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Oct 20, 2023

ヘテロクロマチンタンパク質 1 は、潰瘍性大腸炎において欠損している RNA スプライシング精度の調節因子である

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 13、記事番号: 6834 (2022) この記事を引用

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RNA スプライシングの欠陥はヒトの疾患に関連していると考えられていますが、炎症性腸疾患 (IBD) についてはまだ十分に調査されていません。 今回我々は、潰瘍性大腸炎（UC）においてクロマチンおよび選択的スプライシング調節因子HP1γの発現が低下していることを報告する。 したがって、マウス腸上皮における HP1γ 遺伝子の不活化は、炎症や腸内細菌叢異常などの IBD 様形質を引き起こします。 同時に、その機能の喪失によりスプライシングノイズが広範囲に増加し、腸内生物学において機能する多数の遺伝子における隠れたスプライス部位の使用が促進されることも我々は発見した。 これにより、プレラミン A mRNA の有毒なスプライス変異体であるプロジェリンが生成され、早老のハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群の原因となります。 スプライシング ノイズも炎症に関連して UC 患者で広範囲に検出され、プロジェリン転写物が結腸粘膜に蓄積します。 私たちは、HP1γ 活性と RNA スプライシング精度をモニタリングすることが、IBD の管理、より一般的には老化の促進の管理に役立つ可能性があると提案します。

潰瘍性大腸炎 (UC) やクローン病 (CD) などの炎症性腸疾患 (IBD) は、腸損傷を引き起こす制御不能な炎症を特徴とする慢性炎症性腸疾患です。 感受性遺伝子座は特定されているが、遺伝的要因は疾患全体の差異の一部のみを説明しており、疾患の発症における遺伝子と環境の間の相互作用をより詳しく調査する必要があることが示されている。 エピジェネティクスは環境ストレスを捕捉し、それらを特定の遺伝子発現パターンに変換することで、IBDの病因におけるクロマチンの調節解除の探索を促します。 以前の研究で、我々はヘテロクロマチンタンパク質 1γ (HP1γ) が腸内細菌に反応する炎症遺伝子の制御因子であることを特定しました 2。 マウスおよびヒトの HP1α および HP1β も含む HP1 タンパク質ファミリーのメンバーは、H3K9me2/3 ヒストン修飾のリーダーです。 それらはヘテロクロマチンの形成と維持において重要な役割を果たし、それによって転写遺伝子サイレンシングに関与します3。 同時に、複数の種で記載されているように HP1 タンパク質は RNA 結合活性を示し 4、哺乳動物では、HP1γ がプレメッセンジャー RNA のイントロン反復モチーフに結合し 5、共転写プレ mRNA プロセシングと選択的スプライシングを促進することが in vitro 研究で示されています 6,7 、8。 今回我々は、腸上皮において、HP1γを介した転写とRNA代謝の両方の調節が腸の恒常性にとって必要であり、IBDの理解において重要であることを示す。

我々が以前に報告した、細菌感染に応じた腸内炎症の制御に対する HP1γ の影響に関する観察 2 をきっかけに、慢性炎症の状況におけるこのタンパク質の発現を調べるようになりました。 そのために、UC患者およびスクリーニング結腸内視鏡検査を受けている健康な個人からの非炎症組織の結腸生検の利用可能なコホートを調べました（母集団の詳細な説明については、図1aおよび補足データ1）。 定量的免疫蛍光（IF）は、健常人（対照患者）と比較して、UC患者の結腸上皮におけるHP1γの発現の大幅な減少を示しました（図1a、b）。 UCに関連したHP1γ発現の低下は、免疫機能不全（Il10欠損）と上皮NADPHオキシダーゼ1（Nox1）欠損を組み合わせたEXCY2マウスモデルを用いて確認された9。 初期段階では、これらのマウスは自然発生的な慢性大腸炎を示し、それが大腸炎関連異形成および腺癌に発展しました。 上皮における HP1γ 発現の低下は、初期の慢性炎症期 (生後 1 ～ 5 か月) では蔓延していましたが、がん期では発現が回復しました。これは、さまざまながんにおける Cbx タンパク質ファミリーメンバーの検出増加の報告と一致して、10、 １１（図１ｃ、ｄ）。

a、b HP1γ 発現は潰瘍性大腸炎 (UC) 患者で影響を受けます: (a) 結腸切片の抗 HP1γ 抗体 (赤) および Dapi (青) で染色された結腸組織切片 (スケール バー: 50 μm) および(b) コントロール患者 (n = 10) および UC 患者 (n = 16) における平均蛍光 HP1γ シグナル強度/セクションの ImageJ 定量化。コントロール患者に対する相対値として表されます (c、d) IL10/IL10 における HP1γ の二相性発現NOX1 KO マウスモデル、c 抗 HP1γ 抗体 (赤) および Dapi (青) 蛍光による免疫染色、および (d) 平均蛍光強度の ImageJ 定量化。 各グループの n = 6 マウス、スケールバー：80μm、（e）Ctrl（コントロール）およびCbx3 KOマウスの絨毛および結腸上皮からのReg3bおよびReg3gのmRNA発現（n = 3〜6マウス/グループ）（f） Ctrl (コントロール) および Cbx3 KO マウスの結腸上皮からの RT-qPCR による Tnf、Il1b、および II6 の mRNA 発現 (n = 3 ～ 4 マウス/グループ) (g) 炎症誘発性シグネチャを持つ結腸 Cbx3 KO トランスクリプトームの大幅な濃縮, 両側の公称 P 値は GSEA によって計算されました。 (h) Villin-Cre Cbx3 雄マウスおよび雌マウスにおけるベータ多様性の時間的進化。 雌マウス（n = 8）および雄マウス（n = 6）における、治療前（グループ A と定義）および治療後（Vhc または Tamox）（グループ B ～ E と定義）の糞便サンプル採取の時間経過を示す図。 統計分析は補足データ 4 に提供されています。すべてのデータは平均 ± SEM として表示されます。 両側スチューデント t 検定 (b、d、e、f)。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

慢性炎症における HP1γ の役割を示唆するこれらの観察は、腸上皮系統における Cbx3 遺伝子 (HP1γ タンパク質をコードする) の誘導的不活性化を可能にする Villin-creERT2:Cbx3-/- マウス モデルの作製を促しました。 Cbx3 KO マウスと呼ばれるこれらのマウスでは、タモキシフェン強制経口投与により、テストした組織の上皮の HP1γ タンパク質が完全に枯渇しましたが、枯渇には HP1α および HP1β アイソフォームの上方制御が伴いました（補足図 1）。 ）、以前に報告されたように12。 免疫蛍光染色によるこれらの組織の観察では、H3K9me3およびH4K20me3を含む構成的ヘテロクロマチンのマークの変化は示されず、DAPI染色によって視覚化された色中心は変化していないように見えました（補足図1、2）。

若い成体マウス（8～10週齢）の陰窩、絨毛、結腸のいずれかから精製した上皮細胞に対する次世代RNAシーケンスにより、Cbx3 KOマウス上皮のトランスクリプトーム状況に広範な変化が見られ、関与する経路のサインスコアが増加していることが示された脂質酸化において、酸化的損傷の症状を示す(補足データ2)。 さらに、ディフェンシン、カテリシジン、および再生遺伝子（Reg）タイプのAMPを含む抗菌ペプチド（AMP）をコードするmRNAの発現の顕著な減少に注目しました（補足データ3および図1e）。 結腸では、Q-PCRによって確認された炎症性遺伝子発現の大幅な増加にさらに注目しました（図1f、gおよび補足データ2）。

炎症と AMP 産生の変化は、どちらも腸内微生物叢の異常を引き起こす 13,14 ため、細菌 16 S の V3 ～ V4 領域のイルミナ配列決定を介して、マウス (n = 6 雄、n = 8 雌) の糞便微生物叢をさらに特徴付けました。 rRNA。 その後のUniFrac主座標分析では、Cbx3 KOマウスがWTから離れてクラスター化し、微生物群集の変化を示しました（統計の詳細については図1hおよび補足データ4）。 Cbx3 不活化前の細菌群集は両性で同様でしたが、この変化は男性（p 値 = 0.015）と比較して女性（p 値 = 0.006）で悪化しました（図 1h）。 Creリコンビナーゼの非存在下でタモキシフェンで処理したCbx3 fl/fl雌マウスでも細菌組成は変化せず、タモキシフェン投与のみによって誘発される効果は除外されました（補足図3）。

性別は IBD 危険因子に影響を与える可能性があるため 15、雄と雌のマウスを別々に分析しました。 雌マウスでは、HP1 不活化に応答して 110 の操作分類単位 (OTU) が調節されましたが、雄では、HP1 不活化と有意に共変動したのは 60 OTU のみでした (補足データ 5)。 特に女性では、大腸菌やアリスティペスなどの大腸菌形成性細菌の過剰発現と、短鎖脂肪酸（SCFA）生産者であるルミノコッカス科などの抗炎症性細菌種の大幅な下方制御が観察されました（補足図4）。 、両方の現象は、IBD16で報告されている腸内細菌叢の異常の症状です。

したがって、UCは腸上皮におけるHP1γの発現低下と関連しているのに対し、マウス腸における同族遺伝子の不活化は腸恒常性破壊に典型的な特徴をもたらす。 われわれは、結腸上皮においてHP1が保護機能を発揮し、抗炎症および微生物叢の恒常性を伝達していると結論づけた。

次に、小腸で HP1γ が果たす恒常性維持機能を概説しました。 トランスクリプトーム分析は、網膜芽細胞腫（Rb）を介した細胞分裂の制御におけるCbx3の報告された役割と一致して、Cbx3の不活化によるE2F標的遺伝子のサイレンシング解除を示しました（補足データ2）。 細胞周期に対するCbx3不活化の影響と一致して、変異マウスの増殖マーカーKi67は、正常な増殖区画を超えて異所的に検出され、陰窩に沿って絨毛軸の基部に広がっていました（補足図5a）。 さらに、チミン類似体である 5-ブロモ-29-デオキシウリジン (BrdU) の 1 時間のパルスにより、S 期の細胞をマークすると、Cbx3 KO マウスの腸幹細胞 (ISC) コンパートメント内の細胞が頻繁に標識されることが証明されました。これは、陰窩の0〜+4位置でのBrdU陽性細胞の検出の大幅な増加によるものです（図2a、b）。 対照（Ctrl）マウスでは、この標識は主に ISC の直後の子孫コンパートメント、つまり輸送増幅細胞に限定されていましたが、ISC では BrdU はほとんど取り込まれておらず、これは幹細胞の G1 期の延長と一致しています 18。 Cbx3 KO マウスにおける幹細胞ニッチの拡大は、幹細胞性の Olfm4 マーカーの検出領域の拡大によっても証明されました（補足図 5b、c）。 最後に、細胞をCbx3 KOマウスから収集した場合、ex vivoエンテロイド3Dマトリゲル培養物は芽形成の加速を示しました（補足図6a、b）。 ただし、長期培養すると、おそらく細胞の枯渇の結果として、Cbx3 KO由来オルガノイドではオルガノイドあたりの芽の比率が大幅に低下しました（補足図6a、b）。 オルガノイドでは、EdUの取り込みによるS期の細胞の検出により、絨毛軸に沿った異常な陽性細胞も明らかになり、EdU陽性細胞がオルガノイドの内腔を満たしています（図2cおよび補足図6c）。

(a) Ctrl および Cbx3 KO マウスの陰窩回腸切片の抗 BrdU 抗体 (赤) と Dapi (青) による免疫染色 (スケール バー: 20 μm)、および (b) BrdU 陽性細胞 (赤) 対 Dapi の定量(青) 幹細胞コンパートメント (0 ～ +4 の位置) n = 3 匹の動物 Ctrl、n = 20 セクション。 Cbx3 KO n = 15セクション）、（c）n = 3マウス/グループのCtrlおよびCbx3 KOマウスに由来するオルガノイドにおけるEdU（赤）/Dapi（青）の共染色の代表画像（​​スケールバー：100μm）および定量は補足図6cに提供されています。（d）Lgr5 +腸幹細胞サイン（ISC）による絨毛Cbx3 KOトランスクリプトームの大幅な濃縮（Munoz et al.、2012）、両側の名目P値はGSEAによって計算されました。 e）CtrlおよびCbx3 KOマウスの絨毛上皮からのRT-qPCRによるOlfm4およびAscl2のmRNA発現（n = 3〜4マウス/グループ）（f）ヌクレオリン抗体による代表的な免疫蛍光、n = 6マウス/グループ（スケールバー： 100μm、インサート内に25μM）（g）絨毛上部の核小体構造を特徴付ける代表的な透過型電子顕微鏡法（条件あたりn = 3マウス）：（g-左）では、ヘテロクロマチン（hc）が観察されました。 Ctrl マウスの核と Cbx3 KO マウスの標準核小体 (n) が検出されました。スケール バー = 5 μm、(g-右): Cbx3 KO マウスの標準核小体のある関心領域を示す拡大図 (g: 粒状)成分; fc: 原線維中心。 dfc; 高密度線維成分）スケールバー = 2 μm、(h) Cbx3 KO マウスの陰窩と絨毛の両方における rRNA 45 S および 18 S 発現レベル (n = 3 ～ 4 マウス/グループ)、(i) 抗リゾチームによる代表的な免疫蛍光回腸陰窩における抗体（赤）およびDapi（青）（スケールバー：20μm）および（j）リゾチーム発現領域の定量。 （n = 6 マウス/グループ、合計 n = 40 フィールド/条件）（k）絨毛上皮における Sis（スクラーゼイソマルターゼ）の mRNA 発現（n = 4 ～ 8 マウス）。 すべてのデータは平均値 ± SEM として表示されます。 両側スチューデント t 検定 (b、d、e、h、j、k)。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

この増殖恒常性の変化に伴い、突然変異マウスの絨毛は、GSEA 分析で示されるように成熟欠陥を受けやすく、Cbx3 不活化によって調節が解除された遺伝子と腸幹細胞サインに関連する遺伝子との間に強い関連性があることが示されましたが、RT-qPCR 反応により明らかになりました。変異マウスでは幹性マーカーAscl2およびOlfm4の発現が増加しました（図2d、e）。 Cbx3 KO マウスの絨毛上皮に沿って、核小体のマーカーであるヌクレオリンの発現にも注目し、電子顕微鏡検査により、絨毛上部に顆粒成分、線維中心を含む標準的な核小体構造が存在する証拠が得られました。および高密度の原線維成分（図2f、g）。 これは、通常は前駆細胞から受け継いだリボソームで増殖する有糸分裂後の細胞集団におけるリボソームの漸進的な希釈の結果である、陰窩-絨毛軸に沿ったヌクレオリン発現の予想される低下とは顕著な対照を成していた（図2f、g）。 。 核小体細胞小器官の異所性産生は、リボソーム生合成に関与する遺伝子の濃縮に関連して、陰窩と絨毛の両方で観察される18 s rRNA産生の増加によって最終的に証明されました（図2hおよび補足図5d）。 したがって、上皮細胞の成熟中に起こる核小体細胞小器官の恒常性抑制は失われました。 注目すべきことに、RNA-seq実験におけるレトロトランスポゾンにマッピングされたリードの定量化により、腸上皮におけるH3K9メチルトランスフェラーゼSetdb1の不活化について以前に報告された20,21とは異なり、HP1γの不活化はこれらの通常ヘテロクロマチン化されたDNAリピートの発現増加をもたらさないことが実証された。 。 したがって、Cbx3 KOマウスの絨毛に沿ったrDNAのサイレンシング解除と核小体抑制の喪失は、ヘテロクロマチン構造の全体的な不安定化の状況では発生しませんでした（補足図7）。

最後に、Cbx3 KO マウスにおける成熟系統の産生は、吸収系統と分泌系統の両方に影響を及ぼしました。 同様に、両方のコンパートメントからの RNA 配列データの GSEA 分析では、パネートおよび腸細胞の遺伝子発現プログラムの変化が示され（補足図 5e、f）、パネート細胞マーカーであるリゾチームの発現の顕著な欠陥に気づきました。吸収性腸細胞分化マーカーであるスクラーゼ イソマルターゼの作用（図 2i、k）。 全体として、これらのデータは、HP1γ の枯渇による細胞増殖の制御および成熟系統の産生における調節解除を示しています。

次に、腸上皮における RNA 恒常性に対する HP1γ の機能を明らかにしようとしました。 質量分析により、HP1γ相互作用物質はスプライセオソームの成分が高度に濃縮されていることが明らかになりました（補足図8a、bおよび補足データ6）。 その中で、触媒ステップ 2 スプライソソーム (U2 型スプライソソーム複合体 C とも呼ばれる) のメンバーと、Ser/Arg-rich (SR) タンパク質などのスプライス部位認識に必須のスプライシング因子を同定しました。 以前の報告 22 と一致して、これらのタンパク質間相互作用の一部に RNAse を作用させても、RNA 分子の介在の影響は示唆されませんでした 22 (補足図 8c)。 これは、プレ mRNA スプライシングの制御における HP1γ の役割に関する研究と一致していました 6,22。 同様に、転写スプライシングの多変量解析 (rMATS) パイプラインを使用した RNA-seq データの解析により、スプライシングが HP1γ 不活化に広範囲に影響を与えることが確認されました。 スプライシングの有意な変動には、小腸ではイントロン保持が増加する傾向が含まれるが、結腸ではそうではなく、代替エクソンの含有量の増加と減少が観察されました（図3aおよび補足データ7〜9、有意（FDR < 0.05）選択的スプライシング）陰窩、絨毛、および結腸上皮におけるイベント）。 これらのイベントのいくつかはRT-qPCRによって検証されました（補足図9）。

(a) rMATS によって結腸、絨毛、陰窩上皮で検出されたスプライシング変化の種類と量。 スプライシング変更の種類は、示されているように色分けされています。 SE: スキップされたエクソン、MXE: 相互に排他的なエクソン、A3'SS および A5'SS: 代替 3'/5' スプライス サイト、RI: 保持されたイントロン。 （ b ）各組織のctrlまたはCbx3 KOマウスのいずれかからの3つのRNA配列複製を統合した後の、陰窩、絨毛および結腸上皮におけるコントロール（Ctrl）およびCbx3 KO（KO）条件でのde novo接合部の定量。 de novo ジャンクションは、mm9 バージョンのマウス ゲノムに注釈が付けられておらず、WT サンプルと変異サンプルの両方に存在しないジャンクションとして定義されました。 示された p 値は、対応のある両側スチューデント t 検定、n = 3 (陰窩、絨毛および結腸) を使用して計算されました。 WTまたはRbm17に対して不活性化されたマウスプルキンエニューロンにおけるde novo接合部の定量化が、ポジティブコントロールとして示されている。 (c) 注釈付きジャンクションで得られたスコア、およびランダムに選択された配列で得られたスコア (それぞれ黒と青) と比較した、(b) で説明したアプローチで特定された de novo 部位の統合 maxEnt スコア。 示されている値は、陰窩、絨毛、および結腸における Cbx3 KO からのものです (n = 3 マウス、p 値は通常の一元配置分散分析で計算されました)。 (d) Cbx3 KO 不活化による転写影響が 2 倍未満である遺伝子での de novo ジャンクションを定量化しました。 示された各条件について、2 倍以上の新規結合を獲得した遺伝子をカウントしました (p 値 < 0.05)。 （ e ）結腸（PkmおよびCdh1）または絨毛（Lmna）のデノボ接合部を、指定された遺伝子の近傍でゲノムブラウザを使用して視覚化しました。 各バーは、5' スプライス部位から 3' スプライス部位に及ぶ「de novo」ドナー/アクセプター対を表します。 （ f ）棒グラフは、陰窩、絨毛、および結腸の指定された遺伝子で検出された新規結合の数を示します（各条件について n = 3 マウス、データは平均±SEMとして表示されます。示されたp値は2つのパラメータを使用して計算されました） -側スチューデントの t 検定)。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

スプライシングに対する HP1γ の影響には定義されたパターンが存在しないため、これらの多数のスプライシング イベントが、癌や神経変性と関連するノイジー スプライシング 23 に起因するかどうかを調べることが促されました 24、25、26、27。 そのために、各組織の 2 つの実験条件 (WT または Cbx3 KO) のうちの 1 つのみに存在する注釈のないスプライス接合部を特定しました。 以後「デノボ」と呼ぶこれらの接合部の量は、Cbx3の不活性化により有意に増加した(図3b)。 この増加は、潜在的なスプライシングの使用を抑制すると報告されているRNA結合タンパク質であるRbm17が枯渇した小脳プルキンエニューロンで観察されたものと同様の範囲でした26（図3b）。 RT-PCR実験では、HP1γの不活化によって誘導されるエクソンまたはイントロンでの潜在的なスプライス部位の使用量の増加がさらに実証されました（補足図10）。

専用ソフトウェアを使用してコンセンサススプライシングのドナーとアクセプターの品質を評価すると、平均して、de novoジャンクションのスコアは注釈付きジャンクションよりも低いですが、ランダム配列よりは高いことが明らかになりました（図3c）。 これは、HP1γ の不活性化が不十分なコンセンサス スプライス部位の使用を促進し、スプライシングの機会範囲を増加させた可能性があることを示唆しました。 公的に入手可能なデータの調査により、不活化されるとスプライシングノイズの大幅な増加をもたらす HP1γ のいくつかの分子パートナーが同定されました。 これらのパートナーには、ペプチジルプロリルイソメラーゼ様スプライセオソーム成分であるPPL128、N6-アデノシンメチル化（m6A）修飾に関与するRNAメチルトランスフェラーゼをリクルートするジンクフィンガータンパク質ZC3H13、およびSer/Argリッチタンパク質SRSF531が含まれます。 11)。

最後に、Cbx3の不活化によって誘発されるスプライシングノイズを遺伝子ごとに調べると、発現レベルで影響を受けていない遺伝子の大部分で、活性なスプライス部位の数が大幅に増加していることがさらに実証されました（図3dおよび補足データ）遺伝子のリストについては 10)。 これらの遺伝子には、腸の恒常性の調節因子が含まれていました。 特に、選択的スプライシングによって Pkm1 と Pkm2 の両方の mRNA を生成し、後者は大腸炎から保護する Pkm 遺伝子 32 が、結腸内での新規スプライシングの大幅な増加を示したことに注目しました（図 3e、f、左パネル）。 同様に、上皮バリア機能に必須であり 33、選択的スプライシングによる早期終了を受けやすい E-カドヘリンをコードする Cdh1 遺伝子 34 は、陰窩と結腸の両方で Cbx3 不活化の影響を受けました（図 3e、f 中央パネル）。 最後に、絨毛での新規結合の平均9倍の増加というLmna遺伝子での特に強い影響を観察しました（図3e、f、右パネル）。

スプライシングノイズの生物学的重要性は哺乳類ではあまり解明されていないため、HP1γを欠く絨毛におけるLmna遺伝子における新規スプライス結合の使用量の増加がプロジェリンの産生をもたらすかどうかの調査を我々に促している。 LmnA 遺伝子には 12 個のエクソンが含まれており、選択的スプライシングによってラミン A とラミン C の両方の mRNA が生成されます。 場合によっては、まれなスプライシング イベントによって、ハッチンソン ギルフォード プロジェリア症候群 (HGPS) の原因となるドミナント ネガティブなタンパク質アイソフォームとして機能するラミン A の切断型であるプロジェリンが生成されることもあります 35,36。 この早期老化症候群では、ゲノム変異によってこのスプライスバリアントの生成が促進され、正常細胞ではコンセンサスが低いスプライス部位の使用により低収量で使用されるプロジェリンスプライス部位の使用量が増加します37。

したがって、我々はRT-PCRおよびTaqman定量PCRをマウス腸上皮におけるラミンAおよびプロゲリン転写物の検出に適用した（補足図12aおよび図4a、b）。 LmnAのエクソン9および12にネスティングされたプライマーを使用したエンドポイントRT-PCRは、Cbx3 KOではプロゲリン転写物検出の証拠を示しましたが、Ctrlマウスではそうではありませんでした（補足図12a）。 Taqman 定量的 PCR はさらに、絨毛上皮における Cbx3 不活化時のプロジェリン特異的スプライシング イベントの発生の有意な増加を実証しました (図 4b)。 PCR最終産物の配列決定により、このスプライシング産物がG609G HGPSマウスで検出されたものと同一であることが確認されました（図4c）。 ただし、スプライシング産物の量は、変異によってもたらされるプロジェリン 5'SS の強度の増加と一致して、Lmna G609G HGPS マウスの結腸または小腸上皮で観察されるよりも著しく低いままでした 37 (図 4b および補足図 12b)。 。

(a、b) Taqman アッセイ ctrl (n = 4)、Cbx3 KO (n = 8)、WT および HGPS G609G (n = 4 マウス/グループ)、Mann-Witney U テストにおけるラミン A およびプロゲリン (c) の例絨毛 Cbx3 KO サンプル、対照として使用した G609G マウス由来のマウス胎児線維芽細胞 (MEF) における Taqman PCR 最終産物の配列データ、(d) Ctrl、Cbx3 KO マウスおよび as 由来の上皮溶解物における抗プロジェリン モノクローナル抗体によるイムノブロット内部対照、タモキシフェンで処理したCreリコンビナーゼを発現しないCbx3 fl/fl。 実験は2つの独立した繰り返しの代表であり、合計n = 4マウス/グループ（e）抗プロジェリン抗体（赤）およびDapi（青）を使用した代表的な免疫蛍光、スケールバー：20μm、および（f）の定量化は提供されます。回腸陰窩軸に沿った位置に応じたプロジェリン発現細胞のパーセンテージ (%) (Cbx3 KO n = 23 切片、n = 3 マウス)。 データは平均値±SEMとして表示されます。(g) 核膜をマーキングする抗ラミンB1抗体(緑色)による免疫蛍光(スケールバー: 50 μm、インサート: 15 μm)および(h) の定量化は、核膜を有する細胞の割合によって提供されます。変形核、各グループ n = 5 ～ 9 マウス、それぞれ ctrl = 4757 核および Cbx3 KO = 29753 核でカウント。データは平均 ± SEM、両側スチューデント t 検定として表示されます。ソース データは、ソースデータファイル。

次に、デジタル ドロップレット PCR (ddPCR) を使用して、プロジェリン特異的スプライシング イベントのパーセント スプライシング イン (PSI) スコアを各条件で評価しました。これは、プロジェリン アイソフォームの量を標準 (ラミン A) とプロジェリンの総量で割った値に相当します。アイソフォーム。 Ctrl 陰窩および絨毛では、それぞれ平均 415 ± 166 コピー/μl および 0.16 ± 0.15 コピー/μl の標準スプライシング産物とプロジェリン特異的スプライシング産物が検出されましたが、Cbx3 KO では、これらの数値は 1566 ± 725 コピー/μl に上昇しました。ラミンAの場合はμl、プロジェリンの場合は2.8±0.42コピー/μl（補足図12c）。 予想どおり、HGPS マウスの精製陰窩上皮細胞に由来する cDNA におけるプロゲリン検出は、ラミン A では 33.86 コピー/μl および 11.8 コピー/μl でより高くなりました。平均 PSI への変換では、Cbx3 の不活化により 0.045 から 0.21 への増加が示されました。これは、変異マウスにおけるLmna遺伝子の発現増加によるものではない、プロジェリン特異的スプライシング事象の発生増加を実証している（補足図12dおよび補足データ11）。 次に、Cbx3 KO マウスの小腸で検出されたプロジェリン転写物のレベルがプロジェリンの産生をもたらすかどうかを調査しました。 よく特徴付けられた抗プロジェリンモノクローナル抗体（補足図13）を使用して、イムノブロットで視覚化したように、絨毛と陰窩上皮の両方でプロジェリンタンパク質を容易に検出しました（図4d）。 注目すべきことに、誘導性Cre-リコンビナーゼを持たないCbx3 fl/flにはプロゲリンシグナルが存在しないため、プロゲリン産生に対するタモキシフェン誘導の影響を除外することができた(図4d)。 陰窩および絨毛におけるプロジェリンタンパク質の蓄積は、免疫細胞化学によってさらに記録されました（補足図14）。 このアプローチにより、プロジェリンが主にISCの直接の子孫で検出されることが明らかになり（上記の+ 4位置、図4e、f）、したがって、Cbx3 KOマウスの陰窩-絨毛軸に沿ったプロジェリン発現の勾配が証明されました。 腸細胞性TC7細胞におけるインビトロcrispr/Cas9媒介Cbx3ノックアウト(KO)により、プロジェリン転写物の産生および核細胞質プロジェリンタンパク質の蓄積が確認された(補足図15a、b)。

プロジェリンの蓄積は主に核層の構造を破壊します 38。 したがって、我々は、Cbx3の不活化時に核ラミンAに対する毒性が検出されるかどうかを調べた。 Cbx3 KOマウスの小腸を観察すると、ラミンB1免疫染色で上皮細胞の一部における核膜の変形が明らかになりました（図4g、h）。 同様の欠陥は、TC7腸細胞株におけるcrispr / Cas9媒介Cbx3ノックアウト（KO）時にもインビトロで観察され、その結果、電子顕微鏡で検出可能な核膜の深い陥入が生じ、椎弓障害表現型を反映しました（補足図15c、d）。 。 全体として、これらのデータは、HP1γ 欠損がラミン A mRNA スプライス変異体の機会範囲を増加させ、したがって腸上皮における HGPS 変異の非存在下でプロジェリンの産生につながることを示しました。

UCに関連するHP1γレベルの低下（図1a、b）により、UC患者におけるスプライシングノイズの増加を調査することになりました。 これを調査するために、我々は、206 人の若年 UC 患者と、大規模な多施設共同治療開始治療歴のない UC コホート PROTECT39 からの適合する健康なドナー 20 人からの RNA-seq データをマイニングしました。 このデータセットが選択されたのは、十分に制御されており、スプライシング分析に十分な深さのシーケンスがあったためです。 de novo 接合部を定量化すると、健康なドナーと比較して、UC 患者ではスプライシング ノイズが非常に有意に増加している (P 値 = 10-59) ことが明らかになりました (図 5a)。 上位四分位の新規接合レベルを示す UC 患者と下位四分位のレベルを示す UC 患者を比較すると (図 5b の概略図を参照)、高いスプライシング ノイズが炎症反応に関連する遺伝子の活性の増加と相関していること、およびミトコンドリア遺伝子の発現の減少、両方とも最初の研究における疾患の重症度と関連していた39（図5b、c、およびUC患者の説明と機能的注釈強化分析を含む補足データ12）。 これと一致して、組織学的重症度スコアはより高かった(ベースに計算、p 値 = 0.03)。 また、高レベルの 4H 糞便カルプロテクチンが上位 4 分位でより頻繁にみられたため (80% vs 57 %）、寛解状態にある患者は少なかった（下位四分位では 43% 対 67% - 補足図 16a、b）。 Cbx3 KO マウスと同様に、遺伝子ごとにスプライシング ノイズをさらに調べます。 精査中の 2743 個の遺伝子のうち、生検で発現しており (遺伝子あたり少なくとも 10 RNA-seq リード)、UC の影響を受けない (健康なドナーと UC 患者の間で発現の変化が 2 倍未満) として選択され、415 個の遺伝子 (15%) が表示されました。 UC患者ではde novo接合部が1.5倍を超える増加（p Val < 0.01）である一方、これらの接合部のレベルの低下を示したのは11遺伝子（0.4％）のみでした（図5dおよび補足データ13）。 これらの遺伝子にはLMNAが含まれており（図5e）、結腸生検のコホートにおけるプロジェリンの産生を調べるようになりました。 総 RNA は UC 患者 (n = 19) の結腸生検から抽出され、健康な個人 (n = 17) または結腸に関与しているクローン病 (CD) 患者 (n = 16) と比較されました (詳細な説明については補足データ 14)。人口）。 次に、配列決定による PCR 最終産物の検証を含む、taqman アッセイによってラミン A およびプロジェリン mRNA 発現レベルを決定しました。 UC患者では、プロジェリン特異的スプライシングイベントのレベルは有意に上方制御されました（p Val = 0.0002）（図5f、g）が、ラミンAスプライシング産物の産生はそうではありませんでした（図5h）。 プロゲリン mRNA 発現と患者の年齢の間に相関関係は検出されませんでした (補足図 16c)。 逆に、CD 患者では、プロジェリン特異的スプライシングは影響を受けませんでしたが (図 5f)、ラミン A 特異的スプライシング産物は上方制御されました (p Val = 0.016) (図 5h)。この増加は主に若い CD 患者に関係しています。線形回帰分析で示されるように、45 歳未満 (補足図 16d、e)。

(a) PROTECT UC コホート RNA-seq データ (GSE109142) からの、健康なドナー (連続、n = 20) および UC 患者 (n = 206) における新規結合の定量化。 デノボ結合は、hg19 バージョンのヒトゲノムに注釈が付けられておらず、健康なドナーと UC 患者の両方に存在しない結合として定義されました。 示された値は、シーケンスの深さの最終的な変動を考慮して、各 RNA-seq 実験のリードの総数によって正規化されました。 P 値は、対応のない両側スチューデント t 検定を使用して計算されました。 箱ひげ図の中心は中央値を示し、(x) は平均を示し、箱の境界は第 1 四分位数と第 3 四分位数を示し、下ひげと上ひげは最小値と最大値を定義します。 外れ値が存在する場合、代わりにひげが四分位範囲の 1.5 倍に広がります。 外れ値は点として表示されます。 (b) 各ドナーの正規化された新規結合数を表す文字列チャート (青は健康、赤は UC 患者)。 枠で囲まれた領域は、示された四分位に含まれる患者のおおよその数を表します。 （ c ）下位四分位数と上位四分位数の患者間で差次的に発現される遺伝子（>1.5倍、P Val < 0.01）を、遺伝子オントロジーのアノテーションと比較しました。 「生物学的プロセス」のカテゴリーにおいて有意に豊富な経路(P val < 0.01)が示されている。 （ d ）健康なドナーと UC 患者の間で転写の影響が 1.5 倍未満だった遺伝子での de novo 結合が定量化されました。 示された各条件について、1.5 倍以上の新規結合を獲得した遺伝子をカウントしました (p Val < 0.01)。 （ e ）代表的な健康なドナーと代表的なUC患者のスプライス結合を、ゲノムブラウザを使用してLMNA遺伝子（赤色で示す）の近傍で視覚化しました。 各バーは、5' から 3' スプライス部位に及ぶドナー/アクセプターのカップルを表します。 上部のトラックのヒストグラムは、RNA-seq データの局所読み取り密度を表します。 UC 患者は上位 4 分の 1 で選択されましたが、最も高い de novo 接合数 (f–h) を示さない Taqman Assays 対照におけるラミン A およびプロゲリン (n = 17)、クローン病 (CD、n = 16)、および潰瘍性大腸炎(UC、n = 19) 集団の cDNA を結腸生検から抽出しました。 マン・ウィットニーの U 検定。 (h) 1 人の UC 患者における Taqman PCR 最終産物からの配列データの例。HGPS 患者からのヒト線維芽細胞を陽性対照として使用しました。UC = 潰瘍性大腸炎。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

したがって、これらの観察は、UC におけるスプライシング精度の大幅な規制緩和を特定します。 プロジェリン転写物は、UC およびこの増加したスプライシング ノイズの潜在的なマーカーとして浮上します。 最後に、我々の観察は、この疾患のモデル化における Cbx3 KO マウスの予測値を強調しています。

RNA 代謝の役割は、神経変性疾患、心臓疾患、早期老化疾患では広く説明されていますが 40、腸疾患ではほとんど解明されていませんでした。 本研究では、HP1γを腸上皮におけるRNAスプライシングの精度を保護し、自然発生する非標準的スプライシング事象の影響を制限するタンパク質として定義している。 非標準的なスプライシング アクティビティは、「スプライシング ノイズ」と呼ばれることがよくあります 23。 非哺乳類の動物モデルでは、ノイジースプライシングは生理学的機能の可能性を伴う mRNA スプライスバリアントの多様性を促進する可能性がありますが 41,42、哺乳類におけるその重要性は依然としてとらえどころがありません。 後者では、蔓延する誤ったスプライシング活性がゲノム進化の原動力である可能性がある 43 が、非標準的スプライシング部位の全体的な活性化が関与する癌や神経変性疾患などのヒトの病理にも関連している 25、26、27、44。 Rbm17、hnRNP、TP4326,27 など、わずかな RNA 結合タンパク質のみが、潜在的なスプライシングを全体的に抑制することが示されています。 現在の研究に基づいて、腸上皮における基本的な役割を持つ HP1 をこのリストに追加できるようになりました。 スプライシングに対する HP1γ 欠損の影響は、HGPS 変異の非存在下では通常は抑制されている Lmna 遺伝子のスプライス変異体であるプロジェリンの産生を誘導するのに十分でした。 より一般的には、スプライシングに対する HP1γ 不活化の影響は、明らかにスプライシングの精度の一般的な低下によって説明されます。 これは、RNA-seq データによって証明されており、アノテーションのないスプライス接合部や、ドナーまたはアクセプターのコンセンサス配列が非常に乏しい部位での接合リードの検出が増加しています。 この効果は半定量的 PCR でも観察でき、野生型組織から単一種を生成するプライマーを使用して変異マウスで複雑な一連の産物が得られました。 スプライス部位選択におけるこの厳密性の低下には、転写とスプライシングの間の脱共役の可能性など、複数の原因がある可能性がありますが、HP1γ 分子パートナーに対するプロテオミクス的アプローチにより、本物のスプライス部位のみの使用を保証する多数のスプライシング因子が検出されたことに注目します。 これらには、主要な（U2 依存性）スプライセオソームの成分と、コンセンサス配列のスプライセオソーム認識に必須の補助スプライシング因子が含まれていました。 これらのスプライシング因子のいくつかについて利用可能なノックアウト データを調べたところ、それらの不活化により、Cbx3 の不活化時に観察されたものと同様のスプライシング ノイズが生じることがわかりました。 調査されたスプライシング因子には、スプライシングをラミン A 5'SS 利用に向けて方向転換することでプロジェリン産生を減少させることが以前に示されている Ser/Arg リッチ SRSF5、PPL1、ペプチジル プロリル イソメラーゼ様スプライソソーム コンポーネント、その不活化により異常な使用によるスプライシング変化が引き起こされるものが含まれていました。弱いスプライシング部位28、およびRNA N6-メチルアデノシン29のレベルを調節するジンクフィンガータンパク質であるZC3H13も、RNAスプライシングを含むRNA代謝のさまざまな側面に関与する修飾である46、47、48。 したがって、我々は、HP1γがスプライシング決定の精度に関与するタンパク質のクロマチン鋳型への動員を促進することによってスプライシングノイズを低減するモデルを提案する。 HP1γのスプライシング補助制御因子への依存は、おそらく各組織または細胞型で利用可能なスプライシング制御因子の関数として、スプライシングに対するその局所的な影響によっても説明される可能性がある。 特に、ISC コンパートメントを除いて、陰窩-絨毛軸に沿ったプロジェリン発現の勾配に注目しました。 後者は、スプライシングの調節が細胞の発生状態に関連している可能性があることを示唆しており、この概念はHGPS-iPSCモデルによってさらに裏付けられており、プロジェリンは細胞の関与時にのみ観察される49。 我々のデータは主にスプライセオソーム動員を介したHP1γの影響を指摘しているが、動原体周囲の転写物をRNA分解機構にエスコートする酵母HP1ホモログの関与が示唆するように、欠損スプライシング産物の分解におけるHP1γの関与も考慮される可能性がある50。

HP1 の役割がスプライシングと関連付けられる前は、このタンパク質は主に、rDNA 遺伝子座を含む反復 DNA 配列および遺伝子プロモーターのサブセットでの転写を抑制する、ヘテロクロマチン依存性サイレンシングのメディエーターとして知られていました 2,17,51,52,53。 。 マウス腸における HP1γ の不活化は、HP1 依存性転写抑制が腸の生物学に不可欠であり、増殖と炎症を制御する遺伝子のサイレンシングに関与していることを明確に示しました。 これらの実験では、上皮細胞の成熟中にリボソーム遺伝子を抑制する、rDNA 遺伝子座における HP1γ の役割も明らかになりました。 ただし、腸内のH3K9メチルトランスフェラーゼSetdb1の不活性化20、21、または肝臓のHP1α、HP1βおよびHP1γのトリプルノックアウト54（補足図7）時に以前に観察されたものとは異なり、HP1γの不活化は内因性タンパク質のサイレンシングに影響を与えませんでした。レトロウイルス (ERV) は、通常、点在するヘテロクロマチック構造によって抑制されます。 同様に、色素中心の全体的な構成は、HP1γ の不活化時にも保存されました。 しかし、現時点では、ヘテロクロマチン状態の全体的な損失を伴わずに、ヘテロクロマチン構造の完全性に対する HP1γ 欠損の影響の可能性を排除することはできません。

結論として、我々の観察は、ユークロマチンとヘテロクロマチンの両方の必須活性に関与するHP1γの恒常性維持機能を示しています。 種全体の組織寿命における HP1 の前述の役割 53,55 は、主にこの多価性に根ざしている可能性があります。 HP1 遺伝子変異と明確に関係しているヒトの病気はないが、ウェルナー症候群や HGPS などの老化促進症候群では HP1 発現の低下が報告されている 56,57,58。 我々は同様に、UC患者およびこの疾患に関連するマウスモデルにおいてHP1発現の強力な低下を確認した。 我々のCbx3 KOマウスモデルから、我々は、HP1γ欠損が、主要な恒常性遺伝子における炎症とスプライシング欠陥の両方を引き起こす異常な経路を支援している可能性があると結論付けた。 同様に、UC結腸組織におけるプロジェリンの検出の増加は、Cbx3 KOマウスで観察されたものと同様に、ラミンAスプライス変異体は「氷山の一角」にすぎず、RNAにおけるより広範な障害を示すものであると推測するように促します。スプライシング精度は UC 患者に耐えられ、PROTECT UC 患者コホートによって明確に示されています。 腸疾患に関してはまだ初期段階にある59,60,61が、慢性炎症を起こした腸におけるRNAスプライシング機能不全に依存するメカニズムの同定は、IBD患者の腸上皮の機能低下についての理解を変えるに違いない。

C57BL/6 Cbx3fl/fl マウス (フランス、モンペリエ、IRCM の Florence Cammas 博士から提供) を Villin-CreERT2 マウス (フランス、パリ、パスツール研究所の Cohen-Tannoudji 博士から提供) と交配して、C57BL/6 Villin-CreERT2 マウスを作製しました。 creERT2:Cbx3-/- マウス モデル (この研究)。 C57BL/6 ヘテロ接合体 LmnaG609G/G609G マウス (ここでは HGPS マウスと呼ぶ) は、Maria Eriksson 博士 (カロリンスカ研究所、スウェーデン) から提供されました。 雄および雌のマウスに、60% 炭水化物からなる標準食餌 (SD) げっ歯類用餌 (2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet、Harlan) を自由に与えました。 動物は、12 時間/12 時間 (午前 8 時/午後 8 時) の点灯/消灯サイクル、温度 22 °C ± 2、湿度 50 ～ 70% の環境下で飼育されました。 20% クリンオレイン酸で希釈したタモキシフェン (0.5 mg/g) を、記載されているように 5 日ごとに 3 回強制経口投与しました 62。 対照マウスには、20%クリンオレイン酸のみを強制経口投与した。 Creリコンビナーゼを発現しないCbx3fl/flマウスを用いた追加の対照も同様にタモキシフェンで処理した。 Villin-creERT2:Cbx3-/- マウス モデルを使用したすべての実験は、生後 2 ～ 3 か月の雄または雌マウスを用いて行われました。 屠殺の１時間前に、ＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ）を動物の体重１ｇ当たり１００μｇで腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。 動物実験は、パリ デカルト大学の倫理委員会によって承認されました (承認番号 17-022)。

すべての患者は消化器科（パリのボージョン病院）で追跡調査されました。 このプロトコルは地元の倫理委員会 (CPP-Ile de France IV No. 2009/17 および No2014-A01545-42) によって承認され、登録前にすべての患者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。 上皮層の抽出を可能にする結腸ピンチ生検は、対照集団の健康な組織との比較を可能にするために、非炎症領域における内視鏡検査中に得られた。 生検は、右結腸または左結腸で、またはがんの場合はがん部位から少なくとも10cm離れたところで行われました。 免疫組織学的研究には、健康対照患者 10 名と UC 患者 16 名を含む 26 名の患者が含まれました (集団の詳細は補足データ 1 に示されています)。 転写研究には、56人の患者が含まれ、17人の健康な対照、19人の結腸病変を有する19人のUC患者および16人のCD患者が含まれた（補足データ12に提供される集団の詳細）。 RNAble (Eurobio) を使用してヒト生検材料から全 RNA を抽出し、ND-1000 NanoDrop 分光光度計 (NanoDrop Technologies) を使用して定量しました。 メーカーの推奨に従って、M-MLV RT (Invitrogen) を使用して、全 mRNA の逆転写を実行しました。

HGPS p.Gly608Gly 変異を保有するヒト皮膚線維芽細胞患者は、Coriell Cell Repository から入手されました。 Caco2 (TC7 細胞、ECACC によって認証) を使用して、CRISPR/Cas9 媒介 Cbx3 細胞株を生成しました。 Cas9 エンドヌクレアーゼを発現する pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) ベクター (Feng Zhang から贈与、Addgene プラスミド # 48138) を、Cbx3 遺伝子用に特別に設計されたシングルガイド RNA (sgRNA) と連結しました。 2 つのシーケンス ガイド (GAAGAAAATTTAGATTGTCC および GAATATTTCCTGAAGTGAA) は、ZiFiT Targeter バージョン 4.2 ソフトウェアによって定義されました。 配列ガイドの挿入は、PX458 ベクターの BbsI 制限部位に実行され、配列決定によってチェックされました。 TC7細胞でのトランスフェクションはリポフェクタミン2000によって実行され、各配列ガイドの単一クローンはGFPシグナルに従ってFACSによって選択されました。 HEK293T でのトランスフェクションは、Flag-V5 タグ付きトマト、SRp20、RBM39、または TRA2β63 用の pLVX 発現ベクター 5 μg と pSG5-HA64 5 μg を使用して、DNA リン酸カルシウム沈殿によって実行されました。

腸 (回腸または結腸) を収集し、4 °C で PBS で洗浄し、約 5 mm の小片に切断しました。 腸の断片をホルマリンを用いて 4 °C で一晩固定しました。 固定後、腸の断片をパラフィンブロックに含めました。 パラフィン切片はミクロトーム Leica RM2125 RTS で厚さ 4 μm で作成されました。 続いて、キシレン（2×10分）、無水エタノール5分、90％エタノール5分、70％エタノール5分、蒸留水（2×5分）への浸漬によりサンプルの脱パラフィンと再水和を行いました。最後に、EDTA 煮沸技術を使用して 95 °C で 30 分間、続いて室温で 20 分間抗原のマスクを解除しました。 すべてのサンプルを、PBS 中の 0.1 M グリシンで 15 分間、PBS 中の 3% BSA で 30 分間順次処理しましたおよびＰＢＳ中の０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を２時間（マウス組織）。 ヌクレオリン染色の場合、組織切片をプロテイナーゼK 0.05 mg/mlとともに室温で1分間インキュベートし、続いてグリシン2 mg/mlで室温で15分間洗浄した。 次に、一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートし、PBS 中の 0.05% Tween-20 で洗浄し、Alexa 488 または Cy3 (Jackson、USA) と結合した特定の二次抗体中で 1 時間、DAPI (1μg) で 15 分間インキュベートしました。 ／ｍｌ）をＰＢＳで洗浄し、退色防止媒体ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でマウントした。 抗 HP1γ (2MOD-IG6、Thermo Scientific)、HP1β (1MOD-1A9、Thermo Scientific)、HP1α (2H4E9、Novus Biologicals)、Ki67 (ab16667、Abcam)、Olmf4 (D6Y5A、Cell Signalling)、BrdU (MA3-071) 、Thermo Scientific）、ラミンB1（ab65986、Abcam）、プロジェリン（13A4DA、sc-81611、Santa Cruz）、γチューブリン（4D11、Thermo Scientific）、およびヌクレオリン（ab22758、Abcam）を一次抗体として使用しました。 核は、4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI、62248、Thermo Scientific) を使用して染色しました。

顕微鏡画像は、ZEISS Apotome.2 (Zeiss、ドイツ) の構造化照明顕微鏡を使用し、63 倍の油 (1.4 NA) 対物レンズを使用して取得しました。 シグナルの重複を避けるために、A488 と Cy3 をそれぞれ検出するために、488 nm と 543 nm で連続励起して画像を取得しました。 画像はZEISS ZEN liteソフトウェアを使用して処理されました。 免疫蛍光シグナルの定量分析は、ImageJ 上で実行されました。 値は、対照サンプルに対する平均蛍光強度で表されます。

この技術は、Nigro et al., 201965 から採用されました。小腸または結腸を収集し、4 °C で PBS で洗浄し、長さ約 5 mm の小片に切断しました。 上皮を分離するために、腸断片を 10 mM EDTA 中で 4 °C で 30 分間インキュベートした後、PBS 中の BSA 0.1% に移し、30 ～ 60 秒ボルテックスしました。 上清（上皮細胞を含む）を70μmセルストレーナーで濾過した。 このステップでは、陰窩はセルストレーナーを通過し、絨毛はその上に保持されました。 次いで、陰窩画分と絨毛画分を別々に遠心分離し、ペレットを処理するまで液体窒素中で凍結させた。 分離の品質は、RNA シークエンシングによって確認されたように、絨毛ではなく陰窩における幹細胞性マーカーの選択的発現によって評価されました。 オルガノイドの産生のために、陰窩ペレットを分解し、記載されているようにマトリゲル中で培養した65。 EdU 染色は、Click-iT™ EdU Cell Proliferation Kit for Imaging (Thermofisher) を使用し、メーカーの指示に従って実施しました。

TC7 細胞では、凍結固定/凍結置換法により透過型電子顕微鏡 (TEM) を実施しました。 細胞を、0.1 M カコジル酸緩衝液中の 3.7% パラホルムアルデヒド、1% グルタルアルデヒドを用いて 4 °C で一晩固定しました。 固定後、細胞をペレットにし、四酸化オスミウム (OsO4) および酢酸ウラニルで対比しました。 次に、細胞を-80℃で少なくとも3日間凍結置換培地に入れ、-20℃で濃度を増加させたメタノール中で脱水し、-20℃でLowicryl K4 Mに包埋し、紫外線照射で重合させました。 超薄切片をニッケルグリッドに載せ、クエン酸鉛と酢酸ウラニルで染色し、JEOL 1011 電子顕微鏡で検査しました。

約５００ｍｍの腸組織断片を、０．１Ｍカコジル酸緩衝液中の３．７％パラホルムアルデヒド、１％グルタルアルデヒドを用いて、４℃で一晩固定した。 小さな組織断片を0.1 M カコジル酸緩衝液で洗浄し、-20 °Cで濃度を増加させたメタノールで脱水し、-20 °CでLowicryl K4 Mに包埋し、紫外線照射で重合させました。 極薄切片をマウントしました。

メーカーの指示に従い、Trizol (TR-118、Molecular Research Center, Inc.) を使用し、DNase 処理を行って全 RNA を抽出しました。 分光光度計 (Nanodrop Technologies ND-1000) を使用して RNA サンプルを定量しました。 第一鎖cDNAは、RevertAIT H Minus第一鎖cDNA合成キット(Thermo Scientific)を使用したRT-PCRによって合成した。 qPCR は、自動化アタッチメントを備えた Mx3005P システム (Stratagene) を使用して実行されました。 報告されているように、マウス プロジェリンおよびラミン A 半定量 PCR では、エクソン 9 および 12 にネストされたプライマーが使用されました (F: GTGGAAGGCGCAGAACACCT R: GTGAGGGGGGAGCAGGTG)。 リアルタイム PCR 増幅では、マウス GAPDH (Mm99999915_g1)、プロジェリンまたは DNA を認識しないマウス ラミン A (アッセイ ID: APGZJEM)、マウス プロジェリン (F: ACTGCAGCGGCTCGGGG R: GTTCTGGGAGCTCTGGGCT) 用に事前設計されたプライマーを使用して TaqMan アッセイを使用しました。 CGCTGAGTACAACCT)。 これらのプライマーとプローブのペアは、cDNA サンプルに対する TaqMan ddPCR アッセイにさらに使用されました。 液滴デジタル PCR (ddPCR) は、プローブ用 ddPCR Supermix (Bio-Rad) を使用して、マウス lmna およびプロジェリンについて前述した TaqMan プローブベースのアッセイを使用して、cDNA サンプルに対して実行されました。 液滴発生器（Bio-Rad QX200）を使用して、反応混合物から液滴を生成した。 PCR増幅は以下のように実施しました：酵素活性化後95℃で10分間（1サイクル）、95℃で20秒間、60℃で40秒間の2ステップを50サイクル、続いて98℃で10分間の酵素失活C. PCR 液滴を自動液滴リーダー (Bio-Rad QX200) で測定しました。 μlあたりの生の転写物数をQuantasoftソフトウェア(Bio-Rad)によって計算した。 各サンプルと転写物について、少なくとも 2 回の反復実験が実行されました。

ヒト cDNA 内のラミン A およびプロゲリンを検出するためのプライマー プローブのペアは次のとおりです: ヒト ラミン A (F: TCTTCTGCCTCCAGTGTCACG R: AGTTCTGGGGGCTCTGGGT およびプローブ ACTCGCAGCTACCG)、ヒト プロゲリン (F: ACTGCAGCAGCTCGGGG R: TCTGGGGGCTCTGGGCTCCT およびプローブ CGCTGAGTACAACCT)、ヒト GAPDH (Hs00266705_g1)。 SYBRGreen (Takara) ベースの qPCR では、以下のプライマーが使用されました: マウス Ascl2 (F: GGT GAC TCC TGG TGG ACC TA; R: TCC GGA AGA TGG AAG ATG TC) マウス Olfm4(F:ATC AGC GCT CCT TCT GTG AT) R: AGG GTT CTC TCT GGA TGC TG) マウス TNF-α (F: GATCTCAAAGACAACCAACATGTG R: CTCCAGCTGGAAGACTCCTCCCAG) マウス IL1-β (F:TACAGGCTCCGAGATGAACAAC R: TGCCGTCTTTCATTACACAGGA) マウス IL6 (F: ACTTCCATCCAGTTGCCTTCTT R: CAGGTCTGTTGGGAGTGGTATC) マウス スクラーゼイソマルターゼ (F: CGTGCAAATGGTGCCGAATA R: TCCTGGCCA TACCTCTCCAA) GAPDH (F: TGACCACAGTCCATGCCATC; R: GACGGACACATTGGGGGTAG) マウス 45 S (F: GAACGGTGGTGTGTCGTT; R: GCGTCTCGTCTCGTCTCACT)。 マウス 18 S: (F: GATGGTAGTCGCCGTGCC; R: CCAAGGAAGGCAGCAGGC)。

マウスの腸組織におけるスプライシングの検証では、MAJIQ パッケージを使用して、Cbx3 KO マウスと Ctrl マウスの間で異なるスプライシングを受けた遺伝子を検出しました。 各サンプルについて、示されたジャンクションをカバーするリード数を使用して、ソース エクソンとターゲット エクソンを含む各ジャンクションの割合を計算し、示されたバリアントのパーセンテージのヒストグラムとして表されました。 スプライシング指数（Δψ）は、Δψ = バリアント 1/(バリアント 1 + バリアント 2) という式を使用して計算され、図 1 および 2 に示すように比率またはパーセンテージとして表されました。 6 つの RNA-seq サンプルを使用して、平均値 (±偏差) とスチューデントの t 検定 (両側) による p 値を計算しました: P < 0.05 (*)、P < 0.01(**)、P < 0.001 ( ***)。 スプライシング検証に使用されるプライマーは、補足情報の補足表 1 として説明されています。

総 RNA は、コントロールおよび小腸 (陰窩および絨毛) および結腸上皮の Cbx3 KO 上皮細胞 (マウスの各グループにつき n = 3、つまり合計 6 × 3 = 18 RNA サンプル) からチオシアン酸グアニジニウム-フェノール- によって抽出されました。メーカーの仕様書に従って、クロロホルム抽出および DNAse 処理。 Total RNA ライブラリの調製とシーケンスは、lncRNA シーケンス サービスとして Novogene Co., Ltd. によって実行されました。これには、rRNA 枯渇を伴う lncRNA 方向性ライブラリの作製 (Ribo-Zero Magnetic Kit)、定量、プールおよび PE 150 シーケンス (30 G 生データ) が含まれます。 Illumina HiSeq 2500 プラットフォーム上。 RNA 配列データのフィルタリングとトリミングにより、サンプルあたり約 2 億 3,000 ～ 3 億リードペアが残されました。

遺伝子発現解析およびディファレンシャル・スプライシング解析は、Novogene Co., Ltd. により、それぞれ DESeq2 (v1.18.1) パッケージ 67 および rMATS (v4.1.0) 68 (パラメーター: --libType fr-firststruct –novelSS) を使用して実行されました。 mm10 マウス参照ゲノム。 潜在的なスプライス部位を評価するために、社内の RNA-seq データと公的に入手可能な Rbm17 KO RNA-seq データ (GEO GSE79020) を Ensembl (バージョン 67) のマウス mm9 アノテーション ファイル上で再調整しました。 PROTECT コホートからの RNA-seq データは、Ensembl のヒト GRCh37/hg19 アノテーション ファイル上で整列されました。 結果の BAM ファイルは、Deeptools (v3.1.3)69 の bamCoverage (パラメータ: --normalizeUsing CPM) を使用して bigwig ファイルを生成するために使用されました。 次に、regtools (https://github.com/griffithlab/regtools) を使用して、注釈付きジャンクションと注釈なしジャンクションの座標を BAM ファイルから取得しました。 6 つの条件のそれぞれについて、WT 条件と KO 条件の両方に存在するジャンクションを除去する前に、3 つの複製からの注釈のないジャンクションをプールしました。 最後に、20 kb を超えるジャンクションが、アラインメントのアーティファクトの可能性としてフィルターで除去されました。 WT サンプルと変異サンプル間で決して共有されなかった残りの接合部は、新規とみなされました。 スプライス部位の強度を定量化するために、エクソンの最後の 3 ヌクレオチドとイントロンの最初の 6 ヌクレオチドを含む DNA 配列を接合部の 5' 末端で回収しました。 接合部の 3' 末端については、イントロンの最後の 20 ヌクレオチドとエクソンの最初の 3 ヌクレオチドの配列が回復されました。 次に、MaxEnt アルゴリズム 69 を使用して、各接合部のスプライス サイトの強度が計算されました。 MaxEnt アルゴリズムは、bedtools スイート (v.2.25.0)70 の「シャッフル」機能を de novo ジャンクションを含むベッド ファイルに適用することによって生成されたランダム化ジャンクションにも適用されました。

LTR エレメントの定量化では、社内 RNA-seq データおよび HP1 トリプル KO RNA-seq データ (GEO GSE119224) を、STAR (v2.6.0b)71 を使用して Ensembl アノテーション (バージョン 95) 付きで mm10 マウス ゲノムにマッピングしました (パラメーター: - -outFilterMismatchNmax 1 --outSAMmultNmax 1 --outFilterMultimapNmax 30)。 さまざまな LTR ファミリーのリード定量化は、Subread スイートの featureCounts (v1.6.1)72 を使用して実行されました (パラメータ: GSE119244 の場合は -s 2、結腸、陰窩および絨毛の場合はパラメータ: -p -B -C -s ​​2)。 LTR ファミリー (ERK、ERV1、ERVL、および ERL-MaLR) は、UCSC mm10RepeatMasker から取得されました。

同じ発現マトリックス (v2.2.2) を使用して GSEA 分析を実行し (-nperm 1000 -permutegene_set -collapse false パラメーターを使用)、陰窩、絨毛、および結腸で ctrl および Cbx3 KO サンプルを比較しました。 分析に使用した転写シグネチャは、lgr5 ISC シグネチャ 73、腸細胞およびパネート細胞シグネチャ 74、および GSEA データベース (MSigDB ホールマーク遺伝子セット) に関する文献から抽出されました。

QIAamp パワー糞便 DNA キット (Qiagen) を使用して糞便サンプルからゲノム DNA を取得し、TECAN 蛍光光度計 (Qubit® dsDNA HS Assay Kit、Invitrogen) を使用して DNA 量を測定しました。 16 S rRNA 遺伝子の V3-V4 超可変領域は、以下のプライマーを使用した PCR によって増幅されました: フォワード 43 ヌクレオチド融合プライマー 5'CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC TAC GGR AGG CAG CAG3 (28 nt イルミナからなる)アダプター (太字)、14 nt の広範囲細菌プライマー 343 F、および 28 nt イルミナ アダプター ( PCR 反応は、10 ng の DNA、0.5 μM プライマー、0.2 mM dNTP、および 0.5 U の DNA フリー Taq ポリメラーゼ、MolTaq 16 S DNA を使用して実行されました。ポリメラーゼ (Molzym)。 増幅は以下のプロファイルを使用して実行されました: 94 °C で 60 秒を 1 サイクル、続いて 94 °C で 60 秒、65 °C で 60 秒、72 °C で 60 秒を 30 サイクル、最後に72 °C で 10 分間のステップ。 PCR 反応は、Illumina Miseq テクノロジーを使用したシーケンスのために @Bridge プラットフォーム (INRAe、Jouy-en-Josas) に送信されました。 単一多重化は、自家製の 6 bp インデックスを使用して実行され、フォワード プライマー (AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC) およびリバース プライマー (CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-index GTGACTGGAGTTCAGACGTGT) を使用した 12 サイクルの 2 回目の PCR 中に R784 に追加されました。 得られた PCR 産物を精製し、メーカーの指示に従って Illumina MiSeq カートリッジにロードしました。 実行の品質は PhiX を使用して内部でチェックされ、その後、以前に統合されたインデックスを利用してシーケンスがサンプルに割り当てられました。 Galaxy インスタンス (https://migale.inra.fr/galaxy) のおかげで、高品質のフィルター処理されたリードがさらに組み立てられ、FROGS パイプライン (Galaxy Solution を使用した Rapidly OTU の検索) を使用して処理され、OTU とそれぞれの分類学的割り当てが取得されました。 各データセットでは、ペアエンド配列の 97% 以上が、フォワード配列とリバース配列間の少なくとも 10 bp の重複を使用して組み立てられました。 次の連続手順には、SWARM を使用したノイズ除去とシーケンスの OTU へのクラスタリング、VSEARCh を使用したキメラ除去が含まれます。 次に、クラスター存在量が 0.005% でフィルターされました。 クラスターの 100% は、silva138 16 S 参照データベースと RDP (リボソーム データベース プロジェクト) 分類子分類割り当て手順を使用して OTU に所属しました。 細菌群集の豊富さと多様性の指標、およびクラスタリングと順序付けは、RStudio ソフトウェアの Phyloseq パッケージ (v 1.19.1) を使用して計算されました 75。 サンプル間のコミュニティ構成の相違は、β多様性指数 (UniFrac および加重 UniFrac 距離行列) を計算することによって定量的に評価されました。 ヒートマップでは、デフォルト パラメーターを備えた DESeq267 を使用して負の二項モデルを各 OTU に適合させ、存在量の対数倍変化 (FC) を推定しました。 P の値は、Benjamini-Hochberg 手順を使用して複数の検定用に補正され、誤検出率を制御し、有意な OTU は効果の大きさに基づいて選択されました (FC > | 2 | 、調整された P 値 < 0.05)。

免疫沈降溶出液は、わずかに修正された FASP プロトコール 76 に従って消化されました。 簡単に言うと、100 mM DTT (ジチオスレイトール) を使用して 60 °C で 1 時間タンパク質を還元しました。 タンパク質を、50 mM ヨードアセトアミド 100 μL とともに室温、暗所で 30 分間インキュベートすることによりアルキル化しました。 サンプルを 2 μL のシーケンスグレード修飾トリプシン (Promega、ウィスコンシン州、米国) で 37 °C で 16 時間消化しました。 15,000×gで10分間の遠心分離によってペプチドを収集し、その後50mM重炭酸アンモニウムで1回洗浄し、真空乾燥した。

MS 分析の前に、ペプチドを 21 μL の 10% ACN、0.1% TFA を含む HPLC グレードの水に再懸濁しました。 各実行では、5 μL を nanoRSLC-Q Exactive PLUS (RSLC Ultimate 3000) (Thermo Scientific、Waltham MA、USA) に注入しました。 ペプチドをμプレカラム (Acclaim PepMap 100 C18、カートリッジ、内径 300 μm x 5 mm、5 μm) (Thermo Scientific) にロードし、50 cm 逆相液体クロマトグラフィーカラム (内径 0.075 mm、Acclaim) で分離しました。 PepMap 100、C18、2 μm) (Thermo Scientific)。 クロマトグラフィー溶媒は、(A) 水中の 0.1% ギ酸、および (B) 80% アセトニトリル、0.08% ギ酸でした。 ペプチドは、5 ～ 40% B (38 分)、40 ～ 80% (1 分) の勾配でカラムから溶出されました。 39 分で、勾配は 4 分間 80% に留まり、43 分で勾配は 5% に戻り、次の注入までの 16 分間カラムを再平衡化しました。 サンプルのキャリーオーバーを防ぐために、各シリーズの間に 2 つのブランクを実行しました。 カラムから溶出するペプチドは、トップ 10 取得法を使用してデータ依存型 MS/MS によって分析されました。 ペプチドは、高エネルギー衝突解離 (HCD) を使用して断片化されました。 簡単に言うと、機器の設定は次のとおりです。速度を上げるために、MS スキャンの分解能は 70,000、データ依存型 MS/MS スキャンの分解能は 17,500 に設定されました。 MS AGC 目標は 3.106 カウントに設定され、最大注入時間は 200 ms に設定されました。一方、MS/MS AGC 目標は 1.105 に設定され、最大注入時間は 120 ms に設定されました。 MS スキャン範囲は 400 ～ 2000 m/z でした。

免疫沈降したタンパク質に対応する生ファイルを、MaxQuant 1.5.5.1 ソフトウェアを使用して Human Uniprot KB/Swiss-Prot データベース 2016-0177 に対して分析しました。 親質量イオンとフラグメントイオンを検索するために、質量偏差をそれぞれ 3 ppm と 20 ppm に設定し、実行間の一致は許可されません。 カルバミドメチル化 (Cys) は固定修飾として設定され、酸化 (Met) と N 末端アセチル化は可変修飾として設定されました。 タンパク質およびペプチドレベルでの誤検出率 (FDR) は 1% に設定されました。 スコアは、前述のように MaxQuant を使用して計算されました 77。 ペプチドは、MaxQuant MS1 シグナル強度に従って定量化されました。 火山プロットを含む統計的および生物情報学的分析は、Perseus ソフトウェア バージョン 1.6.7.0 (www.perseus-framework.org で自由に入手可能) を使用して実行されました。 統計的比較のために、それぞれ 3 つの生物学的複製を含む 2 つのグループ (IP グループとネガティブコントロール) を設定しました。 次に、少なくとも 1 つのグループで 3 回定量されたタンパク質のみを保持しました。 次に、低信号の分布をシミュレートするために、測定値の標準偏差に対して 33% の標準偏差と平均値の 3 標準偏差のダウンシフトをもつ乱数のガウス分布を作成することにより、欠落しているデータ ポイントを埋めるためにデータが代入されました。価値観。 T 検定を実行し、データを火山プロット上に表しました (FDR < 0.05、S0 = 1)。

HEK293T (CRL-1573、ATCC) または HeLa 細胞 (CCL-2、ATCC) を TNEN300:0.1 バッファー (50 mM Tris pH 8、300 mM NaCl、0.1% NP40、1 U/μl RNasin (Promega)、1X) で抽出しました。プロテアーゼ阻害剤（Roche））を氷上で 30 分間、シリンジゲージを通して再懸濁します。 変性クロマチンをピペットで取り出して除去した。 抽出物を 150 mM NaCl に希釈し、半分には 0.2 μg/mL RNaseA (DNase free、Roche) または 0.1 U/μL RNasin を補充しました。 10 cm ディッシュの 4 分の 1 を、トランスフェクトされた HEK293 細胞の場合は 3 μg の抗 V5 抗体、HeLa 細胞の場合は 1.5 μg の抗 SRSF1 抗体により、ホイール上で 4 °C で一晩免疫沈降しました。 複合体は、ホイール上で 4 °C で 2 時間、G プロテイン ダイナビーズ (Dynal) によって回収されました。 ビーズを1 mLのTNEN150:0.1中でホイール上4℃で7分間5回洗浄した後、ローディングバッファー中100℃で10分間変性させた。 タンパク質は SDS-PAGE 基準 4 ～ 12% (Bio-Rad) で分離されました。

マウスから精製した腸上皮細胞（少なくとも n = 3 回の別個の実験）を、25 mM Tris pH 7.5、1 mM EDTA、0.1 mM EGTA、5 mM MgCl2、1% NP-40 を含む緩衝液中で 4 °C で溶解しました。 % グリセロール、150 mM NaCl を加え、4 °C、14,000 rpm で 30 分間遠心分離して除去しました。 タンパク質は SDS-PAGE ゲルで分離され、標準的な手順でニトロセルロース膜に転写されました。 以下の抗体が使用されています: マウス抗プロジェリン モノクローナル抗体 (13A4DA、sc-81611、Santa Cruz、希釈 1/50)、抗 HP1α (2H4E9、Novus Biologicals、希釈 1/100)、HP1β (1MOD-1A9、 Thermo Scientific、希釈 1/100）および HP1γ（2MOD-IG6、Thermo Scientific、希釈 1/100）および γ チューブリン（4D11、Thermo Scientific、希釈 1/2000）抗体。 抗 HA (12CA5、Sigma、希釈 1/1000)、抗 Flag M2 (Sigma、希釈 1/1000)、抗 V5 (Bエチル A190-120A、希釈 1/1000)、抗 SRSF1 (Santa Cruz sc- ３３６５２、希釈１／２５０）抗体、抗ウサギＩｇＧ Ｂｒｉｇｈｔ７００（ＢｉｏＲａｄ、希釈１／５０００）、抗マウスＩｇＧ Ｂｒｉｇｈｔ７００（ＢｉｏＲａｄ、希釈１／５０００）。 ウェスタンブロットシグナルはChemidoc Imaging (Bio Rad)を用いて取得した。

統計分析は、GraphPad Prism ソフトウェアを使用して実行されました。 グループ間の差異は、GraphPad Prism を使用した両側スチューデント t 検定を使用してアッセイされました。 すべての場合において、実験データは t 検定の要件 (正規分布および同様の分散) を満たすと仮定されました。 このような場合、t 検定の仮定が有効ではないため、ノンパラメトリック統計手法 (マン・ホイットニー検定) が使用されました。 3 つ以上のグループ間の差異は、一元配置分散分析によって検定されました。 p 値 < 0.05 を有意であるとみなしました。 エラーバーは平均値の標準誤差を示します。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で生成された RNA-seq データ、派生 mm9.bigwig ファイル、および de novojunction.bed ファイルは、NCBI Gene Expression Omnibus データベースに寄託されており、GEO シリーズ アクセッション番号 GSE192800 を通じてアクセスできます。 プロテオミクス データは、データセット識別子 PXD031580 とともに PRIDE パートナー リポジトリ経由で ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されています。 この研究で生成された 16 S rRNA 遺伝子配列データは、BioProject アクセッション番号 PRJNA803986 から入手できます。

GSE109142 (UC PROTECT コホート)、GSE145309 (マウス ES Crispr KO Zc3h13)、および GSE119244 (HP1α、HP1β、および HP1γ マウス肝臓のトリプル ノックアウト) の RNA-seq 生 fastq ファイルは、NCBI の GEO データベースから取得しました。 PRJNA669300 (Ppil1A99T/A99T KI E14.5 脳) および PRJNA708182 (SRSF5 KO マウス心臓) は、BioProject のデータベースから入手しました。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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Cbx3fl/fl マウスを提供してくださった Florence Cammas に感謝します。 HGPS マウスから MEF を提供していただいた Zhou Zhongjun 博士 (香港大学李嘉誠医学部生化学教室) に感謝します。 Villin-CreERT2 マウス (パスツール研究所、パリ、フランス) を提供してくださった Cohen-Tannoudji 博士に感謝します。 この研究は、«Agence National de la Recherche» (ANR) の助成金 (EPI-CURE、LA による R16154KK) および ANR の「Laboratoire d'Excellence」プログラム (2011 年から 2021 年) である REVIVE (CM による) によって支援されています。

パリ シテ大学、INSERM、CNRS、ネッカー病児研究所、F-75015、パリ、フランス

ホルヘ・マタ＝ガリド、ヤオ・シャン、ユンファ・チャン＝マルシャン、カロリーヌ・ライザッハー、エリザベス・アゲロン、ローレンス・アービベ

プロテオミクス プラットフォーム Necker、パリ大学 Cité-Federative Structure for Necker Research、INSERM US24/CNRS UAR3633、75015、パリ、フランス

アイダ キアラ ゲレーラ

ナノメディシン グループ、Institute Valdecilla-IDIVAL、39011、サンタンデール、スペイン

イニゴ カサフォント

カンタブリア大学医学部、解剖学および細胞生物学部、39011、サンタンデール、スペイン

イニゴ カサフォント

Micalis Institute、国立農業・食品・環境研究所 (INRAE)、AgroParisTech、パリ・サクレー大学、UMR1319、F-78350、ジュイ・アン・ジョザ、フランス

オーレリア・ブルノー & クレール・シェルビュイ

パリマイクロバイオーム医学センター (PaCeMM) FHU、AP-HP、F-75571、パリ、フランス

オーレリア・ブルノー & クレール・シェルビュイ

UMR-S 1149、パリ シテ大学、Inserm、炎症研究センター、腸炎症チーム、F-75018、パリ、フランス

ザビエル・トレトン、アンヌ・デュメイ、エリック・オジェ＝ドゥニ

パリ IBD センター、アンブロワーズ パレハルトマン私立病院センター、ヌイイ、フランス

ザビエル・トレトン

INSERM 1242 および Centre Eugene Marquis、レンヌ、フランス

エリック・オジエ・デニス

ソルボンヌ大学、パリ・セーヌ生物学研究所 (IBPS)、CNRS 生物学的適応と老化ユニット (B2A)、ヒト疾患におけるエピジェネティクスと RNA 代謝、75005、パリ、フランス

エリック・バチェ、ミカエル・コスタラット、クリスチャン・ムシャール

カロリンスカ研究所、革新的医療センター、生物科学および栄養学科、SE-141 57、ハッディンゲ、スウェーデン

グワディス・レヴェション & マリア・エリクソン

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JM-G. ほとんどの実験を設計して実行し、論文の執筆に参加しました。 YX はスプライシングと YC-M に関する実験を行いました。 HGPS マウスについて。 CRは、マウスCbx3 KOおよびIBD患者に対してQPCR実験を実施した。 EA は免疫蛍光研究を実施しました。 ICG はプロテオーム解析を実施しました。 IC は EM データを作成し、AB は微生物叢分析のために DNA 抽出と PCR を実行しました。 CC は 16 S シーケンスから微生物叢分析を実行しました。 XT、EOD は医療報告書と臨床サンプルを提供し、AD は患者の cDNA と QPCR データを提供しました。 EB はスプライシング、ddPCR の実験を設計、実行、解釈し、論文の執筆に参加しました。 MC は、マウス モデルと UC 患者からの RNA-seq データに対してほとんどのバイオインフォマティクスを実行しました。 GR と ME は HGPS マウスを提供しました。 CM は、スプライシングを探索するバイオインフォマティクスを設計し、論文の執筆にも参加しました。 LA はこのプロジェクトを発案し、研究を監督し、論文を執筆、編集しました。

ローレンス・アービブへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Mata-Garrido, J.、Xiang, Y.、Chang-Marchand, Y. 他ヘテロクロマチンタンパク質 1 は、潰瘍性大腸炎では RNA スプライシング精度が低下する調節因子です。 Nat Commun 13、6834 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-34556-3

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受信日: 2022 年 1 月 24 日

受理日: 2022 年 10 月 27 日

公開日: 2022 年 11 月 18 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34556-3

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