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Mar 16, 2023

メタノール固定は液滴に最適な方法です

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 6、記事番号: 522 (2023) この記事を引用

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24 オルトメトリック

メトリクスの詳細

単一細胞トランスクリプトミクスにおける主な重要なステップは、サンプルの調製です。 サンプル処理をライブラリー調製から分離するために、解離後に細胞を保存するためのいくつかの方法が開発されています。 ただし、これらの方法の適合性は、処理する細胞の種類によって異なります。 このプロジェクトでは、人工多能性幹細胞由来の神経細胞およびグリア細胞に対する液滴ベースの単一細胞 RNA-seq の保存方法の体系的な比較を実行します。 私たちの結果は、DMSO が細胞ごとに検出される RNA 分子および遺伝子の点で最高の細胞品質を提供する一方で、細胞組成に強い影響を与え、ストレスおよびアポトーシス遺伝子の発現を誘導することを示しています。 対照的に、メタノール固定サンプルは、新鮮なサンプルと同様の細胞組成を示し、良好な細胞品質とわずかな発現バイアスを提供します。 まとめると、我々の結果は、メタノール固定が神経細胞集団に対する液滴ベースの単一細胞トランスクリプトミクス実験を実行するための最適な方法であることを示しています。

単一細胞トランスクリプトミクス (scRNA-seq) 法は、個人、組織、さらには疾患における遺伝子発現をハイスループットで研究する方法に革命をもたらしました 1、2、3。 以前は、研究はバルク、つまり特定のサンプルを構成する細胞集団における遺伝子の発現レベルの変化を特定することに限定されていました。 したがって、これらのアプローチでは、対象サンプルの細胞組成の変化と個々の細胞内の遺伝子発現の変化という 2 つの異なる効果が混合されました。 現在、scRNA-seq により、これら 2 つの効果を独立して評価することができ、細胞組成の変化 4,5 と特定の細胞型における遺伝子の発現 6,7 の両方を検出できます。

scRNA-seq 法の人気にもかかわらず、未解決の技術的課題がまだいくつかあります。 たとえば、scRNA-seq に必要な組織からの細胞の解離と良好な細胞懸濁液の取得は非常に組織特異的であり、酵素消化、機械的分離、蛍光活性化細胞などのさまざまな戦略の使用が必要になる場合があります。仕分けおよびその他の技術8、9、10、11、12。 その結果、scRNA-seq 用のサンプルの調製には数時間かかる場合があり、後の時点でサンプルを処理する方が便利になります。 技術的な問題とは別に、外部施設へのサンプルの輸送などの他の理由でサンプルの解離と処理を切り離す必要がある場合、または複数のサンプルを収集して後の時点で一緒に処理したい場合にも、細胞の保存は重要です。時間やお金を節約するため。 これらすべての場合において、研究者は、元のサンプルと比較した個々の細胞の細胞組成および遺伝子発現の違いを最小限に抑える方法でこれらのサンプルを保存したいと考えています。 つまり、最良の保存方法は、サンプルの細胞組成および個々の細胞のトランスクリプトーム プロファイルへの影響が最も少ない方法です。

この問題を克服し、サンプルの取り扱いをライブラリーの調製から切り離すために、いくつかの細胞保存方法がすでに開発されています。 その中には、メタノール固定 13,14、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート 15、ジメチルスルホキシド (DMSO) 凍結保存 16,17、酢酸メタノール (ACME)10、パラホルムアルデヒド 18、CellCover17、および vivoPHIX19 など、自家製および市販のソリューションの両方が含まれています。 これらの方法は、サンプル組成と細胞の RNA の品質を維持することを目的としています。 しかし、サンプルの調製が組織固有であることを考慮すると、サンプルごとに異なる保存方法が最適になる可能性があると予想されます。 これらのプロトコールの多くは、細胞株または末梢血細胞などの入手が容易な細胞でのみテストされているため、解離が難しい細胞や解離中に損傷を受ける可能性のある細胞でのパフォーマンスがどのように機能するかは明らかではありません。 特に、これまでの方法はいずれも、神経疾患を引き起こす分子機構を研究するための神経細胞の主な供給源である成熟ニューロンやヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）由来ニューロンではテストされていません。

この研究では、hiPSC 由来の神経細胞およびグリア細胞における 5 つの一般的な固定または保存方法のパフォーマンスを比較しました。 私たちの研究の結果は、さまざまな保存/固定方法が、トランスクリプトームプロファイル、細胞組成、ライブラリーの複雑さの偏りなど、さまざまな形でサンプルに影響を与えることを示しています。 DMSO 凍結保存は、ライブラリの複雑さの点で最高の細胞品質を提供します。 しかし、取得されたデータセットではニューロンが大幅に枯渇しており、より強いストレスの兆候が示されています。 対照的に、ACME と vivoPHIX は単細胞懸濁液の細胞組成に大きな影響を与えませんが、RNA に損傷を与えるため、ライブラリーの複雑さが減少し、したがって個々の細胞で検出される遺伝子と RNA 分子の数が減少します。 まとめると、我々の結果は、メタノール固定が、新鮮なサンプルと比較して細胞組成や遺伝子発現に影響を与えることなく、高いライブラリ複雑性を提供するため、神経細胞集団に対する液滴ベースの単一細胞トランスクリプトミクス実験を実行するための最適な方法であることを示しています。

個々のまたはプールされた hiPSC 細胞株を、以前に記載されたプロトコル 21 に若干の変更を加えて使用して皮質ニューロンに分化させました。 簡単に説明すると、hiPSCコロニーをマトリゲルでコーティングした12ウェルプレートに播種し、コンフルエントに達した後、BMP阻害剤（ノギン、ドルソモルフィン、およびSB431542）の組み合わせを使用して神経分化を誘導しました（図1a）。 分化の29〜50日後、細胞をパパイン-アキュターゼ溶液で解離して、単一細胞懸濁液を得ました（補足データ1）。 この時点で、サンプルの一部は、Dolomite Bio 自動 Drop-seq セットアップ NADIA (新鮮) を使用して直接カプセル化され、DMSO17 で凍結保存されるか、メタノール 14、22、ACME10、または RNA 分子を安定化する化学成分 (vivoPHIX19 や CellCover17 など) を使用して保存されます。これは以前に単一細胞トランスクリプトミクスで使用されていました（図1b）。

a hiPSC から神経前駆細胞への分化プロトコルの概略図。 b 保存方法の体系的な比較。 hiPSC の分化後、パパイン アキュターゼを使用してすべての細胞を解離し、直接カプセル化するか、試験したさまざまな試薬の 1 つを使用して保存しました。 保存後、細胞を解凍または再水和し、同じプロトコールを使用する市販の Drop-seq セットアップを使用してカプセル化しました。

単一細胞トランスクリプトーム解析を実行する前に、単一細胞懸濁液の保存が取得された RNA の品質に影響を与えるかどうかを調査しました。 この目的のために、-80 °C または 4 °C で最大 15 日間保存した新鮮な保存神経前駆細胞 (NPC) から全 RNA を抽出しました。 各サンプルについて、Agilent TapeStation システムを使用して RNA の総量を定量し、その品質を評価しました。 私たちの結果は、抽出された RNA の品質が使用された保存方法に依存することを示しました。 DMSO、メタノール、および ACME サンプルは、新鮮なサンプルと同様に、非常に高い RNA 完全性数 (RIN) 値 (~9) を示しました。 対照的に、vivoPHIX サンプルにはある程度の RNA 分解（RIN ~7）があり、CellCover で処理したサンプルはより強い分解レベルを示し、RIN 値は 4 °C で ~2、-80 °C で ~6 でした（補足図 1）。 これらの結果は、CellCover が単一細胞トランスクリプトミクス用の細胞の長期保存には適していないことを示しています。 これを考慮して、保存方法を体系的に比較するために CellCover を廃棄することにしました。

異なる保存方法の影響を比較するために、hiPSC を NPC に区別し、異なる保存/固定方法のいずれかを使用して保存するか、市販の Drop-seq セットアップである NADIA 装置で直接カプセル化しました（図 1b）。 細胞のカプセル化とライブラリーの調製は、すべてのサンプルに対して同じプロトコールに従って行われました。 次に、取得したデータセットをさまざまな指標を使用して評価し、その品質を評価しました。

cDNAプロファイルを検査すると、ACMEおよびvivoPHIXサンプルには残りのライブラリーよりもcDNAが少なく、断片が小さいことがわかりました（図2a）。これはRNA分解と一致します。 これは、2週間保存した後にすでにRNAの品質が低いことを示したvivoPHIXサンプルでは予想されましたが、新鮮なサンプルと同様のRIN値を持ったACMEサンプルでは予想されませんでした（補足図1）。 次に、保存方法がライブラリの複雑さに与える影響を評価しました。 samtools23 を使用して、位置合わせされていない各 BAM ファイルをダウンサンプリングし、元のデータセットの 10%、20%、30% などを含むファイルを生成しました。 次に、これらのサブサンプルのそれぞれが同じ計算パイプラインを使用して処理され、ダウンサンプリングされたデジタル遺伝子発現 (DGE) マトリックスが生成されました。 我々の結果は、同じ配列深度において、DMSO凍結保存細胞とメタノール固定細胞は、新鮮細胞と同等以上の細胞当たりの遺伝子と固有分子識別子（UMI）を生成することを示しています。 比較すると、細胞あたり 7500 読み取りの場合、ACME および vivoPHIX サンプルには、新鮮な細胞で得られた遺伝子と UMI の約 40% が含まれています (図 2b) (補足データ 2)。 DMSO サンプル D1 および D2、およびメタノール固定サンプル M3 および M4 における遺伝子および UMI の数が多いのは、カプセル化に使用されたビーズの捕捉効率の違いによるものであり、これらの実験条件における本質的に高い捕捉効率によるものではありません。 (補足図 2 および補足データ 1)。

a カプセル化後に得られたライブラリのトレース（フレッシュ（F1 および F2）、メタノール（M1、M2、M3、および M4）、DMSO（D1、D2、および D3）、ACME（A1 および A2）、および vivoPHIX（V1 を含む）および V2) サンプル。 vivoPHIX および ACME で固定されたサンプルのライブラリーは、断片サイズが小さく、RNA が少なく、これは RNA 分解と一致しています。 b 遺伝子と UMI の数をシーケンス深度 (細胞あたりの平均読み取り数) の関数として示すダウンサンプリング プロット。 どちらの場合も、DMSO (青) ライブラリとメタノール (緑) ライブラリは、新鮮なサンプル (赤) と同等以上の深さを持っています。 c 低品質の細胞とダブレットを廃棄した後の各サンプルの細胞の遺伝子、UMI、ミトコンドリア含有量の割合（％ MT）、およびリボソーム含有量（％ Ribo）の数を示すバイオリンプロット。 バイオリン プロット内に含まれる箱ひげ図は、データ分布を要約します。 ボックスの上辺と下辺は、第 1 四分位数と第 3 四分位数を表します。 中央の線は中央値に相当します。 線は四分位範囲の 1.5 を超えて伸びません。 d 各ライブラリーの細胞に割り当てられたイントロンおよびエキソン UMI のパーセンテージを示す棒グラフ。 イントロンリードの数は、DMSO サンプル D1 の約 10% からメタノールサンプル M4 の約 30% の範囲です。 高イントロン UMI 画分は、細胞 RNA 漏洩または核 RNA 濃縮を示します。

vivoPHIX および ACME ライブラリの複雑さの低さは、サンプル中の低品質細胞の割合にも反映されており、細胞ごとに検出される UMI と遺伝子がほとんどなく (図 2c および表 1)、空の液滴または含まれる液滴に対応する可能性があります。壊れた細胞24． 廃棄される低品質細胞の数は、新鮮な細胞、DMSO 細胞、メタノール固定細胞では細胞の約 10% ですが、ACME サンプルと vivoPHIX サンプルではそれぞれ最大 29% と 49% に増加します (表 1 および補足データ 3)。 ）。

低品質の細胞を廃棄した後でも、残った vivoPHIX 細胞と ACME 細胞は品質に明らかな違いを示しています (図 2c および表 1)。 興味深いことに、ミトコンドリア遺伝子にマッピングされた UMI の割合はすべてのサンプルで同様に低く、これらのサンプルで捕捉された RNA の数が少ないのは、RNA 漏洩や細胞損傷によるものではなく 24、むしろ RNA 捕捉効率または RNA 分解に関連している可能性があることを示唆しています。 さらに、ACMEサンプルは、他のサンプルよりもリボソームタンパク質にマッピングされたUMIの割合がはるかに高いことを示しました（図2c）。これは、以前は低品質の細胞または技術的アーチファクトに関連付けられていました25。

vivoPHIX および ACME 固定細胞の細胞あたりの RNA が少ない理由の 1 つは、固定方法が細胞の破壊を促進するためである可能性があります。 この場合、ライブラリの複雑さは低くなり、主にプレ mRNA に由来し、核に富むイントロン領域からのリードの割合が高くなることが予想されます 26,27。 私たちのサンプルでは、​​各サンプルからのイントロン読み取りの割合は保存方法によって異なり、DMSOサンプルの10％からメタノールおよびvivoPHIXサンプルの約30％までの範囲でした（図2d）。 vivoPHIX およびメタノールサンプルにおけるイントロン読み取りの割合が高いことは、核 RNA が濃縮されていることを示しています 26,27。 しかし、メタノール中で検出された遺伝子と UMI の数が、平均して in vivoPHIX サンプルよりも約 3 倍多いことを考慮すると (補足データ 2)、RNA 漏洩がこの偏りの原因ではない可能性があります。 まとめると、これらの結果は、RNA 漏出の増加や細胞破壊では説明できないが、vivoPHIX および ACME の保存方法がヒト NPC 集団から得られる単一細胞トランスクリプトームの品質に大きな影響を与えることを示しています。

サンプルの全体的な品質指標を評価した後、保存方法がサンプルの細胞組成に影響を与えるかどうかを調査しました。 この目的のために、私たちはすべてのサンプルをプールし、一緒に分析しました。 初期分析では、主に使用された保存方法によって引き起こされる強力なバッチ効果が示されました。 補足図 3 に見られるように、統合前は、異なる実験からのセルが均一多様体近似および射影 (UMAP) プロットの異なる領域を占めています (補足図 3)。 そこで、Harmony28 を使用してデータセットを統合し、hiPSC 分化から得られた細胞集団を特定しました (図 3)。 バッチ補正後、増殖前駆細胞、NPC、アストログリア前駆細胞、中間前駆細胞、および特定のマーカー遺伝子の発現を特徴とするさまざまな種類のニューロンに対応する12の細胞集団を特定しました（図3、補足図4および5、および補足データ4）および5）。 特定されたクラスターはすべて、個々のサンプルすべてに存在していました。 それでも、各細胞集団の相対的な存在量は、使用された保存方法に応じて変化しました（図4aおよび補足図6）。 これらの変化が実験的なバイアスによるものなのか、それとも固定法による系統的なバイアスによるものなのかを調査するために、scCODA を使用してサンプルの組成分析を実行しました。これは、低レベルのデータセットでも単一細胞データセットの変化を確実に識別できる最近開発されたツールです。複製数5。 他の方法とは対照的に、scCODA は各クラスターを個別にモデル化するのではなく、サンプル全体の組成の偏りをモデル化します。 これにより、サンプル内の他のすべての細胞集団が人為的に増加する、単一細胞集団の枯渇による細胞比率の変化を誤って特定することが防止されます。 組成の変化を特定するために、参照グループとして新鮮なサンプルを選択しました。これにより、このグループと比較して組成の変化が見つかったかどうかが結果で示されます。 この分析の結果は、新鮮なサンプルと比較してDMSO凍結保存サンプルにおける興奮性ニューロンの大幅な減少を強調していますが、他の方法を使用して保存されたサンプルでは重大な組成の偏りは見つかりませんでした（図4b）。

NPC サンプルで同定された細胞集団を示す UMAP プロット。これには、さまざまな種類の NPC 集団、星状グリア前駆細胞、中間前駆細胞、興奮性および抑制性の両方の未熟ニューロンが含まれます。 b NPCマーカー（SOX2）、増殖マーカー（TOP2AおよびPCNA）、皮質運命マーカー（FOXG1）、背側運命マーカー（PAX3）、ルーフなど、（a）の細胞集団を特定するために使用されている既知のマーカー遺伝子の特徴プロットプレートマーカー（PTN）、アストログリアマーカー（ADGRV1およびGJA1）、未熟ニューロンマーカー（DCX）、中間前駆細胞マーカー（HES6）、抑制性（GAD2）、および興奮性（SLC17A6）ニューロンマーカー。

各固定方法のクラスター全体にわたる細胞の分布を示す UMAP プロット。 クラスターは図 3a のように色付けされます。 DMSO で保存されたサンプルは、他のすべてのサンプルと比較して、神経細胞クラスター内の細胞が大幅に減少していることを示します。 b 各メソッドの各クラスターに割り当てられたセルの平均割合を示す棒グラフ。 バーの高さは、同じ方法を使用して保存されたすべてのサンプルの平均を表します。 黒い点は、個々のサンプル内の細胞の割合を表します。 * scCODA によって予測された、新鮮なサンプルと比較して、特定のサンプルの細胞割合に有意な差があるサンプルを示します。これは、誤検出率 <0.05 を考慮した scCODA モデルに従って、サンプルの平均スコアがゼロ未満であることを意味します。

最後に、保存方法がサンプル間の比較に影響を与える可能性のある遺伝子発現の変化を誘発するかどうかを調査しました。 サンプル間の遺伝子発現の比較は、すべてのサンプル間で高い相関を示します（ピアソン相関係数 R > = 0.8）が、ACME および vivoPHIX サンプルは他のすべてのサンプルとわずかに低い相関を示します（補足図 7）。 この低い相関関係は、遺伝子発現における全体的または細胞型特異的な変化だけでなく、組成の偏りによっても説明できます。 これをさらに調査するために、各サンプルのクラスターごとに擬似バルク カウントを個別に生成し、クラスター レベルで相関分析を実行しました。 私たちの分析は、固定方法がサンプル全体の細胞集団のクラスタリングに偏りを引き起こすことを示しています（補足図8）。 ただし、異なるクラスター、つまり NPC 集団間の類似性が高いため、特定の方法で保存された細胞クラスターが一緒にクラスター化されます。 この問題に対処するために、階層的クラスタリングの統計的有意性をテストするために設計された統計手法である sigclust229 を使用して、各セル クラスタのサンプルのクラスタリングを個別に評価しました。 図 5 からわかるように、すべての場合において、メタノール サンプルは新鮮なサンプルとクラスター化しています。 対照的に、同定された 12 個の細胞集団のうち 8 個では、いくつかの vivoPHIX および ACME サンプルが新鮮なサンプルとは別にクラスター化しています。 したがって、この分析は、各クラスター内のメタノール固定細胞の全体的な発現プロファイルが、他の方法を使用して保存された細胞の発現プロファイルよりも新鮮な細胞の発現プロファイルに類似していることを確認します。

同じ細胞クラスターに属する異なるサンプルからの細胞の遺伝子発現プロファイルの類似性を示す樹状図。 サンプルには次のようにラベルが付けられています: フレッシュ (F1 および F2、赤色)、メタノール (M1、M2、M3、および M4、緑色)、DMSO (D1、D2、および D3、青色)、ACME (A1 および A2) 、紫色）およびvivoPHIX（V1およびV2、マゼンタ色）。 階層的クラスタリングにおける有意性は、sigclust2 に実装されている shc テストを使用して評価されます。 樹状図内の重要な分岐はピンク色で強調表示されます。 *、**、および *** は、それぞれ 0.05、0.01、または 0.001 より小さい P 値を持つブランチをマークします。 重要でないブランチは黄色で強調表示され、テストされていないブランチは青と緑で強調表示されます。

以前の研究では、解離および保存方法がトランスクリプトーム レベルで反映される細胞ストレスを誘発する可能性があることが示されています9,30。 したがって、データセット内の前初期遺伝子 (IEG) とアポトーシス マーカーの発現を確認しました。 アポトーシス遺伝子サインは、新鮮なサンプルと比較してACME、vivoPHIX、およびDMSOサンプルで高く、メタノール固定サンプルよりもDMSOで高かったが、これらの違いは最小限でした（図6a）。 すべての固定サンプルは新鮮サンプルよりも高いIEGの発現を示しましたが、DMSO凍結保存細胞は他のすべてのサンプルよりも高いIEGの発現を示しました（図6b）。 この結果は、凍結と解凍が細胞のトランスクリプトーム プロファイルに全体的に反映される形で細胞にストレスを与えることを示しています。 細胞の保存が個々のクラスターレベルでさらなる発現バイアスを誘発するかどうかを調査するために、muscat31を使用して、新鮮サンプルと比較して固定サンプルにおける細胞型特異的に発現差のある遺伝子（DEG）を特定しました（補足データ6）。 私たちの分析では、差次的発現遺伝子 (DEG) の数が固定方法によって大きく異なることが示されました。 vivoPHIX サンプルではすべてのクラスターに多くの DEG が存在しますが、DMSO サンプルでは有意な DEG の量はゼロに近いです (図 6c および補足データ 6)。 遺伝子オントロジー用語エンリッチメント分析を使用して、さまざまな固定方法が特定の機能に関連する遺伝子発現にバイアスを導入するかどうかを調査しました。 私たちの結果では、複数の細胞クラスターにわたって一貫して上方制御または下方制御されている遺伝子で過剰表現されている有意な用語は見つかりませんでした。これは、固定方法がクラスター全体の遺伝子発現に及ぼす影響が特定の細胞の機能や位置に関連していないことを示唆しています。

a、b サンプル前処理方法全体でのアポトーシス (a) およびストレス (b) サインの濃縮スコアの分布を示すバイオリン プロット。 バイオリン プロット内に含まれる箱ひげ図は、データ分布を要約します。 ボックスの上辺と下辺は、第 1 四分位数と第 3 四分位数を表します。 中央の線は中央値に相当します。 線は四分位範囲の 1.5 を超えて伸びません。 a アポトーシス濃縮スコアは、新鮮サンプル (黒のアスタリスク) と比較して DMSO、ACME、および vivoPHIX サンプルの方が高く、メタノール (青のアスタリスク) と比較して DMSO の方が高くなります。 b 応力サインは、新鮮なサンプルと比較してすべての固定/保存方法で高く (黒のアスタリスク)、また、他のすべての固定方法と比較して DMSO で高くなります (青のアスタリスク)。 すべての場合において、統計的有意性は片側ウィルコクソン順位和検定を使用して検定されました。 新鮮なものとの比較は黒 * でマークされ、DMSO と他の固定法との比較は青でマークされます。 ** は P 値 <0.01 を示します。 *** は P 値 <0.001 を示します。 c log2fc > = |0.58| で各細胞クラスター内の各固定方法で有意に上方制御および下方制御された遺伝子の数を示す棒グラフ。 調整済みワルド検定 P 値 <0.05。 vivoPHIX およびメタノールのサンプルにはクラスター全体でより多くの DEG が含まれていますが、DMSO の DEG の数はゼロに近いです。

単一細胞トランスクリプトーム解析法は、サンプルや条件にわたるトランスクリプトームの変化を研究するための新しい標準になりつつあります。 これらの技術は、RNA-seq や 3' seq などのバルク トランスクリプトミクス法と比較すると比較的新しいものです。 したがって、多くの場合、使用されるさまざまなサンプルに対する標準的な調製プロトコルはまだ存在しません。 このプロジェクトでは、一般的に使用される保存および固定方法が、hiPSC 由来の神経細胞およびグリア細胞集団の細胞組成および発現にどのような影響を与えるかを比較しました。 したがって、この研究は、単一細胞トランスクリプトームの品質に対する 1 つの保存方法のみの効果を比較した、または異なる細胞型に対する効果に焦点を当てた、したがって神経細胞には適用できない可能性がある以前の研究を拡張します 13、14、15、16 、17、18、19。 私たちの結果は、異なる保存/固定方法が、ライブラリの複雑さの低下、細胞組成の変化、個々の細胞の発現プロファイルの変化など、さまざまな形で単一細胞トランスクリプトミクスデータセットの品質に影響を与えることを示しています（表2）。

ライブラリーの複雑さの点で、ACME および vivoPHIX サンプルは、単一細胞カプセル化後に得られる cDNA 量の大幅な減少を示し (図 2a)、これは遺伝子および UMI の検出低下にも反映されています (図 2b)。 vivoPHIX サンプルの場合、これは RIN 値が低い、RNA サンプルの初期品質の低下に関連している可能性があります (補足図 1)。 ACME サンプルの場合、RNA の品質は新鮮なサンプルと同等であり、この減少は、ACME 固定サンプルでは RNA の完全性が時間の経過とともに低下することを示す以前の報告と一致しています10。 ドロップアウト率が高いため、これらのサンプルのライブラリの複雑さが低いことは、細胞集団クラスタリング分析における偏りの原因である可能性が高く（図5）、それが各クラスターで特定されたDEGの数に寄与する可能性があります（図6cおよび補足）データ6)。

細胞組成を見ると、DMSO 凍結保存サンプルでは神経細胞が大幅に減少していることが結果から明らかにわかります (図 4)。 このプロジェクトではさまざまな細胞株と実験が使用されており、これが細胞型の組成に影響を及ぼす交絡効果である可能性があります。 ただし、まったく同じ分化に由来する DMSO サンプルとメタノールサンプル (M3、M4、D1、および D2) (補足データ 1) を比較すると、メタノールサンプルと DMSO サンプルの間の興奮性ニューロン集団の相対存在量の明らかな違いが強調されます。組成の偏りは固定/保存手順によるものであるという追加の証拠（補足図6）。 DMSO は、単一細胞トランスクリプトミクスのための細胞保存の優れた方法として以前に報告されています 16,17 が、これらの研究はいずれも成熟神経細胞に対する DMSO の影響を検討していませんでした。 回復したニューロンの数の減少は、DMSO 毒性 32,33 または以前に報告されており、非常に短時間の曝露後に細胞に影響を与える可能性がある DMSO 誘発性の反応性グリオーシス 32 、または単に耐性のないニューロンの脆弱性が原因である可能性があります。解凍/冷凍サイクルに耐えられます。 後者は、新鮮なサンプルや他のすべての固定サンプルと比較して、DMSO サンプルにおけるストレス遺伝子の発現が高いことを説明できる可能性があります。 それでも、得られたニューロンは、新鮮なメタノール固定サンプルでクラスター化することが多く、有意なDEGがほとんどないため、強い発現バイアスは示されません（図6および補足データ6）。 私たちの結果は、DMSO が hiPSC 由来細胞の組成分析を行うのに良い選択ではないことを示していますが、細胞の利用可能性が問題にならない場合、純粋な神経サンプルのプロファイリングには使用できる可能性があります。

私たちの分析は、固定/保存方法が異なると遺伝子発現が異なる方法で変化することも示しています。 固定によって誘導される発現バイアスは、vivoPHIX および ACME サンプルの場合と同様に、細胞クラスターの全体的な発現プロファイルに影響を与える可能性があります (図 5、補足図 7 および 8)。あるいは、遺伝子発現における細胞型特異的な変化を引き起こす可能性があります (図.6c および補足データ 6)。 さらに、新鮮と比較してすべてのサンプルでIEGの発現が高く、生体内PHIX、ACME、およびDMSO細胞でのアポトーシスマーカーの発現が新鮮と比較して高いことがわかりました（図6a、b）。 これらの結果は、高い IEG 発現が解離バイアスと凍結保存バイアスに関連するという以前の観察を裏付けており 9,30、単一細胞データで観察された遺伝子発現の変化を確認するための正確な制御と検証実験の必要性を強調しています。

最後に、固定方法はライブラリの複雑さ、遺伝子および UMI の数に影響を与えるため、差次的に発現する遺伝子の検出に影響を与える可能性があることを考慮する必要があります。 差次的に発現される遺伝子を検出する能力が、遺伝子に割り当てられたリードまたは UMI の数に直接関係していることを考えると、生物学的または実験的条件による微妙な差次的発現の変化が見逃される可能性があります。 これらの効果は、細胞ごとに検出される遺伝子とUMIが少ないACMEおよびvivoPHIXサンプルでより高いと予想されます（図2c）が、より多くの細胞を配列決定すればこれを補うことができます。 メタノール固定細胞は、これまでにさまざまな生物学的条件にわたる単一細胞データの遺伝子発現の変化を発見するために使用されて成功しており 34,35 、この固定方法が恒常性遺伝子発現を特定するだけでなく、より微妙な生物学的差異を特定するのにも適していることを示しています。

さまざまな方法の長所と短所 (表 2) およびこの研究の限界を考慮した比較分析により、メタノール固定が神経細胞の単一細胞トランスクリプトミクス分析を実行するための最良の保存方法であることが示されました。 メタノール固定細胞からのライブラリーは、新鮮な細胞のライブラリーと同様の複雑性を持ち (図 2)、細胞の全体的なトランスクリプトーム プロファイルに影響を与える遺伝子発現に強い偏りはありません (図 5 および 6、補足データ 4 および 5)。細胞組成（図4および補足図6）、したがって、新鮮な細胞のプロファイルに最も類似したプロファイルをサンプルに提供します。

この研究では、条件ごとに数回 (2 ～ 4 回) の反復を使用して、hiPSC 由来の神経細胞およびグリア細胞における固定および保存方法の影響をテストしました。 個々の単一細胞実験のコストと現在の実験標準を考慮すると、この反復回数は許容可能です。 しかし、サンプルの品質における考えられるすべての変数の影響を完全に評価する能力は制限されます。 私たちの結果は、保存方法だけがサンプルの組成と遺伝子発現に影響を与えるわけではないことを示しています。 保存日数、使用した細胞株、分化実験、ビーズのバッチなどのその他のパラメーターは、最終的な単一細胞トランスクリプトームに影響を与えます。 ただし、この研究ではそれらすべての広範な比較は提供されていないため、このプロジェクトの範囲外です。 したがって、異なる細胞タイプ、サンプル、および単一細胞技術を使用する場合、またはここで使用した実験条件とは異なる実験条件を使用する場合、この研究で得られる結果は異なる可能性があります。 研究者は、サンプル処理が単一細胞トランスクリプトミクス実験の結果に大きな影響を与える可能性があることを今回の結果が示していることを考慮して、これらすべての要因を考慮し、個々の実験を最適化する必要があります。

hiPSC は、500 U ml-1 ペニシリンおよび 500 mg ml-1 ストレプトマイシン (Gibco、#15140122) を補充した mTeSR-1 培地 (StemCell Technologies、#85850) 中で 1:40 マトリゲル (Corning、#354277) でコーティングしたディッシュ上で維持しました。 皮質ニューロンの分化については、以前に記載されたプロトコル 21 にわずかな変更を加えて従った。 簡単に言うと、播種後1日で100%のコンフルエンスを確保するのに十分な細胞密度で、1:40マトリゲルでコーティングした12ウェルプレートにhiPSCコロニーを播種しました。 1日目に、培地を神経誘導培地（1×N-2（Gibco、#21103049）を含む神経維持培地（DMEM/F-12 GlutaMAX（Gibco、#10565018）の比率が1：1）およびNeurabasal（Gibco、#21103049）培地）に切り替えました。 Gibco、#17502048)、1× B-27 (Gibco、#17504044)、5 μg ml-1 インスリン (Sigma、#I9278)、1 mM l-グルタミン (Gibco、#35050061)、100 μM 非必須アミノ酸(Lonza、#BE13-114E)、100 μM 2-メルカプトエタノール (Gibco、#31350010)、50 U ml-1 ペニシリンおよび 50 mg ml-1 ストレプトマイシン)、500 ng ml-1 ノギン (R&D Systems、# 3344- NG-050)、1 μM ドルソモルフィン (StemCell テクノロジーズ、#72102)、および 10 μM SB431542 (Calbiochem、# 616461))。 神経上皮シートが形成されるまで、神経誘導培地を 9 ～ 12 日間毎日交換しました。 この時点で、ディスパーゼ (StemCell Technologies、#07923) を使用して神経上皮細胞を集合体として収集し、2 ml の神経維持培地を含む 20 μg ml-1 のラミニンでコーティングされた (Sigma、#L2020) 6 ウェル プレートに播種しました。 細胞は、神経ロゼット構造が認識できるまで（神経誘導後 12 ～ 15 日目）、神経維持培地中で 1 日おきに交換しながらインキュベートされました。 次に、神経幹細胞の増殖を促進するために、20 ng ml-1 の bFGF (Peprotech、#100-18B) を培地に 2 ～ 4 日間添加しました。 神経誘導後 18 日目に、前駆体増幅のために細胞をディスパーゼで分割しました。 24日目、ニューロンがロゼットの外側に蓄積し始めると、単細胞懸濁液中でAccutase（Merck Millipore、#SCR005）を使用して細胞を1:3で継代し、20 μg ml-2で50,000細胞cm-2で播種しました。ラミニンコーティングされた 6 ウェルプレート 1 枚。 1週間後、細胞を再び分割し(比率1:4)、20μg ml-1のラミニンコート6ウェルプレートに播種し、培地交換による神経誘導後最大50日間(29〜50日間)培養を継続した。 2日ごとに。 NPC を取得するために、いくつかの hiPSC 細胞株と分化実験が使用されました (補足データ 1)。 細胞培養に使用される培地および試薬に関する追加情報は、補足データ 7 にあります。この研究で使用されるすべての hiPSC 細胞株は、ヒトのドナーからのインフォームドコンセントを得て生成されました。 この研究における hiPSC の使用は、カルロス 3 世国立衛生研究所からのヒト細胞および組織の提供および使用に関するスペインの国家保証委員会によって承認されました。

scRNA-seq 技術に最適化された前述のプロトコールに従って、細胞を単一細胞懸濁液に解離させました 36。 要約すると、パパイン-アキュターゼ解離バッファー (1:1) (PDS キット、パパイン、ワーシントン バイオケミカル コーポレーション、#LK003176) を使用して細胞を 37 °C で 35 分間酵素的に解離し、 10 μM の ROCK 阻害剤 (Y-27632、StemCell Technologies、#72304) および 0.033 mg ml-1 の DNase (DNase (D2)、Worthington Biochemical Corporation、#LK003170)。 細胞培養に使用される培地および試薬に関する追加情報は、補足データ 7 にあります。細胞懸濁液を 40 µm ストレーナー (Pluriselect Life Science、#43-10040-60) でろ過し、150 g で 3 分間遠心分離しました。 RT。 DPBS中の0.4 mg ml-1 BSAで3回洗浄した後、細胞を計数し、トリパンブルー法により生存率を記録した。 細胞生存率が 75% を超えるサンプルのみが研究に含まれました。

解離後の約 2.5 × 106 個の細胞を、1 ml の凍結培地、10% v/v DMSO (Sigma-Aldrich、#D2438) および 20 ng ml-1 bFGF を補充した神経維持培地中の冷凍バイアルに凍結保存しました。 クライオバイアルを、事前にイソプロピルアルコールで満たした Mr. Frosty 冷凍容器 (Nalgene、#5100-001) に入れ、-80 °C で一晩 (ON) 保存し、その後、長期保存のために気相窒素冷凍庫に移しました。 DMSO 凍結保存サンプルを 37 °C のウォーターバスで継続的に撹拌しながら解凍し、その後 1 ml の維持培地をバイアルに加え、10 ml の維持培地を含むファルコンチューブに移しました。 細胞を室温、160 gで5分間遠心分離した。 上清を注意深く除去し、細胞ペレットを1 mlのDPBSおよび0.01% BSAで洗浄し、次いで1.5 ml DNA LoBindチューブ(Eppendorf、#022431021)に移した。 細胞を再びペレット化し、DPBSおよび0.01% BSAに再懸濁した。 最後に、細胞を 40 µm ストレーナーでろ過し、ノイバウアー チャンバー内で標準的なトリパン ブルー法を使用して計数しました。

10X Genomics (CG000136) での単一細胞 RNA-seq のメタノール固定プロトコルに従って、200 μl の氷冷 DPBS を加えて 2.5 × 106 細胞ペレットを再懸濁しました。 事前に冷却した100%メタノール800μlを、最終メタノール濃度が80%に達するまで滴下した。 DNA LoBind チューブ内のサンプルを氷上に 30 分間置き、次に -20 °C でオンにし、最後に長期保存のために -80 °C に移しました。 メタノールで固定した細胞を氷上で解凍し、遠心分離して上清を除去した。 細胞ペレットを洗浄し、RNA分解を避けるために、0.01% BSAおよび0.2 U μl-1のRNase阻害剤（Takara Bio、#2313 A）および1 mM DTT（Sigma-Aldrich、#D0632））を含む1 mlのDPBSで再水和しました。 。 細胞を 40 µm ストレーナーで再度ろ過し、ノイバウアー チャンバーで計数しました。

1 × 106 ～ 5 × 106 細胞のペレットを 100 μl の洗浄バッファー (0.01% BSA、0.2 U μl-1 の RNase 阻害剤および 1 mM DTT を含む DPBS) で穏やかに再懸濁しました。 次いで、チューブを混合しながら、ＡＣＭＥ溶液（洗浄緩衝液：メタノール：酢酸：グリセロール；最終比１３：３：２：２）を滴下して最終体積１ｍｌとし、室温で３０分間インキュベートした。 1000 g、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した後、固定細胞ペレットを1 mlの洗浄緩衝液で2回洗浄し、-で保存するために10％v/v DMSOを補充した1 mlの洗浄緩衝液に再懸濁しました。 80℃。 ACME 固定サンプルは、メタノール固定サンプルと同じプロトコールに従って解凍および再水和されました。

1 × 106 ～ 5 × 106 個の細胞を含む細胞ペレットを、0.01% BSA を含む 25 μl の DPBS で穏やかに再懸濁しました。 サンプルの固定では、75 μl の vivoPHIX 試薬 (Rapid Labs、#RD-VIVO-5) (比率 3:1) を添加し、固定の最初の 5 分間にチューブを 10 回反転させて混合しました。 次に、チューブを室温のホイール装置上に置き、さらに 30 分間インキュベートしました。 サンプルは 4 °C ON で保存され、その後、長期保存の場合は -80 °C に移されました。

vivoPHIX で固定したサンプルは、1 倍量 (100 μl) の 100% エタノールを加え、チューブを数回反転して混合することによって再水和されました。 次に、細胞を室温、1000gで5分間ペレット化し、上清を廃棄した。 ０．５ｍｌのｖｉｖｏＰＨＩＸ−ＳＣＡＡ（３倍量の氷酢酸を含む１倍量のｖｉｖｏＰＨＩＸ）を、細胞ペレットを乱すことなく非常にゆっくりと添加し、室温で正確に３分間インキュベートした。 ペレットからvivoPHIX-SCAAを除去し、P20ピペットチップを使用して残りの液体を除去するために、室温で5分間、100gで細胞を再びペレット化した。 細胞ペレットを、０．０１％ＢＳＡおよび０．２Ｕμｌ−１のＲＮａｓｅ阻害剤および１ｍＭ ＤＴＴを含むＤＰＢＳで３回洗浄し、上清を廃棄した。 細胞を 40 µm ストレーナーでろ過し、ノイバウアー チャンバーで計数しました。

アキュターゼパパイン溶液による酵素解離後、1 × 106 ～ 5 × 106 個の細胞を含む細胞ペレットを残りの洗浄バッファー (25 μl) でチューブを軽くはじくことによって穏やかに再懸濁しました。 次に、10倍量のCellCover (250μl) (Anacyte Laboratories)を加え、細胞懸濁液を使用するまで4℃または-80℃で保存した。 同社が提供する推奨プロトコルでは、サンプルを凍結したり、2 ～ 7 日間の長期間保存したりすることは推奨されていません。 ただし、プロトコルは非常に単純であるため、ワークフローでこの試薬の効率をテストしたいと考えました。 CellCover 固定サンプルは、メタノール固定サンプルと同じ手順に従って回収されました。

NADIA 機器 (Dolomite Bio、#3200590) での単一細胞のカプセル化については、会社が提供するプロトコールに従いました。 75,000 個の細胞を 250 μl (300,000 細胞 ml-1) の容量でロードし、150,000 個の Macosko oligodT ビーズ (ChemGenes Corporation、#Macosko-2011-10 (V + )) を 250 μl (600 ビーズ μl-1) 中にロードしました。溶解緩衝液（ヌクレアーゼフリー水中の６％ｗ／ｖフィコールＰＭ－４００、０．２％ｖ／ｖサルコシル、０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、０．２ＭトリスｐＨ７．５および０．０５Ｍ ＤＴＴ）に再懸濁した。 細胞とビーズは、5 ～ 7% の捕捉効率でデバイスのマイクロ流体チップ内を同時流動しました。

液滴エマルジョンの破壊の直後、oligodT によって捕捉された RNA は逆転写されます (maxima H RT Master Mix、Thermo、#EP0751) (補足データ 8)。 次に、RNA 分子を捕捉しなかった過剰なビーズプライマーを、ビーズを Exonuclease I (New England Biolabs、#174M0293L) と 37 °C で 45 分間インキュベートすることによって除去しました。 微粒子 (STAMPS) に付着した収集された単一細胞トランスクリプトームをカウントし、ヌクレアーゼフリー水に 400 ビーズ µl-1 で再懸濁し、PCR チューブあたり 4000 ビーズのプールに分割し、使用したビーズバッチに応じて 9 または 11 PCR サイクルで増幅しました。カプセル化の場合 (バッチ 01 では 9 サイクル、その他では 11 サイクル)。 サンプルに対して 0.6:1 AMPure XP Beads (Agencourt、#A63881) を使用して cDNA を精製した後、Qubit dsDNA HS Assay (Thermo、#Q32851) で定量化し、4200 TapeStation System (Agilent、#G2991BA) を使用して断片サイズのチェックアップを実行しました。 。 Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina、#FC-131-1096) を、600 pg の cDNA のタグメンテーション、イルミナアダプターのタグ付けおよび増幅に使用しました (補足データ 8)。 サンプルに対して 0.6:1 AMPure XP Beads で精製した後の Nextera ライブラリのサイズは、4200 TapeStation System を使用して決定され、Qubit dsDNA HS Assay で定量されました。1.8 pM のプールされたライブラリは、Nextseq 550 High Output v2 を使用して Illumina NextSeq 550 シーケンサーでシーケンスされました。キット (75 サイクル) (Illumina、#20024906) ペアエンドモード。 カスタム プライマー Read1CustSeqB37 (細胞バーコードおよび UMI) を使用したリード 1 では 20 bp、リード 2 では 64 bp、i7 インデックスでは 8 bp。

scRNA-seq ライブラリは、Drop-seq_tools 2.3 パイプライン 38 を使用して処理され、デジタル遺伝子発現 (DGE) マトリックスが生成されました。 まず、Drop-seq ツールを使用して、Ensembl バージョン 100 アノテーション 39 を参照として使用して、ヒトゲノムの hg38 アセンブリ バージョンのインデックス ファイルとアノテーション ファイルを生成しました。 次に、picard ツール v2.18.1440 を使用して、ペアエンド読み取りを含む fastq ファイルを単一のアライメントされていない BAM ファイルにマージしました。 Drop-seq ツールキットをデフォルトのパラメーターで使用して、リードに細胞と分子バーコードをタグ付けし、5' 末端をトリミングしてアダプター配列を除去し、3' 末端をトリミングしてポリA テールを除去しました。 次に、STAR バージョン 2.7.0.a41 を使用してリードをヒトゲノム (バージョン hg38) にマッピングしました。 結果として得られた bam ファイルには、遺伝子が重複するリードを特定するためにアノテーション メタデータ ファイルがタグ付けされました。 最後に、セル バーコードの修正は、プログラム DetectBeadSubstitutionError および DetectBeadSynthesisErrors を使用し、デフォルトのパラメーターでも実行されました。 単一セルのカプセル化中に取得されたセルの数を推定するために、上位 N 個のバーコードに割り当てられた一意にマップされたリードの数を入力として使用するニー プロットを使用しました。ここで、N は予想されるセルの数の少なくとも 5 倍です。 この手順で得られた推定セル数を使用して DGE を生成しました。 データセットごとに 2 つの DGE マトリックスが生成されました。1 つはパラメーター LOCUS_FUNCTION_LIST = INTRONIC LOCUS_FUNCTION_LIST = INTERGENIC を使用して遺伝子に重複するすべての UMI を含み、もう 1 つはパラメーター LOCUS_FUNCTION_LIST = null LOCUS_FUNCTION_LIST = INTRONIC を使用してイントロンに重複するすべての UMI を含みます。

DGE 発現マトリックスは、Seurat v 4.2.142 を使用して分析されました。 まず、各データセットに対して Seurat オブジェクトを生成し、低品質セルのフィルタリングを実行する前にこれらのオブジェクトを結合しました。 手作業による検査の後、UMI 数が 200 未満または 17000 を超え、遺伝子数が 200 未満または 5500 を超え、ミトコンドリア転写物の割合が 7.5% を超え、リボソーム含有量が 40% を超えるすべての細胞が廃棄されました。 各ステップで破棄されるセルの数は補足データ 3 に示されています。次に、各サンプル オブジェクトで DoubletFinder43 を個別に使用して、ダブレットを削除しました。 各データセットで特定されたパラメーターとダブレットについては、補足データ 9 で詳しく説明します。ダブレットを削除した後、個々のオブジェクトをマージして結合解析を実行しました。 最初に、3 個未満の細胞で発現されたすべての遺伝子が除去されました。 さらに、線形モデルを当てはめて、UMI の対数と細胞ごとに検出された遺伝子の対数の間の関係を記述しました。 残差が-0.5 より小さいすべてのセル (3 セル) を廃棄しました。 得られた最終的なスーラ オブジェクトには、16,870 個の細胞と 24,468 個の遺伝子が含まれていました。

私たちはスーラ関数を使用して、ミトコンドリア転写物の割合、遺伝子の数、UMI の数、および保存方法を回帰分析しました。 データを正規化するには、LogNormalize メソッドを使用し、スケール係数 10,000 を乗算しました。 次に、最も可変性の高い 2,000 個の遺伝子を選択して、100 個の主成分 (PC) を計算しました。 ElbowPlot 関数を使用して、各 PC によって説明される変動量を手動で検査し、kNN グラフの構築に使用される最初の 20 台の PC を選択し、500 トレーニング エポック (反復) を使用して UMAP プロットを計算しました。 データセット間で共有される細胞集団の識別に影響を与えるバッチ効果を排除するために、Harmony パッケージ 28 を使用しました。 RunHarmony 関数はフィルタリングおよび処理されたオブジェクトに適用され、統合する変数としてサンプルを提供しました。 更新されたエルボー プロットを検査することにより、クラスタリングを実行する最初の 19 台の修正された PC を選択しました。 パッケージ clustree44 を使用して、0.1 から 1 までのさまざまな解像度でクラスタリング結果を検査し、12 細胞集団が得られた最終解像度 0.7 を選択しました。 各クラスターの上位マーカーを計算するには、ポジティブ マーカーのみと残りのデフォルト パラメーターを使用して Seurat の FindAllMarkers 関数を使用しました。 調整されたウィルコクソン順位和検定 P 値が 0.05 より小さい、統計的に有意なマーカーが選択されました。

Seurat パッケージ 42 のデフォルトパラメーターを備えた関数 AddModuleScore を使用して、さまざまな固定方法がストレスを誘発するか、細胞間のアポトーシスを促進するかを評価しました。 この関数は、特定の遺伝子のセットの発現を、データセット内で同様の発現を持つランダムな遺伝子のセットと比較して、濃縮度を計算します。 アポトーシス シグネチャについては、遺伝子 BCL2、TNF、TP53、CASP3、BAX、CASP8、FAS45 を含む遺伝子シグネチャを構築しました。 ストレスサインには、次の初期遺伝子 FOS、JUN、EGR1、UBC、HSPA1B、BTG2、IER2、ID330 を使用しました。 異なる固定方法と新鮮なサンプルの間のシグネチャ スコアの統計的に有意な差は、片側 Wilcoxon 順位和検定を使用して計算されました。

細胞組成の変化を評価するために、scCODA5 を使用しました。 scCODA を実行するために、新しいサンプルを参照条件として定義しました。 比較を設定するには、サンプル間の変動が低いクラスターを参照として選択する必要がありました。 この場合、参照として NPC クラスターを使用しました。NPC クラスターは、十分な数のセルと非常に低い分散量 (グループ間の差異として表現) を持ちました。 結果の一貫性と再現性を確保するために、デフォルトのパラメーターを使用してハミルトニアン モンテカルロ サンプリング法を使用して scCODA5 を 10 回実行し、結果を平均しました。 scCODA モデルによると、平均スコアがゼロ未満 (またはゼロ以上) の細胞タイプは、存在量が大幅に減少 (または増加) しています (誤検出率 < 0.05)。

R パッケージ Muscat31 の関数 aggregateData を使用して、各サンプルの各クラスターの擬似バルク発現値を取得しました。 次に、関数 pbDS を使用して、各クラスターに対して DESeq246 を使用した差次的遺伝子発現解析を実行し、新鮮なサンプルと比較して各メソッドの DEG を特定しました。 調整された Wald 検定 P 値 <0.05 および絶対 log2 倍率変化 >0.58 を持つ DEG は、補足データ 6 および図 6c で利用できます。 さまざまな固定/保存方法が特定の遺伝子セットの発現に偏りをもたらしたかどうかを評価するために、GSEApy パッケージのエンリッチャー機能を使用して、上方制御および下方制御された遺伝子に関連する生物学的プロセスを調査しました。 この分析では、各固定/保存方法で少なくとも 4 種類の細胞にわたって一貫して上方制御または下方制御されているすべての遺伝子を使用しました。 少なくとも 10 個の遺伝子を含む遺伝子セットのみが分析されました。 濃縮分析のバックグラウンドセットとして、少なくとも 445 個の UMI (同定された DEG の中で最小の発現) を持つデータセット内で発現されるすべての遺伝子を提供しました。 すべての比較を通じて、有意に過剰表現された遺伝子オントロジー項は特定されませんでした (超幾何テストで調整された P 値 <0.001)。

データセット間の相関関係を評価するために、各データセットのすべての細胞の発現プロファイルをグローバルおよびクラスター レベルで比較しました。 その目的のために、特定のクラスター/データセット内のすべての遺伝子の擬似バルク発現値を計算しました。 その後、正規化された式 n が n = log (c + 1) になるように、擬似カウントを使用してカウント c を対数変換しました。 これらの正規化された発現値を使用して、R の cor 関数を使用して細胞タイプ/サンプルごとのピアソン相関係数を計算しました。 pheatmap48 関数を使用して完全クラスタリング法を使用して階層的クラスタリングを実行し、相関係数を使用してクラスター間のユークリッド距離を計算しました。 多くの細胞クラスターが非常に類似していることを考慮して、各細胞タイプに対して同じ手順を個別に繰り返し、対応する相関テーブルの sigclust2 R パッケージ 29 の shc 関数を使用してサンプルクラスターの統計的有意性を決定しました。 shc メソッドは、モンテカルロ シミュレーション ベースの有意性検定手順を使用して、データセットの階層的クラスタリング結果の有意性を評価します。 統計的有意性は、ガウス帰無仮説検定を使用してルートから始まる階層ツリー (樹形図) に沿って各ノードで評価され、対応する P 値は、帰無仮説と対立仮説に敏感な統計である 2 平均クラスター インデックスを使用して計算されます。 手順を制御するファミリーごとのエラー率は、複数のテストを補正するために適用されます。 さまざまなサンプルのクラスター間の類似性を示し、統計的に有意な違いを強調するために、各細胞タイプの樹状図プロットを生成しました。

ビーズのバッチが異なると、mRNA 捕捉効率が異なる場合があります。 scRNA-seq カプセル化で異なる​​バッチを使用した場合の影響を評価するために、ビーズ バッチ 01 と 02 の捕捉効率を測定しました。論文で使用した両方のビーズ バッチを使用して、同じサンプルを 2 回カプセル化しました。 RT-PCR 後、9、10、11、または 12 サイクルを個別に使用して PCR によって 4000 STAMPS を増幅しました。 AMPure XP Beads 精製後、各 PCR の cDNA を Qubit dsDNA HS Assay によって定量しました。 私たちの結果は、2 つのビーズ バッチで同様の cDNA 濃度を得るには、バッチ 02 を使用するときに PCR サイクル数を 2 増やす必要があることを示しています (補足図 2)。

すべての単一細胞トランスクリプトミクス実験は、少なくとも 2 つの異なる細胞株と 2 つの独立した分化実験を使用して実行されています。 サンプル D1、D2、M3、および M4 は同じ分化実験からのものですが、異なるプロトコルを使用して異なる日に固定されました (D1 と D2 は DMSO 凍結保存、M3 と M4 はメタノール固定)。 F1、F2、M1、M2、D3、A1、A2、V1、および V2 サンプルはすべて、独立した分化実験から得られます。 分化の日数、使用した細胞株、およびサンプル保存のその他の詳細に関するすべての詳細は、補足データ 1 にあります。各サンプルの細胞の初期数と品質フィルター後の最終数を表 1 に示します。セルは、この記事で提供されるすべての分析で使用されるものです。

ほとんどの計算解析は、R49 と、Seurat50、Harmony28、clustree44、muscat31、sigclust229、DoubletFinder43 などの R 4.2.1 に実装された特定のパッケージを使用して実行されています。 また、Python で実装されたプログラム scCODA5 を使用して細胞型存在量の変化を評価し、プログラム GSEApy47 を使用して GO 用語エンリッチメント分析を実行しました。 すべての詳細は「メソッド」セクションに記載されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究のために生成されたすべての生および処理された scRNA-seq データは、GEO データベースでアクセッション番号 GSE209947 で見つけることができます。 図の基礎となるソースデータ。 2c、d、4b、および 6 は補足データ ファイル 10 ～ 14 で利用できます。

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有益なコメントと批判的な議論をいただいた Plass Lab のメンバー全員に感謝します。 また、iPSC 細胞培養にご協力いただいた IDIBELL の再生医療プログラムの Yvonne Richard-Patin 氏と、IDIBELL の高度細胞組織培養プラットフォームの Zomeño 博士に感謝します。 原稿を批判的にレビューしてくださったイグレシアス博士に感謝します。 また、細胞保存のための ACME および vivoPHIX プロトコルの設定における支援をいただいたイグレシアス博士、キム博士、セベペドロス博士にも感謝します。 この研究は、スペイン科学・イノベーション・大学省の国家研究開発プログラム「研究課題」の研究プロジェクトから資金提供を受けました（助成番号：PID2019-108580RA-I00/AEI/10.13039/501100011033）。 MP の仕事は、スペイン科学イノベーション省の Ramón y Cajal 契約 (RYC2018-024564-I) によってサポートされています。 CERCA プログラム/カタルーニャ州政府による IDIBELL の制度的支援に感謝いたします。

これらの著者は同様に貢献しました: Ana Gutiérrez-Franco、Franz Ake。

細胞アイデンティティの遺伝子制御、再生医療プログラム、ベルビッジ生物医学研究研究所 (IDIBELL)、病院、バルセロナ、スペイン

アナ・グティエレス＝フランコ、フランツ・アケ、モハメド・N・ハッサン、ナタリー・チャベス・カユエラ、ミレヤ・プラス

カタルーニャ再生医療の臨床翻訳推進プログラム、P-CMR[C]、L'Hospitalet del Llobregat、バルセロナ、スペイン

アナ・グティエレス＝フランコ、フランツ・アケ、モハメド・N・ハッサン、ナタリー・チャベス・カユエラ、ロリス・ムラロニ、ミレヤ・プラス

再生医療プログラム、ベルビッジ生物医学研究所 (IDIBELL)、病院、バルセロナ、スペイン

ロリス・ムラロニ

生物工学、生物材料およびナノ医療に関するネットワーク型生物医学研究センター (CIBER-BBN)、マドリード、スペイン

ミレヤプレイス

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AGF と MP はプロジェクトを設計し、実験を計画しました。 AGF と NC は実験作業を実施しました。 FA、MH、MP は計算データ分析を実行しました。 LM はサンプルの組成分析を実行しました。 MP は資金を獲得し、作業を監督し、調整しました。 AGF、FA、MP が結果を解釈しました。 MP はすべての著者からの意見をもとに原稿を書きました。

ミレヤプラスへの対応。

MP は Communications Biology の編集委員ですが、この論文の編集レビューや出版の決定には関与していません。 残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Timothy (J) Petros と他の匿名の査読者に感謝します。 主な取り扱い編集者: George Inglis。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Gutiérrez-Franco、A.、Ake、F.、Hassan、MN 他。 メタノール固定は、神経細胞の液滴ベースの単一細胞トランスクリプトミクスに最適な方法です。 Commun Biol 6、522 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04834-x

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受信日: 2022 年 8 月 5 日

受理日: 2023 年 4 月 12 日

公開日: 2023 年 5 月 15 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04834-x

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