マウスの局所放射線誘発損傷後の炎症細胞動態が血管新生と組織治癒を制御する

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 6、記事番号: 571 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

電離放射線への局所的な過度の曝露は、慢性炎症、血管損傷、および悪液質を引き起こします。ここでは、マウス後肢照射後 1 日目 (D) から D180 までの炎症細胞の動態を調査し、組織の血行再建における単球 (Mo) サブセットの役割を分析します。 D1 では、Mo 細胞と T 細胞が脾臓と骨髄から血液中に動員されていることがわかります。初期段階での新血管形成は、血管造影スコアと毛細血管密度がそれぞれ約 1.4 倍と 2 倍に増加することで実証され、照射された筋肉内の循環 T 細胞、モヒおよびタイプ 1 様マクロファージの増加と相関しています。 D90では、照射組織内の循環Moloおよびタイプ2様マクロファージ数の減少に関連して、血管希薄化および悪液質が観察される。さらに、CCR2 および CX3CR1 の欠損は血管新生に悪影響を及ぼします。しかし、モヒの養子移入は血管の成長を促進します。私たちのデータは、放射線誘発性の動的炎症波と血管新生における炎症細胞の主要な役割を実証しています。

高線量の急性放射線事故は、産業事故（放射線源の損失）や医療用途（放射線療法や放射線介入処置）後の過剰線量に続いて毎年発生しています。放射線傷害は、照射後の最初の数日から数年にわたって連続する予測不可能な炎症波を特徴とし、これにより血管希薄化や筋悪液質などの組織傷害が水平方向および垂直方向に広がります1。血管損傷と希薄化は、電離放射線曝露後に組織虚血を引き起こす患者の長期死亡の主な原因であると考えられています2。電離放射線への局所的な過剰被曝は、特に吸収線量が 25 Gy を超え、組織の壊死を引き起こす場合、健康に重大な影響を及ぼします 1,3。急性骨格筋損傷の修復は厳密に制御されたプロセスであり、主に炎症、再生、血管形成の 3 つの段階から構成されます 4,5。全身放射線照射の前臨床モデルでは、筋線維あたりの筋核と衛星細胞の両方の数が線量依存的に減少することが示されています6。さらに、18 Gy の単回照射は、筋芽細胞の致死性を誘発することにより筋肉の再生を阻害します7。 25 Gy を超える照射線量を使用した筋肉の病理学の研究では、形態学的変化、出血、壊死、炎症、線維症、ミトコンドリアの破壊が示されています 8、9、10、11。虚血は、放射線局所傷害と心血管疾患の両方の疾患に共通のプロセスです。虚血性疾患では、栄養動脈の血栓性血管閉塞後の不十分な臓器灌流が虚血後のリモデリングの主要な決定要因です12。しかし、内皮細胞などの哺乳動物細胞を電離放射線に曝露すると、主に DNA 損傷による細胞死につながります 13。虚血は、コラーゲンベースの瘢痕を特徴とする線維症を引き起こす血管損傷/稀少化および炎症を特徴とします14。虚血組織の反応は、血管新生、血管新生、動脈新生、側副増殖という 4 つの主要なプロセスに基づいており、これらは急性および慢性の虚血性血管疾患における組織の修復とリモデリングに寄与します 15。これらのプロセスは、血管壁内の血行力学的力の変化から生じ、血管恒常性の変化につながります 15,16。

低酸素領域における炎症性細胞の浸潤は組織虚血の特徴であり、虚血後の血管新生における異なる白血球サブセット（CD4+ および CD8+ T 細胞 17,18、NK 細胞 19、制御性 T 細胞 20、マスト細胞 21、単球/マクロファージ 22）のそれぞれの役割は異なります。完全に理解されました。すべての T 細胞サブセットを欠くヌードマウスでは虚血後の血管成長が顕著に減少するという事実によって実証されるように、特に T リンパ球がこのプロセスに関与しています 23。白血球と単球は、血管内皮増殖因子（VEGF）、腫瘍壊死因子-α、インターロイキン（IL）-1β、メタロプロテイナーゼなどの炎症促進性サイトカインなど、いくつかの血管新生/動脈形成因子の放出を通じて血管新生を引き起こします24,25。さらに、血管新生プロセスにおける単球の役割は、さまざまなグループによって文書化されています 18,26。

単球は、マウスでは 2 つの主要なサブタイプを持つ不均一な集団です。Ly6ChiLy6G-7/4hi「炎症性」単球 (Mohi) と Ly6CloLy6G-7/4lo 「常駐」単球 (Molo) は、それぞれヒトの CD14hiCD16- および CD14loCD16+ 亜集団に対応します 27。モヒは誘導性 NO 合成酵素 (NOS) と、IL-1 や IL-12 などの炎症促進性サイトカインを発現しますが、モロはアルギナーゼ 1、抗炎症性サイトカイン IL-10、VEGF を大量に産生します。モヒは炎症部位に迅速に侵入し、一方、モロは恒常性維持条件下でリンパ系および非リンパ系器官に入り、CX3CR1依存的に血管内皮全体をパトロールし 28 、さまざまな状況で組織再生を促進します 29 。我々は最近、結腸直腸局所照射のマウスモデルにおける血管新生機構の調整における単球/マクロファージの活性化の中心的な役割を示しました22。さらに、後肢虚血のマウスモデルでは、Molo ではなく Mohi の移植により、虚血後の血管新生が活性化されました 26。

虚血領域への単球の動員は、主にケモカイン/ケモカイン受容体シグナル伝達を介して起こると考えられています。特に、CCL2 およびその同族受容体 CCR2、ならびにフラクタルカイン (CX3CL1) および CX3CR1 のリガンドは、この状況に関係しています 30、31、32。実際、CCL2 は側副増殖部位で上方制御されており、CCL2 治療により血管再生が著しく強化されます 33。同様に、虚血後肢モデルでは、CCL2 または CCR2 の欠損により、虚血後の炎症と血管の成長が減少し 25,34、腓腹筋の萎縮が増強されます 35。したがって、炎症反応の治療的調節は、虚血後疾患の予防のための修復反応を改善する可能性がある15,16。

ここでは、局所的な後肢の放射線誘発損傷のマウスモデルを使用して、術後のD1からD180までのさまざまな組織（骨髄（BM）、脾臓、血液、筋肉）における先天性および適応性炎症細胞の動員と動員の動態を分析しました。照射。私たちは、電離放射線損傷を特徴付ける炎症波を初めて示しました。これらの波は、脾臓、血液、筋肉などのさまざまな組織で観察される増殖/動員段階の交互に対応していました。ただし、BM ではそれほど顕著ではありませんでした。我々は、後肢照射後の 2 つの段階に焦点を当てました。最初は、脾臓からの CD4 および CD8 T 細胞の動員、モヒ筋への浸潤、およびそれらの炎症誘発性マクロファージ (タイプ 1) への分化と相関する炎症および血管新生の初期段階に対応します。 -様マクロファージ/M1様)。後期では、血管希薄化と悪液質が、血液および筋肉中のMolo数の減少と、筋肉中のMoloのタイプ2様マクロファージ（M2様）への分化と相関していることが実証されました。

最後に、初期段階の血管新生に対する Mohi と M1 様の役割をより正確に調査しました。 CCR2またはCX3CR1の欠損は動脈形成機構を妨げたが、WTマウスへのMohi筋肉内注射は動脈形成を改善した。

後肢に対する放射線照射の影響を調査するために、我々はまず、D180までの毎週の創傷治癒過程における創傷範囲、潰瘍形成、湿性落屑、および四肢の収縮の半定量的分析により、病変の進行の動態を評価した。照射後 14 日後、損傷スコアは増加し、D35 でピークに達し、その後 D180 までゆっくりと減少しました (図 1a)。放射線照射のこの有害な影響は、悪液質/筋肉消耗(横紋筋融解症)と関連していました。腓腹筋および脛骨筋の重量は、非照射群と比較して、D120、150、および180でそれぞれ2倍および1.5倍、徐々にかつ有意に減少しました（P < 0.01、図1b）。

a 毎週測定された損傷スコアの動態変化と、さまざまな時点での放射線誘発性後肢損傷の代表的な写真。 b 照射後 1、3、5、7、14、30、60、90、120、150、および 180 日目の、非照射 (NIR) および照射後の脛骨および腓腹筋で測定された筋肉重量の変化。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 対 NIR; n = 8 匹の動物/時点、ANOVA +/- SEM。

BM と脾臓は損傷後に炎症細胞を放出し、放射線照射後の炎症過程に寄与することが知られています 22。好中球および単球に対応するCD11b+白血球は、BMまたは脾臓から血液に動員され、その後、照射された筋肉に浸潤しました（図2a、b）。筋肉内に単球の蓄積は見られず、単球がマクロファージ内で分化したことが示唆されました 36。非照射（NIR）は、さまざまな時点で安楽死させた同腹子に対応し、組織（血液、脾臓、骨髄、筋肉）内の炎症細胞の数に関して常に同等の結果を示しました。

a〜d 好中球（CD45 + CD11b+Ly6G+7/4hi、緑線）、Mohi（CD45 + CD11b+Ly6G-7/4hi、赤線）の細胞数の定量分析（左）および代表的なフローサイトメトリーゲーティング（右） ) および Molo (CD45 + CD11b+Ly6G-7/4lo、青線) (CD45+ および CD11b+ 細胞でゲート制御) は、それぞれ骨髄、脾臓、血液、筋肉に存在します。 e DC (CD45 + CD11b+CD11c+MHCII+)、M1 様 Mɸ (CD45+CD11b-F4/80+CD64+MHCII+)、および M2 様の細胞数の定量分析 (左) および代表的なフローサイトメトリーゲーティング (右)筋肉の Mɸ (CD45+CD11b-F4/80+CD64+MHCII−)、非照射 (NIR) および照射後、1、3、5、7、14、30、60、90、120、150、および 180 日目照射。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 対 NIR; n = 8 ～ 10 匹の動物/時点、ANOVA +/- SEM。

BMでは、好中球（CD11b+Ly6G+7/4hi）は、NIRと比較してD1、D150、およびD180で有意に増殖しました（P < 0.001）（図2a）。 NIRと比較して、モヒ（CD11b+Ly6G-7/4hi）はD14およびD180（P <0.05）、モロ（CD11b+Ly6G-7/4lo）はD150およびD180（P<0.001）でそれぞれ増殖しました（図2a）。興味深いことに、D5 では、好中球、モヒ、およびモロは NIR と比較して枯渇し、その後増殖して D7 で D90 まで基礎レベルに戻りました。さらに、好中球、モヒ、およびモロの数は、D14 および D150 で脾臓で増加しました（P < 0.001、図 2b）。

血液中の好中球、モヒ、およびモロの数は、D1 から実験終了まで増加しました（P < 0.001、図 2c）。

筋肉では、モヒ、モロ、および好中球が動員され、D1、D5、およびD60でピークに達し、その後D3、D30、およびD120で基礎レベルに戻りました（図2d）。筋肉照射後、M2様はD1でピークに達しましたが（P <0.01、図2e）、樹状細胞はD60でピークに達しました（P <0.01、図2e）。また、有意ではありませんが、D60 で筋肉における M1 様の増加にも気づきました。

これらの結果は、筋肉への放射線照射後、自然炎症細胞が早期かつ大量に脾臓およびBMから筋肉に動員されることを示唆しています。さらに、これらの結果は、BMおよび脾臓における自然炎症性細胞の増殖（図2a、b）と血液を介した動員（図2c）の交互の段階に対応する、放射線傷害後の時間的に繰り返す連続的な炎症波を示しています。照射された筋肉へのそれらの浸潤（図２ｄ、ｅ）。

我々は以前、結腸直腸損傷のマウスモデルにおいて、放射線照射後、Tリンパ球が損傷組織に動員されることを示した22。ここで、我々のモデルでは、CD4およびCD8 T細胞が同様に脾臓から動員され、D1（P < 0.001、図3a）からD90まで強い有意な減少を示したことがわかりました。その後、T細胞は増殖し、D120でほぼ基礎レベルに達し、その後、NIRと比較してD150およびD180でT細胞数が再び減少しました（P <0.001、図3a）。血液中では、T細胞数が増加し、D30とD60でピークに達しました（P < 0.001、図3b）。筋肉では、T細胞が補充され、D1とD30でピークに達しました（P < 0.001、図3c）。

a – c 脾臓、血液、筋肉における CD4 (CD45+CD3+CD4+) および CD8 (CD45+CD3+CD8+) の細胞数の定量分析 (左) および代表的なフローサイトメトリーゲーティング (右)、非照射 (NIR) および照射後1、3、5、7、14、30、60、90、120、150、および180日目に照射。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 対 NIR; n = 8 ～ 10 匹/時点、ANOVA +/- SEM。

これらの結果は、局所的な後肢照射が脾臓内の T 細胞数の減少を誘導したことを示しており、脾臓から照射された筋肉への T 細胞の動員と補充が示唆されています。自然細胞と同様に、血液および筋肉における T 細胞の動員と補充の連続的な波が観察されました。しかし、脾臓ではそのような波は観察されませんでした。これはおそらく、T 細胞がすぐに動員されたためと考えられます。

CCL2 および CX3CL1 は、虚血脚における単球および T 細胞の誘引と保持を介して血管新生に寄与することが知られています 26,37。

CCL2のmRNA発現は、NIRと比較して、照射された筋肉においてD14およびD30でそれぞれ11倍および14倍有意に増加した（図4a）。同様に、CX3CL1のmRNA発現は、NIR組織と比較して、照射された筋肉ではD30で3.7倍、D90で7.7倍と有意に増加した（図4b）。

a 筋肉における CCL2 および CX3CL1 mRNA の定量的評価。 b、c 非照射（ NIR) と照射された筋肉。結果は、NIRを100%として相対的なパーセンテージで表し、照射後の筋肉を、照射後1、3、5、7、14、30、60、90、120、150、および180日目のNIR筋肉に対して正規化しました。スケールバー：100μm。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 対 NIR; n = 6 匹の動物/時点、ANOVA +/- SEM。

ケモカインの上方制御は、筋肉におけるマクロファージおよびリンパ球の浸潤と関連していた。 NIR組織と比較して、照射後のD7およびD14では、CD68陽性マクロファージの数がそれぞれ3.5倍および4倍に増加し(P<0.001)、D30では減少した。 CD3陽性リンパ球の数は、D7で39倍、D14で24倍、D30で18倍に増加しました（図4b、cおよび補足図1）。

これらの結果は、局所照射により、CCL2 や CX3CL1 などのケモカインの上方制御と炎症細胞の動員が起こることを示しています。

次に、照射後の筋肉における血管新生促進因子である eNOS を分析しました。照射された筋肉におけるeNOS mRNAレベルは、NIRと比較して、D7、D14、D30、およびD90でそれぞれ2.8、2.6、2.5、および2.3倍上方制御されました（図5a）。したがって、eNOSタンパク質レベルもD30でNIRと比較して2.3倍有意に上方制御されました（P < 0.001、図5b）。

a – d 筋肉内の eNOS mRNA およびタンパク質レベルの定量化。 e、f 微小血管造影の定量的評価と代表的な顕微鏡写真（c;血管は白く表示されます）および毛細管密度（d;毛細管は赤で表示されます、矢印はイソレクチンB4陽性毛細管の例を示します、スケールバー：100μm）。結果は、非照射（NIR）を100％として相対的なパーセンテージで表し、1、3、5、7、14、30、60、90、120、150、および180日目の照射筋をNIR筋に対して正規化しました。照射後。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 対 NIR; n = 5 ～ 8 匹の動物/時点、ANOVA +/- SEM。

さらに、我々は、独立かつ相補的な微小血管造影法と免疫組織化学的アプローチを使用して、筋肉における放射線照射後の血管新生プロセスを評価しました。血管造影スコアは、NIR グループと比較して、D14 で 1.4 倍 (P < 0.01) 有意に増加しました。さらに、毛細血管密度は、NIRグループと比較して、D7およびD14でそれぞれ1.7倍（P <0.05）および2倍（P <0.001）上方制御されました（図5c、d）。さらに、ベイジアン潜在変数アプローチ 38 により、初期段階 (D0 ～ D30) および後期段階 (D60 ～ D180) における血管新生プロセスと炎症細胞の動員/動員との相関を分析しました。照射後の D1 から D30 まで、脾臓からの新しい血管の形成と CD4/CD8 細胞の動員 (両方 P < 0.01) と血液中のそれらの増加 (両方 P < 0.05) の間に有意な相関関係があることがわかりました (表 1)。同様に、照射された筋肉におけるモヒ浸潤数の増加およびそれらのM1様への分化は、血管新生と関連していた(両方ともP<0.01)(表1)。

しかし、D60では、血管造影スコアは基礎レベルに戻り、その後、NIRグループと比較してD90、D120、およびD150で有意に減少しました（P <0.01）（図5c）。さらに、D30では、毛細管密度はNIRレベルに戻り、NIRグループと比較してD60からD180まで有意に減少しました（P <0.05）（図5d）。さらに重要なことは、D60 から D180 にかけて、血中 (P < 0.05) および筋肉 (P < 0.001) の Molo カウントの減少と、筋肉内の M2 様の分化 (P < 0.05) がベイジアン手法によって実証されたことです。）は、この血管希薄化のプロセスと相関していました（表1）。

後肢照射後の血管新生過程における単球/マクロファージの役割に直接取り組むために、CCR2欠損マウスまたはCX3CR1欠損マウスを使用して、モヒとモロの役割をより正確に調査しました。 Ccr2-/- マウスでは、循環 Mohi (P < 0.001、図 6a) および Molo (P < 0.01、図 6b) レベルは、照射後 D3 で野生型マウスと比較して有意に減少しました。さらに、Lu ら。 Ccr2-/- マウスでは、リンパ球や好中球ではなく、単球（Mohi および Molo）の動員が障害されていることが示され、血液中の単球濃度の低下が後肢によるものではないことが示唆されました。照射39．同様に、我々はまた、照射後10日目でWTマウスと比較してCCR2-/-筋肉中のマクロファージの数が少ないことを実証した（P<0.05;図6d）。次に、CCR2 および CX3CR1 シグナル伝達経路が照射後の血管の成長に与える影響を評価しようとしました。照射から10日後、CCR2欠損マウスおよびCX3CR1欠損マウスでは、野生型マウスと比較して血管造影スコアが減少しました（P <0.001、図6e）。

a – c WT マウスまたは CCR2 および CX3CR1 欠損マウスの血液中のモヒ、モロ、好中球の細胞数の定量分析。 **P < 0.01; *** P < 0.001 対照射 WT、n = 3 ～ 4 匹/時点。 d WT マウスまたは CCR2 および CX3CR1 欠損マウスにおける、照射後 D10 での血液から損傷した筋肉への CD68 + マクロファージ浸潤の定量分析、n = 5 動物/時点。 e 後肢照射から10日後のWTマウスまたはCCR2およびCX3CR1欠損マウスにおける微小血管造影の定量的評価および代表的な顕微鏡写真。 f PBS、105 Mohiまたは105 Moloを筋肉内注射した動物における後肢照射から10日後の微小血管造影の定量的評価および代表的な顕微鏡写真。 * P < 0.05 対 PBS 注射マウス。結果は、非照射（NIR）に対する相対的なパーセンテージとして表され、100％に設定され、照射された筋肉はNIR筋肉に対して正規化されました、n = 5〜12動物/時点、ANOVA +/- SEM。

予想通り、我々の結果は、CCL2/CCR2およびCX3CL1/CX3CR1経路の破壊が虚血後の血管成長を妨げることを明確に示している。

Molo 単球は BM には希少であり、血液から十分な量を収集することが難しいため、循環単球サブセットの代用として脾臓の Mohi と Molo を使用しました。さらに、血液と脾臓の単球サブセットはトランスクリプトームと機能においてほぼ同一であることが示されました40。後肢照射の翌日、WT C57BL/6 マウスに PBS、105 Mohi、または 105 Molo を筋肉内注射しました。照射から10日後、モヒ移植により、PBS処理マウスと比較して血管造影スコアが改善されました（P < 0.5、図6f）。対照的に、Molo の注射では血管造影スコアは改善されませんでした。

これらの所見は、後肢照射後の急性期における血管炎症の調整および血管新生の促進におけるモヒ活性化の中心的な役割を明らかに特定している。

電離放射線への局所的な過剰被曝は、特に吸収線量が 25 Gy を超え、組織の壊死を引き起こす場合、健康に重大な影響を及ぼします 1。放射線傷害は、照射後の最初の数日から数週間にわたる連続した予測不可能な炎症波を特徴とし、これにより血管希薄化や筋悪液質などの組織傷害の表面および深さの拡大が引き起こされます1。この報告書では、放射線誘発性損傷を特徴付ける動的炎症波を初めて示しました。脾臓と骨髄では、これらの波は細胞の増殖と血液を介した動員、そして照射された筋肉への浸潤の間の交互の段階に対応していました。これらの波は、主に脾臓と筋肉の好中球、モヒ、次にモロでより顕著でした。しかし、血液中では、自然循環細胞の数が照射後 D1 から D180 まで増加しましたが、照射された筋肉ではその数が非常に少なく、血液中の蓄積が示唆されました。さらに、血液と筋肉で T 細胞波が観察されました。結腸直腸局所照射 22、大腿虚血または心筋梗塞後の炎症細胞の動員と動員がすでに多くの研究で示されています 20、24、41。しかし、古典的な心血管虚血モデル 14 と比較すると、照射された筋肉内の M2 様マクロファージの数は D1 でのみ増加しました。我々は、この観察を説明できるいくつかの仮説を持っています。それらには、(i) 組織内の M2 常在細胞の増殖、(ii) M2 の出口 (遊走能力) の欠陥 42、または (iii) M2 細胞の放射線誘発性アポトーシスの抵抗性が含まれます。筋肉内のプロセス。

いくつかの研究では、放射線照射を受けた虚血内皮が炎症促進特性を示すことが以前に示されています。内皮細胞は CCL2 や CX3CL1 などのケモカインを発現し、その受容体 CCR2 または CX3CR1 を介して炎症細胞の動員と浸潤を引き起こし、新しい血管の形成を改善します 26,30。われわれは、照射組織が初期段階（IR後D0～D30）に血管新生促進因子（eNOS）および動脈形成促進因子（CX3CL1、CCL2）を発現し、炎症促進性CD4、CD8 T細胞の動員を誘導することを示した。血液を介した脾臓およびBMからのモヒ、およびそれらの放射線照射組織への動員および浸潤により、モヒがM1様マクロファージに分化する。その後、抗炎症性 Molo 動員の減少と、M2 様、血管希薄化、および悪液質への分化との相関を特徴とする後期（IR 後 D60 ～ D180）を観察しました。照射後 90 日目では、CX3CL1 および eNOS mRNA 発現の増加を検出できましたが、対応するタンパク質の同様の増加は観察されませんでした。これは血管希薄化および悪液質と一致します。

これらの結果は、炎症細胞の動員への関与と血管新生の改善におけるCCL2およびCX3CL1の役割に関する文献と一致しています。したがって、大腿動脈閉塞後、CCL2 の局所注入または過剰発現により循環単球数が増加し、その蓄積が側副および末梢のコンダクタンス、および血管新生をサポートすることが示されました 26,31。アテローム発生モデルにおいて、CX3CL1 欠損マウスには、コントロールよりも有意に少ないマクロファージが含まれていました 43。これらのデータは、単球/ケモカイン経路が血管新生の調節において中心的な役割を果たしていることを示す証拠の蓄積をさらに強化するものである。さらに、すべての T 細胞サブセットを欠くヌードマウスでは虚血後の血管成長が顕著に減少するため、T リンパ球もこのプロセスに関与しています 23。さらに、CD4 および CD8 T 細胞サブセットは、血管リモデリングに役割を果たしていることが示唆されています。実際、CD4 および CD8 欠損マウスは虚血後の血管成長の大幅な減少を示します 17,18。

次に、CCR2欠損マウスおよびCX3CR1欠損マウスを用いて、後肢局所照射後の血管新生過程に単球が寄与していることを示した。以前に報告されているように、CCR2 または CX3CR1 の欠失により、循環単球の数が減少し、血管造影スコアが減少しました。 CCR2 および CX3CR1 は、虚血組織への単球の動員を制御することが示されています 30,44。 CCR2 は主に循環モヒレベルの調節に関与しています。興味深いことに、CCR2 の欠如は、虚血性心筋層における Mohi 浸潤を特異的に無効にします 29,40。また、急性骨格筋損傷後の炎症反応を開始して 45、その後の筋毛細血管の動脈化を可能にするためには、損傷した筋組織細胞ではなく、BM 細胞による CCR2 発現が必要であることが示されています 46。モヒは成長因子を生成することにより動脈形成と血管形成を促進します35、47、48、49。さらに、CX3CR1 シグナル伝達は短命細胞である単球の生存を促進することが示されています 50: 新たに動員された BM 由来単球の生存には内因性 CX3CR1 シグナル伝達が必要である可能性があります。これは、WT動物と比較してCX3CR1-/-マウスではMolo単球の数が少ないという我々の観察によって裏付けられています。 CX3CR1欠損マウスは、皮膚修復と創傷血管新生のために適切な単球動員と血管再生を示した。ただし、骨髄細胞の反応と血管新生の程度は野生型マウスと比べて弱まっています51。さらに、アテローム性動脈硬化症では、CX3CL1/CX3CR1 シグナル伝達がプラーク微小血管形成中の血管新生に関与していることが多くの研究で示されています 44,52,53。

最後に、虚血後の血管成長におけるモヒ単球の主要な役割を強調しました。 Mohi の筋肉投与は動脈形成を促進しましたが、Molo 注射はこのプロセスに影響を与えませんでした。我々は、後肢虚血の誘導後早期に単球の炎症性サブセットを養子移植すると、虚血後の再灌流が顕著に増強されることを示す。急性大腿動脈結紮のウサギモデルでは、側副動脈の成長が循環単球の数に直接依存することが実証されています 25。さらに、明確な動脈形成促進性の可能性は、細胞外マトリックスに結合した VEGF55 の放出を介した MMP-926,54 などの血管新生因子の発現差から生じる可能性があります。心筋梗塞では、M2 マクロファージが選択的に枯渇すると、頻繁な心破裂が増加し、致命的な予後をもたらしました。組織修復は、M2 様マクロファージの外部供給によって完全に救われました 56。これらの結果は、M1 様マクロファージが血管新生を刺激することによって治癒プロセスを開始するのに対し 38,57、M2 様細胞が血管新生を促進するという点で、連続的かつ相補的な機能に対応する組織修復における M1 様細胞と M2 様細胞の役割と一致しています。マウスの骨格筋再生中の再生線維の直径58の増加をサポートすることによる、血管新生と組織の成熟の安定化。

したがって、単球/マクロファージをバイオマーカーとして使用して、照射組織を評価および管理し、患者に個別化された再生医療治療を提供できる可能性があります。 M1/M2 様マクロファージの浸潤は 3 つの異なる方法で調査できます。マクロファージ浸潤の評価に最も適しているのは、抗体混合物を用いたフローサイトメトリーですが、このアプローチは採取した組織の量によって異なります。したがって、PCR および免疫組織化学的染色は、サイトカインまたは炎症細胞の発現を分析するために使用される可能性があります。

要約すると、後肢照射後に炎症細胞が主要な役割を果たし、血管新生プロセスを可能にし、悪液質の発生を制限するために血管を維持することが示されました。

実施されたすべての動物実験は、放射線防護・核安全研究所 (IRSN) の施設内動物実験・倫理委員会 (C2EA) によって承認されました。実験は、フランスの獣医学ガイドラインおよび欧州共同体が実験動物使用のために策定したガイドライン (APAFIS#12903-2018010418086132 v1 および APAFIS #19137-2019021313569870 v1) に従って実施されました。雄の C57Bl/6 マウス (8 週齢) を実験動物として使用しました (Janvier、フランス)。 8週齢の雄CCR2-/-、CR3CR1-/-およびそれらの野生型(WT)C57BL/6同腹子をJackson Laboratoriesから購入した。すべての動物は、12 時間の明暗サイクルを交互に繰り返す安定した微環境条件 (22 ± 1 °C) で飼育され、標準的な実験室用の餌と水を与えられました。マウスをイソフルラン吸入(2%)で麻酔し、2×24cmの照射野(Elekta Synergy Platform、Elekta Synergy Platform、 Elekta SAS、フランス、ブローニュビヤンクール）。

病変の進展の動態は、半定量的分析によって評価されました。創傷の範囲、潰瘍形成、湿性落屑、四肢の収縮などの各臨床徴候に 0 (正常) と 1 (最大損傷) の間のスコアが割り当てられ、術後毎週の創傷の発達と治癒過程での合計損傷スコアが最大 5 になりました。照射。

腓腹筋を切除し、PBSですすぎ、液体窒素中で凍結させた。クライオスタットを使用して組織を厚さ7μmの切片に切断しました。

マクロファージおよび CD3 陽性細胞は、CD68 抗体 (1/250、Biorad) または CD3 染色 (1/250、DAKO) の後に視覚化され、続いてロバ 488-AF – 抗ラットまたは抗ウサギ IgG (1/250) で染色されました。、ジャクソン免疫リサーチ）それぞれ。 Image J ソフトウェア (NIH) を使用して、ランダムに選択したフィールドで CD68 および CD3 陽性細胞を計数しました。筋肉の構造を分析するために、切片をヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) で染色しました。

照射後、以前と同様に 2 つの異なる方法で血管新生を評価しました 59。

屠殺時、マウスに麻酔をかけ（アルファキサン（８０ｍｇ／ｋｇ体重）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ体重））、縦開腹術を行って腹部大動脈にポリエチレンカテーテルを導入し、造影剤（バリウム）を注入した。硫酸塩、1 g/mL) その後、後肢の血管造影が実行され、高精細デジタル X 線トランスデューサーを使用して画像 (動物あたり 2 枚) が取得され、後肢の全体像が得られるように画像がまとめられました。血管が占めるピクセル数は、Primed angio ソフトウェア (Trophy System、パリ、フランス) を使用して定量化領域で測定されました。定量化の領域は、腸骨、膝、大腿骨の端の配置によって制限されました結果は、照射された脚と非照射の脚の比率として表されました。

腓腹筋を右（照射肢）と左（NIR肢）から切除し、凍結切片作成のためにOCTコンパウンド（Sakura Finetek France、Villeneuve d'ASCQ、フランス）中で凍結させた。凍結筋肉切片 (7 μm) を DyLight 594 標識 GSLI-イソレクチン B4 (Vector Laboratories、希釈 1:200) を使用して染色し、毛細血管を同定しました。筋肉領域の mm2 あたりの毛細血管の数を測定しました。

マウスは、後肢照射後 1、3、5、7、14、30、60、90、120、150、または 180 日目にイソフルラン吸入 (4%) で鎮静した後、頚椎脱臼により安楽死させた (1 匹あたり n = 8 ～ 10 匹のマウス)時点）。ヘパリン溶液を用いた下大静脈穿刺により末梢血を採取した。免疫蛍光染色後、BD FACS 溶解液 (BD Biosciences) を使用して全血を溶解し、Kova スライドを使用して総血中白血球数を測定しました。骨髄細胞を大腿骨から採取し、40μmナイロンメッシュ(BD Biosciences)を通して濾過した。脾臓を収集し、40μmナイロンメッシュ(BD Biosciences)に静かに通過させた。脾細胞と骨髄由来細胞の両方について、細胞懸濁液を 400 xg、4 °C で 10 分間遠心分離しました。赤血球溶解緩衝液（Sigma-Aldrich）を使用して赤血球を溶解し、脾細胞および骨髄細胞をPBSで洗浄した。非照射および照射筋肉を収集し、細かいハサミで細かく刻み、Bel-Art Scienceware 12ウェル組織分解器（ThermoFisher Scientific）に静かに通しました。次いで、細胞をナイロンメッシュ（40μm）を通して濾過し、遠心分離した（10分間、400×g、4℃）。

対象の組織から単離した細胞を、以下の抗体混合物とともに暗所で 4 °C で 30 分間インキュベートしました。炎症細胞の検出では、AF700 結合抗 CD45、FITC 結合抗 CD11b (ThermoFisher Scientific)、APC 結合抗 Ly-6B.2 (クローン 7/4、Biorad)、PE で全細胞をゲートしました。結合型抗 Ly6G、PB 結合型抗 CD64、APC 結合型抗 F4/80、PerCP5.5 結合型抗 MHCII (BD Biosciences)、FITC 結合型抗 CD4 (クローン RM4-5; eBioscience)、PercpCy5 -結合抗 CD8 (クローン 53-6.7、BD Pharmingen)、APC 結合抗 CD3 (クローン 17A2、eBioscience)、PE-シアニン 7 結合抗 CD11c (クローン N418、eBioscience) を 4 °C で 30 分間処理。

以下のように、異なる組織で異なる抗体混合物を使用しました。

骨髄: ミックス 1: Mo: FITC 結合抗 CD11b、APC 結合抗 Ly-6B.2、PE 結合抗 Ly6G。ミックス 2: リンパ球: AF700 結合抗 CD45、FITC 結合抗 CD4、PercpCy5 結合抗 CD8、APC 結合抗 CD3、

脾臓: ミックス 1: Mo: FITC 結合抗 CD11b、APC 結合抗 Ly-6B.2、PE 結合抗 Ly6G。ミックス 2: リンパ球: AF700 結合抗 CD45、FITC 結合抗 CD4、PercpCy5 結合抗 CD8、APC 結合抗 CD3、

血液: ミックス 1: Mo: FITC 結合抗 CD11b、APC 結合抗 Ly-6B.2、PE 結合抗 Ly6G。ミックス 2: リンパ球: AF700 結合抗 CD45、FITC 結合抗 CD4、PercpCy5 結合抗 CD8、APC 結合抗 CD3、

筋肉: ミックス 1: Mo: AF700 結合抗 CD45、FITC 結合抗 CD11b、APC 結合抗 Ly-6B.2、PE 結合抗 Ly6G。ミックス 2: リンパ球: AF700 結合抗 CD45、FITC 結合抗 CD4、PercpCy5 結合抗 CD8、APC 結合抗 CD3、ミックス 3: マクロファージ: AF700 結合抗 CD45、FITC 結合抗 CD3 CD11b、PE 結合抗 Ly6G、PB 結合抗 CD64、APC 結合抗 F4/80、PerCP5.5 結合抗 MHCII、PE-シアニン 7 結合抗 CD11c Mohi (CD11b+Ly6G–7/ 4hi)、Molo (CD11b+Ly6G-7/4lo)、M1 様細胞 (CD11b+Ly6G-F4/80+CD64+MHCII+)、および M2 様細胞 (CD11b+Ly6G-F4/80+CD64+MHCII-) 、DC (CD11c+MHCII+)、CD4 (CD3+CD4+)、および CD8 (CD3+CD4+)。

次いで、細胞の総数を筋肉重量に対して正規化した。フローサイトメーター(Canto II、BD Biosciences)を使用して細胞を分析した。

メーカー（Invitrogen、フランス）の指示に従って、Trizol試薬を使用して凍結筋肉サンプルから全RNAを抽出しました。 NanoDrop ND-1000 装置 (NanoDrop Technologies、デラウェア州ロックランド) で定量した後、メーカーの指示に従って QuantiTect Reverse Transription (Qiagen) を使用して逆転写を実行しました。 PCRは、Power SYBR PCR Master Mix (Bioline)を使用してABI PRISM 7900で実行されました。マウス GAPDH の Ct を使用してサンプルの増幅を正規化しました。以下のオリゴヌクレオチド (Applied Biosystems) がプライマーとして機能しました: GAPDH フォワード: 5'-CGTCCCGTAGACAAAATGGTGAA-3'、リバース: 5'-GCCGTGAGTGGAGTCATACTGGAACA-3'。 eNOS 順方向: 5'-CGCCCACCCAGGAGAGATCCAC-3'、逆方向 5'-GCATCGGCAGCCAAACACCAAAGT-3'。 CCL-2 順方向: 5'-CCCCACTCACCTGCTGCTA-3'、逆方向 5'-TTACGGGTCAACTTCACATTCAAA-3'。 CX3CL1 順方向: 5'-GTGGCTTTGCTCATCCGCTATCAG-3'、逆方向: 5'-CACATTGTCCACCCGCTTCTCA-3'。

タンパク質抽出物の調製を行った。簡単に説明すると、総タンパク質を調製するために、照射および非照射後肢の前脛骨筋をRIPA緩衝液（50 mM Tris HCl pH7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1% Triton X-100、1% デオキシコール酸、0.1%）中でホモジナイズしました。プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む SDS)。タンパク質を勾配変性ゲル電気泳動で分離し、0.2μmのニトロセルロースシート(Biorad、Marnes la Coquette、フランス)にブロットしました。 eNOSに対する抗体(1:1000; BD Biosciences)をイムノブロッティングに使用しました。タンパク質ローディングコントロールとして、膜を剥がし、GAPDH に対するモノクローナル抗体 (1:10,000、Abcam) とともにインキュベートし、特異的な化学発光シグナルを検出しました。

養子移植実験では、8 週齢の C57BL/6 マウスの脾臓を 40 mm のセルストレーナー上で機械的に分離しました。脾細胞は、AF700結合抗CD45、FITC結合抗CD11b、APC結合抗Ly-6B.2、パシフィックブルー結合抗Ly6GおよびPE結合抗NK1.1で染色した。次いで、FACS BD InFluxを使用して、CD11b+Ly6G-NK1.1-7/4hiおよびCD11b+Ly6G2NK1.1-7/4loを選択した。両方のサブセットの純度は 99% でした。注射前に、トリパンブルー排除によって細胞を計数した。後肢照射の翌日、合計で 105 個の Mohi 単球または 105 個の Molo 単球が C57BL/6 レシピエントに筋肉内注射されました。

結果は±SEMとして表した。一元配置分散分析 (ANOVA) を使用して各パラメータを比較しました。次に、事後ボンフェローニの t 検定比較を実行して、どのグループの差が有意な全体的な ANOVA の原因となっているかを特定しました。 P < 0.05 の値は有意であるとみなされました。

これら 2 つの測定が異なる動物コホートで行われたため、一方では炎症細胞および白血球サブセットの浸潤と他方では虚血後の血管新生との間の統計的関連性の研究は困難である。これにより、予測変数と応答変数が同じ被験者で観察されないため、古典的な統計的アプローチが非効率になります。ベイジアン潜在変数モデル 60 は、炎症細胞および白血球サブセット数の分布に関する事前分布を含めて、血管成長との相関関係を推定する可能性を提供します。モデルのフィッティングは、マルコフ連鎖モンテカルロスを介して JAGS ソフトウェアを使用して実行されました。さまざまな統計分析セクションのすべての P 値は、Benjamini および Hochberg 手順を使用した複数の検定で補正されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究の結果を裏付けるすべてのデータは、この論文とその補足情報ファイルおよび補足データ 1 に含まれています。

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セリーヌ・ロワナール博士は、フランスのフォンテネー・オ・ローズにある放射線防護・核安全研究所（IRSN）の支援を受けています。

放射線防護・核安全研究所 (IRSN)、フォントネー・オー・ローズ、フランス

セリーヌ・ロワナール、モハメッド・アミン・ベナジャウド、ブルーノ・ロム、ステファン・フラマン、ラディア・タマラット

CEA、フォントネーオーローズ、フランス

ヤン・バイジャー

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CL と RT は研究を考案し、実験を計画し、データを解釈しました。 CL、MAB、BL、SF、および JB が実験を実行し、データを分析しました。 CL と RT は、共著者全員の最終承認を得て原稿を執筆しました。

セリーヌ・ロワナールへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。主な編集者: Jemond Dalli と Karli Montague-Cardoso。査読ファイルが利用可能です。

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転載と許可

Loinard, C.、Benadjaoud, MA、Lhomme, B. 他炎症細胞の動態は、マウスの局所放射線誘発損傷後の血管新生と組織治癒を制御します。 Commun Biol 6、571 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04939-3

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受信日: 2022 年 7 月 4 日

受理日: 2023 年 5 月 15 日

公開日: 2023 年 5 月 29 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04939-3

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マウスの局所放射線誘発損傷後の炎症細胞動態が血管新生と組織治癒を制御する