ニュース

Oct 23, 2023

気道

Natura Volume 615, pagine

Nature volume 615、pages 660–667 (2023)この記事を引用

32,000 アクセス

1 引用

385 オルトメトリック

メトリクスの詳細

病原体感染は、神経細胞が調整した行動的および生理学的変化を伴う、定型的な病気の状態を引き起こします1,2。 感染すると、免疫細胞はサイトカインやその他のメディエーターの「嵐」を放出し、その多くはニューロンによって検出されます 3,4。 しかし、自然主義的感染時に疾病行動を引き起こす反応する神経回路と神経免疫相互作用メカニズムは依然として不明である。 アスピリンやイブプロフェンなどの市販薬は、病気を軽減するために広く使用されており、プロスタグランジン E2 (PGE2) 合成をブロックすることで作用します5。 主要なモデルは、PGE2 が血液脳関門を通過し、視床下部ニューロンに直接関与するというものです 2。 今回我々は、末梢感覚ニューロンアトラスを広くカバーする遺伝的ツールを使用して、代わりにマウスのインフルエンザ誘発性疾病行動に不可欠なPGE2検出舌咽頭感覚ニューロン（錐体細胞GABRA1ニューロン）の少数集団を同定した。 ペトロサル GABRA1 ニューロンを切除するか、これらのニューロンにおける PGE2 受容体 3 (EP3) を標的ノックアウトすると、感染初期におけるインフルエンザによる食物摂取量、水分摂取量、および可動性の低下が解消され、生存率が向上します。 遺伝学的に誘導された解剖学的マッピングにより、錐体細胞GABRA1ニューロンが感染後にシクロオキシゲナーゼ-2の発現増加とともに鼻咽頭の粘膜領域に投射し、脳幹において特異的な軸索標的パターンも示すことが明らかになった。 これらの発見を総合すると、局所的に生成されるプロスタグランジンを検出し、呼吸器ウイルス感染に対する全身性疾病反応を媒介する、気道から脳への主要な感覚経路が明らかになります。

インフルエンザやその他の病原体によって引き起こされる呼吸器感染症は、世界中で死亡および入院の主な原因となっており6、最近の新型コロナウイルス感染症のパンデミックは人間社会を広く混乱させています。 体調不良は深刻な衰弱を引き起こす可能性があり、ほとんどの人は年に数回体調を崩します。 病気の感覚は感染に対する神経反応を表しており、回復を促進するための高度に調整された適応戦略を提供する可能性があります 1,2。 さまざまな病原体に感染した動物は、発熱、嗜眠、食欲不振、頭痛や痛み、気分の変化、社会性の低下などの共通の行動的および生理学的反応を示し、共有の神経回路が関与する共通の病気状態を示唆しています2,7。 一般的な症状に加えて、他の病気への反応も感染部位に合わせて行われます。 たとえば、一部の呼吸器感染症は咳、うっ血、気管支収縮を引き起こしますが、一部の腸感染症は吐き気、下痢、嘔吐を引き起こします。 感染症特有の行動反応は、病原体検出のための複数の体と脳のコミュニケーション経路を示唆しています。

インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子 (TNF)、エイコサノイドなど、いくつかのサイトカインや免疫メディエーターは、単独で投与すると疾病行動を誘発する可能性があります 1、2、4、8。 これらおよび他のサイトカイン、ならびにリポ多糖、細菌毒素、ホルミルペプチドなどの病原体由来の因子は、さまざまな中枢および/または末梢感覚ニューロンを活性化する可能性があります4,9。 これらの観察を総合すると、神経免疫クロストークには多数の経路が存在する可能性が高まりますが、これらの各経路が自然感染中にいつ関与するか、関与するかどうかは不明です。

ヤナギの樹皮由来のサリチル酸、アスピリン、イブプロフェンなどの化学物質は、シクロオキシゲナーゼ酵素の阻害を通じて主要な感染症誘発性脂質メディエーターの生合成をブロックし、病気の症状を管理するための歴史的に効果的なアプローチを提供してきました5,10。 プロスタグランジン E2 (PGE2) は、病気行動を引き起こす重要なシクロオキシゲナーゼ依存性代謝産物であり、PGE2 生合成経路におけるシクロオキシゲナーゼの下流にある他の酵素のノックアウトも病気反応を改善します 11。 PGE2 は 4 つの G タンパク質共役受容体 (EP1 ～ EP4) の小さなサブファミリーによって検出され 12、パイロジェン誘発性疾病反応の一部 (すべてではない) は EP3 受容体によって媒介されると考えられています 2。 EP3 受容体は、視床下部や心室周囲器官、末梢ニューロン、免疫細胞、その他多くの細胞型を含むさまざまな脳領域で発現しています 12、13。 視床下部の正中視索前核（MnPO）にあるEP3受容体の領域特異的ノックアウトは、リポ多糖類誘発性の発熱反応を減少させ14、他の領域のPGE2受容体が覚醒と摂食への影響に関連していると報告されている2。 これらおよびその他の発見により、(1) PGE2 はその疎水性により血液脳関門を直接通過できる、(2) PGE2 は脳室周囲臓器で検出または脳に侵入できる、および/または (3) PGE2 は脳自体で合成できます 2,15,16。 中枢の PGE2 は、MnPO などのさまざまな受容脳領域を備えた分散型神経ネットワークを活性化し、特徴的な病気反応の特定の側面を引き起こす可能性があります 17。

末梢ニューロンにおけるプロスタグランジン受容体の役割は依然として不明であり、さらに、化学的に定義された発熱物質の外因性適用は全身性炎症反応を引き起こす可能性があるのに対し、異なる場所およびさまざまな強度の自然感染は代わりに局所的な神経免疫応答経路を引き起こす可能性があると推論しました。未開拓のまま残っているもの。

私たちは、インフルエンザ誘発性の疾病行動の根底にある神経機構を特徴付けるマウスモデルを開発しました。 マウスは、インフルエンザ A ウイルス PR/8/34 (H1N1) の鼻腔内投与によって感染し、その後 10 ～ 20 日間にわたって特徴的な病気反応をモニタリングしました。 インフルエンザ感染は、野生型マウスの食物摂取量、水分摂取量、運動量、体重、生存率を減少させた。 ウイルス接種材料の力価が高いほど病気の程度が増加し、最も重篤な表現型は感染後 6 ～ 7 日後に生じます (図 1a)。 酵素免疫測定法（ELISA）で測定したところ、インフルエンザ感染により、血漿と気管支肺胞洗浄液（BALF）の両方のPGE2レベルが同様の時間枠で増加しました（拡張データ図1b）。 また、PGE2投与は食物摂取を急激に抑制し（拡張データ図2a）、ファイバー測光測定により、アグーチ関連ペプチド（AGRP）を発現する視床下部ニューロンの活動の低下が示されました（拡張データ図2c）。これは、むしろ食べる意欲の低下と一致しています。単に物理的に食べることができないだけではありません。 また、マウスでの以前の観察と一致して、インフルエンザ感染に対する低体温反応も観察されました（拡張データ図3a）。 インフルエンザ感染マウスにイブプロフェン（飲料水中1 mg ml-1、自由摂取）またはアスピリン（20 mg kg-1、毎日腹腔内注射）を投与すると、血漿PGE2レベルが低下し、摂食量、水分摂取量および体重が回復し、体重が増加しました。感染からの生存率（図1bおよび拡張データ図1bおよび3b）。 イブプロフェンおよびアスピリンで治療したマウスは、PGE2の上昇がなく摂食、飲酒および運動性の低レベルの低下を維持したため、他の神経免疫伝達経路も行動反応に寄与している可能性が高まっています。 しかし、イブプロフェンとアスピリンはインフルエンザ誘発性の病気行動を大幅に減少させ、これは神経免疫クロストークにおけるシクロオキシゲナーゼ-2代謝産物の重要な役割と一致しています。

a、マウスに、低用量（105 EID50 ml-1）、中用量（106 EID50 ml-1）または高用量（107 EID50 ml-1）のインフルエンザA型ウイルス25μlを鼻腔内感染させ、摂食量、水分摂取量、運動性およびその後、体重を毎日監視した。 EID50 は、卵の 50% 感染量です。 データは平均値±標準誤差です。 n = 1 グループあたり 6 匹のマウス。 ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析とビヒクル対照との比較。 食物摂取量: P = 0.0048 (低)、P < 0.0001 (中)、P < 0.0001 (高)。 水分摂取量: P = 0.8185 (低)、P < 0.0001 (中)、P < 0.0001 (高)。 運動性: P = 0.5231 (低)、P < 0.0001 (中)、P < 0.0001 (高)。 体重: P = 0.0002 (低)、P < 0.0001 (中)、P < 0.0001 (高)。 生存率: P = 0.3173 (低)、P = 0.0185 (中)、P = 0.0007 (高)。 b、マウスをインフルエンザAウイルスに感染させ（特に示さない限り、すべての感染は106 EID50 ml-1でのもの）、1 mg ml-1のイブプロフェンを含むまたは含まない飲料水を与え、示されたようにモニタリングした。 データは平均値±標準誤差です。 n = 1 グループあたり 6 匹のマウス。 食物摂取量: P < 0.0001; 水分摂取量: P = 0.0001; 運動性: P = 0.0001; 体重: P < 0.0001; 生存率: P = 0.0295。 c、マウスをインフルエンザAウイルスに感染させ、EP1（SC-51322）、EP2（PF-04418948）、EP3（DG-041）またはEP4（ONO- AE3-208)、または車両単独で、示されているように監視されます。 データは平均値±標準誤差です。 ビヒクル群の場合、n = 10 匹のマウス。 他のすべてについては、n = 8 マウス。 EP3 アンタゴニストの場合 - 食物摂取: P < 0.0001; 水分摂取量: P < 0.0001; 運動性: P < 0.0001; 体重: P = 0.0002; 生存率: P = 0.0094。 b、c、対応のない両側t検定。cはイブプロフェンまたはEP3アンタゴニストとビヒクルで治療した群間の比較。 生存分析のためのログランク (マンテル-コックス) 検定。 行動または生理学的変化については、各マウスの行動の平均日次変化（感染後または生存後 1 ～ 10 日）を取得し、実験グループ間の比較に使用しました（詳細については、拡張データ図 1a を参照）。 *P<0.05、**P<0.005、***P<0.0005; NS、重要ではありません。

ソースデータ

病気行動における複数のプロスタグランジン受容体の役割が提案されています 2,19。 私たちは、インフルエンザ感染後に各 PGE2 受容体に対する選択的アンタゴニストを毎日投与し、病気の行動のさまざまな側面を測定しました。 EP3受容体アンタゴニストDG-041は、測定された各パラメータにおいてインフルエンザ誘発性疾患を効果的にブロックし、生存も促進しました（図1c）。その効果の大きさはイブプロフェンやアスピリンと同様でした。 対照的に、EP1、EP2、または EP4 受容体の拮抗作用は、測定されたパラメーターに影響を与えませんでした。 EP3 選択的アゴニストであるスルプロストンには、食物摂取を阻害するという逆の効果がありました (拡張データ図 2b)。 したがって、マウスは、EP3 受容体に対する PGE2 の作用を通じて、インフルエンザウイルス感染に対して特徴的な行動変化を示します。

EP3 受容体は、いくつかのクラスの中枢ニューロンおよび末梢ニューロンで発現されます。 インフルエンザ誘発性疾患における EP3 受容体作用の重要な部位を決定するために、EP3 受容体をコードする Ptger3 遺伝子 14 の Cre 依存的ノックアウトの対立遺伝子 (Ptger3flox) を持つマウスを入手しました。 次に、Ptger3floxマウスと、それぞれCreリコンビナーゼをほとんどの中枢ニューロンまたは末梢ニューロンに標的とするNestin-creまたはAdvillin-creERマウスのいずれかと交配し（拡張データ図4a）、インフルエンザ誘発性の疾病行動を測定しました。 Advillin-creER; Ptger3flox マウスをタモキシフェンで処理し、ウイルス投与の少なくとも 1 週間前に Cre 媒介組換えを誘導しました。 対照マウスの事前のタモキシフェン治療は、インフルエンザ感染に対するその後の行動反応に影響を与えなかった（拡張データ図4b）。 インフルエンザによる摂食、飲酒、運動、体重、生存の減少は、Advillin-creERでは軽減されました。 Ptger3flox マウス (図 2b)、効果の大きさはイブプロフェン治療と同様ですが、Nestin-cre では持続しました。 Ptger3flox マウス (図 2a)。 Ptger3 遺伝子欠失が病気行動に及ぼす同様の影響は、より低致死量のインフルエンザウイルスを使用した場合にも観察されました (拡張データ図 5)。 病気行動が軽減されたマウスは、すべての実験グループで感染後約2週間までに正常な摂食、飲酒および運動性が観察されたため、同様の回復時間を示しました。 これらの観察は、インフルエンザが末梢感覚ニューロンに対する PGE2 作用を通じて疾病反応を誘導することを示しました。

a、b、ネスティンクレ。 Ptger3flox (a)、Advillin-creER; Ptger3flox マウス (b) または Ptger3flox (a、b) マウスをインフルエンザ A ウイルスに感染させ、示されているようにモニタリングしました。 データは平均値±標準誤差です。 n = 8 マウス (Ptger3flox)、n = 6 マウス (Nestin-cre および Advillin-creER)。 行動または生理学的分析のための、対応のない両側 t 検定（図 1 に詳述）。 生存分析のためのログランク (マンテル-コックス) 検定。 a、食物摂取量: P = 0.0126; 水分摂取量: P = 0.1006; 運動性: P = 0.0701; 体重: P = 0.9361; 生存率: P = 0.7735。 b、食物摂取量: P = 0.0004; 水分摂取量: P = 0.0004; 運動性: P < 0.0001; 体重: P = 0.0004; 生存率: P = 0.0216。 c、Ptger3floxマウスのNJP神経節にAAV-creを両側に注射し、A型インフルエンザウイルスまたは生理食塩水に曝露し、示されているようにモニタリングした。 データは平均値±標準誤差です。 n = 1 グループあたり 8 匹のマウス。 Ptger3flox、ウイルス - 食物摂取: P < 0.0001; 水分摂取量: P < 0.0001; 運動性: P < 0.0001; 体重: P < 0.0001; 生存率: P < 0.0001。 Ptger3flox; AAV-cre、ウイルス - 食物摂取: P < 0.0001; 水分摂取量: P < 0.0001; 運動性: P < 0.0001; 体重: P < 0.0001; 生存率: P = 0.0376。 行動または生理学的分析については、図 1 に詳述されているダネットの多重比較検定を使用した一元配置分散分析。 Ptger3flox、ウイルス、および Ptg​​er3flox の間で比較を行う、生存分析のためのログランク (マンテル-コックス) 検定。 AAV-cre、ビヒクル (赤い星)、または Ptger3flox、ウイルスと Ptger3flox の間。 AAV-cre、ウイルス (青い星)。

ソースデータ

EP3 受容体は、迷走神経感覚ニューロン、舌咽頭感覚ニューロン、後根神経節の脊髄感覚ニューロンを含む、Advillin-creER マウスでマークされたいくつかのクラスの末梢ニューロンで発現しており、他のニューロン タイプでも発現している可能性があります 20,22。 舌咽頭および迷走神経の感覚ニューロンは、上気道および下気道の神経支配の大部分を占めているため、呼吸器病原体検出の主な候補と考えられていました23。 マウスでは、迷走神経（結節および頸静脈）および舌咽頭（錐体骨）の感覚ニューロンの細胞体が体の両側で融合して大きな超神経節を形成しています23。 我々は、構成的 cre 対立遺伝子 (AAV-cre) を持つアデノ随伴ウイルス (AAV) を、Ptger3flox マウスの両方の結節 - 頸静脈 - 錐体神経節 (NJP) 神経節に両側から注射しました。 NJP 神経節における Ptger3 の効果的なノックアウトは、AAV 注射の 2 週間後に RNA in situ ハイブリダイゼーションによって確認されました (拡張データ図 6)。 NJP 神経節を標的とした Ptger3 ノックアウトは、インフルエンザ誘発性の疾病行動の顕著な軽減を引き起こしました (図 2c)。 これらの発見は、インフルエンザが迷走神経および/または舌咽の求心性感覚神経に発現する EP3 受容体を介して行動の変化を誘発することを示しています。

RNA in situ ハイブリダイゼーション (拡張データ図 6b) および単一細胞トランスクリプトーム データの分析 (図 3a) によって明らかになったように、Ptger3 は迷走神経および舌咽感覚ニューロンのサブセットで発現しています。 単細胞 RNA 配列決定アプローチにより、数十の分子的に異なる NJP 感覚ニューロンが明らかになりました 22、24、25。 最も高いPtger3発現は、6つのニューロンクラスター：J1、J2、J3、NP2、NP9およびNP26で観察されました（図3a）。Jは頸静脈を示し、NPは結節-錐体ニューロンを示します。 Ptger3flox マウスを、J1、J2、J3 およびその他の NJP ニューロンが標識された Piezo2-IRES-cre マウス、および NP2、NP9、NP26 およびその他の NJP ニューロンが標識された Phox2b-cre マウスと交配しました。 インフルエンザ誘発性の病気行動は、Phox2b-cre では軽減されました。 Ptger3flox マウスはさまざまなウイルス力価に渡りますが、Piezo2-IRES-cre では異なります。 Ptger3flox マウス (図 3b および拡張データ図 7 および 8a)。これは、NP2、NP9、または NP26 ニューロンのいずれかの役割を示唆しています。 これらのニューロンの種類を区別するために、次に Ptger3flox マウスを、NP26、NP2、および NP9 ニューロンの異なるターゲティングを示す Pdyn-IRES-cre、Oxtr-IRES-cre、および Gabra1-IRES-cre マウスと交雑しました。 Gabra1-IRES-cre; Ptger3flox マウスは、イブプロフェン治療と同様に、インフルエンザ誘発性の病気行動の顕著な減弱を示しましたが、Pdyn-IRES-cre では効果が観察されませんでした。 Ptger3flox または Oxtr-IRES-cre。 Ptger3flox マウス (図 3b および拡張データ図 8a)。 Gabra1-IRES-cre; さらに、Ptger3flox マウスは、インフルエンザ感染に対する低体温反応の減弱を示しました (拡張データ図 3a)。 また、TRPV1 ニューロンの欠失は致死性肺炎を引き起こす細菌性肺感染症後の生存に影響を与えるため、TRPV1 ニューロンの役割も調べました 26。 しかし、インフルエンザ誘発性の病気の行動は、Trpv1-IRES-creでは正常でした。 Ptger3flox マウス (拡張データ図 8b、c)、さらに GABRA1 ニューロンは主に Trpv1 陰性です。 したがって、Gabra1 を発現する末梢感覚ニューロン (NP9 ニューロン) の小さなサブセットにおける EP3 受容体の欠失は、インフルエンザ感染に対する行動反応に広範な影響を及ぼします。

a、示された遺伝子の発現を示す、迷走神経および舌咽頭感覚神経節の公表された単一細胞トランスクリプトーム データ 22 に由来する均一多様体近似および投影 (UMAP) プロット (色は自然対数スケールでの相対発現を示します)。 b. a で強調表示されている細胞タイプは、指定された遺伝子と Ptger3 を発現します。 マウスをインフルエンザ A ウイルスに感染させ、指示に従ってモニタリングしました。 データは平均値±標準誤差です。 n = 8 (Piezo2-IRES-cre)、n = 6-8 (Phox2b-cre; 8 コントロールと 6 Phox2b-cre)、n = 6 (Pdyn-IRES-cre)、n = 6 (Oxtr-IRES-cre) ）およびn = 10（Gabra1-IRES-cre）マウス/グループ。 行動または生理学的分析のための、対応のない両側 t 検定（図 1 に詳述）。 生存分析のためのログランク (マンテル-コックス) 検定。 Piezo2-IRES-cre—食物摂取量: P = 0.2631; 運動性: P = 0.2680; 体重: P = 0.7925; 生存率: P = 0.4736。 Phox2b-cre - 食物摂取量: P < 0.0001; 運動性: P < 0.0001; 体重: P = 0.0002; 生存率: P = 0.0181。 Pdyn-IRES-cre - 食物摂取量: P = 0.4539; 運動性: P = 0.4946; 体重: P = 0.2675; 生存率: P = 0.7937; Oxtr-IRES-cre—食物摂取量: P = 0.4786; 運動性: P = 0.6333; 体重: P = 0.3297; 生存率: P = 0.7121; Gabra1-IRES-cre—食物摂取量: P = 0.0001; 運動性: P < 0.0001; 体重: P = 0.0004; 生存率: P = 0.0263。

ソースデータ

次に、感覚ニューロンの操作がウイルスの転写レベルとサイトカイン産生にどのような影響を与えるかを調べました。 インフルエンザ感染は、血漿および Gabra1-IRES-cre の BALF において PGE2 を同様のレベルに誘導しました。 Ptger3flox、Phox2b-cre; Ptger3flox、Advillin-creER; Ptger3flox および Ptg​​er3flox マウス (拡張データ図 9a)、観察された行動の違いの根底にある PGE2 合成ではなく PGE2 検出の変化と一致しています。 対照マウスでは、ウイルス転写レベルは、上気道での感染から 3 日後、肺での感染から 5 日後にピークに達しました。 Gabra1-IRES-cre で; Ptger3flox マウスでは、ウイルス転写レベルは上気道で部分的に減少し、肺では減少し、遅延し、持続しました（拡張データ図 9b）。 インターフェロン-ガンマ (IFNγ)、TNF、およびインターロイキン 6 (IL-6) のレベルは、対照マウスの BALF では感染後 5 日で同様にピークに達しましたが、Gabra1-IRES-cre では同様に減少および遅延しました。 Ptger3flox マウス (拡張データ図 9c)。 これらの発見は、感覚ニューロンにおける標的EP3受容体ノックアウトが病気の行動だけでなく、免疫反応や上気道感染から下気道感染への移行にも影響を与えることを示しています。

我々は、ジフテリア毒素誘導細胞アブレーションを含む相補的なアプローチを使用して、インフルエンザ誘発性疾患におけるGabra1発現迷走神経舌咽頭感覚ニューロンの役割を明らかにし、他のGabra1発現部位の役割を除外しました。 マウス細胞は通常、ジフテリア毒素に対して耐性がありますが、ヒトジフテリア毒素受容体（DTR）の発現によって感受性が高まることがあります。 Gabra1-IRES-cre の NJP 神経節。 lsl-DTRマウスにジフテリア毒素を両側に注射し（これらをGabra1-ABLATEマウスと呼びます）、迷走神経および舌咽のGABRA1ニューロンの非常に効率的なアブレーションをもたらしました（図4c）。 我々は以前に、このアプローチがNJP神経節のCre陰性ニューロン、または離れた位置にあるCre陽性ニューロンに影響を与えないことを実証しました27。 Gabra1-ABLATE マウスは、Gabra1-IRES-cre と同様に、インフルエンザ感染に対する疾病反応の減弱を示しました。 Ptger3flox マウスまたはイブプロフェン処置マウス (図 4a)。

a、Gabra1-IRES-cre; lsl-DTR マウスに、ジフテリア毒素 (DT) の有無にかかわらず、NJP 神経節に両側注射し、その後、インフルエンザ A ウイルスを感染させ、指示に従ってモニタリングしました。 データは平均値±標準誤差です。 n = 1 グループあたり 8 匹のマウス。 食物摂取量: P < 0.0001; 水分摂取量: P < 0.0001; 運動性: P < 0.0001; 体重: P = 0.0004; 生存率: P = 0.049。 b、両側舌咽神経切断手術または偽手術を受けた野生型マウスをインフルエンザAウイルスに感染させ、指示に従ってモニタリングした。 データは平均値±標準誤差です。 n = 1 グループあたり 8 匹のマウス。 食物摂取量: P < 0.0001; 水分摂取量: P < 0.0001; 運動性: P < 0.0001; 体重: P < 0.0001; P = 0.036。 行動または生理学的分析については、図 1 に詳細を示す対応のない両側 t 検定。 生存分析のためのログランク (マンテル-コックス) 検定。 c、注射から4週間後のNJP神経節のホールマウント調製物におけるDTRの免疫染色。 スケールバー、200 μm。 d、PGE2（1μM）またはKCl（150mM）によって誘発されたカルシウム過渡現象は、Gabra1-IRES-creのNJP神経節から急性に収集されたtdTomato陽性ニューロンにおいてCalbryte 520 AMを使用して画像化されました。 lsl-tdトマトマウス。 スケールバー、10μm。 画像は 3 つの技術的複製を表しています。 AU、任意の単位。

ソースデータ

NP9 ニューロンは Hoxb4 の発現を欠いており (参考文献 22)、GABRA1 ニューロンは舌咽頭枝近くの NJP 神経節内に集中していることが多く (拡張データ図 10a)、これらのニューロンが迷走神経ではなく舌咽神経の一部を構成していることを示唆しています。 ジフテリア毒素注射は迷走神経と舌咽ニューロンにも同様に影響を与えるため、迷走神経を温存しながら舌咽神経を両側に切断することで、これらの神経からの寄与を区別しました。 両側舌咽神経切断を行ったマウスは、インフルエンザ誘発性疾患の同様の軽減を示しました（図4b）。 PGE2 は、脊髄および迷走神経の求心性神経の転写変化を活性化および/または誘導することが以前に示されていたため、GABRA1 ニューロンも直接活性化されるかどうかをテストしました。 われわれは、Gabra1-IRES-creのNJP感覚神経節から急性培養したGABRA1ニューロンにおいて、PGE2がカルシウム過渡状態を直接誘発することを観察した。 lsl-tdTomato マウス (図 4d、26 個中 16 個、または tdTomato 陽性、KCl 反応性ニューロンの 61.5%)。 したがって、まれな舌咽の NP9 ニューロンは、EP3 受容体を介して間接的に呼吸器ウイルス感染の存在を検出し、それに応答して、多方面にわたる病気行動プログラムを引き起こします。

Gabra1-IRES-cre マウスは、神経免疫クロストークに関与する希少な舌咽感覚ニューロンを視覚化するための貴重なツールを提供するため、遺伝的マッピングアプローチを使用して、GABRA1 ニューロンの末梢および中枢の投影をマークしました（図5a）。 Gabra1-IRES-cre マウスの NJP 神経節に、tdTomato (AAV-flex-tdTomato) またはアルカリホスファターゼ (AAV-flex-AP) をコードする Cre 依存性レポーター遺伝子を含む AAV、および Cre を含む AAV を注射しました。 -GFP (AAV-GFP) をコードする独立したレポーター遺伝子により、グローバルな NJP 投影フィールドを視覚化します。 次に、気道と脳内の線維を視覚化しました。

a、Gabra1-IRES-cre マウスの NJP 神経節に Cre 非依存性 AAV-GFP および Cre 依存性 AAV-flex-tdTomato を両側に注射し、蛍光軸索を視覚化しました (緑色: すべての NJP 感覚軸索、赤色: GABRA1 NJP 軸索)。マウス脳幹の固定冠状凍結切片における tdTomato と GFP の免疫組織化学による。 スケールバー、200μm。 b、Gabra1-IRES-creマウスのNJP神経節にAAV-flex-tdTomatoを両側に注射し、鼻咽頭の固定冠状凍結切片におけるtdTomatoに対する免疫染色によって軸索を視覚化しました。 スケールバー、100 μm (上)、50 μm (下)。 c、上、非感染マウス（対照）またはA型インフルエンザウイルスに5日間感染させたマウスの鼻咽頭の固定凍結切片におけるCOX2の免疫組織化学。 スケールバー、100μm。 下は、示されたマウスの鼻咽頭における COX2 免疫蛍光の定量化です。 データは平均値±標準誤差です。 n = 3 回の独立した実験にわたる 1 グループあたり 5 匹のマウスからの 29 切片。 対応のない両側 t 検定、P < 0.0001。 左パネルの一部は参考文献の許可を得て改変したものです。 35、エルゼビア。 BioRender.com で作成されたパート b の上部パネル。

ソースデータ

中枢では、結節および錐体神経節の感覚ニューロンが頭蓋骨を横切り、孤独路核（NTS）および後野を含む脳幹領域を神経支配します 32 のに対し、頚静脈感覚ニューロンは三叉神経傍核を神経支配します 33。 Cre で定義されたさまざまな迷走神経求心性神経は、NTS の空間的に制限されたサブ領域をターゲットにしており、すべてではありませんが一部の求心性タイプも後領域にアクセスします 24,34,35。 NJP GABRA1ニューロンの軸索は、外側NTSで高度に制限されており（図5a）、後領域では観察されず、マークされた腸神経支配ニューロンなど、他のCreで定義されたNJPニューロンの軸索が標的とするNTSの位置から離れていました。 Gpr65 または Glp1r35 の発現による。 これらの発見は、少なくとも他の内受容入力から空間的に制限された気道感染症の存在をニューロンが中継するという、脳幹における地形的組織化のモデルをさらに裏付けている 36 。

末梢では、標識された GABRA1 軸索が、迷走神経および舌咽神経支配を受けることが知られている少数の内臓のみで観察されました。 味乳頭などの鼻咽頭および口腔における最も密度の高い神経支配、気管および咽頭筋の若干の神経支配、および胃筋のまばらな神経支配を観察しました（拡張データ図10b）。 心臓、食道、大動脈、頸動脈洞など、他の多くの内臓では神経支配は観察されませんでした。 鼻咽頭は、鼻腔を呼吸器系の他の部分に接続し、粘膜免疫防御の初期ラインを提供するため、免疫監視にとって豊富な部位です37。 インフルエンザ感染は鼻咽頭内の局所的な PGE2 レベルを増加させ 38、ヒトでは鼻咽頭扁桃の炎症を引き起こします 39。 マウスは鼻咽頭関連リンパ組織40として知られるオルソロガス系を持っているため、GABRA1軸索が関連する免疫メディエーターの近くに位置するかどうかをテストしました。 GABRA1軸索は、鼻咽頭の上皮層および上皮下層の背側に濃縮されており（図5b）、特に、シクロオキシゲナーゼ-2の発現が同様に鼻咽頭の背側上皮で検出されました（図5c）。 さらに、マウスのインフルエンザ感染後、シクロオキシゲナーゼ-2の発現が鼻咽頭背側で顕著に上方制御されました（図5c）。 したがって、GABRA1 ニューロンは、ウイルス感染中に発生する PGE2 レベルの上昇を検出するための戦略的かつ特権的な位置を占めています。

季節性ワクチン接種や抗ウイルス治療にもかかわらず、インフルエンザ A ウイルス感染症は依然として人類にとって最も深刻な脅威の 1 つであり、毎年世界中で数百万人が影響を受けています。 シクロオキシゲナーゼ 2 阻害剤は、最も普及している抗疾病薬および抗疼痛薬の 1 つであり、米国だけで年間約 300 億回分の非ステロイド性抗炎症薬 (NSAID) が消費されています41。 PGE2 産生の遮断は病気を軽減し、脳が PGE2 を介して末梢感染に関する入力をどのように受け取るかについていくつかのモデルが提案されています (参考文献 2)。 今回我々は、インフルエンザ誘発性の疾病行動が、1) イブプロフェン、アスピリン、EP3 受容体拮抗作用、2) Advillin-creER、Phox2b-cre、Gabra1-IRES-cre マウスを用いた Ptger3 標的遺伝子ノックアウト、および直接 AAV によって同様に軽減されることを観察しました。 NJP 神経節への -cre 注射、3) GABRA1 NJP ニューロンの切除、および 4) および舌咽神経切断。 これらの総合結果から、我々は、Gabra1を発現する舌咽頭感覚ニューロンの小さなクラスターがPGE2を検出し、呼吸器ウイルス感染に対する一連の行動反応に関連する神経的に組織化された疾病状態を誘発すると結論づけた。

プロスタグランジンおよび他の多くのサイトカインは、in vitro で迷走神経および他の末梢求心性神経を活性化することができます 8,29,31 が、自然主義的感染症におけるそれらの生理学的役割を解析することは困難でした。 迷走神経切除術はサイトカインやリポ多糖に対する病気の反応をブロックする研究もあるが、ブロックしない研究もある 42,43。このばらつきは発熱物質の投与場所や投与量による可能性がある。 私たちの発見は、インフルエンザ誘発性のPGE2を検出するために解剖学的に準備が整っているまばらな舌咽頭感覚ニューロンの明確な役割を示しています。 PGE2 は生体内での安定性が限られているため 44、感染部位で PGE2 を直接検出する末梢感覚ニューロンは、脳への情報伝達のための高速かつ堅牢な経路を提供すると考えられます。

病気の行動は、感染症と戦うためのエネルギーを節約するのに役立つと提案されています1。 しかし、舌咽神経のインフルエンザ検出経路を排除すると、病気の行動が軽減されるだけでなく、生存も促進されます。 舌咽ニューロンの小グループからの EP3 のノックアウトは、全身ノックアウトで観察される深遠な生存表現型を模倣するのに十分です。 1つのモデルは、病原体誘発性食欲不振は、一部の感染モデルでは有益であるが、他の感染モデルでは有害であるというものです。 たとえば、PGE2 産生の阻害は、マイコバクテリウム 3 感染時には有害ですが 45、インフルエンザ感染時には生存を促進します 19,46。 さらに、グルコース強制経口摂取は、細菌性敗血症の場合には有害であり、血糖は病原体に直接燃料を提供する可能性がありますが、インフルエンザ感染時には防御効果があります47。 したがって、感染に対する神経反応を破壊すると、摂食行動の変化が弱まり、死亡率が低下する可能性があります。 さらに、感染によって活性化され食欲不振を促進する神経経路は、特定の細菌感染時には生存に正味の利益をもたらす可能性があり、進化を通じて維持されるが、今回観察されたようにウイルス感染時には有害である。 さらに、病気の動物は隔離を求め、それによって kin48 への病原体の伝播を制限するため、病気の行動は個体群レベルで別の利益​​をもたらす可能性があります。

これらの発見は、感覚ニューロンにおける標的EP3受容体ノックアウトが病気行動だけでなく、免疫反応や上気道から下気道へのウイルス移行にも影響を及ぼすことを示している。 これらの発見を倹約的に解釈すると、岩石性GABRA1ニューロンは、PGE2を検出すると、免疫機能に影響を及ぼす運動反射だけでなく、病気の行動を含む協調反応を引き起こす神経回路に関与するということになる。 さらに、摂食行動の変化は二次的に免疫機能に影響を与える可能性があり 47,48、錐体細胞GABRA1ニューロンの活性化はPGE2以外のサイトカインのレベルに影響を与える可能性があり（拡張データ図9c）、これによりさらなるニューロンフィードバックを誘発し、病気行動を強化する可能性があります。 このような感染に対する反応はすべて、岩石状 GABRA1 ニューロンの EP3 受容体に決定的に依存していると考えられます。この受容体は、最初に上気道感染症の存在を脳に伝え、最終的には病気の行動を引き起こすという重要な役割を果たします。

インフルエンザ感染による疾病行動は、NSAID治療、標的EP3受容体ノックアウト、標的ニューロンアブレーション、舌咽神経切断後に軽減されたものの、排除されず、他の経路で病気​​になることが示唆された。 注目すべきことに、岩石性GABRA1ニューロンの操作後の残存疾病行動の動態は、肺におけるウイルス蓄積の時間経過と一致しており、インフルエンザ誘発性疾病行動にはおそらく2つの段階があることを示している。 第 1 段階は、ウイルスが上気道で最も蔓延しているときに起こり、病気は主に、鼻咽頭に投射する GABRA1 によって特徴付けられる PGE2 検出舌咽頭感覚ニューロンによって媒介されます。 病気の第 2 段階は、ウイルスが下気道で最も蔓延し、肺が舌咽感覚ニューロンではなく迷走神経によって主に神経支配されるときに発生します。 私たちのデータは、この病気の第 2 段階には、PGE2、EP3、および舌咽感覚ニューロンとは独立した別のニューロン経路が関与している可能性を高めています。 残存神経免疫相互作用経路の阻害剤が同定されれば、NSAID と組み合わせて使用​​すると、インフルエンザ誘発性倦怠感の改善をもたらす可能性があります。 また、PGE2 受容体は、脳や後根神経節だけでなく、複数の NJP 感覚ニューロン タイプでも発現していることにも注目します。 おそらく神経系は末梢感染を検出するために複数の感覚経路を使用しており、おそらく特定の病原体の種類や体内の感染部位に特化したさまざまなセンサーを使用していると考えられます。 このようにして、腸および呼吸感覚ニューロンは、例えば咳や吐き気を引き起こす異なる神経回路に関与する可能性があります 31,49。 この概念と一致して、病気に至るさまざまな経路は薬理学的阻害に対する感受性が異なっています。 たとえば、腸の倦怠感はセロトニン受容体 HTR3A50 のアンタゴニストを使用して臨床的に治療されます。 病気に至る感覚経路の多様性と、それらが異なる病原体感染に関与する時期を理解することは、この複雑でよく理解されていない生理学的状態を解読するための重要な枠組みを提供し、治療介入の改善を可能にする可能性があります。

すべての動物手順は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに概説されている倫理ガイドラインに従い、すべてのプロトコルはハーバード大学医学部の施設内動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認されました。 マウスは、12 時間の明暗サイクルで一定の温度 (23 ± 1 °C) および相対湿度 (46 ± 5%) で維持されました。 野生型 C57BL/6J (000664)、Nestin-cre (003771)、Phox2b-cre (016223)、Advillin-creER (032027)、Trpv1-IRES-cre (017769)、Pdyn-IRES-cre (027958)、Piezo2 -EGFP-IRES-cre (027719)、Oxtr-IRES-cre (031303)、Agrp-cre (012899)、lsl-DTR (007900)、lsl-tdTomato (Ai14、007914) は Jackson Laboratories から購入しました。 Gabra1-IRES-cre、lsl-L10-GFP、および Ptg​​er3flox マウスは以前に生成されました 14、22、51。

インフルエンザ A/PR/8/34 (H1N1) は、EID50 が 1012 ml-1 の Charles River Avian Vaccine Services (10100374) から購入しました。 ウイルスは、別段の指示がない限り、投与量（EID50 106 ml-1）となるように滅菌生理食塩水で希釈した。 ウイルス投与は以前の研究から適応されました52。 覚醒しているマウスを手動で拘束し、こぼれや口への送達を防ぐために、P200ピペットを使用してインフルエンザA型ウイルスを各鼻孔からゆっくりと送達した(総量25μl)。 投与後、マウスは鼻孔を立てた状態で 10 ～ 15 秒間保持され、ケージに戻されました。

A 型インフルエンザウイルス感染による行動変化を分析するために、性別に偏りのない生後 6 ～ 8 週目のマウスを単独で飼育し、餌と水を自由に摂取させました。 ベースライン値は、接種前の 3 日間の毎日の食物摂取量、毎日の水摂取量、体重、および運動性を測定することによって得られました。 ウイルス感染後、すべての測定値はベースライン値からの変化率として表されました。 餌と水の摂取量は、ケージ内に残っている餌と水の重量の変化を測定することによって毎日計算されました。 動物の動きをホームケージ内で毎日 30 分間記録し (C922x Pro Stream Webcam、Logitech)、運動性を ImageJ で利用可能な MTrack2 プラグイン (1.53q、NIH) によって決定した総移動距離として表しました。 急性食物摂取量を測定するために、マウスを 24 時間絶食させ、暗所開始時に、図の凡例に示す曝露経路および用量で PGE2 またはスルプロストン (EP3 アゴニスト、14765、Cayman Chemical Company) を投与しました。 次に、動物を清潔なケージ内で単独で飼育し、餌と水を自由に摂取させ、試験期間の前後にケージ内の餌を測定することによって、1時間に消費した餌の量を決定した。

中核体温は、直腸プローブまたは無線テレメトリーによって監視されました。 直腸プローブ測定は、温度計 (Kent Scientific WD-20250-9) に接続されたマウス直腸温度プローブ (Kent Scientific、RET-3、先端直径 0.16 mm) を使用して、毎日正午から深夜まで 1 時間ごとに行われました。 プローブを滅菌し（70% エタノール）、潤滑し（Aquagel 潤滑ゲル、ParkerLabs、57-05）、物理的に拘束したマウスの直腸に約 5 ～ 7 mm 挿入し、温度を 30 秒間記録しました。 無線遠隔測定のために、体温を報告する無線遠隔測定装置 (HD-X11、DSI) が腹腔内に外科的に埋め込まれました。 手術はアベルチン（200 mg kg-1、腹腔内注射）による麻酔下で行われ、腹部を消毒して剃りました。 約 1 cm の切開を行い、腹部の白線の腹膜を穏やかに露出させて、滅菌無線遠隔測定装置を挿入しました。 手術部位を VICRYL 縫合糸 (J392H、Ethicon) で密閉しました。 動物にブプレノルフィン SR (BupSR-LAB、ZooPharm、首の後ろに 20 mg kg-1 を皮下投与) を投与し、少なくとも 1 週間回復させました。 体温データは、iox ソフトウェア v.2.10.8 を実行しているコンピューターに接続された受信機 (easyTEL、Emka Technologies) を使用して 15 分間隔で収集されました。 特定の日に 1 匹のマウスから得たすべてのデータ ポイントを平均しました。

イブプロフェン (I4883) とアスピリン (アセチルサリチル酸、A5376) は Sigma から購入し、PGE2 受容体拮抗薬 SC-51322 (2791)、PF-04418948 (4818)、DG-041 (6240)、および ONO-AE3-208 (3565) を購入しました。 ）はトクリスから購入しました。 イブプロフェン (1 mg ml-1、生理食塩水) を飲料水に自由に加え、アスピリン (20 mg kg-1、生理食塩水) および PGE2 受容体拮抗薬 (1 mg kg-1、生理食塩水) を毎日 (腹腔内) 注射しました。 シクロオキシゲナーゼ 2 阻害剤と PGE2 受容体拮抗薬の投与はウイルス接種の 3 日前に開始し、モニタリング期間の終了まで続けました。 タモキシフェンは、インフルエンザウイルス感染の少なくとも1週間前に5日間毎日投与されました（腹腔内注射、70 mg kg-1）。

NJP 神経節には、以前に記載されているように 34、若干の変更を加えて AAV またはジフテリア毒素を注射しました。 マウスに麻酔をかけ（200 mg kg-1 アベルチン、腹腔内注射）、つま先のピンチ反応がないことにより手順全体を通して麻酔の深さを確保した。 NJP 神経節を露出し、AAV (力価 > 6.7 × 1012 vg ml-1) または 0.05% Fast Green FCF 色素を添加したジフテリア毒素 (5 μg ml-1、Sigma) を含む生理食塩水を連続注射しました (10 × 13.8 nl)。 (Sigma)、Nanoject Injector (Drummond) に取り付けられた鋭く引っ張られたガラス ピペットを使用します。 AAV-cre (AAV-Syn-Cre-GFP、SignaGen Laboratories、SL100892、AAV9)、AAV-flex-tdTomato (AAV9.CAG.Flex.tdTomato.WPRE.BGH、Addgene、51503、AAV9)、AAV-GFP (pENN) .AAV.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG、Addgene、105542、AAV9)、および AAV-flex-AP (AAV9.CAG.flex.PLAP.WPRE.bgH、カスタム ウイルス、ボストン小児病院ウイルス コア、ボストン) MA、AAV9）を購入しました。 注入が成功したことは、Fast Green FCF 色素が漏れなく神経節全体をゆっくりと満たすことで検証されました。 外科的創傷をコーティングされたVICRYL縫合糸(J392H、Ethicon)で閉じ、動物に鎮痛剤としてブプレノルフィンSR(BupSR-LAB、ZooPharm、首の後ろに20 mg kg-1)を投与した。 動物は、行動分析の場合は少なくとも 2 週間、組織学的分析の場合は 4 週間回復しました。

マウスに麻酔をかけ（200 mg kg-1 アベルチン、腹腔内注射）、つま先のピンチ反応がないことにより手順全体を通して麻酔の深さを確保した。 NJP 神経節を外科的に露出し、舌咽神経を特定し、マイクロハサミを使用して神経節に隣接して切断しました。 偽手術には、神経切断を伴わないNJP神経節の露出が含まれていました。 外科的創傷をコーティングされたVICRYL縫合糸(J392H、Ethicon)で閉じ、動物に鎮痛剤として20 mg kg-1 ブプレノルフィンSR(BupSR-LAB、ZooPharm、首の後ろの皮下)を投与した。 動物は行動分析前に少なくとも 2 週間回復しました。

免疫組織化学および天然組織蛍光の分析は、固定液(10 mlのPBS、次いで10 mlのPBS中の4%パラホルムアルデヒド)の心臓内灌流後に実施した。 ホールマウント DTR 免疫染色では、NJP 神経節を収集し、37 °C で 1 週間透過処理しました (グリシン 11.5 g、0.2% Triton X-100 を含む PBS 400 ml、DMSO 100 ml)。 次いで、神経節をブロッキング緩衝液（5%正常ロバ血清、017-000-121、0.05% Tween-20/PBS中のJackson）中でブロックし（1時間、室温）、1:200でインキュベートした（一晩、4℃）。ブロッキングバッファー中の抗 DTR (HB-EGF、ヤギ、AF259NA、Fisher Scientific)。 サンプルを洗浄し（4 × 10 分、PBS 中の 0.05% Tween-20、室温）、抗ヤギ Alexa 488 溶液（Jackson Immunoresearch、705-545-147、1:500 溶液）とともにインキュベートしました（2 時間、室温）。 0.05% Tween-20 を含む PBS)。 組織を再度洗浄し（4 × 10 分、PBS 中の 0.05% Tween-20、室温）、顕微鏡スライド（Fisher Scientific）上にマウントし（Fluoromount G 培地、SouthernBiotech）、Leica SP5 II 共焦点顕微鏡を使用して視覚化し、 ImageJ (1.53q)。 シクロオキシゲナーゼ-2免疫染色のために、鼻咽頭組織を凍結切片(15μm)にし、ブロッキング溶液(5%正常ロバ血清、0.01%Triton X-100を含むPBS)でブロックし(1時間、室温)、インキュベートした(一晩、4℃)。 C) 抗 COX2 抗体 (ウサギ、ab179800、Abcam、0.01% Triton X-100 を含む PBS 中で 1:500) を含む。 切片を洗浄し（3 × 10 分、室温、0.01% Triton X-100 を含む PBS）、抗ウサギ Alexa 488 溶液（Jackson Immunoresearch、711-545-152、1:1,000）とともにインキュベートしました（2 時間、室温）。 0.01% Triton X-100 を含む PBS 溶液)。 切片を再度洗浄し（3 × 10 分、室温、0.01% Triton X-100 を含む PBS）、Fluoromount G 培地でマウントし、Leica SP5 II 共焦点顕微鏡を使用して視覚化しました。 脳幹軸索を視覚化するために、AAV を注射したマウスから脳幹凍結切片 (20 μm) を取得し、抗体が 1:1,000 抗 GFP (ニワトリ、GFP-1020、Aves) であったことを除き、鼻咽頭組織におけるシクロオキシゲナーゼ-2 免疫染色について上記と同様に処理しました。 Labs)、1:1,000 抗 RFP (ウサギ、600-401-379、Rockland)、抗ニワトリ Alexa 647 (Jackson Immunoresearch、703-605-155、1:300)、および抗ウサギ Cy3 (Jackson Immunoresearch、111) -165-144、1:300)。 鼻咽頭の軸索を視覚化するために、固定した鼻咽頭 (15 μm) 切片をシクロオキシゲナーゼ-2 免疫染色について上記と同様に染色しましたが、抗 RFP 一次抗体、続いて抗ウサギ Cy3 二次抗体を使用しました。 気管および下咽頭収縮筋への GABRA1 ニューロン神経支配については、組織を新鮮に収集し、開帳視覚化のために腹軸に沿って切断し、固定 (4% パ​​ラホルムアルデヒド/PBS で 1 時間、室温、または一晩、4 °C)、一次抗体のインキュベーション (36 時間、4 °C) とその後の洗浄 (3 × 12 時間、4 °C) が長かったことを除いて、鼻咽頭における tdTomato の視覚化について上記と同様に tdTomato について染色しました。 アルカリホスファターゼを視覚化するために、動物を PBS で灌流し、組織を収集し、固定し (4% パ​​ラホルムアルデヒド、1 時間、室温)、冷 PBS で洗浄しました。 次に、組織をアルカリホスファターゼ緩衝液（0.1 M Tris HCl pH 9.5、0.1 M NaCl、50 mM MgCl2、0.1％ Tween-20、5 mM レバミゾール）中でインキュベートし（70 °C、2 時間）、アルカリホスファターゼ緩衝液で 2 回洗浄しました。 アルカリホスファターゼ活性は、NCT/BCIP 溶液 (34042、ThermoFisher Scientific) を製造業者のプロトコールに従って使用して視覚化しました。 染色サンプルを後固定し (4% パ​​ラホルムアルデヒド、一晩、4 °C)、一連のエタノール洗浄で脱水し、ベンジルアルコール (Sigma-Aldrich 402834-500ML): 安息香酸ベンジル (Sigma) の 1:2 混合物を使用して透明化しました。 -アルドリッチ B6630-1L）。 次に、開いたブックを視覚化するために、組織を腹軸に沿って切断しました。 ホールマウント染色は、AxioZoom (Zeiss) を使用した顕微鏡検査によって捕捉され、ImageJ (1.53q) を使用して分析されました。

Ptger3 (ロット番号 PRH698) および Phox2b (ロット番号 PRF341) に対する DNA ベースのハイブリダイゼーション連鎖反応 (HCR) プローブは、Molecular Instruments から購入しました。 ハイブリダイゼーション溶液 (30% ホルムアミド、5× SSC、9 mM クエン酸 (pH 6)、0.1% Tween-20、50 μg ml-1 ヘパリン、1× デンハルト溶液、10% デキストラン硫酸)、プローブ洗浄バッファー (30%ホルムアミド、5× SSC、9 mM クエン酸 pH 6.0、0.1% Tween-20、50 μg ml-1 ヘパリン)、増幅バッファー (5× SSC、0.1% Tween-20、10% デキストラン硫酸)、および蛍光標識HCR アンプは Molecular Instruments から購入しました。 NJP 神経節を新たに収集し、OCT (Sakura Finetek) にマウントし、凍結切片 (10 μm) に切り出しました。 組織を後固定し（4% PFA、PBS、室温、20 分）、洗浄し（3 × 10 分、PBS、室温）、1% 過酸化水素で処理し（PBS、室温、20 分）、インキュベートしました。 Ptger3 および Phox2b HCR プローブを使用 (0.4 pmol、ハイブリダイゼーション バッファー、加湿チャンバー内、37 °C、一晩)。 次に、組織を(1) 3:1 プローブ洗浄バッファー: 5x SSCT (5x SSC、0.1% Tween-20)、(2) 1:1 プローブ洗浄バッファー: 5x で洗浄しました (15 分、37 °C)。 SSCT、(3) 1:3 プローブ洗浄バッファー: 5x SSCT、および (4) 5x SSCT。 次に、組織を増幅バッファー（30分間、室温）でインキュベートし、次に蛍光HCRアンプ（6pmol、Ptger3プローブの場合はAlexa594、Phox2bプローブの場合はAlexa 488）とともに増幅バッファー中でインキュベートしました（加湿チャンバー、室温、一晩）。 次に組織を洗浄し（5×SSCT、2×30分、1×5分、室温）、Fluoromount G培地にマウントし、共焦点顕微鏡（Leica SP5 II）で視覚化しました。

この原稿のすべての UMAP プロットは、Seurat (4.1.0) および R Studio (4.1.2) を使用して、公開されている単一細胞トランスクリプトーム データ (GEO Accession ID: GSE145216)22 から作成されました。

マウス Ptger3、Gapdh 転写物、およびインフルエンザ ウイルス核タンパク質 (NP) のレベルを、視床下部、NJP 神経節、鼻洗浄 (上気道分析用)、および/または BALF (下気道分析用) から得た cDNA で測定しました。 BALFは、首を外科的に開き、21Gカテーテルを気管に挿入することによって収集されました。 合計 3 × 1 ml の PBS を肺にゆっくりと注入し、溶液をゆっくりと吸引してシリンジに戻し、収集しました。 収集した BALF を遠心分離し (7 分、400 g、4 °C)、上清を分析まで保存しました (-80 °C)。 鼻洗浄は、鼻に向かって斜めに上部気管に針 (26G) を挿入することによって実行されました。 滅菌ＰＢＳ（１ｍｌ）を、カニューレ付き注射器（ＰＥ２０ポリエチレンカニューレ、内径０．３８ｍｍ）を介して針を通して投与し、鼻から排出した後に回収した。 メーカーのプロトコルに従って、Trizol (15596026、ThermoFisher) および High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (4368813、ThermoFisher) を使用して、BALF、鼻洗浄液、およびホモジナイズした組織から RNA を収集し、cDNA を合成しました。 QuantStudio 7 qPCR 装置 (ThermoFisher) で遺伝子特異的プライマー、PowerTrack SYBR Green Master Mix (A46012、ThermoFisher) を使用して、cDNA に対して qPCR 分析を実行しました。 Gapdh プライマーは GGGTGTGAACCACGAGAAATATG および TGTGAGGGAGATGCTCAGTGTTG でした。 Ptger3 プライマーは CAACCTTTTCTTCGCCTCTG および TTTCTGCTTCTCCGTGTGTG でした。 インフルエンザウイルス核タンパク質プライマーは GACGATGCAACGGCTGGTCTG および ACCATTGTTCCAACTCCTTT でした。 Ptger3 および核タンパク質の発現レベルは、Gapdh レベルに対して正規化されました。 正規化は、拡張データ図 4a では 2-ΔCT 法、拡張データ図 9b では 2-ΔΔCT 法 53 によって行われ、非感染コントロールの値を使用した正規化が追加されました。

マウスは、インフルエンザ A ウイルス感染後のさまざまな時点で安楽死させられました。 ０．５Ｍ ＥＤＴＡでコーティングされた針および注射器を使用して心臓穿刺によって全血を収集し、直ちに０．５Ｍ ＥＤＴＡ（５０μｌ）と混合した。 血漿を遠心分離（3,000 rpm、10分間、4℃）によって単離し、上清をELISA分析まで保存（-80℃）した。 BALFを上記のように収集した。 血漿および/またはBALF中のPGE2およびサイトカインレベルを、製造業者の指示に従ってELISA(R&D Systems、PGE2: KGE004B、TNF: DY410-5、IFNγ: DY485-05、IL-6: DY406-05)によって測定した。

NJP 神経節は Gabra1-IRES-cre から急性に収集されました。 lsl-tdTomato マウスを解離溶液 (リベラーゼ (55 mg ml-1、Roche、05401135001)、DNase (0.004%、Worthington、LS002007) を含む解離溶液 (ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)) 中でインキュベートしました (37 °C、90 分間、回転させながら)。 ））。 次に細胞をペレット化し(3分、300g、4℃)、0.2%オボムコイド、0.004%DNase、DMEM、200μlに再懸濁した。 P200 ピペットを使用して、塊が見えなくなるまで細胞を少なくとも 10 回粉砕し、40 μm メッシュのセル ストレーナーで濾過し、再度ペレット化しました (3 分、300 g、4 °C)。 次に細胞を、5 μM C​​albryte 520 AM (20651、AAT Bioquest) を含む培地に再懸濁しました。 フェノールレッドを含まない Neurobasal 培地 (Gibco、12348017) に 1 × B27 (Gibco、17504044)、1 × N2 (Gibco、17502048)、1 × ペニシリンおよびストレプトマイシン (Gibco、15140122) を含む培地。 次に、再懸濁した細胞をラミニンでコーティングしたカバーガラス上にプレーティングし、加湿 CO2 インキュベーター内でインキュベートしました (37 °C、イメージングの少なくとも 30 分前)。 次いで、カバーガラスを、ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)の連続流による入口および出口灌流を備えたチャンバー(Warner Instruments、RC-24N)に移した。 次に、プロスタグランジン E2 (HBSS 中で 1 μM、2 分) および KCl (150 mM、実行終了時) の灌流でカルシウム応答を画像化しました (488 nm)。 GABRA1 陽性ニューロンは、tdTomato 蛍光 (568 nm) によって同定されました。 刺激期間中の平均 Calbryte 520 AM 蛍光がベースライン平均を上回る 3 標準偏差を超えた場合、細胞は応答性があると特定されました。

AGRP ニューロンのファイバー測光は、Synapses ソフトウェア (ビルド: 94-42329P、Tucker-Davis Technology) を使用して、短時間の手動拘束中に PGE2 (腹腔内注射、0.5 mg kg-1) または PBS を急激に注射して、記載されているように実施しました 54。 データはMatlab (R2020a)を使用して分析されました。

グラフ内のデータは平均値±標準誤差として表され、すべてのサンプルサイズと P 値は図の凡例に示されています。 行動実験の統計分析には、マウスごとに示されたパラメーターの毎日の変化の平均が含まれていました（感染後または生存までの 1 ～ 10 日）。 統計的有意性は、Prism 8.4.3 ソフトウェア (GraphPad) を使用して計算され、図の凡例に記載されている統計的検定が含まれました。 拡張データ図 5b のプロビット分析は SPSS, 21 (IBM) を使用して実行されました。 サンプルサイズは、当分野の事前の専門知識と出版物に基づいて選択されており 26,55、図の凡例に開示されています。 動物グループはランダムに割り当てられ、対照動物は実験動物と年齢が一致しました。 同じ研究者が遺伝子型決定と疾病反応の分析を実行したため、遺伝子型や実験グループを無視してデータが生成されたわけではありません。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

個々のマウスからの行動データ ポイントを含む、図の生成に使用されるすべてのデータがソース データとして提供されます。 特定のトランスジェニックマウスや AAV を含む市販されていない可能性のあるすべての試薬は、合理的な要求に応じて自由に入手できるようになります。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

Poon、DC、Ho、YS、Chiu、K.、Wong、HL & Chang、RC 病: サイトカイン、プロスタグランジン、補体因子への焦点からニューロンの視点まで。 神経科学。 生物行動。 改訂 57、30–45 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Saper, CB、Romanovsky, AA & Scammell, TE 酔い症候群中にプロスタグランジンによって関与する神経回路。 ナット。 神経科学。 15、1088–1095 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dennis, EA & Norris, PC 感染症と炎症におけるエイコサノイドの嵐。 ナット。 イミュノール牧師。 15、511–523 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pinho-Ribeiro、FA、Verri、WA Jr.、Chiu、IM 痛みと炎症における侵害受容器感覚ニューロンと免疫の相互作用。 トレンド免疫。 38、5–19 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Funk、CD プロスタグランジンとロイコトリエン：エイコサノイド生物学の進歩。 サイエンス 294、1871–1875 (2001)。

論文 CAS PubMed ADS Google Scholar

シモンセン、L.ら。 インフルエンザの流行が死亡率に及ぼす影響: 重症度指数の導入。 午前。 J. 公衆衛生 87、1944 ～ 1950 年 (1997)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hart, BL 病気の動物の行動の生物学的基礎。 神経科学。 生物行動。 改訂版 12、123–137 (1988)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ザノス、TP 他マウスの迷走神経活動を解読することによるサイトカイン特異的感覚神経信号の同定。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 115、E4843–E4852 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chiu、IM et al. 細菌は、痛みや炎症を調節する感覚ニューロンを活性化します。 Nature 501、52–57 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

McCarthy、MK & Weinberg、JB エイコサノイドと呼吸器ウイルス感染症：炎症と潜在的な治療標的の調整者。 メディエーター・インフラム。 2012、236345 (2012)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Pecchi, E.、Dallaporta, M.、Jean, A.、Thirion, S. & Troadec, JD プロスタグランジンと病気の行動: 古い話、新しい洞察。 生理。 振る舞い。 97、279–292 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

成宮 伸、杉本 裕、牛首 文 プロスタノイド受容体: 構造、特性、および機能。 生理。 改訂 79、1193–1226 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Breyer, RM、Bagdassarian, CK、Myers, SA & Breyer, MD プロスタノイド受容体: サブタイプとシグナル伝達。 アンヌ。 ファーマコル牧師。 有毒。 41、661–690 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ラザラス、M.ら。 正中視索前核の EP3 プロスタグランジン受容体は、発熱反応に重要です。 ナット。 神経科学。 10、1131–1133 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ダンツァー、R. et al. 病気の行動の分子基盤。 アン。 ニューヨークアカデミー。 科学。 856、132–138 (1998)。

論文 CAS PubMed ADS Google Scholar

王、TAら。 マウスの視索前野における温度依存性のPGD2産生による体温調節。 ニューロン 103、309–322.e7 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

オスターハウト、JA et al. 視索前神経細胞集団は、病気時の発熱と食欲を制御します。 Nature 606、937–944 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Jhaveri, KA、Trammell, RA & Toth, LA C57BL/6J マウスの睡眠、運動活動、中核体温および免疫応答に対する環境温度の影響。 脳の行動。 免疫。 21、975–987 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Coulombe, F. et al. 標的プロスタグランジン E2 阻害は、I 型インターフェロンの誘導とマクロファージのアポトーシスを通じて抗ウイルス免疫を強化します。 免疫 40、554–568 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ラウ、J.ら。 タモキシフェン誘導性アドビリン-Cre-ERT2リコンビナーゼマウスを用いた感覚神経節における遺伝子欠失の時間的制御。 モル。 痛み 7、100 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

シスレー、Ｓ．ら。 ニューロンの GLP1R は、リラグルチドの食欲抑制作用を媒介しますが、血糖降下作用は媒介しません。 Ｊ．クリン． 投資する。 124、2456–2463 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

プレスコット、SL、ユーマンズ、BD、ウィリアムズ、EK、ブルスト、RD & リベレス、SD 迷走神経求心性神経の徹底的な遺伝子制御によって明らかにされた気道保護プログラム。 セル 181、574–589.e14 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Prescott、SL & Liberles、SD 迷走神経の内部感覚。 ニューロン 110、579–599 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bai、L.ら。 摂食を制御する迷走神経感覚ニューロンの遺伝的同定。 セル 179、1129–1143.e23 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kupari, J.、Haring, M.、Agirre, E.、Castelo-Branco, G. & Ernfors, P. 迷走神経感覚ニューロンとその分子特殊化のアトラス。 セル担当者 Rev. 27、2508–2523.e4 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baral、P. et al. 侵害受容器感覚ニューロンは、細菌性肺感染症および致死性肺炎における好中球およびガンマデルタ T 細胞の反応を抑制します。 ナット。 医学。 24、417–426 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ミン、S.ら。 動脈圧受容器は、装飾された大動脈の爪を通して血圧を感知します。 Cell Rep. 29、2192–2201.e3 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baba, H.、Kohno, T.、Moore, KA & Woolf, CJ プロスタグランジン E2 によるラット脊髄後角ニューロンの直接活性化。 J. Neurosci. 21、1750–1756 (2001)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

コールリッジ、HMら。 プロスタグランジンによる肺の「刺激物」受容体と求心性C線維の刺激。 ネイチャー 264、451–453 (1976)。

論文 CAS PubMed ADS Google Scholar

Verzele、NAJ et al. 迷走神経気管支肺感覚ニューロンに対するインフルエンザの肺感染と炎症の影響。 FASEB J. 35、e21320 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Mohammed, SP、Higenbottam, TW & Adcock, JJ エアロゾル適用されたカプサイシン、ヒスタミンおよびプロスタグランジン E2 が麻酔をかけられた猫の気道感覚受容体に及ぼす影響。 Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ． 469、51–66 (1993)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Berthoud、HR & Neuhuber、WL 求心性迷走神経系の機能的および化学的解剖学。 オートン。 神経科学。 85、1–17 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

マクガバン、A.E. et al. 新しい条件付き順行性シナプス経シナプスウイルス追跡システムを使用して、気管感覚ニューロン入力を受け取る明確な脳幹回路と前脳回路が明らかになった。 J. Neurosci. 35、7041–7055 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chang、RB、Strochlic、DE、Williams、EK、Umans、BD & Liberles、SD 呼吸を差次的に制御する迷走神経感覚ニューロンのサブタイプ。 セル 161、622–633 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウィリアムズ、EK他。 消化器系の伸びや栄養素を検出する感覚ニューロン。 セル 166、209–221 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ran, C.、Boettcher, JC、Kaye, JA、Gallori, CE、Liberles, SD 内臓感覚の脳幹マップ。 ネイチャー 609、320–326 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Tacchi、L.ら。 鼻免疫は、脊椎動物の粘膜免疫システムの古代の部門です。 ナット。 共通。 5,5205（2014）。

論文 CAS PubMed ADS Google Scholar

タム、VC 他インフルエンザ感染のリピドミクスプロファイリングにより、炎症を誘発および解消するメディエーターが特定されます。 セル 154、213–227 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eccles, R. 風邪とインフルエンザの症状を理解する。 ランセット感染。 ディス。 5、718–725 (2005)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Kiyono, H. & 福山, S. NALT 対パイエル板媒介粘膜免疫。 ナット。 イミュノール牧師。 4、699–710 (2004)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ジョージア州グリーン NSAID の理解: アスピリンから COX-2 まで。 クリン。 コーナーストーン 3、50–60 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Konsman, JP、Luheshi, GN、Bluthe, RM & Dantzer, R. 迷走神経は末梢免疫信号に応答して行動抑制を媒介しますが、発熱は媒介しません。 機能解剖学的分析。 ユーロ。 J. Neurosci. 12、4434–4446 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Sehic, E. & Blatreis, CM モルモットの横隔膜下迷走神経切開によるリポ多糖類誘発発熱の遮断。 脳解像度 726、160–166 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Forstermann, U. & Neufang, B. プロスタグランジン E2 および I2 と比較した、猫の循環からの 6-ケト-プロスタグランジン E1 の除去。 Ｊ．Ｐｈａｒｍ． 薬理学。 35、724–728 (1983)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Divangahi, M.、Desjardins, D.、Nunes-Alves, C.、Remold, HG & Behar, SM エイコサノイド経路は、結核菌に対する適応免疫を制御します。 ナット。 イムノール。 11、751–758 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マサチューセッツ州キャリーら。 シクロオキシゲナーゼ-1 (COX-1) および COX-2 欠損が A 型インフルエンザウイルス感染に対する宿主反応に与える対照的な影響。 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 175、6878–6884 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ワン、A.ら。 細菌性およびウイルス性炎症における組織耐性に対する絶食代謝の反対の効果。 セル 166、1512–1525.e12 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ラオ、S.ら。 病原体を介した食欲不振の抑制は、宿主の生存と伝染を促進します。 セル 168、503–516.e12 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang、C.ら。 吐き気に関連した行動を媒介する領域後領域の細胞タイプ。 ニューロン 109、461–472.e5 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Freeman, AJ、Cunningham, KT & Tyers, MB 5-HT3 受容体拮抗薬の選択性と制吐作用のメカニズム。 抗癌剤 3、79–85 (1992)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

クラッシェス、MJ 他空腹感を引き起こす興奮性室傍核から AgRP ニューロン回路へ。 Nature 507、238–242 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Hanson, LR、Fine, JM、Svitak, AL & Faltesek, KA 覚醒したマウスへのCNS治療薬の鼻腔内投与。 J.Vis. 経験値 https://doi.org/10.3791/4440 (2013)。

Livak, KJ & Schmittgen, TD リアルタイム定量 PCR と 2(-ΔΔCT) 法を使用した相対的な遺伝子発現データの分析。 方法 25、402 ～ 408 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ホリオ、N. & リベレス、サウスダコタ州 飢餓は、神経ペプチド Y のスポットライトを通じて食べ物の匂いへの魅力を高めます。 Nature 592、262–266 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Ilanges、A. et al. 脳幹 ADCYAP1+ ニューロンは、病気の行動のさまざまな側面を制御します。 Nature 609、761–771 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

野々村和也ほか Piezo2 は気道の伸びを感知し、肺の膨張によって引き起こされる無呼吸を仲介します。 ネイチャー 541、176–181 (2017)。

論文 CAS PubMed ADS Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

Ptger3flox マウスと原稿へのコメントについて C. Saper に感謝します。 漫画は BioRender.com を使用して作成されました。 この研究は、NIH (DP1 AT009497 および R01 HL132255) からの助成金と、SDL へのチャン ザッカーバーグ イニシアチブ、N.-RB へのバンティング博士研究員フェローシップ、NHSLP へのハーバード大学医学部ゴールドバーグ フェローシップによって支援されました。ハワード・ヒューズ医学研究所の研究者です。

サラ・L・プレスコット

現在の住所：米国マサチューセッツ州ケンブリッジ、マサチューセッツ工科大学生物学部

ハワード・ヒューズ医学研究所、ハーバード大学医学部細胞生物学科、ボストン、マサチューセッツ州、米国

ナリョム・ビン、サラ・L・プレスコット、ナオ・ホリオ、ヤンダン・ワン、スティーブン・D・リベレス

米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバード大学医学部免疫学部

アイザック・M・チウ

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

N.-RB、SLP、NH、IMC、および SDL は実験を計画しました。 N.-RB、NH、SLP、YW が実験を行いました。 N.-RB、SLP、NH、IMC、SDL の分析データ。 N.-RB と SDL が原稿を書きました。

Stephen D. Liberles への通信。

SDL は Kallyope, Inc. のコンサルタントです。他の著者は競合する利益を宣言していません。

Nature は、この研究の査読への貢献について、Alice McGovern、Ruslan Medzhitov、Kevin Tracey に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

ａ、行動実験の統計分析には、ここで棒グラフで表されているように、マウスごとに示されるパラメータ（感染後１〜１０日または生存期間中）の毎日の変化を平均することが含まれた。 統計値は図 1a のものと同じです。 b、血漿（左、中央）およびBALF（右）中のPGE2レベルは、A型インフルエンザウイルス（赤、青）またはビヒクル対照（黒）への曝露後に示された時点でELISAによって測定されました。 一部のウイルス感染マウス (青) には、感染の 3 日前から飲料水中のイブプロフェン (1 mg/ml) を自由摂取させた (左) か、毎日のアスピリン投与 (IP、20 mg/kg) を追加しました。平均± sem、n: 1 群あたり 3 匹のマウス、*** 二元配置分散分析とそれに続く赤と黒の曲線 (赤い星) または赤と青の曲線 (青い星) の間で比較を行うボンフェローニの多重比較検定による p < 0.0005。 b の p 値は、示されたすべての星について <0.0001 です。

ソースデータ

a、示された用量（mg/kg）でPGE2（左：IP、右：鼻腔内）を投与され、食物に自由にアクセスできるようにした（1時間）絶食マウスによる食物摂取、平均±sem、n：9（左）グループあたりのマウス、28 (ビヒクル)、10 (0.0625、0.125、0.25)、20 (0.5) インチ (右)、***p < 0.0005、**p < 0.005、*p < 0.05、ns: 有意差なし二元配置分散分析 Tukey の多重比較検定。 b、EP3受容体アゴニストであるスルプロストンを示された用量(mg/kg)で投与し、食物を自由に摂取させた(1時間)絶食マウスによる食物摂取、平均±sem、n: 1 グループあたり 8 匹のマウス、二元配置分散分析 Tukey の多重比較検定 (左) または両側対応のない t 検定 (右) による ***p < 0.0005、* p < 0.05。 c、GCaMP6s蛍光（ΔF/F）は、PGE2（PBS中0.5mg/kg）またはビヒクル単独（PBS）のIP注射の前後に、ファイバー測光法によって弓状核のAGRPニューロンで測定されました。 (上) 応答は、10 分の時間間隔で行われた測定の平均として示されています (たとえば、10 は 0 から 10 分の間で行われた測定の平均を指します)、平均 ± 標準誤差、n: 1 グループあたり 12 匹のマウス、**ボンフェローニの多重比較検定による二元配置分散分析による p < 0.01、***p < 0.001、(下) 注射時間を示す赤いバーが付いた代表的な記録トレース。 aのp値は左から右へ：IP：<0.0001、0.0005、<0.0001、鼻腔内：<0.0001、0.0455、0.0008、0.6630。 b、IP: <0.0001、0.0312、0.0187、鼻腔内: <0.0001。 c: <0.0001、<0.0001、0.0045。

ソースデータ

a、flox-Ptger3 および Gabra1-ires-Cre における深部体温。 flox-Ptger3 マウスは、インフルエンザ ウイルス (赤、青) または生理食塩水 (黒) の投与後、直腸プローブ (左) またはラジオテレメトリー (右) を使用して毎日測定されました。平均 ± 標準誤差、n: 6 (左) および 3 (右)グループあたりのマウス、***一元配置分散分析ダネット多重比較検定による p < 0.0005 (左)。 ***p < 0.0005 右の両側対応のない t 検定によると、行動/生理学的分析 (右)、赤と黒の曲線 (赤の星) または赤と青の曲線 (青の星) の比較については図 1 に詳述されています。 ）。 右側のデータでは、3 匹のコントロール flox-Ptger3 マウスのうち 2 匹が 5 日目に死亡したため、その後のデータは破線で表され、統計分析は 1 ～ 4 日目のデータに対してのみ実行されました。 b. マウスには、パラダイム全体を通じて、アスピリン (IP、20 mg/kg)、赤またはビヒクル単独 (黒) を毎日注射しました。 3日後、マウスをA型インフルエンザウイルスに感染させ、その後示されているようにモニタリングしました。平均値±標準誤差、n:1グループあたり6匹のマウス、***対応のない両側t検定によるp < 0.0005（行動については図1に詳述） /生理学的分析、生存分析のログランク (マンテル-コックス) 検定による *p < 0.05。 a の p 値、左: 赤 <0.0001、青 0.0003、右: <0.0001。 b、左から右: <0.0001、<0.0001、<0.0001、<0.0001、0.0243。

ソースデータ

a、flox-Ptger3（白）、Nestin-Creの視床下部（左）またはNJP神経節（右）におけるPtger3発現のqPCR分析。 flox-Ptger3 (赤)、および Phox2b-Cre。 flox-Ptger3 (青色) マウス。 Phox2b-Cre マウスは、結節および錐体ニューロンで Cre 発現を示しますが、頸静脈ニューロンでは発現しません 56。 Ptger3 転写レベルは、Gapdh 発現レベルに正規化した後に表しました、平均 ± sem、n: flox-Ptger3 については 6 匹のマウス、他のグループについては 3 匹、***p < 0.0005、ns: 一元配置 ANOVA ダネット多重比較検定では有意ではありません。 b、flox-Ptger3対照マウスは、Advillin-CreERの場合と同様に、タモキシフェンあり（右）またはなし（左）で5日間連続して治療されました（IP、70 mg/kg）。 flox-Ptger3 マウス。 少なくとも 1 週間後、マウスをインフルエンザ A ウイルス (赤) または生理食塩水 (黒) に曝露し、示されているようにモニタリングしました。平均値±標準誤差、n: 1 群あたり 6 匹のマウス、***p < 0.0005 (両側不対応 t 法による) - 行動/生理学的分析については図 1 に詳述されているテスト、生存分析についてはログランク (マンテル-コックス) 検定による *p < 0.05。 a の p 値、左: <0.0001、0.7506、右: 0.8680、<0.0001; b 上から下、左: <0.0001、<0.0001、<0.0001、<0.0001、0.0179、右: <0.0001、0.0003、<0.0001、0.0179。

ソースデータ

ａ、野生型マウスを示された力価でＡ型インフルエンザウイルスに感染させ、その後の生存を毎日モニターした、ｎ：１群あたり１０匹。 b、R2 = 0.926の非線形フィットによるウイルス力価(log10)対生存率の用量反応曲線。 c、プロビット回帰分析によって決定された推定致死率%とともに、さまざまなA型インフルエンザウイルス接種用量に対する生存率を示す表(統計製品およびサービスソリューション)。 d、アドビリン-CreER。 示されている flox-Ptger3 マウス (赤色、タモキシフェンを事前に注射済み) または flox-Ptger3 マウス (黒色) は、亜致死量のインフルエンザ A ウイルス (上: 105 EID50 または LD21、下: 105.5 EID50 または LD39) に感染し、示されているように毎日モニタリングされました。 、平均±標準誤差、n: グループあたり 6 匹のマウス、***行動/生理学的分析について図 1 に詳述した対応のない両側 t 検定により p < 0.0005、*p < 0.05、ns: 対数では有意ではない-生存分析のためのランク (マンテル-コックス) 検定。 d の p 値は左から右、上：<0.0001、<0.0001、0.0002、<0.0001、0.4788。 下: <0.0001、<0.0001、0.0004、0.0004、0.0078。

ソースデータ

a、flox-Ptger3マウスのNJP神経節へのAAV-Creの両側注射を示す漫画。 b、flox-Ptger3 マウスの NJP 神経節に AAV-Cre (下) または生理食塩水 (コントロール、上) を両側に注射し、その後 NJP 神経節の凍結切片を 2 色 RNA in situ ハイブリダイゼーションによって調べて Phox2b (緑色) を検出しました。および Ptg​​er3 (赤)、スケール バー: 100 μm。 画像は 3 つの独立した実験からの代表的なものです。 パート a は BioRender.com で作成されました。

Phox2b-Cre; flox-Ptger3 マウス (赤) または flox-Ptger3 マウス (黒) を亜致死量のインフルエンザ A ウイルス (上: 105 EID50 または LD21、下: 105.5 EID50 または LD39) に感染させ、示されているように毎日モニタリングしました (平均 ± sem、n) : 1 グループあたり 6 匹のマウス、**p < 0.005、**p < 0.0005、行動/生理学的分析については図 1 に詳細を示す両側対応のない t 検定による、*p < 0.05、ns: 対数では有意ではない-生存分析のためのランク (マンテル-コックス) 検定。 p 値は上から左下まで: <0.0001、<0.0001、<0.0001、0.0002、0.4524。 右: <0.0001、<0.0001、<0.0001、0.0002、0.0155。

ソースデータ

a、図3のマウスにおけるインフルエンザ感染後の水分摂取量の変化、平均±sem、n: 8 (Piezo2-ires-Cre)、6-8 (Phox2b-Cre; 8 対照および6 Phox2b-Cre)、6 (Pdyn) -ires-Cre)、1 グループあたり 6 匹の (Oxtr-ires-Cre)、および 10 匹の (Gabra1-ires-Cre) マウス、***p < 0.0005、ns: で詳述されている対応のない両側 t 検定では有意ではありません。行動・生理学的分析の図1。 b、Trpv1 発現を示す、迷走神経および舌咽頭感覚神経節の公表された単一細胞トランスクリプトーム データ 22 に由来する均一多様体近似投影 (UMAP) プロット (赤色の陰影: 自然対数スケール)。 c、Trpv1-ires-Cre。 flox-Ptger3 マウス (青) または flox-Ptger3 マウス (黒) をインフルエンザ A ウイルスに感染させ、示されているように毎日モニタリングしました。平均±標準誤差、n: 1 群あたり 6 匹のマウス、ns: 対応のない両側 t 検定では有意ではありません。行動/生理学的分析については図 1 で詳述されているように、ns: 生存分析のログランク (マンテル-コックス) 検定では有意ではありません。 a: 0.9101、0.0004、0.0534、0.9544、<0.0001、および c: 0.2485、0.0705、0.0888、0.1801、0.8412 の p 値は上から下にあります。

ソースデータ

a、血漿（左）およびBALF（右）中のPGE2レベルは、A型インフルエンザウイルスまたはPBS対照への曝露後のさまざまな時点で示されたマウスのELISAによって測定されました、平均±sem、n：1グループあたり5匹のマウス、ns：有意ではありませんインフルエンザウイルス感染グループの分析を含む二元配置分散分析による。 b、flox-Ptger3およびGabra1-ires-Creの上気道および下気道におけるウイルス核タンパク質（NP）転写レベルのqPCR分析。 インフルエンザウイルス感染後の flox-Ptger3 マウス、Gapdh および非感染コントロールに対して正規化、平均値 ± sem、n: 1 グループあたり 5 匹のマウス、***p < 0.0005 二元配置分散分析とそれに続くボンフェローニの多重比較検定により、赤色と非感染の対照の間で行われた比較青い曲線 (青い星) または黒と緑の曲線 (緑の星)。 c、BALF中のIFNγ、TNFα、およびIL-6のレベルは、flox-Ptger3（黒）またはGabra1-ires-CreにおけるA型インフルエンザウイルスへの曝露後に示された時点でELISAによって測定されました。 flox-Ptger3 (赤)、平均値±標準誤差、n: グループあたり 3 匹のマウス、二元配置分散分析とそれに続く赤と黒の曲線 (赤い星) の間で行われた比較によるボンフェローニ多重比較検定による p < 0.0005。 a の p 値: 0.1591、0.0662、b および c: 示されたすべての星について <0.0001。

ソースデータ

a、Gabra1-ires-cre由来のNJP神経節のホールマウント調製物におけるネイティブGFP蛍光シグナル。 lsl-L10 GFP、スケールバー: 200 μm。 b、Gabra1-ires-CreマウスのNJP神経節にCre依存性AAV-flex-APまたはAAV-flex-tdTomatoを両側に注射し、比色アルカリホスファターゼ基質のいずれかを使用して固定ホールマウント組織標本で軸索を視覚化しました（上の2行、下の 2 行の左の画像）または tdTomato 免疫染色（下の 2 行の右 2 つの画像）。 スケール バー (左から右へ) 上の行: 500、1000、1000 (挿入図: 250) μm。 2列目：500、1000、500μm。 3列目：200、50μm。 最下段：200、100μm。 画像は、GFP と tdTomato を含む 3 つの独立した実験と、アルカリホスファターゼを含む 2 つの独立した実験の代表です。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Bin, NR.、Prescott, SL、Horio, N. 他気道から脳への感覚経路は、インフルエンザ誘発性疾患を媒介します。 ネイチャー 615、660–667 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-023-05796-0

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 4 月 13 日

受理日: 2023 年 2 月 3 日

公開日: 2023 年 3 月 8 日

発行日: 2023 年 3 月 23 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05796-0

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティ ガイドラインに従うことに同意したことになります。 虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。