116695 が RFS に授与されました シーケンスデータは、NIH S10 OD026799 によって SEB に資金提供された Illumina NovaSeq6000 で取得されました。この原稿を、このプロジェクトと科学的発見への貢献を果たした Timothy N. Hoang 博士に捧げたいと思います。この研究を進める上で極めて重要です。 ホアン博士の知性、行動力、科学に対する愛情、そして短くも影響力のあるキャリアの中で彼が関わったすべての人生は記憶に残るでしょう。

これらの著者は同様に貢献しました: Amit A. Upadhyay、Elise G. Viox、Timothy N. Hoang。

この作品は、ミルコ・パイアルディーニ、スティーブン・E・ボーシンガーの著者が共同で監修しました。

故人: ティモシー N. ホアン。

米国ジョージア州アトランタ、エモリー大学、エモリー国立霊長類研究センター、微生物学および免疫学部門

アミット A. ウパディヤイ、エリーズ G. ヴィオックス、ティモシー N. ホアン、マリア ピノ、ミシェル Y.-H. リー、ザカリー・ストロンギン、ジャスティン・L・ハーパー、クリストファー・T・エドワーズ、ケビン・グエン、ラマ・R・アマラ、トーマス・H・ヴァンダーフォード、ミルコ・パイアルディーニ、スティーブン・E・ボーシンガー

米国ジョージア州アトランタ、エモリー大学、エモリー国立霊長類研究センター、エモリー NPRC ゲノミクスコア研究所

アルン・K・ボダパティ、デビッド・A・コーワン、エリザベス・N・ビーグル、トリスタン・R・ホートン、シドニー・ハミルトン、ハジ・アウエド、キャスリン・L・ペレグリーニ、グレゴリー・K・サープ

ピッツバーグ大学感染症微生物学部、ピッツバーグ、ペンシルバニア州、米国

ジャクリーン・コリー & サイモン・M・バラット・ボーイズ

米国ジョージア州アトランタ、エモリー大学医学部病理学および検査医学科

アン・ピアンタドシ、スーザン・P・リベイロ、ラフィック・P・セカリー、ミルコ・パイアルディーニ、スティーブン・E・ボーシンガー

米国ジョージア州アトランタ、エモリー大学医学部医学部

レベッカ・D・レビット

米国ジョージア州アトランタ、エモリー大学エモリー医学部微生物学および免疫学科

ラーマ・R・アマラ

ピッツバーグ大学免疫学部、ピッツバーグ、ペンシルバニア州、米国

サイモン・M・バラット・ボーイズ

米国ジョージア州アトランタ、エモリー大学医学部小児科およびアトランタ小児医療センター

レイモンド・F・スキナージ

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概念化: AAU、TNH、EGV、M. Pino、M. Paiardini、RFS、SEB。 方法論: TNH、M. Pino、EGV、SPR、MY-HL、JC、ZS、DAC、ENB、TRH、SH、HA、JLH、KN、KLP、AP、RDL、THV。 正式な分析: AAU、TNH、M. ピノ、AKB、MY-HL、CTE、ZS、EGV、GKT および THV。 調査: AAU、EGV、TNH、M. ピノ、M. パイアルディーニ、SEB。 リソース: SEB、SMBB、RRA、RFS、RPS、M. Paiardini および SEB。 執筆 - 原案: AAU、M. Pino、SEB。 執筆、レビュー、編集: TNH、SPR、EGVM Paiardini、RFS 視覚化: AAU、TNH、M. Pino、AKB、GKT 監督: M. Paiardini、SEB。 資金調達: M. パイアルディーニ、SEB、RFS

ミルコ・パイアルディーニまたはスティーブン・E・ボーシンガーとの通信。

RFS は過去にイーライリリー社の無給コンサルタントを務めており、イーライリリー社の医薬品はこの論文で説明されている研究で評価されており、イーライリリー社の株式を所有しています。 同氏はまた、米国とメキシコでの新型コロナウイルス感染症用バリシチニブの販売からロイヤルティーも受け取っている。 この取り決めの条件は、利益相反ポリシーに従ってエモリー大学によって検討され、承認されています。 他のすべての著者には、宣言する矛盾はありません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Jincun Zhao と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Upadhyay、AA、Viox、EG、Hoang、TN 他。 TREM2+ および間質性マクロファージは、アカゲザルの SARS-CoV-2 感染における気道炎症を調整します。 ナットコミューン 14、1914 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-37425-9

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受信日: 2021 年 10 月 4 日

受理日: 2023 年 3 月 16 日

公開日: 2023 年 4 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37425-9

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