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Oct 22, 2023

DNA 配列とクロマチン修飾因子が協力してインプリンティング制御領域にエピジェネティックな双安定性を与える

Genetica della natura, volume 54,

Nature Genetics volume 54、pages 1702–1710 (2022)この記事を引用

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53 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ゲノムインプリンティングは、インプリンティング制御領域 (ICR) の親特異的な DNA メチル化によって制御されます。 同一の DNA 配列にもかかわらず、ICR は 2 つの異なるエピジェネティックな状態で存在でき、これらの状態は無制限の細胞分裂を通じて記憶され、生殖系列形成中にリセットされます。 ここでは、このエピジェネティックな双安定性の遺伝的およびエピジェネティックな決定要因を体系的に研究します。 ICRおよび関連するDNA配列をマウスゲノム内の異所性位置に反復的に組み込むことにより、我々はまず、胚性幹細胞におけるエピジェネティックな状態の維持に必要なDNA配列の特徴を同定する。 ICR の自律的調節特性により、DNA メチル化感受性レポーターを作成し、そのエピジェネティック記憶の調節に関与する主要なコンポーネントをスクリーニングすることがさらに可能になりました。 DNMT1、UHRF1、ZFP57に加えて、メチル化状態から非メチル化状態への切り替えを妨げる因子を同定し、これらの候補のうちの2つであるATF7IPとZMYM2が、胚性幹細胞のICRにおけるDNAとH3K9のメチル化の安定性に重要であることを示した。

遺伝子活性のエピジェネティックな制御は、DNA 複製中に維持される複数層のクロマチン修飾に依存します 1,2。 定義上、これらのエピジェネティックなメカニズムは、それらが占めるゲノム部位の DNA 配列とは独立して作用します。 しかし、いくつかの研究では、クロマチン修飾の制御と維持に対する DNA 配列の寄与が強調されており、遺伝子活性のエピジェネティック制御と遺伝的制御の明確な区別が妨げられています 3、4、5、6、7、8。 ゲノムインプリンティングはエピジェネティックな現象であり、母方または父方の ICR 上の DNA メチル化マークが、cis9、10、11 の転写物の親特異的な活性を決定します。 ICR は、卵母細胞または精子から親特異的な DNA メチル化マークを継承し、それが次世代のすべての体細胞組織に伝播されます 9。 同一の DNA 配列、同一の染色体の位置、および核内の同じ調節因子への曝露にもかかわらず、親染色体上で異なるエピジェネティックな状態が継承されるため、ICR は DNA 配列とクロマチン修飾のエピジェネティック記憶に対する個々の寄与を研究するための優れたモデルになります。

ICR での DNA メチル化の維持を調節するいくつかの要因と機構が特定されています。 メチル化マークが生殖系列に沈着すると 12、維持メチルトランスフェラーゼ DNMT1 とその付属タンパク質 UHRF1 が DNA 複製中のメチル化の維持を担当します 13。 さらに、SETDB1、KAP1、G9A など、DNA メチル化 ICR で H3K9me3 を制御するいくつかの因子が同定されています14、15、16。 重要なことです。 KRAB ジンクフィンガー因子 ZFP57 は、メチル化ヘキサヌクレオチド DNA 配列 TGCmCGC に結合し、KAP1 およびその他の関連因子を動員して、ICR における DNA メチル化と H3K9me3 との間のフィードバックを確立します。 実際、ZFP57 の結合と KAP1 の動員は、マウスにおける Zfp57 のノックアウト (KO) によってほぼすべてのインプリントが失われ、胎児致死性が生じるため、インプリントを制御する際の重要なステップであり 18、19、20、ZFP57 は DNA メチル化と細胞システムの ICR における H3K9me3 16、18、21。

ICR での DNA およびヒストンのメチル化を制御する因子は広く研究されていますが、ICR の DNA 配列特性は詳細には調査されていません。 さらに、追加の主要なプレーヤーがICRでのエピジェネティックな維持に貢献しているかどうかも不明です。 我々は、ICR DNA配列をマウス胚性幹細胞（mESC）の同じゲノム部位に反復的に組み込むことにより、ICRが内因性の位置で観察されるエピジェネティックな状態を再現できる自律的な遺伝要素であることを示した。 この設定を使用して、DNA メチル化を事前設定することで、異所性 ICR によって忠実に伝播される 2 つの相反するエピジェネティックな状態を確立できることを示します。 この DNA メチル化依存性スイッチは ICR に特有のものです。 バリアントおよび合成 ICR を体系的に統合することにより、このスイッチのような動作に必要かつ十分な配列要件を特定することができました。 さらに、機能喪失型遺伝子スクリーニングにおいて異所性ICRをDNAメチル化感受性レポーターとして使用することにより、DNMT1、UHRF1およびZFP57がゲノムインプリンティングの中核となるエピジェネティック調節因子であることを確認した。 さらに、ICR でのエピジェネティックな状態の維持の制御に関与する因子として ATF7IP と ZMYM2 を特定しました。

我々は、ICRのDNA配列には、親対立遺伝子で観察される明確なエピジェネティックな状態を確立および維持するのに十分な情報が含まれているはずであると仮説を立てました（拡張データ図1a）。 Airn、Kcnq1ot1、Zrsr1、およびH19インプリンティングクラスターから4つのICRを選択し、リコンビナーゼ媒介カセット交換（RMCE3）を使用して、それらをmESCのゲノムに個別に統合しました（図1a）。 ICRの異なるDNAメチル化状態を模倣するために、非メチル化ICRと細菌のCpGメチルトランスフェラーゼM.SssIによって事前メチル化されたICRに対してRMCEを並行して実行しました（図1aおよび拡張データ図1b）。 制御配列として、分化中にのみ示差的な DNA メチル化を獲得するプロモーターである Igf2r DMR (示差的メチル化領域) を使用しました 22。 さらに、同じRMCE部位に組み込まれた場合にde novo DNAメチル化から保護されることが以前に示されている不活性遺伝子プロモーターのセット（Hes3、Tcl1、およびSyt1）を含めました3（図1b）。

a、RMCEを使用したメチル化または非メチル化ドナープラスミドによる安定な細胞株生成の実験概要。 b、すべての統合されたICR、コントロールDMR、およびプロモーター配列のメチル化分析の表の概要。 内因性メチル化 (Endog. meth.) は、mESC における内因性遺伝子座のメチル化状態を表します。 Mat.、母親のメチル化。 特許、父性メチル化。 該当なし、メチル化なし。 サイズ、CpG 密度 (100 bp 単位)、および GC 含量 (%) が表示されます。 bsPCRによって測定されたRMCEを介して組み込まれたDNA配列の総メチル化パーセンテージを、非メチル化(-M.SssI)および事前メチル化(+M.SssI)ドナープラスミドを使用した実験について示します。 該当なし、未定。 アスタリスクは、Lienert et al.3 から得られた測定値を示します。 c、異所性 Airn ICR の詳細なメチル化分析。 Airn ICR 配列内の CpG 位置は黒い縦線で示されています。 bsPCR の増幅領域が示されており、単一分子の測定値はメチル化 CpG ジヌクレオチドに対応する黒丸および非メチル化 CpG ジヌクレオチドに対応する白丸として示されています。 「x」でマークされた CpG 位置は、配列決定エラーにより整列されていないヌクレオチドに対応します。 集約されたメチル化値は、それぞれの CpG 位置に色分けされた垂直線として表示されます。 d、遺伝子間部位と比較した異所性および内因性ICRでのChIP-qPCR測定。 H3K9me3、青。 H3K4me2、オレンジ。 データ ポイントは個々の技術的複製を示します。

組み込みが成功した後、亜硫酸水素塩変換 PCR (bsPCR) によって RMCE 部位の DNA メチル化を測定しました。 4つのICRはすべて、異所性部位で事前に確立されたDNAメチル化状態を維持しましたが、場合によっては、非メチル化ICRでの小規模な新規メチル化が観察されました（図1b、cおよび拡張データ図1c〜e）。 対照的に、Igf2r DMRおよびコントロールプロモーターエレメントでは、事前に確立されたDNAメチル化の維持は観察されませんでした（図1bおよび拡張データ図1f-i）。 異所性 Airn ICR における異なる DNA メチル化状態は、20 継代を超える mESC の長期培養後、またはゲノム内の異なる RMCE 位置への組み込み後、また、mESC の神経前駆細胞への in vitro 分化後も安定に維持されました (拡張データ)図 2a ～ c​​)。 さらに、ナイーブ幹細胞状態の獲得により 5-メチルシトシンが全体的に減少したにもかかわらず、異所性 Airn ICR の DNA メチル化は、2i 培地で 10 日間 mESC を培養した後も高レベルで維持されました 23,24,25,26 (拡張)データ図 2a、d)。

DNAメチル化に加えて、内因性ICRはさらに異なるヒストン修飾を示し（拡張データ図1a）、それによりメチル化ICRはH3K9me3によって修飾され、非メチル化ICRはH3K4me2によって修飾されます（参考文献14、22、27）。 H3K9me3およびH3K4me2に対してクロマチン免疫沈降（ChIP）定量的PCR（qPCR）を実行し、AirnおよびKcnq1ot1 ICRのRMCE統合におけるこれらのマークの濃縮を内因性対応物と比較しました（図1d）。 RMCE部位の非メチル化ICRはH3K9me3の欠如とH3K4me2の増加を示しましたが、事前メチル化ICRは逆のパターンを示し、H3K9me3の増加とH3K4me2の欠如を示しました（図1d）。 以前の研究では、DNA メチル化特異的な KRAB-Znf タンパク質 ZFP57 が、内因性 ICR での DNA メチル化および H3K9me3 の維持に必要であることが特定されました 16、18、21。 mESCにおけるZfp57のCRISPR-Cas9欠失により、異所性部位と内因性部位の両方でDNAメチル化が急速かつ完全に失われるため、この制御は異所性ICRで再現されます（拡張データ図2e）。

私たちは、ICR DNA 配列がエピジェネティック記憶に必要かどうかをテストすることにしました。 まず、小さなICRフラグメントも事前に設定されたDNAメチル化パターンを効率的に記憶するかどうかを確認することを目的とし、Airn ICRの4つの小さなフラグメントを使用して同じ実験を繰り返しました（図2aおよび拡張データ図2f）。 試験したフラグメントのいずれも、示差的なメチル化維持を忠実に再現できませんでした。 父親的にメチル化されたH19 ICRでも同じことが観察されました（拡張データ図2g、h）。 非ICR調節領域（プロモーター、CpGアイランドまたはエンハンサー）に焦点を当てたこれまでの研究では、CpG密度、GC含有量および/またはヌクレオチド配列がDNAメチル化パターンの確立に影響を与える可能性があることが明らかになりました3、4、5、6。 CpG 密度と GC 含有量に基づいて、ここでテストした ICR は、非メチル化 CpG アイランド プロモーターと重複するゲノム要素の範囲内にあります (拡張データ図 3a)。 ICRのCpG密度とGC含量がメチル化状態と非メチル化状態の維持に寄与しているかどうかを調べるために、サイズ、GC%、CpG数、分布においてAirn ICRと非常に類似している4つのゲノム領域を選択しました（拡張データ図1）。 3b–d)。 これらの「Airn様」エレメントは、異なるメチル化を維持できず、内因性の対応物と同様に低メチル化状態を採用しており、DNA配列の長さ、CpG密度、GC含量が2つの異なるエピジェネティック状態を確立するには十分ではないことを示唆しています（拡張データ図3e、 f）。

a、すべての Airn-ICR フラグメントのメチル化分析の表の概要を左側に概略的に示します。 さらに、各フラグメントのフラグメント長、CpG 密度、および GC 含有量が示されています。 図 1b と同じ表現。 b. シャッフルされた Airn ICR のメチル化分析。 図 1c と同じ表現。 「x」でマークされた CpG 位置は、配列決定エラーにより整列されていないヌクレオチドに対応します。 c、内因性Airn ICRと比較した、異所性部位におけるシャッフルAirn ICRでのChIP-qPCR測定。 データ ポイントは個々の技術的複製を示します。 H3K9me3、青。 H3K4me2、オレンジ。 ｄ、再構成されたＺＦＰ５７結合部位を有するシャッフルされたＡｉｒｎ ＩＣＲのメチル化分析。 パネル b と同じ表現。 e、マウス赤白血病（MEL）細胞に組み込まれたシャッフルAirn ICRのメチル化分析は、DNAメチル化の維持を示します。

CpGおよびGC含量からDNA配列の直接的な要件をさらに区別するために、Airn ICR配列に基づいて合成DNA要素を生成し、78％の不一致に達するまでCpG間のDNA配列を並べ替えました（拡張データ図4a、 b）。 重要なのは、元の配列の順列では、局所的な GC 内容と元の CpG の数と位置が保持されていることです。 この置換により、CpG 間の DNA 配列情報がすべて削除され、CpG の頻度と分布から DNA 配列の寄与を区別できるようになりました。 この「シャッフルされた」Airn ICRを使用してRMCE実験を繰り返したところ、事前に設定されたエピジェネティックな状態を維持できないことが観察されました（図2b）。 どちらの場合も、DNAメチル化は、非メチル化挿入では40.3％、事前メチル化挿入では23.5％の中間値に達し、メチル化パターンは乱れていました（図2b）。 配列の変化により、あらかじめ設定されたメチル化状態とは無関係に、RMCE部位でのH3K9me3およびH3K4me2の確立がさらに減少しました（図2c）。

Airn ICR の CpG 間 DNA 配列のシャッフリングにより、すべての ZFP57 結合モチーフが破壊されました。これは、BPNet28 を使用した、野生型およびシャッフルされた Airn ICR 配列に対する ZFP57 の結合のインシリコ評価と一致して、観察された維持の欠如を説明する可能性があります (拡張データ図 4c、d)。 したがって、ZFP57 モチーフがエピジェネティックな状態の維持に十分であるかどうかを調査したいと考えました。 したがって、シャッフルされたICRのZFP57結合モチーフを復元し（拡張データ図4e）、このメチル化および非メチル化DNA要素をmESCのRMCE部位に導入しました。 非メチル化バージョンは低メチル化状態を維持できませんでしたが、事前メチル化されたICRは完全に過剰メチル化状態を維持することができました（図2d）。 これらの観察を考慮すると、特に Zfp57 遺伝子発現は組織特異的であるため、ZFP57 結合部位の要件は細胞の状況に依存するのではないかと考えました 18,29。 したがって、我々は、シャッフルされた Airn ICR を RMCE コンピテントマウス赤白血病 (MEL) 細胞に導入し 30、標的重亜硫酸塩シーケンシングを実行しました。 メチル化および非メチル化シャッフルICRは両方とも、事前に設定されたDNAメチル化パターンを保持しており（図2e）、MEL細胞ではCpG含有量がDNAメチル化状態の記憶に十分であることを示しています。

内因性 ICR は、DNA メチル化状態に基づいて近くの転写産物の対立遺伝子発現を決定するシス制御要素です9。 我々はまず、ICR配列がRMCE部位に一緒に組み込まれた場合に、DNAメチル化の存在下で3つの異なるレポーター構築物をサイレンシングできるかどうかをテストしたいと考えました（図3aおよび拡張データ図5a）。 我々は、一般的に使用される3つの構成的プロモーター（pCAGGS、hEF1alpha、およびhPGK）を選択し、それらがICRの非存在下でもRMCE組み込み部位でGFPレポーターの発現を維持できることを示しました（拡張データ図5b）。 次に、同じRMCE組み込み部位でこれらのプロモーターを安定して抑制する3つのメチル化ICR（Airn、Kcnq1ot1、およびPeg10）の能力を測定しました（図3b）。 試験したすべての ICR 配列は、Ef1alpha および hPGK プロモーターと組み合わせて安定した抑制を示しました。 対照的に、ICR を持たないメチル化プロモーター、または DNA メチル化依存的に調節されることが知られている Dazl プロモーターと組み合わせたメチル化プロモーター 31 は、抑制状態を維持できませんでした (図 3b)。 合成 pCAGGS プロモーターは、使用した ICR に応じてさまざまな結果をもたらし、この複合プロモーターの強度が一部の ICR によって誘導されるエピジェネティックな抑制を克服できることを示唆しています (図 3b)。 16、23、および30日後の複数のクローン由来集団におけるGFP活性によって測定されるように、DNAメチル化依存性の抑制は、より長期間にわたって維持された(拡張データ図5c)。 同じメチル化 ICR 依存性抑制が、父性メチル化 H19 ICR でも観察されました (拡張データ図 5d)。

a、RMCEを使用したレポーター細胞株生成の概略図と実験概要。 b、異なるプレメチル化ICR/プロモーターの組み合わせによるトランスフェクション12日後のGFP発現のフローサイトメトリー分析。 各データ ポイントは、クローン由来の細胞集団から測定された GFP 陽性細胞の割合を示します。 c、フローサイトメトリー分析は、野生型、シャッフルAirn ICR、またはpEF1aプロモーターと組み合わせて再構成されたZFP57部位を有するシャッフルAirn ICRを含むメチル化または非メチル化RMCEドナープラスミドを回収する独立した細胞株におけるGFP陽性細胞の割合を示します。 GFP 活性は 2 つの連続した時点 (16 日と 23 日) で測定されました。 d、DNAメチル化阻害剤GSK-3484862で2日間処理した後のメチル化Airn-CAGレポーターを有する3つの独立したクローン、および未処理およびDMSO対照のフローサイトメトリー分析。 レポーターサイレンシングの復帰をテストするために、薬物の洗い流しから7日後に測定を繰り返した。 パネル b と同じ表現。

この設定により、ICR のサイレンシング潜在力に対する DNA メチル化と配列の寄与をテストすることができました。 このために、我々は、非メチル化挿入された場合にはGFP発現の安定した維持を示し、メチル化された挿入された場合には安定したサイレンシングを示すAirn-pEF1a-GFPレポーターコンストラクトを利用しました（図3c）。 Airn ICRをシャッフルAirnバージョンに置き換えたところ、測定したクローンのほとんどで16日後にすでにサイレンシングの消失が観察され、長期培養後にはさらにサイレンシングの消失が観察されました。これは、シスにおけるメチル化依存性のサイレンシングには無傷のICR配列が必要であることを示唆しています（図1）。 3c）。 最後に、再構成された ZFP57 結合部位を含むシャッフルされた Airn 配列を導入しました。 非メチル化バージョンは転写活性の確率的損失を引き起こしたが、メチル化構築物は複数世代にわたって近くのプロモーターの安定した抑制を引き起こしたことから、ZFP57結合はICRにおけるエピジェネティック記憶の維持に必要であるだけでなく、エピジェネティックサイレンシングにも十分であることが示されたシスでは（図３ｃ）。

ICR の DNA メチル化が近くのプロモーターの抑制に必要かどうかをテストするために、確立されたレポーター細胞株を 2i および 2i + ビタミン C 培地で培養してチャレンジしました。 どちらの条件もゲノム全体の DNA メチル化レベルを低下させます 23、24、25 が、ビタミン C を添加すると、ICR および反復要素から DNA メチル化がさらに除去されます 26、32。 GFP 抑制は 2i 培地で維持されました。 ただし、2i + ビタミンCの存在下では抑制は徐々に失われました（拡張データ図5e-g）。 ICRレポーターでの抑制状態を維持するためのDNAメチル化への依存性をさらにテストするために、一般的なDNAメチル化維持因子Uhrf1およびDnmt1のKO実験を実行しました（参考文献33）。 予想通り、これらの KO 細胞における DNA メチル化の除去により、7 日以内に ICR レポーターが再活性化されました (拡張データ図 6a、b)。 これらのアッセイで GFP 再活性化を示す細胞の割合が低いのは、CRISPR 標的細胞プールにおける KO 効率が低いためです。 したがって、DNMT1阻害剤GSK-3484862（参考文献34）の存在下でAirn-ICRレポーターを2日間培養しました。 GFPを発現する細胞の95％以上で完全な再活性化が観察されました（図3dおよび拡張データ図6c）。 この DNMT1 阻害剤を使用すると、再活性化が可逆的であるかどうかをテストすることがさらに可能になりました。 したがって、GSK-3484862を培地から除去し、ウォッシュアウト後さらに7日間培養を継続しました（図3dおよび拡張データ図6c）。 活性化されたレポーターの回復は観察されませんでした。これは、ICR のスイッチが一度オンになると、サイレント状態に戻ることができないことを示しています。

複数の ICR 特異的レポーター細胞株を樹立した後、ICR の抑制状態の維持に必要なタンパク質をスクリーニングしたいと考えました。 まず、6,204のガイドRNAを含む1,051のクロマチン関連因子に対するターゲットライブラリ（ChromMMライブラリ）と、pCAGGS-Airnレポーター細胞株の500の非ターゲティングガイドを含むコントロールライブラリを使用して、CRISPRスクリーニングワークフローを確立しました（図4aおよび拡張データ）図 7a)、陽性クローンを収集する時点を決定しました (拡張データ図 7b)。 3つのメチル化ICRレポーター株（Airn、Kcnq1ot1およびPeg10）でスクリーニングを実行し、8日後にGFP陽性細胞を収集し、感作2i培地条件でAirn、Kcnq1ot1のスクリーニングを繰り返しました（拡張データ図7c、d）。

a、複数のプレメチル化ICRレポーターを使用した標的CRISPRスクリーニングの実験概要。 ゲーティング戦略については、拡張データの図 7a と方法で説明されています。 b、血清条件で増殖させた3つのICRレポーター細胞株におけるCRISPRスクリーニングからのヒットの概要。 青い点は、MAGeCK RRA (ロバスト ランク アグリゲーション) を使用して計算された P 値 < 0.01 の遺伝子を示します。 破線は、0.05 の P 値閾値を示します。 c、すべての CRISPR スクリーニングからの潜在的な候補を示すヒートマップ。 色は、MAGeCK によって決定された、特定の遺伝子のすべてのガイドにわたる要約された対数倍率変化を示します。 濃縮度は、未分類の細胞プールに対する GFP 濃縮画分を使用して、1 つの比較に対してすべての複製を組み合わせて計算されました。 アスタリスクは、MAGeCK の堅牢なランク集約を使用した場合に P < 0.05 であることを示します。 対応するパネル b および拡張データ図 8b、d を参照してください。 正確な P 値は補足表 1 にあります。

予想どおり、3 つのポジティブコントロール Zfp57、Uhrf1、および Dnmt1 が、すべてのスクリーニングでトップヒットとしてスコアを獲得しました（図 4b、c、拡張データ図 8a ～ c​​、および補足表 1）。 さらに、Cbx1、Cbx5、Atrx、Daxx、Setdb1 などの他のヘテロクロマチン関連因子が GFP 陽性画分に豊富に含まれていました。 すべてのスクリーニングで繰り返し見つかった信頼性の高いヒットのリストでは、Zfp57、Uhrf1、および Dnmt1 が豊富でしたが、他のヒットは個々の ICR レポーター細胞株で特定されました（図 4c）。 KRABジンクフィンガータンパク質ファミリーの大部分をカバーするために、核因子をコードする4,095個の遺伝子に対する20,470個のガイドRNAからなる拡張CRISPRライブラリー（EpiTF）を再設計し、Airn ICRレポーターを使用してスクリーニングを繰り返しました（補足表1）。 ライブラリの複雑さの増加にもかかわらず、Airnレポーターサイレンシングの維持に役割を果たす追加の転写因子は同定されませんでした（図4cおよび拡張データ図8d、e）。 複数のスクリーニングで特定されたいくつかの候補者は、単一 KO 検証によってテストされました。 Zfp57、Uhrf1、およびDnmt1は3つのレポーター株すべてで一貫した上方制御を示しましたが、他の候補は、テストしたレポーター株の一部でより低いまたは確率的な再活性化をもたらしました（拡張データ図8f）。

少なくとも 3 つの異なるスクリーニングで 2 つの因子が同定されました（図 4c および拡張データ図 8g）：ATF7IP、SETDB1 を介した転移因子 35、36、37 のサイレンシングを担う 35、36、37、および ZMYM2、ATF7IP と関連する ATF7IP 相互作用因子ヒト多能性細胞の増殖制限38,39。 それらの H3K9me3 との関連性、および報告されている反復要素の転写サイレンシングへの関与を考慮して、ICR でのエピジェネティックな維持の制御へのそれらの寄与をテストしました。 さらに、ヒトATF7IPは、父親から発現されるインプリント遺伝子のリプレッサーであり、精子特異的遺伝子のサイレンシングに必要であることが最近同定された40。 我々はまず、これらの因子が実際に内因性ICRに局在するかどうかを確認したいと考え、SETDB1（参考文献41）、ZFP57（参考文献42）、ATF7IP39およびZMYM2（参考文献43）で利用可能な既存のmESC ChIP-seqデータセットを分析しました。 CRISPRスクリーニングで使用された内因性ICRですべての因子の強い共局在が観察されました（図5a）。 分析をすべてのアノテーション付き ICR にさらに拡張すると、ほぼすべての ICR が ATF7IP、ZMYM2、ZFP57、および SETDB1 によって共結合していることがわかります (図 5b)。 注目すべき例外は、ATF7IP が存在しない MCTS2/H13 と、ZMYM2 の局在化の低下を示す H19 です。 一般的な傾向として、ATF7IP と ZMYM2 は SETDB1 と ZFP57 の存在下で常に共局在することが観察され、これらは H3K9me3 機構の一部として ICR に局在することが示唆されます。 興味深いことに、ATF7IP、ZMYM2、ZFP57、およびSETDB1ピークのゲノムワイド分析は、この共局在が常にICRの外側で観察されるわけではないことを示しています。 検出したいくつかのATF7IPピークの大部分（85％）はZFP57およびSETDB1部位と重複していますが、ZMYM2ピークの30％のみがZFP57およびSETDB1と共局在します（拡張データ図9a）。 ZFP57 / SETDB1部位の外側のZMYM2ピークは、ZFP57 / SETDB1と重複するピークと比較して、より低いH3K9me3およびDNAメチル化を示し、ZMYM2がSETDB1とは独立して複数の制御経路に関与していることを示唆しています（拡張データ図9b、c）。 この結合に関係なく、ZFP57の非存在下では、Airn ICRへのATF7IPおよびZMYM2局在化の減少が見られます（拡張データ図9d）。

a、CRISPRスクリーニング実験で使用されたAirn、Kcnq1ot1、およびPeg10 ICRのゲノムブラウザスナップショット。 ChIP-seq データセットは、対象の ICR での ZFP57、ATF7IP、ZMYM2、および SETDB1 の共局在を示します。 b、マウスゲノム内のすべての注釈付きICRにおけるATF7IP、ZMYM2、ZFP57、SETDB1、およびH3K9me3 10 kb (k)上流および下流の結合を要約したヒートマップ。 20 bp ごとのライブラリー正規化リードを示します。 c、左：TurboIDに融合したZFP57を比較して、ZFP57結合部位のタンパク質を検出するためのビオチン近接ライゲーションセットアップの概略図。 LC MS/MS: タンデム質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー。 右: 濃縮されたタンパク質を示し、ZFP57-TurboID と TurboID-NLS (nTurboID) の直接比較からの統計的に有意なヒットを示す火山プロット。 統計的に濃縮されたタンパク質が示されています (偽発見率 (FDR) 補正両側 t 検定: FDR = 0.05、群内人工分散 (s0) = 1、n = 4 技術的反復)。 d、選択されたICRにおけるDNAメチル化分析は、Atf7ip-KO細胞およびZmym2-KO細胞におけるメチル化の喪失を示す(他のICRについては拡張データ図10cを参照)。 野生型、Zmym2-KO または Atf7ip-KO 細胞の WGBS から得られた個々の CpG のメチル化値が示されています。 CpG のゲノム位置を以下に示します。 e、H3K9me3 ChIP-seqは、選択されたICRでのH3K9me3の損失を示します（他のICRの拡張データ図10e）。 100 bp ウィンドウごとの読み取りを示します。 各インプリンティング領域の ICR が表示されます。

ICRにおけるATF7IPとZMYM2の間の関連をさらに調査するために、RMCE部位から発現されるZFP57-TurboID融合タンパク質を介して近接ビオチンリガーゼTurboID44をメチル化ICRにリクルートし、前述のようにBioIDを実行しました45（図5c）。 バックグラウンド対照として、NLS-TurboID (nTurbo) のみを発現する細胞株を生成し、クロマチンに結合していない場合に ZFP57 と相互作用するタンパク質を区別するために、TurboID リガーゼに融合した ZFP57 の KRAB ドメインのみを発現する細胞株を含めました。 濃縮されたタンパク質の質量分析による検出には、以前に ZFP57 に関連していたいくつかの因子 (KAP1、CBX3、CBX5、および MORC3) が含まれていました。 その中で、ATF7IPを検出しました（図5c、拡張データ図9e、および補足表1）。これは、CRISPRスクリーニングとゲノムワイド分析から得られた結果を裏付けています。 ZMYM2の場合、ビオチン化画分またはバックグラウンドサンプルでタンパク質を検出できませんでした。これは、その濃縮が検出限界を下回っていたか、ZFP57と特異的に相互作用していないかのいずれかを示唆しています。

次に、マウスの発生初期に発現するこれらの因子の欠如が内在性ICRのエピジェネティック状態に影響を与えるかどうかをテストしたいと考え、CRISPR-Cas9を使用してAtf7ipおよびZmym2のKO mESCを生成しました（拡張データ図9f、g）。 全ゲノム重亜硫酸塩配列決定（WGBS）により、ゲノム全体のメチル化の損失は限られていたにもかかわらず、分析されたICRの大部分でDNAメチル化の減少が明らかになりました（図5dおよび拡張データ図10a〜c）。 Peg13 および Meg3/Rian ICR は両方の KO 細胞株で DNA メチル化を保持しましたが、H13/Mcts および Gnas/Nespas は ZMYM2 および Zrsr1/Commd1 の非存在下で、H19 は ATF7IP の非存在下で特異的にメチル化を保持しました。 ICRメチル化の喪失は、Airn、Kcnq1ot1、およびPeg10 ICRにおけるATF7IPおよびZMYM2の結合部位周辺の標的重亜硫酸塩配列決定によってさらに確認された(拡張データ図10d)。 最後に、同じ KO 細胞株で H3K9me3 をプロファイリングし、両方の KO 株で H3K9me3 を保持していた Peg13 と Meg3/Rian を除くすべての ICR で H3K9me3 の消失を観察しました。 さらに、Zrsr1/Commd1およびH19は、Atf7ip KO細胞においてH3K9me3を保持した（図5eおよび拡張データ図10e）。 ATF7IPまたはZMYM2の非存在下でのICRにおけるDNAメチル化とH3K9me3の一致した変化は、mESCにおけるICRのメチル化状態から非メチル化状態への切り替えを防ぐためにこれらの因子が必要であることを示している。

ここで我々は、ICR が異なる DNA メチル化を維持できるようにする遺伝的およびエピジェネティックな決定基の研究に着手しました。 これに向けて、我々は内在性染色体コンテキストから ICR を単離し、mESC ゲノムの異種位置に挿入しました。 メチル化されずに組み込まれた場合、試験したICRはDNAメチル化のないユークロマチック状態を維持し、de novoメチル化を防ぐ配列特異的なメカニズムを示唆しています。 この挙動は、CpG 密度の上昇によって DNA メチル化から保護される CpG アイランド プロモーターに似ています 4,5。 実際、CpG 密度と GC パーセンテージに基づいて、ほとんどの ICR は CpG アイランドの定義を満たしています。 対照的に、DNA メチル化された ICR 配列を同じ部位に組み込むと、このデフォルト状態が上書きされ、DNA メチル化の安定した伝播とその後のヘテロクロマチン マークの確立がもたらされます。 したがって、ICR は、内因性の位置で観察されるエピジェネティックな制御機構を再現できる自律的な DNA 配列要素です。 この発見は、ICR の DNA 配列がマウス発生中のインプリントの確立を再現するのに十分であることを示す以前の研究と一致しています 45、46、47、48、49。 重要なことは、DNAメチル化に基づく2つの相反するクロマチン状態間のこの切り替えは、非ICRプロモーターや同様のサイズ、CpG密度、またはGC含量の他のDNA配列では観察されなかったことであり、これには完全長ICRの特殊な特性が必要であることが示唆されます。エピジェネティックな双安定性」。

異所性ICRにより、制御されたゲノム環境においてICRでのエピジェネティック記憶の生成と維持に必要なDNA配列とクロマチン調節因子を系統的に研究することが可能となった。 修飾された DNA 配列を含む合成 ICR の導入を通じて、GC 含有量と CpG 密度は mESC の双安定性をコードするのに十分ではないが、ZFP57 結合モチーフなどの追加の配列が DNA と H3K9 メチル化の維持に重要な役割を果たしていることが観察されました。 この発見は、ZFP57 認識モチーフのメチル化 CpG の変異により Snrpn ICR21 全体のメチル化維持が失われるという以前の研究と一致しています。 さらに、ZFP57 結合は、mESC のメチル化 Airn ICR 状態におけるエピジェネティック記憶に必要であるだけでなく、十分であることを示します。 非メチル化対立遺伝子の場合、同じ配列変化により新たなメチル化からの保護が失われ、新たなメチル化から保護する配列特異的な機構が示唆されており、これはインプリントされていない遺伝子の調節領域で観察されるものと潜在的に同様である3,5。 それにもかかわらず、MEL 細胞における差次的な Airn ICR メチル化の維持は CpG 以外の DNA 配列とは無関係であったため、エピジェネティックな維持に関与する配列特異的な因子に対する細胞型特異的な要件が示唆されます。 ZFP57 の場合、これは、その転写活性が生殖細胞および発生初期に限定されていることと一致すると考えられます 18,29。

メチル化されたICRでのヘテロクロマチンの堅牢な確立と維持を特定したので、DNAメチル化に応答するレポーター細胞株を生成することができました。 Snrpn プロモーターを使用して内因性遺伝子プロモーターのメチル化の変化を報告する以前の戦略 50,51 とは対照的に、我々の細胞株は導入された ICR での制御変化を直接報告します。 これらのレポーターを使用して、抑圧状態の維持に必要な因子をスクリーニングしました。 ターゲットを絞った CRISPR スクリーニングにより、テストされたすべての ICR で DNA メチル化状態を維持するために必要な最も関連性の高い遺伝子として Dnmt1、Uhrf1、および Zfp57 が特定され、セットアップの適合性が確認されました。 さらに、我々の機能的スクリーニングは、ゲノム全体でH3K9me3を調節し、DAXX、ATRX、CBX1およびCBX5を含むICRと関連すると記載されている追加の因子を同定し、検証した（参考文献14、52、53）。

得られたヒットの中から、ICR レポーターにおけるエピジェネティックな抑制の維持に関与する因子として ATF7IP と ZMYM2 を同定しました。 ATF7IPとSETDB1は内在性レトロウイルスエレメントの制御において機能的に重複しており、ATF7IPはSETDB1の酵素活性を刺激し、プロテアソーム分解から保護し、核局在化を促進することによりSETDB1の補因子として作用する35、37、54、55。 SETDB1 の喪失は mESC では致死的ですが、ATF7IP の欠如により SETDB1 のレベルが低下します。これは生存には十分ですが、ゲノム内のすべての抑制部位を維持するには不十分です 37,56。 ATF7IP の C 末端フィブロネクチン III 型ドメインは、ZMYM2 (ZFP198 も) と相互作用することが示されており、この相互作用は、インプリントされた FKBP6 遺伝子を含むいくつかの生殖系列特異的遺伝子のサイレンシングに重要であることが示唆されています 39,57。 ZMYM2 は、H3K9me3 でマークされたクロマチンと相互作用し 58,59、さらに内因性レトロウイルス要素のサイレンシングに必要であるため、mESC 培養における 2 細胞様細胞への移行を防ぐことが記載されています 43,54。 効力の制限における ZMYM2 の役割は、多能性から抜け出すために ZMYM2 が必要であるという事実によってさらに裏付けられます 38,60。 われわれは、ATF7IPおよびZMYM2が、mESCの内因性ICRの大部分でZFP57およびSETDB1とともに共局在し、メチル化ICRにおけるエピジェネティックな状態の記憶に必要であることを示す。 これは、精子特異的遺伝子およびヒト単為生殖ESCにおけるPeg13を含む父系発現インプリント遺伝子の制御におけるATF7IPの役割を示す文献と一致している40。 我々の結果は、mESCにおいて、ATF7IPが親の起源とは無関係に、すべてのメチル化ICRの制御において広範な役割を果たす可能性があることを示している。

これら 2 つの要因が接合子形成および初期発生中のインプリントの維持に寄与するかどうか、またどのように寄与するかはまだ検証されていません。 mESC では、それらの欠如により、親の起源とは関係なく、複数の ICR で維持忠実度が損なわれ、H3K9me3 が散発的に消失しました。 これにより、DNAメチル化とH3K9me3の間の抑制フィードバックループが不安定になり、ICRがデフォルトの非メチル化状態に切り替わることが可能になると考えられます。 一部のICR（Mcts2/H13、Zrsr1/Commd1、H19など）ではATF7IPとZMYM2の調節活性の違いが観察されていますが、これがこれらのICRに対するこれらの因子の特異性によるものであるかどうかはまだ判明していません。 あるいは、これは、どちらかの因子が存在しない場合に非メチル化状態に切り替わるICRの確率性を反映している可能性があり、これはクローン由来の細胞に記憶されています。

RMCE コンピテント mESC (TC-1 (参考文献 3)、国立衛生研究所 (NIH) の A. Dean から入手) を、DMEM (Invitrogen)、15% ウシ胎児を含む mESC 培地中の 0.2% ゼラチンコートディッシュで培養しました。血清 (Invitrogen)、1 × 非必須アミノ酸 (Invitrogen)、1 × Glutamax (Invitrogen)、0.001% 2-メルカプトエタノール (Invitrogen)、および滴定された白血病阻害因子 (自社製)、37 °C、7% CO2 。 あるいは、mESC を、50% Neurobasal 培地 (Invitrogen)、DMEM/F12 培地 (Invitrogen)、1× 非必須アミノ酸 (Invitrogen)、1× Glutamax (Invitrogen)、0.001% 2-メルカプトエタノール (Invitrogen) を含む 2i 培地で培養しました。 ）、1× N2 サプリメント（Invitrogen）、1× B27 サプリメント（Invitrogen）、滴定された白血病阻害因子、3 μM C​​HIR99021（Sigma-Aldrich）および 1 μM PD0325901（Sigma-Aldrich）。 示されている場合、l-アスコルビン酸 (Stemcell Technologies) を 100 μg ml-1 の濃度で添加しました (参考文献 26)。 神経前駆細胞への分化は、フィーダー細胞を使用せずに前述のように実行されました 61。 DNMT1 阻害の場合、以前に決定したように、GSK-3484862 (MedChemExpress) を最終濃度 10 μM で添加しました 34。 RMCE コンピテント MEL 細胞 30 (FMI バーゼルの D. Schübeler から入手) 細胞を、10% ウシ胎児血清 (Invitrogen) および 1 × Glutamax (Invitrogen) を補充した DMEM (Invitrogen) 中で懸濁培養しま​​した。 すべての RMCE コンピテント細胞株 (TC-1 および MEL) は、RMCE 耐性カセットでの選択と PCR に基づいて認証されました。

mESC への標的細胞株の組み込みは、Amaxa Nucleofector (Lonza) による 2 × 106 細胞のエレクトロポレーションまたは 2.5 × 104 細胞の Lipofectamine 3000 (Invitrogen) トランスフェクションを使用した RMCE によって得られました。 Amaxa Nucleofector キットの場合は合計 40 μg のプラスミド、リポフェクタミン 3000 の場合は 1 μg を使用して、すべての RMCE ベクターを CRE 発現プラスミドと 1:0.6 μg の比率でコトランスフェクトしました。トランスフェクションの 2 日後、細胞を 3 μM ガンシクロビルを 8 日間以上投与。 得られた細胞株をプールとして保存し、必要に応じて限界希釈によりクローン細胞株を取得した。 プールまたはクローン細胞株は、組み込み部位特異的 PCR を使用して遺伝子型決定されました。 CRISPR スクリーニングで使用されるすべてのレポーター細胞株の親細胞株には、前述したように TALEN を介した組み込みによって得られた、Rosa26 遺伝子座から安定して発現された Cas9 遺伝子が含まれています 62。 シングルクローン KO 細胞株は、px330-hSpCas9 (Addgene、42230) プラスミドと pRR-Puro 組換えレポーター 62 を使用した CRISPR-Cas9 によって得られました。 px330 と pRR-Puro の比率が 1:0.1 の合計 1 μg のプラスミド DNA を、リポフェクタミン 3000 を使用してトランスフェクトしました。ピューロマイシンの選択は、トランスフェクションの 36 時間後に開始し、濃度 2 μg ml-1 で 36 ～ 48 時間行いました。 KO 細胞株は、ターゲティング部位特異的 PCR を使用して検証されました。 MEL 細胞における RMCE は、リポフェクタミン 3000 (Invitrogen) を使用して、浮遊細胞用の 6 ウェル プレートに 5 × 105 個の細胞をプレーティングして実行されました。 合計 2.5 μg のプラスミド DNA を、前述と同じ比率を使用して、製造業者の指示に従ってトランスフェクトしました。 48 時間後、細胞を T75 フラスコに移し、8 日間以上培養した 5 μM ガンシクロビル含有培地で組換えを受けた細胞を選択しました。

2 つの逆位 loxP 部位 3 を含むバックボーンを使用して、中央の EcoRV 制限部位を持つ 60 bp のユニバーサル エントリー サイト、その後に eGFP または mScarlet 遺伝子を駆動するプロモーター (pCAGGS、hPGK、および Ef1alpha) を含むいくつかの空のレポーター ベクターをクローニングしました。 ChroMM および EpiTF をそれぞれスクリーニングし、続いて下流の BGH-ポリ(A) および WPRE シーケンスを検査します。 個々の ICR またはコントロール配列はゲノム DNA から増幅されました (補足表 1)。 ギブソンアセンブリは、NEB ギブソンアセンブリマスターミックスプロトコルに従って実行されました。 インビトロメチル化は、NEB M.SssI メチルトランスフェラーゼを使用し、マイクログラムあたり 600 µM SAM (NEB、B9003S) および 1.5 U M.SssI (NEB、M0226L) を用いた少なくとも 4 時間の 2 つの連続反応で最大 40 µg のプラスミド DNA を使用して実行されました。 DNA。 プラスミドの完全なメチル化は、CpG メチル化感受性制限酵素 HpaII (NEB) および MspI (NEB) によるメチル化非感受性の対照反応を使用して確認されました。 細胞株は前述のように生成されました。 loxP 部位にわたるプライマーを使用した PCR を使用して、個々のクローンの遺伝子型を特定しました。 組み込まれたレポーター構築物のメチル化は、選択されたクローンで検証されました。

フローサイトメトリーデータの取得は、BD FACSCanto II または BD LSR Fortessa セル アナライザーで実行されました。 FACS は BD FACSAria III セルソーターを使用して実行されました。 データ分析は、FlowJo (バージョン 10.7) または BD FACSDiva (9.1.2) を使用して行われました。 すべてのサンプルは、前方散乱面積 (FSC-A) 対側方散乱面積 (SSC-A)、続いて FSC-A 対前方散乱高さ (FSC-H) を使用して、単一細胞に対してゲート処理されました。 GFP 陰性および陽性の集団は、GFP 陰性の野生型細胞を参照として使用して定量されました。 細胞表面マーカー染色の場合、トリプシン処理および 40 μm セル ストレーナー (BD Bioscience) で濾過することにより、均一な細胞懸濁液を調製しました。 細胞を、アロフィコシアニン (APC) 結合 CD90.1 抗体 (Invitrogen、17-0900-82) を用いて、飽和抗体濃度 (1,500 万細胞あたり 1 μl) で 4 °C で 30 分間染色しました。

BPnet28 (バージョン 0.0.23) を使用して、mESC における ZPF57 結合の配列モチーフとコンテキストを決定しました。 ZFP57 ChIP-seq データおよび対応する入力ファイル 42 は、trimgalore (バージョン 0.6.6) を使用してアダプターを除去した後、bowtie2 (バージョン 2.3.5.1) を使用してマウスゲノム (NCBI Build 37 mm9、2007 年 7 月) とアラインメントされました。 Picard (バージョン 2.23.9) を使用してアライメントされたリードをフィルターして PCR 重複を検出し、マッピング品質 (MAPQ) > 40 のリードのみをさらなる分析のために保持しました。 すべてのレプリケートは、ピーク コールの前に MACS2 (バージョン 2.1.1.20160309) のパラメータを使用してマージされました: callpeak -g mm–keep-dup all -q 0.05–call-summits。 マージされたデータセットのポジティブ鎖とネガティブ鎖にマッピングされたリードは、個々のファイルに分割され、BPnet の入力トラックとして 5' 塩基にトリミングされました。 モデルはデフォルトの bpnet9 アーキテクチャ (https://github.com/kundajelab/bpnet) でトレーニングされ、染色体 1、8、9 をテスト セットとして使用し、染色体 2、3、4 のピークを検証セットとして使用しました。 染色体 X および Y 上のピークはモデルのトレーニングから除外されました。 BPnet の DeepLIFT メソッドを使用して寄与スコアを計算した後、BPnet の TF-MoDISco メソッドを使用してモチーフを決定しました。 Airn 配列およびシャッフルされた Airn 配列の寄与スコアを決定するために、入力 DNA をワンホット エンコードしてから、トレーニング済みモデルに適用して ZFP57 結合予測を生成しました。 歩行変異の場合、シャッフルされた配列の 10 nt が元の Airn 配列と交換され、予測ごとに 1 bp シフトされました。

最大 2 μg のゲノム DNA、または ChIP から溶出した物質の総量を、EpiTect 重亜硫酸塩キット (Qiagen) を使用した重亜硫酸塩変換に使用しました。 亜硫酸水素塩 PCR は、次の条件を使用して、補足表 1 に示すプライマーを使用して PhusionU ポリメラーゼ (Thermo Fisher Scientific) を使用して実行されました: 95 °C で 5 分間の初期変性、続いて 95 °C で 1 分間の 45 サイクル、1 50 ～ 60 °C で 1 分間 (プライマーペアに応じて)、72 °C で 1 分間、その後 72 °C で 5 分間の最終伸長を行います。 アンプリコンを CloneJET ベクター (Thermo Fisher Scientific) にクローン化し、サンガー配列決定によって配列決定し、QUMA63 を使用して分析しました。

標的重亜硫酸塩配列決定ライブラリーは、等モルのプールされた重亜硫酸塩 PCR フラグメントから作成されました。 増幅バイアスを軽減するために、アニーリング温度を 50 °C と 58 °C にして、ターゲットごとに 2 つの独立した PCR 反応を実行しました。 NEBNext Ultra II キット (NEB) を使用して、メーカーのプロトコールに従って 10 ng のプールされたアンプリコンからインデックス付きライブラリーを調製しました。 配列決定は、150 bp ペアエンド リードを備えた Illumina NovaSeq6000 マシンで行われました。 Fastq ファイルは、trim_galore (バージョン 0.6.6) を使用してトリミングされ、パラメータ non_direction を使用して Bismark (バージョン 0.23.0) を使用して位置合わせが実行されました。 Bismark メチル化抽出器を使用して CpG メチル化を抽出し、カバーされた回数が 500 回未満の CpG を除いて、平均 CpG メチル化を R で計算しました。

Atf7ip および Zmym2 KO mESC の WGBS は、以前に記載されているように実行されました 64。 つまり、10 μg のゲノム DNA を約 400 ～ 500 bp の長さに超音波処理しました。 各サンプルについて、2 μg の剪断ゲノム DNA を、10 ng の等モルのプールされた超音波処理メチル化ファージ T7 および非メチル化ファージ ラムダ DNA と混合しました。 メーカーの指示に従って、Qiagen Epitect 重亜硫酸塩変換キットを使用して重亜硫酸塩変換する前に、メチル化アダプター (NEB、E7535S) を使用して NEBNext Ultra II キット (NEB E7645L) でアダプターライゲーションを実行しました。 変換後、Pfu TurboCx Hotstart DNA ポリメラーゼ (Agilent) および NEB デュアル インデックス プライマー (NEB、E7600S) を使用してライブラリーを 10 サイクル増幅しました。 PCR 反応は以下のパラメータで実行されました: 95 °C で 2 分間、98 °C で 30 秒、続いて 98 °C で 15 秒、65 °C で 30 秒、および 72 °C で 3 分間を 10 サイクル行って終了72℃で5分間。 PCR反応物を1.2×AMPure XPビーズ(Beckman Coulter)を使用してクリーンアップし、20μlのEB緩衝液(Qiagen)で溶出した。 ライブラリの品質は Agilent TapeStation でチェックされ、シーケンスは Illumina NovaSeq 6000 マシンで行われました。

IP あたり約 15 × 106 細胞を収集し、1% メタノールフリーのホルムアルデヒドで 8 分間固定しました。 グリシンを最終濃度0.125 nMまで添加することによって架橋をクエンチし、氷上で4℃で10分間インキュベートした。 細胞を600×gで5分間ペレット化し、冷PBSで洗浄し、10 mM EDTA、10 mM Tris pH 8、0.5 mM EGTAおよび0.25% Triton X-100を含む緩衝液中で氷上で10分間インキュベートした。 遠心分離後、細胞を1 mM EDTA、10 mM Tris pH 8、0.5 mM EGTAおよび200 mM NaCl中で氷上で10分間インキュベートした。 50 mM HEPES、pH 7.5、1 mM EDTA、1% Triton X-100、0.1% デオキシコール酸、0.2% SDS、および 500 mM NaCl を含む高塩緩衝液でクロマチンを 4 °C で 2 時間抽出し、クロマチンをBioruptor Pico 超音波処理装置 (Diagenode) を使用して剪断しました。 次に、30 μl のプレブロックされた磁性プロテイン A ビーズ (Invitrogen) との IP 反応ごとに 100 μg のクロマチンを使用しました。 ビーズは、使用前にプロテイナーゼ阻害剤混合物（Roche）を含むTE緩衝液中の1 mg BSAおよび100 ngの酵母tRNA（Sigma）でブロックした。 IP の前に、クロマチンを 20 µl のブロックビーズで 4 °C で 1 時間プレクリアしました。 次に、投入材料の 5% を -20 °C に保ち、IP 材料に沿って脱架橋しました。 次に、IP あたり 5 μg の抗体を使用して、4 °C で一晩インキュベートしました。 翌日、ブロックされたビーズ 30 μl をクロマチンに添加し、4 °C で 4 時間インキュベートしました。 ビーズを磁石上で分離し、高塩緩衝液で8分間2回、50 mM LiCl、0.5% NP-40、0.5% デオキシコール酸、1 mM EDTAおよび10 mM Tris、pH 8で1回洗浄しました。さらに2回洗浄した後、 TE で 8 分間処理し、1% SDS および 100 mM NaHCO3 中の 60 μg RNaseA (Roche) と 37 °C で 30 分間インキュベートした後、10 mM EDTA、40 mM Tris、pH 8 を加えて 3 時間インキュベートした後にクロマチンを溶出しました。 、および60μgのプロテイナーゼK（Roche）。 最終的な脱架橋は 65 °C で一晩行われました。 溶出した物質はフェノールクロロホルム抽出を使用してクリーンアップし、Qubit 2.0 蛍光光度計 (Thermo Fisher Scientific) を使用して定量しました。 以下の抗体を ChIP に使用しました: H3K9me3 (Abcam、ab8898、IP あたり 5 μg)、H3K4me2 (Diagenode、C15410035、IP あたり 5 μg)、H3K4me3 (Abcam、ab8580、IP あたり 5 μg)、ATF7IP (Betic、A300- 169A、IP あたり 5 μg）および ZMYM2（ベチル、A301-711A、IP あたり 10 μg）。

qPCR 反応は、KAPA SYBR Fast ユニバーサル qPCR キット (Sigma) を使用し、IP 材料用の溶出 DNA 1 μl または 1:10 希釈液 1 μl を含む 10 μl 反応で、Rotor Gene Q マシン (Roche) で技術的複製として実行されました。入力材料の。 デルタ Ct 値を入力に対して計算し、続いてデルタ Ct と遺伝子間領域にわたる変化倍率を計算しました。 プライマーは補足表 1 にリストされています。対応するプロットは Prism (5.0a) を使用して生成されました。

ChIP-seq ライブラリは、Illumina (NEB、E6240) 用の NEBNext ChIP-seq Library Prep Master Mix セットまたは NEBNext Ultra II Kit を使用して、メーカーのプロトコルに従って調製しました。 最終ライブラリは、2200 TapeStation System (Agilent) で視覚化および定量化され、Illumina NovaSeq6000 マシンで 150 bp ペアエンド リードで配列決定する前に、等しいモル比でプールされました。

公開されている mESC ゲノムワイド データセットは GEO から入手しました (WGBS65; H3K9me3、H3K4me3、H3K36me3 および H3K27me3 (参考文献 66)、DNase-seq および RNA-seq67、SETDB1 (参考文献 41)、ZFP57 (参考文献 42)、ZMYM2 (公開されたデータセットからのシーケンシングリードとこの研究で生成された ChIP-seq リードは、trimgalore (バージョン 0.6.6) を使用して低品質リードとアダプター配列をフィルタリングし、マウスゲノム (NCBI Build) にマッピングしました。 37 mm9、2007 年 7 月).H3K9me3、H3K4me3、H3K36me3、H3K27me3、DNase-seq、および RNA-seq のマッピングは、標準の qAlign() 設定を使用して R の QuasR (1.30.0) を使用して実行されました。ウィッグ トラックは QuasR qExportWig( ) コマンドを実行し、UCSC ゲノム ブラウザー (https://genome.ucsc.edu) を使用して視覚化しました。WGBS データのマッピングは、次の設定で qAlign() を使用して QuasR で実行されました: genome = 'BSgenome.Mmusculus.UCSC.mm9'、アライナー= 'Rbowtie' および重亜硫酸塩 = 'dir'。CpG メチル化コールは qMeth() を使用して抽出され、少なくとも 10 倍でカバーされた CpG のみを含むようにフィルター処理されました。ChIP-seq ピーク座標は、MACS2 (バージョン 2.1.1.20160309) を使用して次のように取得されました。パラメータ: callpeak -g mm – keep-dup all -q 0.05 – call-summits。 座標は GenomicRanges オブジェクトとして R にインポートされ、1 kb を超えるピークはさらなる分析から除外されました。 ピーク間のオーバーラップは、R の findOverlaps() 関数を使用して、maxgap=1000 L で計算されました。ICR およびピーク領域のヒートマップは、ScoreMatrixList() 関数と multiHeatMatrix() 関数を使用して、R の genomation() で生成されました。

ChromMM および EpiTF ライブラリは、以前に記載されているように、Vienna sgRNA ライブラリのサブプールとして構築されました 68。 レンチウイルスは、記載されているように、HEK293T (チューリッヒ大学の G. Schwank から入手) 細胞で産生されました 69。 実際の CRISPR スクリーニングに使用されたのと同じ形質導入手順に従って、非濃縮ウイルスをさまざまな量で滴定しました。 形質導入は、8μg ml-1ポリブレン（Merck）を含む胚性幹細胞培地中のゼラチンコート6ウェルプレートに播種した1.25×106細胞を用いて、37℃、500×gで60分間回転させて実施した。 遠心分離後、細胞を 37 °C で 12 時間インキュベートした後、複数の 15 cm プレートに移し、さらに 24 時間培養しました。 36時間後、FACSを使用して形質導入細胞を選択しました。 ChromMM ライブラリーの場合、APC 結合抗体 (Invitrogen、17-0900-82、1,500 万細胞あたり 1 μl) を使用して、APC 陽性および GFP 陰性の単一細胞をゲーティングして細胞を CD90.1 細胞表面マーカーに対して染色しました。 EpiTF ライブラリーの場合、GFP 陽性および mScarlet 陰性の単一細胞で細胞をゲートしました。 選別後、ライブラリー表示におけるボトルネックを避けるために、細胞を複数の 15 cm ディッシュにまばらに播種し、4 日後に 1 回だけ継代しました。 形質導入後 10 日目に、GFP 陽性細胞を選別し、DNeasy Blood and Tissue キット (Qiagen) を使用してゲノム DNA 抽出のためにさらに処理しました。 すべてのスクリーニングは、少なくとも 3,000 万個の細胞と 0.1 ～ 0.2 の低い感染多重度で実行され、最初の選別後に少なくとも 300 万個の細胞の総細胞数とガイドあたり少なくとも 450 倍のガイド表示が得られました。 最終的なソートでは、同じ数の最初に形質導入された細胞をソートに使用し、参照プールとして保持しました。 EpiTFライブラリーを用いたスクリーニングは上記のように実施したが、感染多重度0.2での形質導入には9,000万個の細胞を使用した。 最初に、すべてのスクリーニングは、個々のレポーター クローンを使用して技術的に二重または三重に実行され、後に独立した実験としてもう一度繰り返されました。 必須遺伝子および増殖制限遺伝子をスコアリングするために、示された日にプールされた細胞を最初のプラスミドライブラリーと比較しました。

抽出されたゲノム DNA の全量について、2 つの連続する PCR 増幅ステップでライブラリーの調製を行いました。 最初の PCR では、製造業者の指示に従って Herculase II Fusion DNA ポリメラーゼ (Agilent) を使用し、バーコード化用の 3' アダプター配列を持つライブラリー特異的プライマーを使用し、50 μl 反応あたり最大 500 ng DNA インプットで、組み込まれたガイド配列を増幅しました (補足表 1)。 PCR ミックスには 1.5% DMSO が含まれ、MgCl2 の最終濃度は 3 nM でした。 増幅産物をまず、MinElute Gel 抽出キット (Qiagen) を使用して精製し、潜在的なプライマーダイマーを AmpureXP ビーズ (Beckmann) を使用して 0.7 倍の体積比で除去しました。 メーカーのマニュアルに従って、NEBNext Multiplex Oligos (NEB) および NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master mix (NEB) を使用し、最初の PCR および 7 つの増幅サイクルからの溶出産物の 10% を使用した 2 回目の PCR で、サンプル固有のバーコーディングを実行しました。 EpiTF ライブラリーの場合、NEBNext Multiplex Oligo キット (NEB) の i5 プライマーと P7 配列を持つカスタム プライマーを使用してバーコーディングを実行しました (補足表 1)。 配列決定は、EpiTF ライブラリーの 10 bp インデックス読み取り 1 を指定して、Illumina NovaSeq6000 または MiSeq マシンで実行されました。

逆多重化は、Illumina の標準パイプラインを使用して実行されました。 EpiTF ライブラリの場合、i7 インデックスには UMI68 が含まれているため、逆多重化は i5 インデックスに対してのみ実行されました。 Fastq ファイルは、Cutadapt (バージョン 3.10) を使用してガイド RNA 配列のみを含むようにトリミングされ、ChromMM ライブラリーのレンチウイルス バックボーン内のリンクされたアダプター配列に -g 5'-TAGCTCTTAAAC...GGTGTTTCGTC-3' または -g aaacaccg...gtttaaga を指定しました。 EpiTF ライブラリ用。 アライメントは、sgRNA 配列から構築された参照ゲノムに対して bowtie2 (バージョン 2.3.5.1) を使用して行われ、次のアライメント パラメーターを指定しました: -k 1 – 非常に高感度。 BAM ファイルは、bedtools (バージョン 2.27.1) の bamtobed 関数を使用して bed ファイルに変換されました。 ベッド ファイルを R にインポートして、MAGeCK (バージョン 0.5.9.2) のカウント マトリックスを作成しました。 最終分析では、技術的反復からのカウントと、さまざまな GFP 高ビンおよび GFP 低ビンが集計されました。 MAGeCK は、norm-method を total に設定して実行し、独立した複製を指定して、対照サンプルとして未ソートのプールに対して実行されました。

シングルガイド検証は、参考文献に記載されているように、ライブラリーに含まれる 1 つのガイド RNA と、オンターゲット活性が高くオフターゲット活性が低い独立して設計された 1 つのガイドを使用して行われました。 70 (補足表 1)。 ガイドは、ピューロマイシン選択を可能にする px459 バックボーン (Addgene、62988) にクローン化されました。 このために、トランスフェクションの 1 日前に、1,000 個の細胞を 96 ウェル プレートのゼラチンでコーティングしたウェルに播種しました。 次に、リポフェクタミン 3000 (Invitrogen) を使用して、技術的複製としてウェルごとに 100 ng のプラスミド DNA をトランスフェクトしました。 36 時間後、トランスフェクトされていない細胞をコントロールとして使用し、トランスフェクトされた細胞を 2 μg ml-1 ピューロマイシンで 36 ～ 48 時間かけて選択しました。 トランスフェクションの 12 日後にフローサイトメトリーを使用してレポーターの再活性化を評価し、ノンターゲティング コントロール ガイドでトランスフェクトした細胞に対する GFP の再活性化を定量しました。

ウェスタンブロッティングでは、20 ～ 35 μg のタンパク質を 6% または 10% ポリアクリルアミドゲルで分離し、TransBlot Turbo システム (Bio-Rad) を使用してポリフッ化ビニリデン膜に転写しました。 抗体ベースの染色では、メンブレンを TBS-T (10 mM Tris、pH 8.0、150 mM NaCl および 0.1% Tween-20) で 1 回洗浄し、TBS-T 中の 5% 脱脂粉乳でブロックし、 ATF7IP (ベチル、A300-169A)、ZMYM2 (ベチル、A301-711A-M)、または LAMIN B1 (Santa Cruz Biotechnology、374015) に対する一次抗体を 4 °C で一晩反応させます。 翌日、膜を TBS-T で 10 分間 3 回洗浄した後、種特異的ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ結合二次抗体とともに室温で 1 時間インキュベートしました。 TBS-T で各 10 分間さらに 3 回洗浄した後、Amersham ECL ウェスタンブロット検出試薬 (GE Healthcare Life Sciences; RPN2109) を使用してシグナルを検出し、暗室で Amersham Hyperfilm ECL (GE Healthcare Life Sciences; 28906836) に露光しました。

Villasenor et al.45 に記載されているように細胞株を生成しました。 元のエントリーベクターの BioID2 酵素のコード配列は、TurboID 酵素のコード配列と交換されました 44。 細胞は、核局在配列を持つ TurboID のみを含むエントリーベクター、TurboID の上流にクローン化された全長マウス ZFP57 cDNA 配列、または UniProt で注釈が付けられている ZFP57 の KRAB ドメインのいずれかでトランスフェクトされました。 すべての細胞は、前述のように、ビオチン検出に対応するために若干の調整を加えて、50 μM ビオチン (Sigma-Aldrich) とともに 12 時間インキュベートした細胞のウェスタンブロットを使用して検証されました。 つまり、膜を0.1% Triton X-100を含むTBS中の5% BSAで1時間ブロックし、0.1% Triton X-100を含むTBS中のストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ(1:20,000)で4℃で一晩染色しました。 メンブレンを0.3% Triton X-100を含むTBSで2回、0.3% Triton X-100を含むTBSで2回、さらに500 mM NaClを加えて洗浄し、最後に0.3% Triton X-100を含むTBSで室温で10分間洗浄した。それぞれ。

TurboID サンプルは、Villaseñor et al.45 に記載されているように調製されました。 簡単に説明すると、細胞を 15 cm プレート上で 4 つずつ増殖させ、70% コンフルエントになった時点で 50 μM ビオチン (Sigma-Aldrich) とともに 12 時間インキュベートし、トリプシンで回収しました。 以下では、サンプルは 4 °C または氷上で処理されました。 細胞ペレットを 5 倍量の核抽出バッファー 1 (NEB1、10 mM HEPES、pH 7.5、10 mM KCl、1 mM EDTA、1.5 mM MgCl2、1 mM ジチオスレイトール (DTT)、1 × EDTA フリー完全プロテアーゼ阻害剤) で膨潤させました。カクテル (PIC; Roche) で 10 分間遠心分離した後、2,000 × g で 10 分間遠心した後、2 倍量の NEB1 中で緩いダウンス雌しべを使用して細胞をホモジナイズし、2,000 × g で 10 分間遠心分離して核を収集し、 450 mM NaCl を含む 1 倍量の核抽出バッファー 2 (NEB2; 20 mM HEPES、pH 7.5、0.2 mM EDTA、1.5 mM MgCl2、20% グリセロール、1 mM DTT および 1× PIC)、タイトダウンスでさらに 10 回ホモジナイズめしべを頭上回転させながら 1 時間インキュベートし、2,000 × g で 10 分間遠心分離して破片を除去した後、上清の塩濃度を 2 倍量の NEB2 で 150 mM NaCl に調整し、最終 NP40 濃度をタンパク質抽出物は、Qubit タンパク質アッセイ キット (Thermo Fisher Scientific、Q33211) を使用して定量化し、IP ごとに等量のタンパク質抽出物を使用しました。 各 IP について、1% コールド フィッシュを含む IP バッファー (IPB; NEB2、150 mM NaCl、0.3% NP40、1 mM DTT、1× PIC) でプレブロックしたストレプトアビジン M-280 Dynabeads (Thermo Fisher Scientific) 40 µlゼラチンを抽出物に加え、回転させながら 4 °C で一晩インキュベートしました。 次に、ビーズを、1 mM DTTおよび1×PICを含むTE中の2% SDSで室温で回転させながら10分間2回洗浄し、続いて高塩緩衝液(50 mM HEPES、pH 7.5、1 mM EDTA、 1% Triton X-100、0.1% デオキシコール酸、0.1% SDS、500 mM NaCl、1 mM DTT、1× PIC)、DOC 緩衝液で 1 回洗浄 (50 mM LiCl、10 mM Tris、pH 8.0、0.5% NP40、0.5 ％デオキシコール酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴおよび１×ＰＩＣ）を用いて２回、そして１ｍＭ ＤＴＴ、１×ＰＩＣを含むＴＥ緩衝液で２回。 洗浄後、ビーズを40μl消化緩衝液（50mMトリス中1M尿素、pH8.0、1mMトリス-(2-カルボキシエチル)-ホスフィン）中の5μg ml-1トリプシン（Promega; V5111）で予め消化した。 26 °C で 2.5 時間、600 rpm で振盪します。 上清を２ｍＭのトリス－（２－カルボキシエチル）－ホスフィンを用いて室温で４５分間さらに還元し、１０ｍＭのクロロアセトアミドを用いて室温で３０分間アルキル化し、光から保護した。 最終消化のために、タンパク質溶液を追加の 0.5 μg トリプシンとともに 37 °C で一晩インキュベートしました。 翌日、トリフルオロ酢酸 (TFA) を最終濃度 0.5%、アセトニトリル (ACN) を最終濃度 3% で添加することにより、消化されたサンプルを C18 StageTips にロードするために準備しました。 社内で製造した C18-StageTips (Functional Genomics Center Zurich) を 100% メタノールで加湿し、溶出液 (60% ACN、0.1% TFA) で 2 回洗浄し、3% ACN と 0.1% TFA で 2 回洗浄してローディングの準備をしました。 。 ペプチド溶液をロードした後、サンプルを遠心分離し、上清をさらに時間をかけてロードした後、3% ACN および 0.1% TFA で 2 回洗浄しました。 最後に、ペプチドを溶出液で 2 回溶出し、液体窒素でショック凍結し、高速真空で乾燥させて遠心分離し、内部保持時間標準ペプチド (iRT、Biognosys) を含む 3% ACN、0.1% ギ酸で再構成しました。 サンプルは、ブロックランダム化サンプルを使用して Orbitrap Fusion 質量分析計 (Thermo Fisher Scientific) に接続された Easy-nLC 1000 HPLC システムで実行されました。

MaxQuant (バージョン 1.5.3.30) は、タンパク質およびペプチドの FDR 値を使用して、手動でアノテーションを付けた夾雑タンパク質と組み合わせたマウス参照プロテオーム (UniProtKB/Swiss-Prot および UniProtKB/TrEMBL) バージョン 2018_12 に基づいて、タンパク質の同定とラベルフリーの定量化71に使用されました。 1%に設定します。 ペルセウスは、以前に説明したように統計分析に使用されました72。 このため、グループごとに 4 つのサンプルのうち 3 つで同定されたタンパク質のみが保存されました。 欠損値は、幅 0.3 で左にシフトした 1.8 標準偏差のガウス分布から補完されました。 t 検定を使用して、FDR 閾値 < 0.05 および S0 値 1 を使用して潜在的な相互作用因子を特定しました。データは R (バージョン 4.0.3) を使用して視覚化しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

配列決定データは、次のアクセッション番号 GSE176461 で NCBI GEO に寄託されています。 質量分析プロテオミクス データは、データセット ID PXD034918 とともに PRIDE パートナー リポジトリ経由で ProteomeXchange Consortium に寄託されています。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

すべての分析は、以前に公開または開発されたツールを使用して実行されました。 カスタム コードは開発または使用されませんでした。

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TC-1 mESC ラインをご提供いただいた A. Dean (NIH/NIDDK) と、プラスミドを共有してくださった M. Buehler (FMI Basel) および C. Földy (University of Zurich) に感謝します。 さらに、CRISPRスクリーニングプロトコルの確立にご協力いただいたG. Schwank氏とそのグループ（チューリッヒ大学）、チューリッヒ機能ゲノミクスセンター（FGCZ）、S3ITチューリッヒ、およびチューリッヒ大学サイトメトリー施設の支援に感謝します。 P.-Aさんに感謝します。 Defossez (パリ ディドロ大学) と Baubec グループのメンバーには、ご意見と建設的な批判をいただきました。 TB は、チューリッヒ大学とユトレヒト大学、スイス国立科学財団 (183722、180354 および 190378)、欧州研究評議会 (865094 - ChromatinLEGO - ERC-2019-COG)、および EMBO Young Investigator プログラムからの支援に感謝します。 NS は EMBO とチューリッヒ大学の博士研究員の支援を受けており、SNSF Ambizione 助成研究員 (186012) です。 RV はチューリッヒ大学からの支援に感謝します (UZH ポスドク助成金 FK-21-060)。 DS は、Novartis Research Foundation、欧州連合 (EU) の Horizo​​n 2020 研究およびイノベーション プログラム助成契約 (667951-ReadMe および 884664-DNAccess) に基づく欧州研究評議会、およびスイス国立科学財団 (310030B_176394) からの支援を認めています。 ARK は、欧州分子生物学研究所、ドイツ研究所 (KR 5247/1-1) およびスイス国立基金 Ambizione (助成金 PZOOP3_161493) からの支援を認めています。

ニーナ・シュモルカ

現在の住所: チューリッヒ大学実験免疫学研究所、チューリッヒ、スイス

ロドリゴ・ビジャセニョール

現在の住所: 分子生物学部門、バイオメディカル センター ミュンヘン、ルートヴィヒ マクシミリアン大学、ミュンヘン、ドイツ

シルヴィア・ドムケ

現在の住所: ワシントン大学ゲノム科学部、シアトル、ワシントン州、米国

アルノー・R・クレブス

現在の住所: 欧州分子生物学研究所 (EMBL)、ゲノム生物学ユニット、ハイデルベルク、ドイツ

チューリッヒ大学、病気の分子メカニズム学部、チューリッヒ、スイス

ステファン・バッツ、ニーナ・シュモルカ、イノ・D・カレメイカー、ロドリゴ・ビジャセニョール、イザベル・シュワルツ、タンケイ・バウベック

スイス、チューリッヒのチューリッヒ大学およびチューリッヒ工科大学生命科学チューリッヒ大学院の分子生命科学博士課程

ステファン・バッツ

フリードリヒ・ミーッシャー生物医学研究所、バーゼル、スイス

シルヴィア・ドムケ、フロリアン・リーナート、アルノー・R・クレブス、ダーク・シューベラー

バーゼル大学理学部、バーゼル、スイス

シルヴィア・ドムケ、フロリアン・リーナート、ディルク・シューベラー

オーストリア分子バイオテクノロジー研究所 (IMBA)、ウィーン バイオセンター (VBC)、ウィーン、オーストリア

エスター・CH・ウイッテヴァール & ウルリッヒ・エリング

分子病理学研究所 (IMP)、ウィーン バイオセンター (VBC)、ウィーン、オーストリア

ジュリアン・ジュード & ヨハネス・ズーバー

ユトレヒト大学理学部生物学部生物力学・生物複雑性研究所ゲノム生物学およびエピジェネティクス部門（オランダ、ユトレヒト）

ナタリー・P・デ・ワゲナール、シュエ・バオ、トゥンケイ・バウベック

ウィーン医科大学、ウィーンバイオセンター (VBC)、ウィーン、オーストリア

ジョン・ズーバー

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SB と TB が研究を設計しました。 SB、NS、IK、RV、IS、SD、FL、NdW​​、XB、TB が実験を行いました。 JJ、UE、JZ、および UE は、ターゲットを絞った CRISPR ライブラリを設計および生成しました。 AK と DS は、この研究で使用された細胞株とデータセットを提供しました。 SB と TB は、すべての著者からの意見をもとに原稿を書きました。

タンケイ・ボーベックへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Genetics は、この研究の査読に貢献してくれた Maxim Greenberg と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a) マウス胚性幹細胞の Airn ICR 遺伝子座のゲノムブラウザスナップショット。 クロマチン修飾の ChIP-seq トラック、転写活性の RNA-seq データ、クロマチンのアクセス可能性の DHS-seq、DNA メチル化の WGBS データ、およびローカル GC 密度 (パーセント) が示されています。 実験に使用された ICR 配列が強調表示されます。 b) トランスフェクション前の in vitro メチル化および非メチル化プラスミドの制限消化のための代表的なアガロースゲル。 HpaII と MspI は同じ認識部位を共有していますが、HpaII は CpG メチル化によってブロックされます。 実験は RMCE 統合前に少なくとも 2 回繰り返されました。 分子サイズマーカーが示されています。 c) H19 の異所性統合 DNA フラグメントの概略図。縦線は個々の CpG 部位 (上) と重亜硫酸塩 PCR を使用したプレメチル化配列および非メチル化配列の DNA メチル化の単一分子測定 (下) を示しています。 de) (c) と同じ: Zrsr1 (d) および Kcnq1ot1 (e) の場合。 f）Igf2r配偶体DMRの異所性統合DNA断片の概略図。縦線は個々のCpG部位（上）と重亜硫酸塩PCRを用いたプレメチル化および非メチル化配列のDNAメチル化の単一分子測定（下）を示しています。 gi) f と同じ: Hes3 (g)、Syt1 (h)、および Tcl1 (i)。 gi の非メチル化 (-M.SssI) 重亜硫酸塩のデータは Lienert らから入手し 3、比較のために示しました。

ソースデータ

a）長期培養（連続20継代以上）、異なるゲノム部位へのランダム組み込み、神経前駆細胞（NPC）への分化中、または2iで10日間培養した後のAirn ICRのメチル化分析の要約表。 ｂｄ）ａに要約されたデータに対応する亜硫酸水素塩ＰＣＲからの単一分子測定。 e）CRISPR媒介Zfp57 KO後の異所性および内因性Airn ICRのメチル化分析。 三角形は、ZFP57 モチーフ内の CpG を示します。 bsPCRで解析した領域を示します。 f) 研究でテストされた Airn ICR フラグメントの概略図 (上) および個々のフラグメントからの単一分子重亜硫酸塩 PCR 結果 (下) g) サイズ、CpG 密度、GC を含む、H19 ICR フラグメントのメチル化分析の概要表コンテンツ情報。 h) gにまとめたデータに対応する亜硫酸水素塩PCRからの単一分子測定。

a) ゲノムワイド 1 kb ウィンドウの配列特性の分析。 黄色の点は、この研究で使用された ICR 配列を示します。 赤い点は Airn 様の断片を示します。 b) 4 つすべての Airn 様配列のゲノムブラウザスナップショット。 強調表示されたボックスは、RMCE 実験で使用された DNA 配列を示します。 c) Airn ICRと比較した、選択されたAirn様配列の配列特性。 垂直線は配列内の個々の CpG 部位に対応します。 d) 選択された Airn 様配列の GC パーセンテージ。 e) fで要約したデータの単一分子表現。 f) 比較のための Airn ICR を含む、すべての Airn 様配列のメチル化解析の表概要。

a) Airn ICR のインシリコ シーケンス シャッフルを示すワークフロー。 b) 元の Airn シーケンスと比較した、最も発散性の高いシャッフルされたシーケンス (Airn シャッフルされた) のシーケンス特性。 ｃ）野生型Ａｉｒｎ ＩＣＲにおけるＺＦＰ５７結合のＢＰＮｅｔ評価、およびシャッフルされたＡｉｒｎ ＩＣＲにおける結合の予測。 ｄ）シャッフルされたＡｉｒｎ配列からの１０ｂｐの置換をスキャンして、野生型ＡｉｒｎにおけるＺＦＰ５７結合を予測した。 各行は、1 つの置換実験からの予測を表します。 e）シャッフルされたAirn +再構成されたZFP57結合モチーフにおけるZFP57結合予測。

a) ギブソンアセンブリのための同一のオーバーハング配列を使用した、異なるプロモーターを備えた GFP レポーターコンストラクトの設計、および b) ICR を持たない非メチル化の空のレポーターコンストラクトを保持する細胞の GFP 発現のフローサイトメトリー分析。 c) 16、23、および30日目に測定したEF1a (上) またはPGK (下) プロモーターと組み合わせたメチル化ICRレポーターの抑制の安定性を示す、集団(個々のクローン由来)あたりのGFP陽性細胞の割合を示すフローサイトメトリー分析トランスフェクション後。 さらに、メチル化プロモーターのみ (ICR なし) またはコントロールとして Dazl プロモーターと組み合わせたレポーターを受け取った細胞の GFP パーセンテージが示されています。 各ドットは、独立して派生したクローンを示します。 d) H19-EF1a レポーターを含む細胞のフローサイトメトリー分析。 e) 血清、2i、または2i + ビタミンC中で12日間培養したAirn-pCAGGSレポーターを含む代表的なmESCクローンのフローサイトメトリー分析。 f) 異なる培地条件で8日後の、メチル化Airn-CAGレポーターを用いた3つの独立したクローンのフローサイトメトリー分析。 g) 異なる増殖条件における異なるICR-プロモーターの組み合わせの再活性化の時間経過。 データポイントは 3 つの独立したクローンの平均値を示します。 エラーバーは平均値の標準誤差を示します。

a) Uhrf1 および Dnmt1 遺伝子をターゲットとするガイド RNA でトランスフェクトしてから 8 日後の GFP 再活性化を、非ターゲティング ガイド RNA でトランスフェクトした細胞と比較したフローサイトメトリー分析。 KO 細胞の事前選択を行わない、標的細胞の集団全体からのデータが示されています。 b) a の結果を要約したもの。 各ドットは、標的細胞の集団全体における GFP 陽性細胞の割合を示します。 c) DNA メチル化阻害剤 GSK-3484862 で 2 日間処理し (上)、その後 7 日間洗い流した、メチル化済み Airn-EF1a-GFP のフローサイトメトリー分析。これは、レポーターが一度再活性化されると再びサイレントにならないことを示しています。

a) ChromMM ライブラリを使用した CRISPR スクリーニングの FACS ゲーティング戦略。 形質導入された mESC は、導入遺伝子を含む sgRNA から共発現される CD90.1 細胞表面マーカーに基づいて選択されます。 再活性化された細胞は、GFP 発現に基づいて分類されます (たとえば、8 日)。 b) ChromMM または 3 つの独立したクローンを使用して実行されたコントロール ライブラリを使用した CRISPR スクリーニングの経時的実験。 エラーバーは平均値の標準誤差を示します。 ｃｄ）血清および２ｉそれぞれにおける、クロマチンターゲティングライブラリ対非ターゲティング対照ライブラリで形質導入された細胞株のフローサイトメトリー分析。 軸は、CRISPR スクリーニング集団における GFP 陽性細胞の割合を示しています。

a) 血清条件におけるスクリーニングのランクプロット。 水平破線は、p 値のしきい値 0.05 を示します。 P 値は、MAGeCK RRA (ロバスト ランク アグリゲーション) を使用して取得されました。 赤い点はICR制御に関連する既知のヘテロクロマチン因子を示し、青い点は複数のスクリーニングで見つかった遺伝子を示し、緑の点はポジティブコントロールを示します。 b) 2i 条件で増殖させた Airn および Kcnq1ot1 レポーター細胞株に対する CRISPR ヒットの概要。 水平破線は、MAGeCK RRA (ロバスト ランク集計) を使用して取得された p 値のしきい値 0.05 を示します。 c) 2i 条件のスクリーンのランク プロット。 水平破線は、MAGeCK RRA (ロバスト ランク集計) を使用して取得された p 値のしきい値 0.05 を示します。 d) 血清増殖させた Airn レポーター細胞株の EpiTF ライブラリーを使用した CRISPR ヒットの概要。 水平破線は、MAGeCK RRA (ロバスト ランク集計) を使用して取得された p 値のしきい値 0.05 を示します。 e）EpiTFライブラリーを使用した血清中のAirn pEF1aレポーターを使用したスクリーニングのランクプロット。 水平破線は、MAGeCK RRA (ロバスト ランク集計) を使用して取得された p 値のしきい値 0.05 を示します。 f) 示された遺伝子に対するガイド RNA の単一トランスフェクションを使用した潜在的な候補の検証。 GFP 発現はトランスフェクションの 12 日後に測定されました。 トランスフェクションは技術的反復で実行されました。 潜在的な候補は、1 つの独立したガイドと ChromMM ライブラリからの 1 つのガイドを使用してターゲット化されました。 データは、CRISPR ターゲティング後のプール内の陽性細胞の割合を示しています。 g) STRING データベースを使用したすべての潜在的な候補者のネットワーク表現。 ピンクのエッジは実験的に決定された相互作用を示します。 シアンのエッジは、厳選されたデータベースからの既知の相互作用を示します。 緑、赤、青のエッジは、それぞれ遺伝子近傍、遺伝子融合、遺伝子の共起に基づいて予測される相互作用を示します。 黄色と黒のエッジは、それぞれテキストマイニングと共表現に基づいて予測されたインタラクションです。

a) SETDB1、ZFP57、または ZFP57 と SETDB1 が共結合するゲノム部位と一致する ZMYM2 または ATF7IP ピークのパーセンテージを示すピーク重複分析。 b) ZMYM2 ピークでの ZMYM2 結合を示し、SETB1 および SETB1 非依存ピークと重なるピークによって分離されていることを示すヒートマップ。 同じピークセットに対する H3K9me3 ChIP-seq 信号が示されています。 c) 独立した ZMYM2 および ATF7IP ピークでの WGBS メチル化分析 (N = 159)。 ZMYM2 ピークは、SETDB1 と重複する部位 (N = 4201) と重複しない部位 (N = 10292) によって分離されます。 箱ひげ図は、四分位範囲を箱 (IQR) で表し、箱の周囲の 1.5 x IQR の範囲内の最低値と最高値をひげで示します。 d）野生型およびZfp57-KO細胞の内在性Airn ICRにおけるATF7IPおよびZMYM2結合のChIP-qPCR。 ChIP 濃縮は 5% インプットに正規化され、バックグラウンドのゲノム部位 (遺伝子間) に合わせて校正されます。 独立した技術的複製が示されています。 e）バックグラウンドのTurboID細胞株（nTurbo）よりもZFP57_dZNF-TurboID（KRABドメインのみ）が豊富なタンパク質を示すボルケーノプロット。 統計的に濃縮されたタンパク質が示されています (FDR 補正両側 t 検定: FDR = 0.05、s0 = 1、n = 4 技術的反復)。 f）初期胚発生中のさまざまな時点で測定された、ZFP57、ATF7IP、およびZMYM2の発現レベル。 参考文献から取得した RPKM 正規化リードを示します。 g) 特異的抗体を使用した、野生型およびKO細胞におけるATF7IPおよびZMYM2のイムノブロット検出。 ラミンB1はローディングコントロールとして使用されます。 アスタリスクは、WGBS 分析に使用した Zmym2-KO クローンを示します。 実験は少なくとも３回繰り返された。 分子量マーカーが示されています。

ソースデータ

a) マウスゲノムの少なくとも 10 倍をカバーするすべての CpG にわたる平均 DNA メチル化を示す箱ひげ図。 四分位範囲はボックス (IQR) として表示され、ボックスの周囲の 1.5 x IQR の範囲内の最低値と最高値がひげとして表示されます。 分析された独立した CpG の数が示されています。 b) スパイクインされたラムダ DNA およびメチル化 T7 ファージ DNA からの亜硫酸水素塩変換コントロールは、DNA 分子の完全な変換を示します。 四分位範囲はボックス (IQR) として表示され、ボックスの周囲の 1.5 x IQR の範囲内の最低値と最高値がひげとして表示されます。 分析された独立した CpG の数が示されます。 c）野生型、Atf7ip-KO、およびZmym2-KO mESCにおけるすべての注釈付きICRのWGBSデータ分析。 d）野生型、Atf7ip-KO、およびZmym2-KO mESCにおけるAirn、Kcnqot1およびPeg10 ICRの標的重亜硫酸塩配列決定実験からの個々のメチル化プロファイル。 視覚化を改善するために、サンプルあたり 1000 個のアンプリコンがランダムにサンプリングされました。 e）野生型、Atf7ip-KO、およびZmym2-KO mESCのすべてのICRでH3K9me3を示すヒートマップ。 20 bp ごとのライブラリー正規化リードを示します。

CRISPR スクリーニング、bioID MS 実験、および DNA 配列情報に関連する追加情報と数値を含む補足表。

クロップされていない DNA ゲル。

切り取られていないウエスタンブロット。

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転載と許可

Butz、S.、Schmolka、N.、Karemaker、ID 他。 DNA 配列とクロマチン修飾因子は協力して、インプリンティング制御領域にエピジェネティックな双安定性を与えます。 Nat Genet 54、1702–1710 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41588-022-01210-z

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受信日: 2021 年 6 月 10 日

受理日: 2022 年 9 月 19 日

公開日: 2022 年 11 月 4 日

発行日：2022年11月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-022-01210-z

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エピジェネティクスとクロマチン (2023)