関節リウマチの発症におけるリウマチ因子誘導に対する歯周微生物叢の異なる影響

Rapporti scientifici Volume 12,

Scientific Reports volume 12、記事番号: 19636 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

歯周病菌への曝露と関節リウマチ（RA）に関連する自己抗体の発生との関連性は広く受け入れられています。しかし、歯周病菌とリウマチ因子（RF）の間の直接的な因果関係は、現時点では完全には理解されていません。歯周病菌がRF状態に影響を与えるかどうかを調査しました。前臨床、新規発症、または慢性関節リウマチの患者は歯周検査を受け、16S rRNA シーケンスによる歯肉縁下のマイクロバイオームの調査を受けました。関節炎と RF 誘発の程度を、さまざまな歯周病菌種を経口接種したコラーゲン誘発性関節炎 (CIA) マウスで調べました。続いて、マウス脾臓細胞の単一細胞 RNA シーケンス分析を実行しました。前臨床関節リウマチの患者は、歯周炎の重症度が同等であるにもかかわらず、新規発症または慢性関節リウマチの患者と比較して、歯肉下微生物叢におけるポルフィロモナダ科の存在量の増加を示しました。注目すべきことに、高陽性RF患者と陰性または低陽性RF患者との間には、明確な歯肉縁下の微生物群集が見出された(p=0.022)。 CIA マウスにおける歯周病原体 P. gingivalis および Treponema denticola による口腔感染も同様に関節炎スコアを高めましたが、RF 誘発のレベルは異なりました。 B細胞受容体シグナル伝達、B細胞の増殖、活性化、分化、CD4+ T細胞の共刺激とサイトカイン産生に関連する遺伝子は、さまざまな細菌に曝露されたマウスにおけるRFの差次的誘導に関与していた。要約すると、歯周微生物叢は、RA 発症時の体液性免疫応答に影響を与えることにより、RF 状態を形成する可能性があります。

関節リウマチ (RA) は複雑な自己免疫疾患であり、患者の遺伝的背景と環境要因の相互作用によって引き起こされます。歯周炎は関節リウマチの環境誘因と考えられており、主要な歯周病原体である P. gingivalis は自己免疫反応や関節炎の発症を促進する可能性があります 1。 P. ジンジバリスの口腔感染は、実験動物モデルにおいて歯周炎および自己免疫性関節炎を誘発しました2、3。コントロールゲルに曝露されたルイスラットではなく、P. ジンジバリスに曝露されたルイスラットは、関節の炎症と破壊を発症しました2。私たちのグループによる以前の研究では、P. ジンジバリスに感染したコラーゲン誘発性関節炎 (CIA) マウスは、非感染 CIA マウスよりも重篤な関節炎を示し、関節内のタンパク質のシトルリン化が増加していることが判明しました 3。私たちのグループは、その後の研究で、抗線毛抗体によって P. gingivalis の経口感染を中断すると、P. gingivalis 感染による自己免疫性関節炎の増加が回復したことも発見しました4。これらの結果は、歯周炎とポルフィロモナス・ジンジバリスが関節リウマチの発症に重要な役割を果たしていることを示しています。

歯周炎は確立された関節リウマチ患者に蔓延しています。しかし、早期または前臨床の RA 患者にはすでに存在しており、対照よりもより頻繁かつより進行した病因を示しています 5、6、7、8。 Scherらは、初期RA患者の歯肉縁下の微生物叢が対照の微生物叢とは異なることを発見したが、微生物叢の偏りは歯周炎の存在と重症度に依存していた9。対照的に、歯周病で健康な関節リウマチ患者では、対照患者と比較すると、異なる歯肉縁下微生物叢が見られ、この変化が関節リウマチ特異的であることが示されています10。最近の研究では、RA11のリスクがある抗シトルリン化タンパク質抗体（ACPA）陽性者の歯周の健康な部位と疾患部位の両方で、P.ジンジバリスの存在量が増加し、歯肉下微生物叢が変化することが実証された。総合すると、これらは、歯周炎の重症度に関係なく、歯周微生物叢の変化が関節リウマチの発症に先行することを示唆しています。

リウマチ因子（RF）やACPAなどのRAに関連する自己抗体は、RAの発症前に体内に出現します12、13、14。 RF および ACPA の力価は前臨床段階で著しく増加することが報告されています 13,14。さらに、P. gingivalis に対する血清抗体は関節炎の前臨床段階で増加し、RA 診断後は安定しました 15。したがって、歯周病菌への曝露と RA 自己抗体の発現との関連が示唆される可能性があります。しかし、歯周病原菌とACPA1、10、16、17の関連などのよく研究されたメカニズムと比較して、RF状態における歯周病原菌の役割はRAでは完全には理解されていない。いくつかの研究では歯周病菌とRFの間に正の関係があることが示されていますが、他の研究ではそうではありません18,19。これらの矛盾した結果は、細菌の少量のサンプルのみを調査すること、または細菌量の測定にハイスループットのシーケンス技術を使用しないことなど、これらの研究の限界に起因している可能性があります。

この研究では、メタゲノム配列決定に基づいて、前臨床RA（pre-RA）、新規発症RA（NORA）、および慢性RA群の患者の歯肉縁下マイクロバイオームを（歯周炎の状態とともに）調査しました。次に、各 RF 状態に応じて歯肉縁下のマイクロバイオームを比較し、歯周病菌と RF の関連性を調べました。さらに、歯周細菌感染とRF誘導の間の潜在的な因果関係を確認するために、マウスモデル実験と単一細胞RNA配列分析が行われました。

研究プロトコールは、韓国カトリック大学ソウル聖母病院の治験審査委員会によって承認されており（承認番号：KC15RISI0612）、すべての研究は関連ガイドラインおよび規制に従って実施されました。研究対象者は、ソウル聖母病院リウマチセンターから登録されました。前RA患者、NORA患者、および慢性RA患者は、各被験者から書面によるインフォームドコンセントが得られた後、連続して登録された。 Pre-RAは、被験者のRFおよび/またはACPAが陽性であるが、身体検査および筋骨格超音波検査で明らかな滑膜炎の証拠が示されなかった場合に定義されました。 NORA および慢性 RA の患者は、診断時に米国リウマチ学会および欧州対リウマチ連盟の RA 分類基準を満たした患者でした 20。NORA 患者の罹患期間は 6 か月未満でしたが、慢性 RA 患者は6ヶ月以上経過した状態。除外基準には、3 か月以内の抗生物質の使用、および抗生物質の使用を必要とする病状が含まれていました。歯肉縁下のプラークサンプリングに同意した患者に対してマイクロバイオーム分析を実施した。歯周検査および歯肉縁下のマイクロバイオーム分析を受けた研究集団の特徴は、それぞれ補足表S1およびS2に記載されています。

歯周プローブの深さ（PPD）は、この研究の参加者から歯の表面と歯肉の間の空間に歯周プローブを挿入することによって測定されました。自由歯肉縁から歯肉溝の基部までの距離をPPDとして定義した。歯肉下のプラークサンプルは、歯周キュレットを使用して最も深い歯間部位から収集されました。サンプルはマイクロチューブに入れ、さらなる分析まで-80℃で凍結保存しました。

細菌のゲノム DNA をプラークサンプルから抽出しました。配列決定は、抽出された DNA から 16S rRNA 遺伝子の V3-V4 領域をターゲットにしました。 16S 遺伝子は、フォワードプライマー 341F (5'-TCGTCGGCAGCGTC-AGATGTGTATAAGAGACAG-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'、下線の配列は標的領域プライマーを示す) およびリバースプライマー 805R (5'-GTCTCGTGGGCTCGG-AGATGTGTATAAGAGACAG-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') を使用して増幅しました。次に、Illumina NexTera バーコードを取り付けるための二次増幅を、i5 フォワードプライマー (5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-XXXXXXXX-TCGTCGGCAGCGTC-3'、X はバーコード領域を示します) および i7 リバースプライマー (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-XXXXXXXX-GTCTCGTGGGCTCGG-) を使用して実行しました。 3'）。ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 産物は、Gel Doc System (Bio-Rad、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ) を使用して 1% アガロースゲル電気泳動で確認および視覚化されました。増幅産物は、CleanPCR (CleanNA、Waddinxveen、オランダ) を使用して精製しました。同濃度の精製産物を一緒にプールし、CleanPCR (CleanNA) を使用して短い断片 (非標的産物) を除去しました。品質と製品サイズは、DNA 7500 チップを使用して Bioanalyzer 2100 (Agilent、パロアルト、カリフォルニア州、米国) で評価されました。混合アンプリコンをプールし、ChunLab, Inc. (ソウル、韓国) で、Illumina MiSeq Sequencing システム (Illumina、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) を使用したペアエンド法 (250 bp x2) を使用して配列決定を実行しました。メーカーの指示に従います。

生の 16S rRNA 遺伝子配列の処理は、Trimmomatic 0.32 を使用して低品質の配列を除去することから始まります。品質フィルタリングの後、同じ PCR アンプリコンの各末端を表す 2 つの配列が PANDAseq を使用してマージされました。プライマーは、ChunLab の社内プログラムを使用してトリミングされました。シーケンスは DUDE-Seq を使用してノイズ除去され、計算時間を短縮するためにこのステップで同一のシーケンスの複製が解除されました。ノイズが除去され複製が解除された配列は、分類学的割り当ての対象となりました。 USEARCH プログラム (8.1.1861_i86linux32) を使用して、EzBioCloud 16S データベースに対するクエリ次世代シーケンシング (NGS) リードの配列類似性を検索および計算しました。 97% の 16S 類似性が種レベルの同定のカットオフとして使用されました。 UCHIME プログラムと EzBioCloud の非キメラ 16S rRNA データベースを使用して、残りのリードのキメラをチェックしました。次に、CD-HIT と UCLUST を使用して配列データをクラスター化しました。

生後 5 週間の雄 DBA/1J マウスを OrientBio (城南、韓国) から購入しました。マウスは、韓国カトリック大学で無病原体条件下で維持された。すべての実験手順は、韓国カトリック大学の施設内動物管理使用委員会によって提供された実験動物福祉法、実験動物の管理と使用に関するガイド、齧歯動物実験のガイドラインとポリシーに従って実行されました（承認）番号: 2020-0011-01)。

自己免疫性関節炎を誘導するために、DBA/1J マウスを完全フロイントアジュバント (Chondrex) で乳化した II 型コラーゲン (Chondrex、レドモンド、ワシントン州、米国) で免疫しました。最初の免疫から２１日後、不完全フロイントアジュバント（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）中に乳化させたＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）の追加免疫をマウスの皮内に注射した。関節炎の発症は週に 2 ～ 3 回評価されました。各足の関節炎スコアは、炎症の程度に応じて 0 から 4 の間で等級分けされました。0 = 紅斑と腫れの証拠なし。 1 = 足根骨または足関節に限定された軽度の腫れ。 2 = 足首から足根骨まで広がる軽度の腫れ。 3 = 足首から中足骨関節にかけての中程度の腫れ。 4 = 足首、足、指に及ぶ重度の腫れ、または四肢の強直。総関節炎スコアは、4 本の足すべての各関節炎スコアの合計でした。

ポルフィロモナスジンジバリス株アメリカンタイプカルチャーコレクション (ATCC) 33277 および T. デンティコラ株 ATCC 35405 は、ATCC (米国バージニア州マナッサス) から購入しました。細菌は、37℃の嫌気性環境で培養されました（BD GasPak TM 150 System; BD、Franklin Lakes、NJ、USA）。

2% カルボキシメチルセルロースを含むリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 30 μL (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) に懸濁した 1 × 109 コロニー形成単位の P. gingivalis または T. denticola をマウスに接種しました。または、コントロールとして、2% カルボキシメチルセルロース (Sigma-Aldrich) を含む PBS 30 μL のみ 3。次に、細菌含有ゲルまたは対照ゲルを、最初の免疫の 14 日前から始めて 3 週間、週に 3 回、マウスの口腔に直接接種しました。これは CIA モデルの確立中に行われました。私たちのグループは以前、同じ環境で歯周病菌を経口接種した後の歯周炎の誘発を確認しました4。

マウス RF-IgM ELISA キット (MyBioSource、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) およびマウス ACPA ELISA キット (MyBioSource) を使用して、マウス血清中のリウマチ因子 (RF) および抗シトルリン化タンパク質抗体 (ACPA) の濃度を測定しました。、それぞれ。

マウスを屠殺し、脾細胞を取得した。マウスの脾臓を採取し、すりつぶした脾臓を40μmのセルストレーナーを通して氷冷RPMI培地に濾すことによって脾細胞を単離した。赤血球は、Gibco™ ACK 溶解バッファーを 10 分間添加して溶解しました。残りの細胞を 1,500 rpm、4 °C で 5 分間遠心分離し、上清を除去しました。脾細胞をもう一度洗浄し、1 × 107 細胞/mL の濃度で再懸濁して、単一細胞分析を実行しました。

メーカーの推奨に従い、DB Rhapsody Single-Cell Analysis System を使用して単一細胞の捕捉と cDNA 合成を実行しました。ライブラリーは、シーケンスのために Illumina Next-Seq で複数回実行されました。 R を使用して、SC シーケンス Seurat パッケージバージョン 3.2.322 のデータを使用してセルの教師なしクラスタリングを実行しました。 3 細胞未満で発現した遺伝子はフィルターで除外されました。我々は、細胞あたり発現遺伝子数が 200 以上または 2500 未満、ミトコンドリア遺伝子が 25% 未満、UMI が 20,000 未満の細胞を処理しました 23。次にスーラ演算により遺伝子の変動係数を計算した。スーラの「vst」法を使用して、各サンプルから 2,000 個の非常に可変性の高い遺伝子を同定し、異なるサンプルに由来する細胞を整列できるようにしました。すべてのデータの次元を削減するために、最初の 2000 個の最も改変可能な遺伝子に基づいて主座標分析 (PCoA) が実行されました。 k 最近傍グラフは、最初の 10 個の重要な主成分の空間内のユークリッド距離を使用して構築されました。 Louvain モジュール最適化アルゴリズムを使用して、セルを画像内にクラスター化しました。次に、教師なしクラスタリングの最終結果は、t 分布確率的近傍埋め込み (tSNE) 分析によって視覚化されました。

各クラスターで上方制御された遺伝子と下方制御された遺伝子を選択しました。これらは、Seurat の実装における Wilcoxon 順位和検定に基づいた他のクラスターとの関係であり、他のクラスターと比較して >0.25 対数倍変化、および ap <0.05 でした (付録の eTable 1)。各クラスター内の高度に差次的に発現される遺伝子 (DEG) が計算され、それぞれの細胞のアイデンティティを手動で注釈付けできるようになりました。同一性は、自動参照ベースのアノテーション用の scCATCH を使用して確認されました 24。

R でヒートマップ (可変遺伝子を含む選択された遺伝子セット) を構築するために、分散安定化読み取りカウントに対して K 平均法クラスタリングが実行されました。行と列の両方の K 平均法オプションとユークリッドクラスタリング距離が、pheatmap 関数と一緒に適用されました。。我々は、PANTHER (進化的関係によるタンパク質分析) 分類システム (http://geneontology.org) 25 を使用した遺伝子オントロジー分析を使用して、結果として得られたクラスターの割り当てられた遺伝子に注釈を付けました。

PPD と分類学的相対存在量は、Wilcoxon 順位和検定または Kruskal-Wallis 検定を使用して、さまざまな患者グループ間で比較されました。 UniFrac 距離の主座標分析 (PCoA) と PERMANOVA テストを実行して、各グループの微生物群集 (ベータ多様性) を比較しました。差次的に存在する分類群は、線形判別分析効果サイズ (LEfSe) を使用して選択されました。対応のない t 検定を使用して、CIA マウスグループの関節炎スコアと RF および ACPA レベルを比較しました。統計分析は、GraphPad Prism バージョン 5 (GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ) および EzBioCloud Web ベースソフトウェア (https://www.ezbiocloud.net) を使用して実行されました。

PPD 測定は、前 RA 患者 18 名、NORA 患者 18 名、慢性 RA 患者 49 名で実施されました。 PPDは、前関節リウマチ、NORA、および慢性関節リウマチの患者の間で差はなく（それぞれ中央値5.5、6、6 mm、p = 0.525、クラスカル・ウォリス検定、図1A）、すべての患者が同様の程度を示しました。歯周炎の。次に、対照患者と比較して、前RA患者の歯周炎の有病率を調べました。 RAを患っていない対照被験者は、年齢、性別、BMIが一致しました。糖尿病や高血圧の有無、喫煙状況にも応じてそれらは一致した。これらのデータは、韓国国民健康栄養調査データベースから抽出されたものです。 72 人の対応対照被験者と比較した場合、前 RA 患者は歯周炎を患う可能性が高く、前 RA 患者の 44.4% と 50% の PPD はそれぞれ 4 ～ 5 mm と 6 mm 以上でした。一方、対照被験者の19.4％と4.2％は、それぞれPPDが4〜5 mmと6 mm以上でした（p <0.001、フィッシャーの直接確率検定、補足図S1）。要約すると、前RA患者は対照患者よりも歯周炎を患う頻度が高かった。さらに、前関節リウマチ患者の歯周炎の程度は、確立した関節リウマチ患者の歯周炎の程度と同様でした。

前臨床関節リウマチ（前RA）、新規発症RA（NORA）、慢性RA患者における歯周炎と歯肉縁下の微生物叢。 (A) 前RA患者、NORA患者、および慢性RA患者間の歯周探査深さ(PPD)の比較(ns:有意ではない、クラスカル・ウォリス検定)。 (B) 異なる RA 状態間の歯肉下微生物叢のベータ多様性は、UniFrac 距離行列 (p = 0.388、PERMANOVA) を使用した主座標分析 (PCoA) プロットによって表されます。 (C) 前RA患者、NORA患者、および慢性RA患者間の門レベルでの歯肉縁下の微生物組成の比較(クラスカル-ウォリス検定)。 (D) 線形判別分析効果サイズ (LEfSe) 分析により、前 RA、NORA、および慢性 RA の患者間で異なる豊富な分類群が特定されます。赤いバーと青いバーは、それぞれ前RAグループと慢性RAグループに豊富な分類群を示します。

歯肉縁下マイクロバイオームは、前RA患者5名、NORA患者2名、慢性RA患者3名で調査された。補足表 S2 に見られるように、彼らは全員非喫煙者であり、ACPA 陽性率が高かった。ただし、RF力価の程度はさまざまでした。歯肉下の微生物群集は、UniFrac 距離の PCoA に関して RA 群間で有意な差はありませんでした (p = 0.388、PERMANOVA、図 1B)。門レベルの分類群の相対存在量は、RA グループ間で有意な差はありませんでした (すべて p >0.1、クラスカル-ワリス検定、図 1C)。すべての分類レベルを含めると、LEfSe 分析を使用して、前 RA、NORA、および慢性 RA の患者間で異なる豊富な分類群が同定されました (図 1D)。ポルフィロモナダ科の細菌およびサッカリモナス種は、前RA患者に豊富に存在していましたが、ストレプトコッカス・アンギノサスは慢性RA患者にのみ豊富でした。

前RA、NORA、および慢性RAの患者は、RF力価に基づいて、陰性または低RFグループと高RFグループの2つのグループに分けられました。歯周炎の重症度および PPD は、陰性または低 RF の患者と高 RF の患者の間で差がないにもかかわらず (図 2A)、歯肉下の微生物組成はこれらのグループ間で大きく異なりました。 UniFrac 距離の PCoA により、RF 状態に応じた微生物群集のクラスター化が明らかになりました (p = 0.022、PERMANOVA、図 2B)。門レベルでの分類学的相対存在量を比較すると、フソバクテリア、サッカリバクテリア（旧TM7）、およびスピロヘータが、陰性または低RFの患者と比較して、高RFの患者に有意に豊富であることが示されました（p = 0.047、p = 0.028、p = 0.009、それぞれ、Wilcoxon 順位和検定、図 2C)。すべての分類レベルでの LEfSe 分析により、陰性または低 RF の患者と高 RF の患者の間で 43 の異なる豊富な分類群が示されました (図 2D)。具体的には、フソバクテリア門、サッカリバクテリア門、スピロヘータ門、サッカリモナス科、ポルフィロモナス科、スピロヘータ科が高 RF グループに豊富に含まれていました。

リウマチ因子 (RF) の状態に応じた歯周炎と歯肉縁下のマイクロバイオーム。 (A) 陰性または低 RF の患者と高 RF の患者との間の PPD の比較 (ns: 有意ではない、Wilcoxon 順位和検定)。 (B) 異なる RF ステータス間の歯肉下微生物叢のベータ多様性は、UniFrac 距離行列 (p = 0.022、PERMANOVA) を使用した PCoA プロットによって表されます。データは、歯肉下のマイクロバイオーム分析を受けた同じ 10 人の患者からのものでした。 (C) 陰性または低 RF の患者と高 RF の患者間の門レベルでの歯肉縁下の微生物組成の比較 (*p<0.05、**p<0.01、Wilcoxon 順位和検定)。 (D) LEfSe 分析により、陰性または低 RF の患者 (赤色のバー) と高 RF の患者 (緑色のバー) の間で、差次的に豊富な分類群が特定されます。

異なる歯周細菌が異なるレベルの RF を誘発するかどうかを調べるために、CIA モデルの確立中に DBA/1J マウスに異なる細菌を経口接種しました。経口細菌接種の概略スケジュールを図３Ａに示す。関節炎は、コントロールゲルを接種したCIAマウス群と、P.ジンジバリスまたはT.デンティコラ含有ゲルを接種した群で発症した(図3B)。最初の免疫から 55 日後、関節炎スコアは、対照マウスよりも P. gingivalis および T. denticola を接種した CIA マウスの方が高く、歯周病菌を接種した CIA マウスではより重度の関節炎が発症したことが示されました。関節炎の重症度は、P. ジンジバリスを接種したマウスとT. デンティコラを接種したマウスの間で有意な差はないようでしたが、RFの力価は、P. ジンジバリスを接種したマウスの方が、T. デンティコラを接種したマウスよりも有意に高かった（p = 0.008）、対応のない t 検定)。 ACPAの力価は、P.ジンジバリスを接種したマウスとT.デンティコラを接種したマウスの間で有意な差はなかった。これは、歯周病菌の種類に応じて RF 誘導の程度が異なることを示しています (図 3C、D)。

異なる種の歯周病菌を接種したコラーゲン誘発性関節炎（CIA）マウスモデルにおける異なる程度のRF誘発。 (A) CIA モデルの開発と歯周病菌、ポルフィロモナスジンジバリスおよび T. デンティコラの有無による経口接種の概略図。 (B) 正常対照マウス(n = 5)、対照ゲルを接種したCIAマウス(n = 10)、P. gingivalis含有ゲルを接種したCIAマウス(n = 10)、およびP. gingivalis含有ゲルを接種したCIAマウスの関節炎スコアの変化。 II 型コラーゲンによる最初の免疫化以降の T. denticola 含有ゲル (n = 10)。 (C) 最初の免疫化から 55 日後の異なるマウスグループにおける RF IgM のレベル (各グループの n = 3)。 (D) 最初の免疫化から 55 日後のさまざまなマウスグループにおける抗シトルリン化タンパク質抗体 (ACPA) のレベル (各グループの n = 3)。データは 2 つの独立した実験の代表です。対応のない t 検定による *p <0.05、**p <0.01、***p <0.001。 NC、通常制御。 PG、P.ジンジバリス。 TD、T.デンティコラ。

単細胞レベルでのトランスクリプトームの違いを理解するために、P. gingivalis および T. denticola に曝露されたマウスの脾細胞の単細胞 RNA シーケンスを実行しました (図 4A)。分析のために、P. gingivalis および T. denticola に曝露されたマウスから 3 つの脾臓をそれぞれ採取しました。合計で、濾過後にそれぞれ 962 個と 851 個の脾細胞が分析されました。まず、単一細胞アトラスをマッピングし、脾細胞の細胞集団を定義しました。 P. gingivalis および T. denticola に曝露されたマウスの単細胞アトラスが提示され、細胞は 9 つの区画にクラスター化されました (図 4B)。好中球、マクロファージ、B細胞、T細胞、樹状細胞などの細胞集団が両方のグループで同定されました（図4C）。細胞集団のパターンと頻度は、P. gingivalis に曝露されたマウスと T. denticola に曝露されたマウスの間で同等でした (p = 0.783; カイ二乗検定)。次に、脾細胞の遺伝子発現を単細胞レベルで解析しました。各細胞型で最も重要な 10 個の遺伝子が決定され、それらの発現レベルがすべての細胞型で検査されました (図 4D)。各細胞型の代表的な遺伝子は、特定の細胞型では差次的に上方制御されましたが、他の細胞型ではそうではなく、各細胞型を別の細胞型から区別する際のそれらの役割が示されました。このパターンは、P. gingivalis と T. denticola に曝露されたマウスの両方で観察されました。次に、K-means クラスタリングを介して差次的発現遺伝子 (DEG) の発現レベルを決定しました (図 4E)。注目すべきことに、異なる遺伝子クラスターが、P. gingivalis および T. denticola に曝露されたマウスの B 細胞および T 細胞で見つかりました。 B 細胞の異なる遺伝子クラスターは、B 細胞受容体シグナル伝達経路および B 細胞の増殖、活性化、分化に関連する遺伝子によって支配されていました (クラスター 9 および 29)。 T 細胞の異なる遺伝子クラスターは、CD4+ T 細胞の共刺激および Th1 サイトカイン産生に関連する遺伝子によって支配されていました (クラスター 8、16、17、および 30)。遺伝子オントロジー (GO) エンリッチメント分析の詳細な結果は付録に記載されています。異なる種の歯周病菌を接種されたマウスの B 細胞と T 細胞における異なる遺伝子発現は、RF 誘導の程度の違いを説明する可能性があります。

異なる種の歯周病菌を接種したCIAマウスにおける細胞集団と異なる遺伝子発現パターンの同定。 (A) 脾細胞の収集から可視化までの単一細胞トランスクリプトーム実験の概略図。 (B) 主要な細胞系統 (左のパネル) およびマウスの種類、CIA-PG または CIA-TD (右のパネル) によって色付けされた単一細胞の t 分布確率的近傍埋め込み (tSNE) プロット。 (C) tSNE および棒プロットによって視覚化された CIA-PG および CIA-TD モデルにおける各細胞型の識別と割合。 (D) 細胞型クラスターごとの最も重要な 10 個の遺伝子の遺伝子発現レベルのヒートマップ。 (E) 差次的発現遺伝子 (DEG) の K 平均法クラスタリングとその後の遺伝子オントロジー (GO) エンリッチメント分析のヒートマップ。 DEG は 30 のグループにクラスタリングされました (K = 30、モデルベースの最適数、左パネル)。 B および T 細胞集団の選択されたクラスターについて、生物学的プロセス、細胞成分、および分子機能に従って最も異なって濃縮された GO カテゴリーが示されています (右パネル)。 CIA-PG、P. gingivalis に曝露された CIA マウス。 CIA-TD、T. denticola に曝露された CIA マウス。 BP、生物学的プロセス。 CC、細胞成分。 MF、分子機能。

前RA患者の歯肉下マイクロバイオームは、歯周炎の有病率と重症度が同様であるにもかかわらず、NORAまたは慢性RA患者と比較して、ポルフィロモナダ科の微生物の存在量が増加していることを示した。注目すべきことに、歯肉下の微生物群集の構造は、RA の状態ではなく RF の状態に依存していました。 RAのマウスモデルにおいて、異なる歯周病原体であるP.ジンジバリスまたはT.デンティコラによる口腔感染は、同様に関節炎誘発を増強したが、RF誘発の程度は異なった。マウス脾臓細胞の単一細胞 RNA-seq 解析では、P. gingivalis および T. denticola に曝露されたマウスは、B 細胞および CD4+ T 細胞において特定の遺伝子の非常に多様な発現パターンを示しました。これは、歯周病菌が RA の進行中に体液性免疫応答に異なった影響を及ぼして RF を誘導することを示しています。

我々は、RAのリスクのあるACPA陽性個人には歯周炎と歯周微生物叢の変化がすでに存在していることを実証した。その程度とパターンは、新規発症または慢性関節リウマチの患者のものと同様でした。 RAのリスクがあるACPA陽性個人における独特のマイクロバイオームの変化は、ポルフィロモナダ科の存在量の増加にあり、これはRAのリスクのある個人におけるP.ジンジバリスの増加を示した以前の研究と一致していた11,26。 RA発症のリスクが高い個人からなるコホート研究では、歯周炎の存在はこれらの群間で同様であったにもかかわらず、P.ジンジバリスに対する抗体の血清濃度はRA関連自己抗体陽性群の方が自己抗体陰性群よりも有意に高かった26。。しかし、他の歯周病菌に対する抗体の濃度は、自己抗体陽性群と陰性群の間で差がなかったことから、P. ジンジバリスに対する免疫が、RA リスクのある個人における RA 関連自己抗体産生と関連していることが示されました。最近の研究では、メタゲノム配列決定により、RA11のリスクがあるACPA陽性者の歯肉下微生物叢における腸内細菌叢の異常と豊富なP.ジンジバリスが確認された。文献と合わせた我々の結果を総合すると、口腔マイクロバイオームの変化は関節リウマチの発症に先立ち、P. ジンジバリスがこの前臨床段階で重要な役割を果たしていることが示されています。

次に、特に RF 自己抗体に焦点を当てて、RA 関連自己抗体の発生における歯周病原体の役割を調査しました。 RF は RA の診断マーカーです。ただし、他の自己免疫疾患や感染症でも見られます。以前の研究では、臨床的関節炎を有していない歯周炎患者の歯肉縁下プラークと血清サンプルの両方にRFが存在することが確認されており、細菌感染とRF誘発との関連が示唆されています27。粘膜部位に定着する細菌は、B 細胞の活性化と自己抗体産生の誘導における重要な因子である可能性があります。さらに、自己抗体の誘導レベルは使用した細菌の種類によって異なりました。例えば、ラットでは、P. gingivalis の経口曝露は ACPA 関連関節炎を誘発しましたが、Prevotella intermedia の経口曝露は誘発しませんでした 2。私たちの研究では、P. gingivalisに曝露されたCIAマウスは、T. denticolaに曝露されたマウスと比較してRFを高度に誘発したという発見が追加されました。我々は、患者の高RF群と低RF群の別個の異なる口腔微生物叢パターンを説明し、RAのマウスモデルにおけるRF誘発に対する歯周病菌の因果関係も確認した。したがって、歯周病菌は RA 自己免疫中の RF 状態に異なる影響を与える可能性があると考えられます。

RF は、免疫グロブリン G (IgG) の Fc 領域に位置する抗原決定基 (エピトープ) を標的とする自己抗体です。 RF は、RF 陽性 B リンパ球 (B 細胞受容体として RF を発現する) によって産生されます 28。通常の条件下では、RF B 細胞は RF を生成せずに自己抗原に対する耐性を維持します。ただし、RF B 細胞は自己免疫条件下または微生物感染中に活性化される可能性があります。細菌性リポ多糖類 (LPS) や DNA などの微生物成分は、非特異的なメカニズムによって B 細胞の活性化と RF 生成を媒介します。たとえば、細菌の LPS または DNA は、Toll 様受容体 (TLR) シグナル伝達を介して B 細胞の活性化を直接刺激できます 29。以前の研究では、RF 活動を誘導する能力を調べるために、LPS をいくつかの系統のマウスに注射しました 30。 RF は、LPS 耐性マウスを除くすべての系統で誘導され、RF の増加は他の IgM 抗体の増加と並行していました。したがって、LPS は B 細胞によるポリクローナル抗体形成を刺激し、それによって RF 産生を誘導すると考えられました。別の最近の研究では、LPS結合タンパク質とRFの間の正の相関関係が発見されており、RF31の発症における全身性微生物曝露の重要な役割が示唆されています。

しかし、微生物曝露後の B 細胞活性化の亢進と RF 誘導を説明するには、非特異的 B 細胞活性化に加えて、さらに 2 つの抗原特異的メカニズムが必要です 32。まず、B 細胞受容体と TLR の間の相乗効果です。第二に、T細胞の助けです。 B細胞受容体とB細胞表面上のTLRの相互作用は、微生物抗原-IgG免疫複合体の形成と架橋によって可能になりました。免疫複合体は、B 細胞受容体と TLR の両方に信号を送り、RF 生成 B 細胞を活性化します。 B 細胞受容体シグナル伝達は免疫複合体を捕捉し、微生物抗原を B 細胞表面に集中させることができるため、TLR シグナル伝達が強化されます。 TLRシグナル伝達を妨げずにB細胞受容体シグナル伝達を選択的に阻害すると、免疫複合体によって誘導されるRF B細胞増殖が阻害されました。次に、RF 産生を増加するには、微生物抗原特異的な CD4+ T 細胞の助けが必要です。微生物抗原がRF B細胞内に取り込まれて抗原ペプチドに加工され、B細胞表面に提示された後、抗原特異的CD4+ T細胞が活性化されます。次に、RF B 細胞は、CD40 シグナル伝達または CD4 T+ 細胞によって産生されるサイトカインを介して CD4+ T 細胞の助けを受け取り、RF 産生形質細胞に分化します。要約すると、微生物抗原、B 細胞受容体、TLR、および CD4+ T 細胞は、細菌感染後に RF 産生 B 細胞を活性化するために協力しており、B 細胞受容体シグナル伝達と CD4 T+ 細胞の助けの両方が RF 分泌の増強に重要です 32。私たちの研究では、異なるレベルのRFを有するP. ジンジバリスとT. デンティコラに曝露されたマウスの間で見出された差動遺伝子発現は、B細胞受容体シグナル伝達経路、B細胞の増殖、活性化、分化、CD4+ T細胞の共刺激に関連していた。、およびTh1サイトカインの産生。前述の研究と合わせた我々の結果は、異なる歯周病菌による異なるRF誘導は、それらがB細胞受容体シグナル伝達経路、B細胞の増殖、活性化、分化、CD4+ T細胞の共刺激とサイトカイン産生に影響を与えるかどうかに依存する可能性があることを裏付けている。

Rifkinらは、自己免疫マウスの血清はin vitroでRF産生B細胞の活性化を誘導するが、非自己免疫マウスの血清は誘導しないことを示した33。刺激因子は、自己免疫マウスの血清中に存在する IgG2a 免疫複合体でした。ただし、すべての免疫複合体が RF 産生 B 細胞を活性化するわけではありません。その後の研究では、ヌクレオソーム抗原を含む IgG2a 免疫複合体は B 細胞受容体と TLR に結合することで RF 産生 B 細胞を効率的に活性化するが、他の抗原を含む IgG2a 免疫複合体は活性化できないことが示されました 34。これらの発見は、RF を発現する B 細胞の活性化が免疫複合体に存在する抗原の種類に依存することを示しています。

この研究にはいくつかの制限があります。第一に、歯肉縁下のマイクロバイオーム配列解析には比較的少数の患者しか含まれていませんでした。したがって、私たちの結果は、より大きな研究集団内でのさらなる研究で検証される必要があります。しかし、マイクロバイオーム配列解析における我々の発見を裏付けるために、マウスモデル実験と単細胞RNA配列解析を実施しました。第二に、この研究には健康な対照群が含まれていませんでした。しかし、健常対照者と比較して、関節リウマチ患者およびリスクのある個人では、歯肉縁下の微生物組成が異なることが以前の研究で確認されている9、10、11。その代わりに、我々は、RF または RA の状態に応じて、RA 患者の歯肉下の微生物組成を比較することを目的としました。

私たちは、RA患者およびRAのリスクのある個人の異なるRF状態の間で、歯肉縁下マイクロバイオームの異なる状況を明らかにしました。 RA マウスモデルでは、さまざまな歯周病菌種による口腔感染により、関節炎発症中にさまざまなレベルの RF が引き起こされました。我々は、歯周病菌が B 細胞受容体シグナル伝達、B 細胞の増殖、活性化、分化、CD4+ T 細胞の共刺激とサイトカイン産生に異なる関与をすることで RF 状態に影響を与えていることを示唆しています。

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI) BioProject リポジトリ、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA765928 (メタゲノム配列データセット) および https で入手できます。 ://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA820883 (単一細胞 RNA 配列データセット)。

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この研究は、韓国政府（科学情報通信省）から資金提供された韓国国立研究財団助成金（JHJへの番号2019R1A2027588および2020R1A2C3004123、およびJWKへの番号2019R1G1A1100421）によって支援されました。資金提供者は、研究の設計、データの収集と分析、出版の決定、原稿の準備には何の役割もありませんでした。

大邱カトリック大学医学部内科リウマチ科、大邱、大邱

キム・ジウォン

韓国カトリック大学ソウル聖母病院内科リウマチ科、222 Banpo-daero、Seocho-gu、Seoul、06591、Republic of Korea

チョン・ヘリン、ナム・ユジュン、カン・ジェウ、ジェニファー・リー、クォク・スンギ、キム・ワンウク、パク・ソンファン、ジュ・ジ・ヒョンジュ

YiPSCELL Inc.（韓国、ソウル）

ペク・インピョ

韓国ソウル市梨花女子大学医学部内科リウマチ科

ミン・ギョンチョン

韓国カトリック大学医学部歯周病学科（ソウル、大韓民国）

パク・ジュンボム

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概念化: JWK および JHJ。データキュレーション: JWK、HJ、IPB、および JHJ。正式な分析: JWK、HJ、および IPB。資金調達: JWK と JHJ。調査: JWK、HJ、IPB、YN、JK、および JHJ。リソース: JBP および JHJ。監修：MKC、JL、SKK、WUK、SHP。視覚化: JWK、HJ、および IPB。執筆 - 原案の準備: JWK、HJ、IPB、および JHJ。執筆 - レビューおよび編集: JWK、HJ、IPB、YN、MKC、JBP、JL、SKK、WUK、SHP、および JHJ

チ・ヒョンジュさんへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Kim、JW.、Jung、H.、Baek、IP。他。関節リウマチの発症におけるリウマチ因子の誘導に対する歯周微生物叢の異なる影響。 Sci Rep 12、19636 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-21788-y

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受信日: 2022 年 3 月 20 日

受理日: 2022 年 10 月 4 日

公開日: 2022 年 11 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21788-y

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