多指症

medicina rigenerativa npj

npj 再生医療第 7 巻、記事番号: 71 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

同種異系細胞療法は、変形性膝関節症 (OAK) の治療には完全には効果がありません。我々は最近、ヒトにおける自家軟骨細胞シートの移植とオープンウェッジ高位脛骨骨切り術が硝子軟骨修復を促進したことを報告した。ここでは、多指症由来の同種異系軟骨細胞シート (PD シート) と温度応答性培養インサートを使用した OAK の再生療法について説明します。関節鏡検査でアウターブリッジグレードIIIまたはIVに分類されたOAKおよび軟骨欠損を有する10人の患者が治療を受けた。軟骨の粘弾性と厚さを移植の前後で評価しました。移植から 12 か月後に得られた関節鏡視下生検を組織学的に分析しました。 PDシートを評価するために遺伝子発現を解析した。この小さな初期縦断シリーズでは、軟骨特性の変化によって示されるように、PD シート移植は OAK の治療に効果的でした。 PD シート内の遺伝子マーカーセットは、治療後の転帰を予測し、ドナー細胞の選択のためのマーカーを提供する可能性があります。この併用手術は、OAK 患者における疾患修飾効果を備えた理想的な再生療法となる可能性があります。

変形性関節症（OA）は、可動性喪失の最も一般的な原因であり、世界中で最も蔓延している筋骨格系疾患です1,2。 OA は生活の質、仕事の生産性、医療費に悪影響を及ぼします。私たちは最近、OA3 における手術と自家軟骨細胞シート移植の併用効果に関する臨床研究を報告しました。併用手術に関連した重篤な有害事象は治療期間中および経過観察期間中に観察されず、セカンドルック関節鏡手術では硝子軟骨を含む関節表面の優れた再生が確認されました。再生された軟骨のすべての生検サンプルでは、サフラニン O の強い染色と II 型コラーゲン (COL2) の発現が明らかになりました。膝損傷および変形性関節症アウトカムスコア (KOOS) およびリショルム膝スコア (LKS) は手術後に大幅に改善し、これらの改善は 3 年以上維持されました。ただし、自家軟骨細胞シート移植にはいくつかの制限があります。たとえば、移植前に軟骨組織と滑膜組織の採取を必要とする関節鏡視下手術が必要です。採取される細胞やその性質には個人差があり、細胞シートを作製するには不十分な数が採取される場合があり、高齢の変形性膝関節症（OAK）患者から採取された細胞には染色体異常が見つかることがよくあります。これらの制限と関節軟骨が免疫寛容であるという事実を考慮すると、組織採取の必要性を回避するための実行可能な選択肢として同種細胞シートの使用が考えられます。

同種間葉系幹細胞（MSC）、脂肪由来幹細胞、臍帯幹細胞は、OAK 治療の臨床試験でよく使用されます。ただし、これらの方法のほとんどは関節内注射を使用した細胞治療を伴います。これらの治療法は症状の一時的な改善ではなく、構造の再構築や天然の硝子軟骨の生成を達成する傾向があります。最近、軟骨修復のための細胞ベースの戦略の使用が増加しているため、強力で安全な既製の細胞ソースが緊急に必要となっています。私たちは、同種細胞ソースとして組織サンプルを取得する方法として多指症手術に着目し、温度応答性培養インサートを用いた多指症由来同種軟骨細胞シート（PDシート）の作製に成功しました4,5。最近、近藤ら。らは、ラット局所骨軟骨欠損モデルを使用して、多指症由来の若年軟骨由来軟骨細胞シートの前臨床安全性と有効性を in vitro および in vivo で報告しました6。 PD 軟骨細胞は急速に増殖し、十分な細胞外マトリックスを備えた層状構造を確立し、容易に操作できるシートを形成します。作製できる自己軟骨細胞シートの数は限られていますが4、理論上、継代2（P2）細胞からは600枚以上、P3細胞からは3000枚以上のPDシートを作製することができます。ここでは、高位脛骨骨切り術 (HTO) と組み合わせた PD シート移植の使用について説明し、それが OAK 患者にとって理想的な再生療法であることを示唆します。

我々は、我が国で国民健康保険の対象となっているOAKに対する従来の外科的治療に続いて、異常組織の切除、骨髄刺激、軟骨細胞シート移植を行う併用療法（図1a）を設計しました。 RMSC法」）による軟骨欠損の治療3．この研究は、各治療の追加効果ではなく、治療全体の有効性を評価するように設計されました。 OAK患者に対するHTOは、世界中で注目を集めている関節温存術です。 HTO による脚全体のアライメントの改善後に関節軟骨が再生されることもありますが、これは主に線維性軟骨であり、硝子軟骨とは異なる性質を持っています 7,8。我々は、HTO と併用した PD シート移植が硝子軟骨などの天然軟骨の再生を促進し、OAK の症状を軽減し、膝関節の生物学的性質の維持に役立つ可能性があると仮説を立てました。

a 従来の外科的介入と軟骨細胞シートの移植の組み合わせ。多指症由来の同種異系軟骨細胞シート (PD シート) は、多指症の手術で得られた軟骨組織から作製されました。細胞処理センターでは、単離された軟骨細胞を 1 回継代し、-180 °C で保存しました。 PD シートを作製するには、細胞を解凍して 1 回継代し、温度応答性培養インサートに播種しました。 PD シートをさらに 14 ～ 16 日間培養し、移植しました。 OAK患者はまず従来の外科治療OWHTOで治療され、続いて不健康な組織の除去、骨髄刺激、軟骨細胞シート移植（RMSC法）が行われた。 b 臨床研究の全体的なプロトコル。臨床研究への参加に関する最終決定は、関節鏡検査の評価中に行われました。対象基準を満たす患者については、LIPA を使用して軟骨欠損を評価しました。不健康な組織のRMSC除去、骨髄刺激、および軟骨細胞シート移植、OWHTOオープンウェッジ高位脛骨骨切り術、LIPAレーザー誘発光音響、KOOS膝損傷および変形性関節症アウトカムスコア、LKSリショルム膝スコア、MRI磁気共鳴画像法。 c CONSORT のフロー図。単群、非盲検、非対照比較研究 (つまり、登録、介入の割り当て、追跡調査、およびデータ分析) の CONSORT 図。

温度応答性培養皿またはインサート (CellSeed Inc.、東京、日本) は、その使用が岡野ら 9,10 によって初めて報告され、特別なインテリジェントな表面を備えています。これらのインサートを使用すると、細胞外マトリックスを維持した後、温度を下げてシートを放出することにより、酵素消化を必要とせずに軟骨細胞シートを製造できます。

私たちは、関節軟骨修復のための層状軟骨細胞シートの応用を最初に報告しました11,12。我々は、ラットの非外傷性関節炎 13、ウサギの関節軟骨の部分欠損 14、およびラット 15、16、ウサギ 17、18、19、およびミニブタ 20 の軟骨の骨軟骨欠損の治療におけるこれらの層状軟骨細胞シートの可能性を示す動物研究からの証拠を報告しました。この種の欠陥は通常、OAK に存在します。我々はまた、層状軟骨細胞シートの作用機序を研究し、軟骨細胞シートが黒色腫阻害活性（MIA）やトランスフォーミング成長因子β（ TGF-β)、およびプロスタグランジン E2、これらは軟骨の再生に重要です 21,22。

OAK および軟骨欠損のある 10 人の患者がこの研究に登録され、PD シートによる治療を受けました。厳密な評価プロトコル (図 1b) は、治療の安全性と有効性のエンドポイントを評価し、臨床的および構造的結果を評価するために設計されました。移植された同種異系 PD シートの特性も、遺伝子発現解析を使用して徹底的に評価され、治療の臨床的および構造的結果を予測するための潜在的な用途が調査されました。この小規模な初期縦断症例シリーズでは、PD シートにおける特定のマーカー遺伝子セットの発現が、OAK に対するこの新しい再生療法の結果を予測するための潜在的なマーカーを提供できるかどうかを判断したいと考えました。

図 2 に本研究で移植した PD シートの特性を示す。 PD シートは、ポリ二フッ化ビニリデンの円形の白色支持膜を使用して取り扱うことができます (図 2a)。多層構造は組織学的染色によって確認されました（図2b）。免疫染色により、シートがフィブロネクチン (FN)、COL1、およびアグリカン (ACAN) を強く発現していることが示されました。 PDシートはCOL2発現をほとんど示さなかった(図2b)。 PD シート内の細胞は脱分化しており、軟骨細胞シートの性質は硝子軟骨の性質とは異なっていました。図2c〜eは、それぞれ細胞数、生存率、厚さに関する移植されたPDシートの特性の分布を示しています。図 2f は、分散した PD シートのフローサイトメトリー分析の結果を示しています。 PD シートのほぼすべての細胞は、分化クラスター 81 (CD81) および間葉系幹細胞マーカー、CD90 (Thy-1)、CD44 (ヒアルロン酸の受容体)、および CD105 (エンドグリン) に対して陽性でした。 CD146 (黒色腫細胞接着分子) 陽性および GD2 (ジシアロガングリオシド GD2) 陽性細胞は 20 ～ 70% の頻度で存在し、CD49a (インテグリン α1) 陽性細胞は 5 ～ 25% の頻度で存在しました。ほとんどすべての細胞は、血液系譜マーカーである CD31 (血小板内皮細胞接着分子-1) および CD45 (白血球共通抗原) に対して陰性でした。マーカーの発現は、自家細胞を使用した以前の臨床研究で移植された成人膝軟骨細胞シートの発現と同様でした。トランスフォーミング成長因子 β1 (TGF-β1) および以前に同定された有効性関連因子 5、黒色腫阻害活性 (MIA)、ディッコフ WNT シグナル伝達経路阻害剤 1 (DKK1)、内皮細胞特異的分子 1 (ESM1)、およびグレムリン 1 の産生（GREM1）は酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）によって確認されました（図2g）。 PDシートによって発現された遺伝子の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）分析により、目的の軟骨関連遺伝子の広範な発現が明らかになりました（図2h）。

a PD シートは、円形の PVDF 支持膜を使用して処理されました。 b PDシートの断面の代表画像。ヘマトキシリンおよびエオシン (HE) による組織学的染色、I 型コラーゲン (COL1)、II 型コラーゲン (COL2)、アグリカン (ACAN)、およびフィブロネクチン (FN) の免疫組織化学的染色。スケールバー; 50μm。 c–e 9 ロットの移植 PD シート特性の分布: ボックスは値の四分位範囲を表します。ひげの上部と下部は最大値と最小値を表します。ボックス内の線は中央値を表します。細胞シートの酵素消化後に、細胞数 (c) と細胞生存率 (d) を測定しました。 e PDシートの厚さは、断面の顕微鏡画像を使用して測定しました。 f PD シート内の細胞の表面マーカーのフローサイトメトリー分析。 PD シートは酵素的に消化され、単色染色によって分析されました。データは、9ロットのシートからの表面マーカー発現細胞の割合の平均±SDとして表されます（補足図2）。細胞は、CD81、CD90、CD44、および CD105 に対して陽性であり、CD31 および CD45 に対して陰性でした。 CD146、CD49a、および GD2 の染色はロット間で異なりました。 g PD シートによって分泌される体液性因子の濃度。各マークは枚数を表します。いくつかのマークが重なっています。 h 移植されたシートの遺伝子発現プロファイルは、軟骨関連遺伝子の qPCR を使用して分析され、結果は GAPDH の発現と比較して報告されます。 3 人の多指症患者ドナーからの凍結保存細胞を使用して、合計 9 ロットの PD シートが製造されました。 3 つのロットはドナー 1 からのもので、h でシート 1-1、1-2、および 1-3 を作成するために使用されました。 4 つのロットはドナー 2 からのもので、シート 2-1、2-2、2-3、および 2-4 の作成に使用されました。 2 つのロットはドナー 3 からのもので、シート 3-1 および 3-2 の作成に使用されました。各ロットは 1 人の患者に使用されましたが、シート 3-2 は 2 人の患者 (患者 9 と 10) に移植されました。同じ色のデータは、g、h の同じロットの PD シートからのものです。

フォローアップ期間中に、深部感染や偽関節症などの併用手術に関連した重篤な有害事象は観察されませんでした。その他の有害事象も報告されており、患者 1 名における深部静脈血栓症、患者 10 名における疼痛、患者 10 名における白血球増加症、および患者 10 名における C 反応性タンパク質レベルの上昇が含まれていました。深部静脈血栓症は保存療法により治癒した。これらの有害事象は、オープンウェッジ高位脛骨骨切り術（OWHTO）に関連していると考えられました。これらは PD シートの移植に関係する可能性は低いと考えられます。

LKS は術前の 40.1 ± 13.9 ポイントから最終追跡調査では 80.5 ± 15.7 ポイントまで大幅に改善しました。すべてのKOOS下位尺度（症状、痛み、日常生活機能、スポーツおよびレクリエーション機能、生活の質）も大幅に改善しました（図3a、bおよび補足表1、2）。

KOOS は、膝関連パラメータへの影響を評価するために使用されました。 KOOSサブスケール、症状、痛み、ADL、QOLの患者の平均値は、ベースラインから大幅に改善しました。 *p < 0.05、**p < 0.01。日常生活のADL活動、QOL、生活の質。 b LKS の患者平均はベースラインから大幅に改善しました。ボックスはスコアの四分位範囲を表します。ひげの上部と下部は、外れ値を含む 12 か月のデータを除き、最大スコアと最小スコアを表します。ボックス内の線はスコアの中央値を表します。 *p < 0.05、**p < 0.01。 c – f 相関分析を使用して、各結果尺度を予測する遺伝子マーカーセットを選択しました。散布図は、遺伝子スコアと 12 か月後の KOOS 疼痛 (c)、12 か月後の LKS (d)、OARSI (e) および ICRS II (f) の間の相関関係を示しています。遺伝子スコアは、KOOS疼痛の予測遺伝子マーカーセット（PTGS2、TGFB1、MIA、およびG0S2）、LKS（COL1A2、MATN2、SOX9、およびTGFB1）、およびOARSI組織学的スコア（CCN2、 COMP、ACKR4、ESM1、および GREM1）、および ICRS II の総合評価（COL2A1、COL27A1、ACKR4、および ESM1）（方法セクション（補足表 4 ～ 7）に記載）。各記号に割り当てられた番号は、対応する患者を示します。 g 患者の生検の組織学的結果および臨床評価の結果。 C = 関節軟骨、B = 軟骨下骨、破線 = 関節軟骨領域と軟骨下骨領域の境界。大腿骨内側顆の生検は、術後 12 か月後に再生軟骨領域から採取されました。スケールバー = 1 mm。すべての患者の組織切片をサフラニン O で染色しました。免疫染色により、すべての患者で II 型コラーゲン (COL2) の発現が示されました。

軟骨欠損と位置を表 1 に示します。簡単に説明すると、平均総欠損面積は 1 人の患者では 15.9 cm2、4 人の患者では >20 cm2 でした。 10人の患者には内側大腿顆（MFC）欠損（平均面積10.7cm2）、6人の患者には滑車（Tr）欠損（平均面積4.6cm2）、5人の患者には脛骨のキス欠損（平均面積4.0cm2）があった。

移植前と後では、大腿脛骨角度と機械軸の割合 (%MA) が、それぞれ 179.4° ± 2.8° から 168.9° ± 2.8° に、24.1 ± 10.8 から 67.5 ± 9.2 に大きく変化しました。

磁気共鳴画像法（MRI）により、術前に軟骨が欠如していた領域で軟骨の再生が確認されました（補足図1）。軟骨修復組織の磁気共鳴観察 2.0 (MOCART 2.0) スコアの結果は大幅に改善されました (表 1)。

レーザー誘起光音響（LIPA）評価の結果を表 1 に示します。再生軟骨の粘弾性特性は、同じ関節内の正常な軟骨の粘弾性特性との比率で表されます。移植後は性状が改善し、再生軟骨の平均厚さは3.54mmとなった。

すべての生検では、サフラニン O の強い染色と COL2 の発現が明らかになりました (図 3g)。再生が起こった程度は患者によって異なり、一部の症例では変性の兆候が見られましたが、それでもこれらの結果は硝子軟骨の再生が起こったことを示唆しています。国際変形性関節症研究協会 (OARSI) の組織学的スコア、マンキンスコア、および国際軟骨修復協会 (ICRS II) の総合評価の結果を表 1 に示します。再生された軟骨の品質は非常に高く、ICRS II の平均値は良好でした。表 1 に示すように、スコアは 80.8 (64 ～ 96、0: 線維組織、100: 硝子軟骨) でしたが、線維軟骨も存在しました。

優れた転帰を促進する PD シートを特定するために、遺伝子発現プロファイルと転帰の間の相関分析に基づいて、術後の臨床的および構造的転帰を予測する遺伝子マーカーセットが同定されました。分析は、自己細胞シートに関する研究で以前に説明されています3。潜在的なマーカーセットは、リーブファイブアウトプロセスを使用して、ピアソン相関係数の100セットのマトリックスに出現する確率が最も高い軟骨関連遺伝子（補足表3のリスト）から選択されました。

遺伝子スコアは、「方法」（補足表4〜7）に記載されているように、マーカーセットの遺伝子発現データを使用して計算されました。図3c〜fは、移植されたPDシートの遺伝子スコアと個々の症例の臨床転帰を示す散布図を示しています。各結果スコアのマーカーセットは次のとおりです。KOOS の場合（図 3c）PTGS2、TGFB1、MIA、および G0S2。 LKSの場合（図3d）COL1A2、MATN2、SOX9、およびTGFB1。 OARSI組織学的スコア（図3e）の場合はCCN2、COMP、ACKR4、ESM1、およびGREM1。 ICRS II の総合評価 (図 3f) COL2A1、COL27A1、ACKR4、および ESM1。

51歳女性が左膝OAKに対しOWHTO併用PDシート移植を受けた。大腿脛骨角度と％MAは、それぞれ183°から167°、11.4から68.9に変化しました（図4a）。軟骨下骨は、MFC (図 4b) および内側脛骨プラトー (図 4c) の広い領域にわたって露出しました。 LIPAを使用して残存軟骨および軟骨下骨の粘弾性特性を評価した後、微小骨折（図4d）およびPDシートの移植（図4e）を実行しました。移植から 1 年後、欠損領域を完全に覆う再生軟骨が MFC (図 4f) および内側脛骨プラトー (図 4g) で観察されました。術前の MRI では、MFC に全層の軟骨欠損が示されました。この欠損領域はPDシートで覆われているように見え、3か月後には再生組織で満たされ、移植後12か月でも再生組織ははっきりと見え、維持されていました（図4h）。

X 線写真 (a)、関節鏡画像 (b ～ g)、および磁気共鳴画像 (h)。左膝の術前 X 線写真により、内反変形と内側関節腔の狭窄が確認されました。術後 12 か月後の X 線写真では、OWHTO 後もアライメントが維持されていることがわかりました。術後 24 か月（インプラント除去後 12 か月）の時点でも、アライメントは維持されており、β-リン酸三カルシウム移植片は吸収されています。 b、c 術前の大腿骨内側顆の軟骨欠損と脛骨プラトーのキス状病変により、軟骨下骨が露出しました。 d 微小骨折後の大腿骨内側顆の術中写真。 PDシートは縫合せずにそのまま貼り付けて移植しました。 f、g 再生軟骨の存在は、2回目の関節鏡検査（術後12か月）で確認されました。 h 内側大腿脛骨関節の矢状面図。 T2 強調画像は 3.0 テスラ MRI を使用して取得されました。術前の軟骨欠損から術後の軟骨再生までの時間経過。術前の MR 画像には、大腿骨の内側顆の広範囲の軟骨欠損、脛骨のキス状病変、および滑液の貯留が示されています。再生された軟骨は手術後 3 か月で検出され、時間が経っても維持されました。骨髄刺激によって引き起こされた不規則な軟骨下骨が最初に検出され、12 か月までに滑らかになりました。

我々は、臨床研究を開始する前に、PD シートの作用機序、安全性、有効性を異種モデルを用いた実験 4 やその他の研究 19,21,23 で確認してきました。

今回の研究では、免疫抑制剤を使用しなかったため、PDシートの体液性因子の作用機序が最も可能性の高いメカニズムであると推測しています。私たちの以前の研究では、異種同所性移植後のPDシートの治療可能性のばらつきを発見し、将来の研究におけるドナーの選択の重要性を認識しました5。 Cavalli ら 24 は、多指症軟骨細胞が in vitro で増殖し、最大 5 継代にわたって高速かつ安定した増殖速度を維持できることを報告しました。これは、既製の細胞ソースの重要な特徴です。臨床試験では、PD 細胞を適切に継代することも重要です。この問題に対処するために、PDシート移植の結果を予測するための潜在的な遺伝子マーカーセットを特定しました（図3c〜f）。各結果スコアのマーカー遺伝子は異なります。 TGFB1 は KOOS と LKS に共通して出現し、どちらも自己申告の症状アンケートに含まれています。 ESM1 と ACKR4 は OARSI 組織学的スコアと ICRS II の総合評価に現れ、両方のスコアは生検組織の評価に関連していました。遺伝子のマーカーセットは、臨床使用前に細胞シート作製のための同種細胞源を選択するのに役立ちます。

軟骨関連遺伝子の発現を最初の小さな縦方向の系列のみで分析したため、別の遺伝子セットを分析に使用していたら他の遺伝子が抽出された可能性があります。現在の遺伝子のマーカーセットは、遺伝子を新しく同定されたより予測性の高いものに置き換えることによって改善される可能性があります。

関節軟骨は、骨髄刺激または HTO と組み合わせたアブレーション関節形成術後に再生することがあります。しかし、これらの再生組織は主に線維性軟骨であり、天然の硝子軟骨とは異なり 7,8,25,26,27 、硝子軟骨と同じ長期耐荷重効果は得られません。以前、我々はOWHTOを受けた患者と全膝関節形成術（TKA）を受けた患者の間の臨床転帰を比較した。これらの患者では、OWHTOを受けた患者の方がTKAを受けた患者よりもKOOSが低く、膝軋り、クリック音、こわばりなどの残存症状は、OWHTO後の方がTKA28後の患者よりも悪かった。この点、今回の研究ではOWHTOを併用したPDシート移植後に硝子軟骨の再生が起こることを確認した。今回の結果は、併用療法により下肢アライメントの改善を伴う長期的な治療効果が期待できることを示唆しています。

我々は以前に自家軟骨細胞シート移植の使用について報告し、長期的な臨床転帰の観察を続けてきました3。前回の研究では、細胞シート1枚の大きさである4.2cm2未満の欠損のある膝にのみ細胞シートを移植するよう厚生労働省から指示を受けていました。しかし、今回の研究では、より大きな欠損をカバーするのに十分な PD シートを準備することができ、欠損の大きさを理由に患者登録を制限することはありませんでした。この臨床研究では、一部の患者には 20 cm2 を超える欠損がありました。一般に、「赤い膝」を定義する一般的な除外基準は、8 cm2 を超える病変、配列不良、55 歳以上の年齢、キス病変、およびびまん性の軟骨菲薄化であり 29、赤い膝を患っている一部の患者がこの現在の研究に登録された。 PD シートの移植後に重篤な有害事象は発生しませんでしたが、赤膝のない患者に登録を制限することで、十分に管理された比較研究を伴う第 III 相臨床試験を完了する必要があります。

移植された PD シートの数、欠損の位置、および欠損の合計サイズは、臨床転帰および組織学的スコアとは関連していませんでした。ただし、これらの結果は、すべての患者が欠損を完全にカバーするのに十分な数の PD シートを受け取ったという事実によって影響された可能性があります。

私たちの研究には 3 つの限界があります。まず、この研究にはOWHTOを受けた一般的なOA患者のみが含まれていた。この関連手術が治療の結果に影響を与えた可能性があります。第二に、我々は少なくとも 1.5 年間 PD シートの使用で有望な結果を観察しましたが、この新しい併用療法を十分に評価するには長期的な観察が必要です。最後に、私たちの臨床研究は単群、非ランダム化、非対照研究として設計されており、より多くの患者と症状を対象としたさらなる研究が必要です。

私たちは将来の実用化に向けて、細胞シートの保存・輸送技術の開発を続けています。私たちは、構成細胞の高い生存率を確保するために細胞シートのマクロ構造とミクロ構造を維持しながら、細胞シートの凍結保存を容易にするガラス化法の研究を続けています。循環ガラス化バッグとガラス化保管ボックスは、ガラス化細胞シートの長期保存に有用であり、凍結保存細胞シートの臨床応用がさらに可能になります31。

PDシート移植の安全性と有効性を確認しました。 10人の患者がOWHTOと併用したPDシート移植を受けた。移植から 1 年後のセカンドルック関節鏡検査では、欠損領域を完全に覆う再生軟骨が確認されました。 LIPA 評価では、再生された軟骨が正常な機械的特性を持っていることが示唆され、生検サンプルの組織学的分析では硝子様軟骨が示されました。この併用手術は、OAK 患者に疾患修飾効果を伴う理想的な再生療法を提供する可能性があります。

実験は東海大学医学部臨床研究審査委員会の承認と指導のもとに実施されました。当社は、これらの前臨床研究データを日本の厚生労働省に提出し、再生医療等安全性確保法に基づく第一種再生医療等提供計画の申請を行いました。 2016年4月27日に許可が発行され、PDシートを用いた臨床研究が開始可能となった。すべての場合において、ドナーの両親または保護者からインフォームドコンセントを得た。一部の外科標本は不可逆的に匿名化されました。ヒトの細胞および組織を扱うすべての実験は、ヘルシンキ宣言の教義に沿って実施されました。動物実験は、東海大学動物実験委員会の承認を得て、動物実験規則及び大学所管の学術研究機関における動物実験等の適正な実施に関する基本指針に基づいて実施されました。動物の取り扱いと世話については文部科学省。

私たちの臨床研究は、単一群、非ランダム化、非対照比較研究として設計されました。この研究（UMIN臨床試験登録、UMIN000015205、および日本臨床試験登録、jRCTa030190242）は、東海大学医学部の治験審査委員会および日本の厚生労働省によって承認されました。すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。 CONSORT のフロー図を図 1c に示します。

移植用の細胞シートは、軟骨全層欠損の日本白ウサギモデルへの異種同所移植後に硝子軟骨再生を開始する能力を示したドナー細胞から作製されました5,19。また、細胞シートの作製に使用した P2 PD 細胞と長期培養細胞 (P12 細胞) としてのアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション (アレイ CGH) および核型分析を実行し、in vitro 作製中の PD 細胞の遺伝的安定性を評価しました。アレイ CGH ではコピー数の変化は検出されず、国際ヒト細胞遺伝学命名法ガイドラインで判断したところ、細胞源として使用した細胞では核型異常は検出されませんでした。

東海大学病院で多指症の手術を受けた患者 3 名 (平均年齢: 12.3 か月、範囲: 10 ～ 15 か月、男児 1 名、女児 2 名) から軟骨組織を採取しました。 PD シートの製造プロセスの概要を図 1a に示します。軟骨組織をハサミで切り刻み、20% ウシ胎児血清 (FBS; AusGeneX、Molendinar、オーストラリア、または SAFC Biosciences、 Lenexa、カンザス州、米国）、1% 抗生物質抗真菌溶液（AB、Gibco）、および 5 mg/mL コラゲナーゼタイプ 1（ワーシントン、マンハイム、ドイツ）を 5% CO2 の加湿雰囲気下、37 °C で 1.5 時間95％が空気。細胞懸濁液を洗浄し、100μmのストレーナー（BD Falcon、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国）に通した。

収集した細胞を、20% FBS および 1% AB を添加した DMEM/F12 の 6 ウェル培養プレート (Corning Inc.、Corning、NY、USA) に 0.5 ～ 1 × 104 細胞/cm2 の密度で播種し、インキュベートしました。 37℃で。 4日後、100μg/mLのアスコルビン酸（AA;日新製薬、山形、日本）を培地に添加し、培地を3または4日ごとに交換した。細胞がサブコンフルエンスに達したとき、STEM-CELLBANKER™ (ZENOAQ、福島、日本) を使用して細胞を凍結保存しました。細胞を解凍し、20% FBS、1% AB、および 100 μg/mL AA を添加した DMEM/F12 に 0.5 ～ 1 × 104 細胞/cm2 の密度で 1 回播種しました。細胞がサブコンフルエントに達したら、TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific、東京、日本) を使用して細胞を剥がし、温度応答性培養インサート (CellSeed Inc.、東京、日本) に 1 × 104 細胞/cm2 で播種しました。培地は３日または４日ごとに交換した。 2 週間後、インサートから PD シートの剥離を促進するために、培養プレートを 25 °C で 30 分間保持し、PD シートを回収しました。リアルタイム qPCR、フローサイトメトリー分析、組織学的および免疫組織化学的染色を使用して PD シートの特性を分析するために、PD シートを培養 13 日目に収集しました。

ＰＤシートをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）中で洗浄した。次にシートを TripLE Express® (Gibco) 中で 37 °C で 15 分間インキュベートし、1500 rpm で 5 分間遠心分離しました。細胞シートを 0.25 mg/mL コラゲナーゼ P (Roche、バーゼル、スイス) に 37 °C で最大 30 分間再懸濁し、その後 1500 rpm で 5 分間遠心分離しました。単離された細胞は最終的にDMEM/F12に再懸濁され、トリパンブルー排除アッセイを使用して細胞数と生存率が測定されました。

細胞数を取得した後、単離した細胞を、0.2% ウシ血清アルブミン (BSA; Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) および 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA; Gibco) を含む DPBS で洗浄しました。各チューブで約 1.5 × 105 個の細胞を次の抗体と混合しました: hCD31 – フルオレセインイソチオシアネート (FITC) (1:10; IM1431U、Beckman & Coulter、Brea、CA、USA)、CD44 – FITC (1:10; 555478、 BD Biosciences、フランクリン、ニュージャージー州、米国）、hCD45–FITC（1:10; A07782、Beckman & Coulter）、hCD81–アロフィコシアニン（APC）（1:10; 551112、BD Biosciences）、hCD90–APC（1:100; A07782、Beckman & Coulter） 559869、BD Biosciences）、CD105–フィコエリトリン（PE）（1:5; A07414、B76299、Beckman & Coulter）、CD146–PE（1:5; 5050-PE100T、BioCytex、マルセイユ、フランス）、CD49-PE（1 :5; 559596、BD Biosciences)、および GD2 (1:10; 554272、BD Biosciences)。細胞を4℃で90分間インキュベートし、0.2% BSAおよび1 mM EDTAを含むDPBSで洗浄した。 GD2 は、細胞を二次抗体 FITC 結合抗マウス IgG (1:20; 349031、BD Biosciences) とともに 4 °C で 10 分間インキュベートすることによって認識されました。フルオロプローブ標識マウス IgG1 抗体 (1:10; Beckman & Coulter) をネガティブコントロールとして使用しました。染色された細胞は、FACSVerse™ セルソーター (BD Biosciences) を使用して分析されました (補足図 2)。

培養後に PD シートを採取し、最適な切断温度の化合物 (Sakura Finetek Japan、東京、日本) に包埋して凍結しました。標準的な方法を使用して、厚さ10μmの切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色しました（補足図3）。厚さ20μmの切片を抗ヒトCOL1（1:200; 1310-01、Southern Biotech、バーミンガム、アラバマ州、米国）、COL2（1:200; F-57、協和ファーマケミカル、富山、日本）、FNで免疫染色した。 (1:1000; MA5-11981、Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム)、および ACAN (1:20; 967800、R&D Systems、ミネアポリス、ミネソタ州、米国) を 4 °C で一晩実験しました。切片を洗浄し、COL2 および FN に対する二次抗体 Alexa Fluor 488 結合ヤギ抗マウス Ig (1:200; A-11017、Thermo Fisher Scientific) または Alexa Fluor 546 結合ロバと室温で 1 時間インキュベートしました。 COL1 および ACAN に対する抗ヤギ Ig (1:400、A-11056、Thermo Fisher Scientific)。免疫染色後、切片を洗浄し、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドールを含むVECTASHIELD Antifade mounting Medium（Vector Laboratories、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国）でマウントしました。顕微鏡画像は、BZ-X810 顕微鏡 (Keyence、大阪、日本) で撮影されました。

SHAKE Master Neo デバイス (バイオメディカルサイエンス、東京、日本) を使用して PD シートを TRIzol 試薬 (Thermo Fisher Scientific) で破壊し、RNeasy Mini Kit (Qiagen、バレンシア、カリフォルニア州、米国) を使用して全 RNA を単離しました。メーカーの指示に従います。 RNA の量と質は、Nanodrop One 分光光度計 (Thermo Fisher Scientific) と Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies、米国カリフォルニア州サンタクララ) を使用して測定しました。

QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen) を使用して、全 RNA を cDNA に変換しました。 TaqMan PreAmp Master Mix Kit および TaqMan Gene Expression Assays (どちらも Thermo Fisher Scientific) (補足表 3) を使用して、製造業者の指示に従って cDNA を前増幅しました。 TaqMan qPCR は、7500 qPCR システムまたは QuantiStudio 3 (どちらも Thermo Fisher Scientific 製) を使用して実行されました。各遺伝子の相対発現値 (-ΔCt 値) は、内部対照として GAPDH を使用して計算されました。

作製した PD シートの上清を収集するために、培養 14 日目にシートを 1% FBS および 1% AB を補充した 3 mL の DMEM/F12 に移し、さらに 72 時間培養しました。上清を収集し、15,000 gで10分間遠心分離して細胞残骸を除去した。 TGF-β1 (R&D Systems)、MIA (Roche)、Dickkopf WNT シグナル伝達経路阻害剤 1 (Thermo Fisher Scientific)、内皮細胞特異的分子 1 (ESM1; Abcam、ケンブリッジ、英国)、およびグレムリン 1 (GREM1; Cloud-Clone Corp.、米国テキサス州ケイティ）は、ELISA キットを使用して測定されました。 1% FBS を含むブランク培地で検出されたシグナルを差し引いて、FBS に含まれるタンパク質を調整しました。

関節鏡検査でアウターブリッジグレード III または IV に分類された軟骨欠損を有する 10 人の患者 (男性 4 人、女性 6 人) が登録され、治療を受けました。手術時の平均年齢は 54 歳 (範囲 45 ～ 58)、平均 BMI は 28.3 kg/m2 (範囲 23.5 ～ 35.5) でした。膝のレントゲン写真からのケルグレンおよびローレンスのグレードは、2 人の患者でグレード 2、6 人でグレード 3、2 人でグレード 4 でした (表 1)。 2017年2月に初回、2019年12月に前回の患者様にPDシート移植を施行しました。

この臨床研究研究の対象基準は、通常 OWHTO の適応となる内側区画 OAK を有することでした (表 2)。自家軟骨細胞シート移植に関する他の臨床研究研究では、損傷した軟骨病変のサイズは <4.2 cm2 と規制されています。しかし、今回のPDシート移植の臨床研究では、あらかじめ10枚以上のPDシートを用意することができたため、サイズの規定はありませんでした。 PD シートを移植する欠損の総数は 21 でした (MFC で 10、Tr で 6、キス病変で 5)。平均欠陥サイズは、MFC、Tr、キッシングでそれぞれ 10.8、4.6、4.0 でした。最大合計欠損サイズは、1 人の患者で 22.0 cm2 でした (表 1)。

私たちは、日本の国民健康保険が適用されるOAKに対する従来の外科的治療に続いてRMSC法を適用する併用療法を設計しました（図1a）。凍結保存した同種異系軟骨細胞を解凍し、移植手術前に3週間培養してPDシートを作製した。合計 9 つのロットが作製されました。ドナー 1 から 3 ロット、ドナー 2 から 4 ロット、ドナー 3 から 2 ロットです。各ロットは、2 人の患者に移植された 9 番目のロットを除き、1 人の患者に使用されました。われわれは、Takeuchi et al.32 の記載に従って OWHTO を実施し、術後 %MA 62.5 の達成を目指しました。バイプレーン（斜結節および近位結節）骨切り術後、開いた隙間に人工骨を移植し、TomoFix®（DePuy Synthes、スイス、ベトラッハ）または TriS®（オリンパステルモバイオマテリアルズ、東京、日本）を使用して骨切り部位に固定しました。

OWHTO 後、内側膝蓋骨傍アプローチを使用して膝関節を約 5 cm 開きました。 MFC、内側脛骨プラトー、および膝蓋大腿関節が観察され、RMSCが実行されました（補足動画）。簡単に説明すると、不健康な組織を除去し、骨髄を刺激した後（患者 7 人で微小骨折、3 人で擦過関節形成術）、軟骨欠損表面全体を覆うように PD シートを移植しました。 PDシートは接着性に優れているため、縫合や骨膜パッチを必要とせずに移植が可能です。このRMSC法3は、骨髄由来MSCとPDシートから分泌される各種体液性因子を軟骨欠損腔に挿入するため、硝子軟骨を効率的に再生する方法です。 PD シートは 10 人の患者で MFC、5 人で内側脛骨プラトー、6 人で膝蓋大腿関節に移植されました。移植シートの平均数は 13 (9 ～ 15) でした。アウターブリッジのグレードと軟骨欠損の位置およびサイズを表 1 に示します。

すべての患者は、移植されたシートを乱すことを避けるために、膝屈曲 20°で 2 週間維持された石膏副子を使用して手術直後に固定されました。その後、患者は手術後 2 週間で関節可動域運動と部分荷重を開始し、4 週間で全荷重を開始しました。一般に、影響の少ない活動は 6 か月で開始され、影響の高い活動は 8 か月で許可されます。

我々は、術前と術後 1、3、6、および 12 か月後に、患者志向の KOOS および LKS を使用して臨床転帰を評価しました 33,34。

X線写真とMRIを用いて画像診断を行いました。 X線写真で膝のアライメント、軟骨下骨の状態、OAKの進行度を検査しました。進行状況は、術前および術後に Kellgren-Lawrence 等級スケールを使用して評価されました。 MRI 検査は、TX SENSE Knee 8 チャンネルコイル (Philips Healthcare) 内で Achieva 3.0-T TX スキャナー (Philips Healthcare、オランダ、ベスト) を使用して実施されました。画像は膝を 10°屈曲させて撮影されました。矢状方向および冠状方向の MR 画像を使用して、術前および術後の軟骨欠損領域を評価しました。

治療法の評価には、Schreiner et al.35 によって説明されている MOCART 2.0 法を使用しました (表 1)。軟骨欠損の関節鏡検査には、その状態、サイズ、アウターブリッジのグレードなどが含まれ、術前と術後に実施されました。 LIPA 法は、術前および術後の軟骨の粘弾性特性を評価するために使用されました (補足ムービー)。 LIPA の使用は東海大学臨床研究審査委員会によって承認されており、この方法は患者の軟骨の機械的特性を評価するために臨床に適用されています 36。 LIPA 法は、最初の手術 (PD シート移植および OWHTO) と術後 12 か月 (セカンドルックおよびインプラントの除去) の間、関節鏡視下で使用されました。

組織学的転帰は、再生された軟骨の中心近くから採取された関節鏡検査による生検を使用して、術後 12 か月後に評価されました。サンプルは 10% EDTA 溶液 B (和光純薬工業、大阪、日本) により 4 °C で 9 日間脱灰されました。次に、サンプルをパラフィンワックスに包埋し、3 μm 切片を切断し、脱パラフィンし、サフラニン O で染色し、以前に報告された方法 15 を使用して COL1 および COL2 について免疫染色しました。 ICRS II の総合評価 37 と OARSI の組織学的スコアは、訓練を受けた 3 人の整形外科医によって独立して評価されました。軟骨の顕微鏡スコアリングは、各スコアの代表的な画像を提供した Little et al.38 によって記載された方法を使用して評価されました。 3 人の得点者の間で得点のばらつきは最小限でした。 Mankin スコアも同様に取得されました 39,40。構造の欠陥 (0 ～ 6 ポイント)、マトリックス染色の損失 (0 ～ 4 ポイント)、細胞性の異常 (0 ～ 3 ポイント)、およびタイドマークの完全性の違反 (0 または 1 ポイント) が等級付けされました。このスケールを使用すると、正常な軟骨には 14 点中 0 点のスコアが与えられます。

予測遺伝子マーカーセットは、術後12か月の時点で発現がKOOS疼痛スコアおよびLKS、OARSI組織学的スコア、およびICRS総合評価スコアと相関するものとして、検査された43個の遺伝子および対照遺伝子（GAPDHおよびACTB）（補足表3）から選択されました。まず、-10 サイクルを超える正規化 ΔCt 値を持つ 36 個の遺伝子 (補足表 4 ～ 7) が、検出可能な遺伝子発現を持つものとして特定されました。各アウトカム評価について、リーブファイブアウトプロセスを使用して、各遺伝子の発現レベルと個々のスコア（KOOS、LKS、OARSI 組織学的スコア、および ICRS 総合評価スコア）との間のピアソン相関係数が計算されました。係数の絶対値が最高から最低までランク付けされました。これから、100 セットのピアソン相関係数の行列が計算されました。代表的な遺伝子は、出現確率に従ってリストされた遺伝子のピアソン相関係数の絶対値の >0.5 を選択することにより、各結果尺度の予測マーカーとして独立して選択されました。最終的に、出現確率が最も高い 4 つまたは 5 つの遺伝子セットが予測マーカーとして選択されました。遺伝子スコアは、一次関数に基づいて各遺伝子の発現の正規化値として計算されました: 遺伝子スコア = Σ(-ΔCt 値) (補足表 4〜7)。

反復測定分散分析と事後ボンフェローニ検定を使用してデータを分析し、KOOS スコアと全体的な LKS の臨床転帰 (n = 10) に関する術前スコアと術後スコアの差を特定しました。 p 値 < 0.05 は有意でした。

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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本プロジェクトにご協力いただきました島沢留美子教授（東海大学医学部）、橋本節子博士（株式会社セルシード）に感謝いたします。また、組織学的解析における技術的支援については、東海大学医学研究教育支援センターに感謝いたします。著者の 1 人は以下の資金源から資金提供を受けています。本研究は、国立研究開発法人日本医療研究開発機構再生医療実用化研究事業（研究助成金JP15bk0104001、JP17bk0104063、JP20bk0104101）の助成を受けて行われました。

〒259-1193 神奈川県伊勢原市下粕屋143 東海大学医学部外科学教室整形外科

Kosuke Hamahashi, Eriko Toyoda, Genya Mitani, Tomonori Takagaki, Nagatoshi Kaneshiro, Miki Maehara, Takumi Takahashi, Eri Okada, Ayako Watanabe, Masahiko Watanabe & Masato Sato

東海大学大学院筋骨格革新的研究推進センター（C-MiRA）、〒259-1193 神奈川県伊勢原市

Kosuke Hamahashi, Eriko Toyoda, Genya Mitani, Tomonori Takagaki, Nagatoshi Kaneshiro, Miki Maehara, Takumi Takahashi, Eri Okada, Ayako Watanabe, Masahiko Watanabe & Masato Sato

〒359-8513 埼玉県所沢市並木3-2 防衛医科大学校医工学科

Miya Ishihara

〒259-1193 神奈川県伊勢原市下糟屋143 東海大学病院細胞処理センター

Yoshihiko Nakamura

National Institute of Health Sciences, 3-25-26 Tonomachi, Kawasaki-ku, Kawasaki, Kanagawa, 210-9501, Japan

Reiko Kato

DNA Chip Research Inc., 1-15-1 Kaigan, Suzue Baydium 5F Minato-ku, Tokyo, 105-0022, Japan

Ryo Matoba

国立成育医療研究センター〒157-8535 東京都世田谷区大蔵2-10-1

Takehiko Takagi, Hidenori Akutsu & Akihiro Umezawa

〒259-1193 神奈川県伊勢原市下粕屋143 東海大学医学部臨床薬理学教室

Hiroyuki Kobayashi

〒259-1193 神奈川県伊勢原市下粕屋143 東海大学医学部外科学講座形成外科学教室

Tadashi Akamatsu

東京女子医科大学先端医工学研究所〒162-8666 東京都新宿区河田町8-1

Masayuki Yamato

細胞シート組織工学センター、薬剤学および薬化学学部、ユタ大学、30 South 2000、East Salt Lake、UT、84112、USA

Teruo Okano

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KH: 臨床研究と原稿執筆への貢献。 ET: 臨床および基礎研究と細胞シートの製造への貢献。 MI: 臨床研究、特にレーザー誘発光音響関節鏡法と原稿校正の実施に貢献。 GM: 臨床研究と原稿校正への貢献。 T.Takagaki: 臨床研究と原稿校正への貢献。 NK: 臨床研究と原稿校正への貢献。 MM: 臨床および基礎研究と細胞シートの製造に貢献。高橋哲也: 臨床および基礎研究、細胞シートの製造に貢献。 EO: 臨床および基礎研究および細胞シートの製造への貢献。 AW: 臨床および基礎研究と細胞シートの製造への貢献。 YN: 臨床および基礎研究と細胞シートの製造に貢献。 RK: 臨床および基礎研究と細胞シートの製造に貢献。 RM: 統計分析と原稿校正への貢献。 T.Takagi: 臨床研究と原稿校正への貢献。 HA: 同種細胞の提供、基礎研究や細胞シートの製造への貢献。 AU: 同種細胞の提供、基礎研究や細胞シートの製造への貢献。 HK: 統計分析と原稿校正に貢献。 TA: 臨床研究と原稿校正への貢献。 MY: 実験計画、細胞シート技術のリーダー、および原稿校正への貢献。 TO: 実験計画、細胞シート技術の先導、原稿校正への貢献。 MW: 臨床研究と原稿校正への貢献。 MS: 保証人、臨床研究デザイン、実験デザインへの貢献、実験作業のすべての in vitro 要素のリード、資金の提供、および原稿の準備。

佐藤正人氏への対応。

各著者は、MS がこの作品以外で、および/または読者がこの原稿に影響を与えたと認識できる、または潜在的に影響を与えているように見えるその他の関係または活動以外の、以下の関連する財務活動に関与していることを証明します: CellSeed Inc. からの資金提供。 MSは、出願人である東海大学と株式会社セルシードが保有する軟骨細胞シートの製造方法に関する特許（PCT/JP2006/303759、PCT/JP2017/031136）の発明者の一人です。残りの著者は競合する利益を宣言していません。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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浜橋和也、豊田英治、石原正人他変形性膝関節症の再生療法としての、脛骨高位骨切り術を伴う多指症由来同種異系軟骨細胞シート移植。 npj Regen Med 7、71 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41536-022-00272-1

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受信日: 2021 年 11 月 4 日

受理日: 2022 年 12 月 5 日

公開日: 2022 年 12 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41536-022-00272-1

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