尿路病原性大腸菌感染症

Microbiologia della natura, volume 8,

Nature Microbiology volume 8、pages 875–888 (2023)この記事を引用

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388 オルトメトリック

メトリクスの詳細

過去に尿路感染症（UTI）を経験していると、将来の感染症にかかりやすくなる可能性があります。しかし、再発に影響を与える根本的なメカニズムはほとんど理解されていません。我々は以前、マウスの尿路感染症が疾患の転帰に応じて膀胱上皮（尿路上皮）の差次的リモデリングを引き起こし、それが再発性尿路感染症に対する感受性に影響を与えることを発見した。今回我々は、治癒または慢性の尿路病原性大腸菌（UPEC）感染歴のあるマウスから単離した尿路上皮幹細胞（USC）株を比較し、クロマチンのアクセス可能性、DNAメチル化、ヒストン修飾の違いなどのエピジェネティックな変化に関与する分子インプリンティングの証拠を解明した。。慢性感染マウスの USC におけるエピジェネティックマークは、UPEC 感染時のカスパーゼ 1 媒介細胞死を増強し、細菌の排除を促進します。 Ptgs2os2 発現の増加も起こり、シクロオキシゲナーゼ-2 発現の持続、膀胱炎症および粘膜損傷（重度の再発性膀胱炎に関連する反応）に寄与する可能性があります。したがって、UPEC感染は、尿路上皮エピゲノムを再プログラムするエピ突然変異誘発物質として作用し、尿路上皮固有のリモデリングとその後の感染に対する先天的反応の訓練を引き起こす。

尿路感染症 (UTI) は世界中で最も一般的な細菌感染症の 1 つであり、健康な女性の罹患率の重大な原因となっています 1,2。感受性の高い人では再発率が高いため、治療は困難であり 3、尿路感染症を発症する最も強力な危険因子の 1 つは、以前に尿路感染症を患ったことです 2。再発性尿路感染症（rUTI）の生物学的根拠はほとんど理解されていません。

抗生物質による治療がなければ、ヒトの急性尿路感染症は自然に治癒するか、長期にわたる慢性感染症に発展します4。 C3H/HeN マウスを尿路病原性大腸菌 (UPEC) に感染させると、これら 2 つの結果が再現されます。これらのマウスの慢性膀胱炎は、慢性炎症を伴う持続的な高力価細菌尿（尿中の細菌）（感作マウス）として定義され、感染症の消散は消散マウスと定義されます5。治癒し、感作されたマウスの膀胱を分析すると、感染がrUTIに対する感受性に影響を与える示差的な膀胱リモデリングを引き起こすことが明らかになりました。回復したマウスは rUTI に対して耐性があります。その理由の 1 つは、感染と粘膜の治癒を急速に促進する、一過性の膀胱 TNFα/シクロオキシゲナーゼ 2 (Cox-2) 反応が促進されるためです 6、7、8。感作マウスはチャレンジ時に rUTI に対して非常に感受性が高く、膀胱 TNFα と Cox-2 の強力な持続発現により、膀胱上皮 (尿路上皮) を通過する好中球遊走と粘膜損傷を引き起こし、重度の再発性細菌感染を促進します 6,7,8。したがって、病歴に応じて、膀胱組織はrUTIに対する感受性を増加または減少させる形で異なって再構築される。

これらの表現型は、膀胱粘膜のリモデリングが、その後の感染に対する膀胱粘膜の防御に影響を与える尿路上皮幹細胞（USC）のエピジェネティックな変化によって部分的に媒介されるという我々の仮説につながりました6,7。したがって、我々は、さまざまな病歴を持つマウスの膀胱から上皮細胞を単離し、初代USC株を確立し、細胞培養で増殖させ、in vitroで極性化して完全に分化した尿路上皮を形成しました。これは、in vivoで観察される尿路上皮リモデリング表現型に類似した形態学的表現型を示しました6。。われわれは、USC 株におけるクロマチンのアクセス可能性、DNA メチル化、およびヒストン修飾の違いを特定しました。これらは、rUTI 感受性に影響を与えるプログラム細胞死およびシクロオキシゲナーゼ 2 (Cox-2) によって制御される炎症反応に影響を与える転写反応の違いと対応していました。全体として、我々の研究は、粘膜細菌感染によって引き起こされる上皮固有の訓練された免疫のエピジェネティックな証拠を提供しており、この免疫は、元の疾患の結果に応じて、その後の感染に対する膀胱粘膜の反応を変化させます。この所見は、rUTIの有病率の高さを説明する可能性があり、一般に慢性/再発性細菌感染症に対する重要な治療的意味を持つ可能性がある。

以前の感染から生じる尿路上皮固有の変化を研究するために、我々は三次元（3D）培養9,10における初代腸上皮幹細胞のin vitro増殖方法を、生後8週間のナイーブマウスから単離された初代USCを培養するために適応させた。 C3H/HeN マウス (図 1a および拡張データ図 1a)。形質転換関連タンパク質 63 (p63) をコードする p63 の遺伝子発現は幹細胞の増殖能力に必須であるため 11、Wnt の標的遺伝子 10 である Axin2 の発現は Wnt を評価するために測定されました。 3D培養におけるシグナル伝達活性。同時に、RT-qPCR でこれらの遺伝子の発現をモニタリングすることで、幹細胞の多能性状態を評価できます (拡張データ図 1b、c)。 p63 および Axin2 遺伝子の発現は、多能性を維持するために必要な 50% パーセントの馴化培地 (CM) での 3D 培養の最初の 3 日間を通じて高いままでした。その後、p63 および Axin2 の発現は、感染後 3 日目に細胞を 50% CM でインキュベートしたか、5% CM でインキュベートしたかに関係なく、感染後 5 ～ 7 日で減少しました。これは、培養延長または CM パーセンテージの低下のいずれかが Wnt シグナル伝達を低下させる可能性があることを示しています。。ただし、分化した尿路上皮細胞によって発現される表面タンパク質であるウロプラキン 3a (Upk3a) は、感染後 7 日目に測定したように、5% CM で増殖させた細胞でのみ有意に増加し、50% CM では増加しませんでした (拡張データ図 1d)。。 USC を 50% CM で数継代増殖させ、さらに 50% CM で 5 日間培養した後、すべての細胞が上皮細胞マーカー E-カドヘリンおよび基底尿路上皮細胞マーカーケラチン 5 (K5) について陽性に染色されましたが、Upk3a 発現は欠如していました (拡張データ図 1e)。対照的に、最初の増殖後、3D培養で0％CMで5日間培養すると、中央空洞の形成を伴う上皮極性の発達が生じました（拡張データ図1e）。得られた嚢胞内では、空洞に面した細胞は表層面様細胞 (Upk3a+、K5-) に分化しましたが、マトリゲルマトリックスと接触している周囲細胞は基底細胞様でした (Upk3a-、K5+)。

a、8週齢のC3H/HeNマウスから単離したUSCを、ROCK阻害剤であるY-27632およびTGFβ1型阻害剤であるSB431542を含む50％L-WRN馴化培地（CM）を含むマトリゲル中での球状培養により増殖させた。。 3 日間のスフェロイド培養後、細胞を単一細胞懸濁液に解離させ、3 ～ 4 × 105 個の細胞をトランスウェル膜に播種しました。細胞を 50% CM で 3 ～ 5 日間培養し、その後、完全に分化するまで 5% CM で 2 ～ 3 週間培養しました。 b, TER 値が 4,000 オーム × cm2 を超える細胞培養物を分析しました (1 つの幼若 C3H/HeN 細胞株から培養した 5 つのトランスウェル)。一貫性を保つために、培地交換の 1 日後に TER を測定しました。 c、d、トランスウェル上の分化した尿路上皮を固定し、（c）共焦点顕微鏡および（d）SEMを介して画像化し、倍率500倍（上のパネル）および10,000倍（下のパネル）で尿路上皮のトップダウンビューを示しました。 cでは、サンプルをF-アクチン、最終分化マーカーK20および核（DAPI）について染色しました。 e-h、尿路上皮もパラフィン包埋され、切片化され、ヘマトキシリンおよびエオシン（H&E）で染色され（e）、K20、EcadおよびDAPI（f）、Upk3a、p63およびDAPI（g）またはK5、K14およびDAPIについて免疫染色されました。 DAPI (h)。代表的な画像を示します。データは、5 匹の異なる幼若 C3H/HeN マウスからの USC を使用した 2 ～ 3 回の独立した実験からのものです。

ソースデータ

次に、幼若C3H / HeNマウスのUSCを分極した重層尿路上皮関門に分化させるためのトランスウェル培養システムを確立しました（図1a）。 5637 ヒト膀胱癌細胞株 (ATCC HTB-9) は、UPEC と膀胱細胞の相互作用の in vitro 研究に広く使用されており、基底膀胱癌細胞に由来します 12 を対照として使用しました。 5637 細胞と初代 USC はどちらも基底細胞由来であるため、トランスウェルに播種して 2 ～ 3 週間培養し、細胞分化の表現型を比較しました。初代USCによる無傷の分化した尿路上皮（本明細書では分化型尿路上皮（または尿路上皮）と呼ぶ）の形成は、堅牢な経上皮電気抵抗（TER）（図1b）、最終分化のための大きな六角形の表面細胞の強力な共焦点染色によって確認されたマーカーK20（図1c）、および組織表面上の細胞接合部とウロプラキンプラークの存在（図1d）、表在性小面細胞が無傷の膀胱組織の表面にどのように現れるかに似ています6。分化した尿路上皮切片の顕微鏡分析により、マトリゲル膜上の基底層細胞でp63、K5、およびK14が発現している多層極性上皮（Ecad +）組織層（図1e〜h）が明らかになりました（大部分がK5 + / K14 +、いくつかのK5 + /一部の中層細胞における K14-)、p63、および弱い Upk3a 発現は中間細胞を示し、頂端層細胞表面の強い K20 および Upk3a 染色は最終分化した表層細胞を示します。まとめると、尿路上皮の基底層、中間層、表層におけるこれらの分化特性の分布は、マウスおよびヒトの膀胱組織で観察された分布と一致しています 13。対照的に、これらの特徴はいずれも観察されませんでした 5637 細胞トランスウェル培養では、細胞は細胞の深さ 4 ～ 6 層に緩く詰め込まれていましたが、分極や細胞接合形成の証拠はありませんでした（拡張データ図 2a ～ d）。したがって、原発性 USC は、尿路上皮の研究において腫瘍細胞株に比べて重要な利点を提供します。

われわれは、rUTI のマウスモデル 5,6 を用いて、最初の UTI 事象が、rUTI に対する感受性に影響を与える、尿路上皮の構造的およびプロテオーム変化を含む長期にわたる膀胱リモデリングを引き起こすことを示しました 14。膀胱リモデリングにおけるUSCの役割を調査するために、我々は回復期マウス（抗生物質投与開始から4週間後）、自己消失感染症（回復）マウスと慢性感染症を発症したマウス（感作）の両方から膀胱USCを単離した。対照としての年齢を一致させたナイーブマウスおよび確立されたUSC系統からのものと同様（感染歴あたりn = 4）（図2a、b）。これらの USC 株をそれぞれ 15 ～ 30 継代増殖させ、トランスウェルで分化させ、2 ～ 3 週間の培養後に顕微鏡で各細胞株の特徴を調べました。驚くべきことに、感作された USC 由来の尿路上皮は、ナイーブおよび USC 由来の分化尿路上皮と比較した場合、表面細胞が小さくなったり、最終分化マーカーである Upk3a および K20 の発現が減少したりするなど、多くの継代を経た後でも、以前に in vivo 6 で観察された形態学的差異の多くを再現していることがわかりました。解決された USC (図 2c–e)。表面細胞サイズの自動測定により、感作された分化尿路上皮の頂端細胞は未処理の分化尿路上皮のものよりも大幅に小さいことが示されましたが、解決された尿路上皮は中間の表現型を有し、生体内データと一致しています（図2f-g）6。まとめると、これらのデータは、USC のトランスウェル培養が、インビボで見られる形態学的膀胱上皮リモデリング表現型を再現できることを示しています。

ａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスにおける１０８ｃｆｕのＵＴＩ８９ＫａｎＲによる初回感染および回復期の時間経過。 b、4 wpi にわたる代表的な尿細菌力価の時間経過。水平線は、顕著な細菌尿のカットオフ値を表します: 104 cfu ml-1。ナイーブマウス、回復マウス、感作マウスを N1-4、R1-4、および S1-4 と命名しました。 c、d、これらのマウスから単離されたUSCは、トランスウェル上で分化した尿路上皮に培養され、固定され、共焦点顕微鏡（c）およびSEM（d）によって画像化されました。 cでは、尿路上皮をK20、F-アクチン（ファロイジン）および核（DAPI）について染色しました。 e、トランスウェルはパラフィン包埋され、切片化され、Upk3a、E-カドヘリンおよび核について免疫染色されました。白い矢印は細胞接合部を示し、表面細胞のサイズを示します。 f、g、ナイーブマウス、分解マウス、および感作マウスの44個のトランスウェル（それぞれn = 4、3、4マウスからのn = 16、12、および16個のトランスウェル）から処理した固定スライドを、K20、E-カドヘリンおよび核について染色し、標識したそして二重盲検法で画像化した。次に、Fiji ImageJ マクロプログラムを使用して表面細胞サイズを自動的に測定し、トランスウェルあたりの平均細胞サイズ (f) と個々の細胞サイズ (g) をプロットし、95% CI の中央値として表しました。両側スチューデント t 検定を使用して有意性を決定し、有意な場合には P 値を示します。

ソースデータ

我々のデータは、過去の感染により、何世代もの細胞培養にわたって遺伝するUSC固有の変化を引き起こすことを示しています。したがって、我々は、これらの変化は、(1) 病歴、および (2) クロマチンアクセスのゲノム全体にわたる差異に関連する USC における異なるエピジェネティック修飾によって媒介されると仮説を立てました。クロマチンのアクセス可能性は、シーケンスによってトランスポザーゼにアクセスできる核クロマチンの領域をシーケンスする技術である Omni-ATAC-seq によって測定されました 15。我々は、ナイーブUSC系統、分離USC系統、および感作USC系統のそれぞれ2つの生物学的複製において、合計59,801、63,195および82,030の再現性の高いアクセス可能なクロマチン領域を同定した。これらのUSC系統の主成分分析（PCA）により、感作されたUSCを他のグループから分離します（図3a）。感作USCと解像USCの間で同定されたクロマチンの2,880のディファレンシャルアクセス領域(DAR)のうち、925領域が感作-アクセス可能なDAR(解像より感作の方がアクセスしやすい)であり、1,955領域が解像-アクセス可能なDAR(感作より解像の方がアクセスしやすい)である。 (図3b)。

Omni-ATAC-seq は、ナイーブマウス、分解マウス、および感作マウスの USC を使用して実行されました (細胞株 N1、N3、R1、R4、S1、および S2、それぞれ個々のマウスから)。 a、USC ラインにわたる DAR の PCA プロット。 b, 感作 USC と分解 USC を比較した、有意に異なるピーク (FDR < 0.05) のヒートマップ。全 2,880 の DAR のうち、925 の領域は感作されたアクセス可能な DAR であり、1,955 の領域は解決されたアクセス可能な DAR です。 c. 増感アクセス可能な DAR の上位 15 の強化された GO ターム (n = 747、倍率変化 > 1.5、FDR < 0.05) を GREAT を使用して分析しました。有意性は二項検定を使用して決定されました。 d、e、さまざまなUSCにおけるクロマチンアクセス可能性、DNAメチル化、活性ヒストン修飾、H3K27AcおよびH3K4Me3の違いを、ATAC-seq、全ゲノム亜硫酸水素塩シーケンシング（WGBS）およびCUT&RUNによって評価しました。 d、ナイーブUSC、解決済みUSC、および感作USCの中の感作特異的DMR（n = 189）は、DNAメチル化、ATAC、および活性ヒストン修飾H3K27AcおよびH3K4Me3について各DMRと重複するエピジェネティックランドスケープを表示する一連のヒートマップとして視覚化されます。 e、WGBS、ATAC、H3K27Ac、およびH3K4Me3の感作特異的低DMR（n = 183）の上流5 kbおよび下流5 kbの平均シグナルを各細胞株で視覚化します。 DMR の平均長は 362 塩基対です。 DMR は、DMR の「開始」と「終了」によってサイズが調整され、灰色のバーで示されます。 f、感作特異的低DMRには、ゲノム内の予測された位置に従って注釈が付けられました（n = 183）。 g、異なる細胞株のクラスタリングを示すすべてのDMR比較のPCAプロット。 h. 感作された低 DMR の上位 15 の強化された GO 用語が、GREAT を使用して分析されました (n = 183)。

ソースデータ

GREAT16を用いたDARの遺伝子オントロジー（GO）経路解析により、感作されたアクセス可能なDARに関連する遺伝子が、プログラム細胞死（PCD）、酸化ストレス、免疫応答を含む多くの生物学的プロセスに対して強力に濃縮されていることが明らかになりました（図3c）。これらの DAR の多くは、Casp1 および Gsdmc2/3 (補足表 1) を含む PCD 経路関連遺伝子に近接していました。これらは、膀胱全体の RNA 配列および ex vivo 尿路上皮プロテオミクスの感作対消失の比較の両方で豊富であることが以前に判明しています。マウス6、8。 HOMER17を使用してモチーフ発見分析を実行したところ、解決されたアクセス可能なDARには、サイトカインシグナル伝達の下流にあることが多い、ストレス応答の既知のメディエーターであるAP-1ファミリーメンバーの転写因子（TF）結合モチーフが非常に豊富であることがわかりました（拡張データ図） .3a)。対照的に、感作されたアクセス可能なDARには、AP-1ファミリーのTF結合モチーフだけでなく、SOXファミリーメンバーのEHF、Klf5、RUNX2など、幹細胞の運命や組織の分化と発生を調節するモチーフも豊富に含まれています（拡張データ図） .3b)。

クロマチンのリモデリングは、DNA メチル化とヒストン修飾という 2 つの主なメカニズムを通じて行われます。 USC 系統における DNA メチル化とヒストン修飾のゲノムワイドプロファイリングを、それぞれ WGBS18 と CUT&RUN19 を使用して実行しました。 CUT&RUN では、ヒストン修飾マークに対する抗体を選択しました:H3 リジン 4 トリメチル化 (H3K4Me3)、H3 リジン 27 アセチル化 (H3K27Ac)、および H3 リジン 27 トリメチル化 (H3K27Me3)。これらは、活性プロモーター、活性プロモーター / エンハンサー、およびポリコーム抑制に関連します。それぞれ20．示差的にメチル化された領域 (DMR) のほとんどは、感作された USC と (1) ナイーブまたは (2) 分解された USC のいずれかとの比較で同定されました。ナイーブ群、回復群、感作群の間で DNA メチル化の全体的な差異は観察されませんでした (拡張データ図 4a、b)。感作特異的DMRは、ATAC-seqおよびCUT&RUNピークとともにヒートマップとして表示され、これらのDMR全体のエピジェネティックな状況を視覚化します（図3d）。我々は、感作特異的DMRは、ナイーブおよび回復したUSCと比較して低メチル化（低DMR）する傾向があることを発見した（図3d）。 DNA メチル化は、転写因子の結合を阻害することにより遺伝子発現を低下させる可能性があり、ヌクレオソームの占有に影響を与える可能性があり、その結果、クロマチンがアクセスしにくくなります 21。一致して、感作されたUSCの低DMRは、対応するATAC-seq、H3K4Me3およびH3K27Acシグナルの増加を示し（図3d）、これらの領域が活性なプロモーターおよびエンハンサーのマークが豊富であることを示唆しています。感作特異的低DMRの周囲のゲノム領域（+/- 5 kb）の平均シグナルを見ると、ナイーブUSCおよび解決済みUSCと比較して、同様の低メチル化パターン、クロマチンアクセシビリティの増加、および活性ヒストンマークの増加が見られました（図1）。 3e)。ただし、抑制性ヒストン修飾 H3K27Me3 は、感作特異的 DMR と相関していませんでした (拡張データ図 5a、b)。感作特異的低DMRは、プロモーター、エクソン、イントロンなどの遺伝子特徴とより関連しています（図3f）。すべてのDMRのPCAプロットにより、感作されたUSCがナイーブおよび解決されたUSCから分離されました（図3g）。感作特異的低DMRのGO経路分析により、免疫応答および細胞間接着関連経路の濃縮が示されました（図3h）。したがって、USCは、最初の感染結果に基づいて異なり、異なるDNAメチル化と活性なヒストン修飾によって媒介される、以前のUPEC感染のエピジェネティックな記憶を維持しています。

次に、ナイーブUSC、分離済み、感作済みUSCのRNA-seqを実行し、それらのエピゲノムの変化が差次的な遺伝子発現をもたらすかどうかを調査しました。年齢差の比較対象として、若年性のナイーブな USC を含めました (図 1)。再び、すべてのDEGのPCAは、主成分（PC）1に沿って感作されたUSCを他のグループから分離します（図4a）。感作USCは、ナイーブUSCおよび消失USCと比較して、それぞれ108個および73個の発現差のある遺伝子（DEG）を有しており（拡張データ図6a、b）、そのうち40個の遺伝子が両方の比較に共通でした（図4b）。上位 15 DEG には、グルタチオントランスフェラーゼ遺伝子 Mgst1 および Mgst3 が含まれていました (図 4b)。未感作および回復したUSCと比較して、感作されたUSCで強化された経路には、反応性酸化種（ROS）、核内受容体シグナル伝達および幹細胞多能性に対する保護に関連する経路が含まれます（拡張データ図6c、d）。対照的に、解決された USC とナイーブ USC の間で差次的に発現される遺伝子はありませんでした。若年ナイーブUSCは主にPC2に沿って成人ナイーブUSCから分離されましたが（図4a）、この比較では8つの有意なDEGのみが明らかになりました（拡張データ図7a）。 PCAバイプロットは、Znfx1およびLy6eを含む遺伝子がPC1に強い影響を与える一方、Kank1およびKrt1を含む遺伝子がPC2に強い影響を与えることを示しています（拡張データ図7b）。

RNAは、（a、b）未分化の若年ナイーブ、成人ナイーブ、分解および感作されたUSC（14匹のマウスからのn = 3、n = 4、n = 4、n = 3の細胞株）、または（c〜f）から単離されました。 UPEC感染の有無にかかわらず、ナイーブ、分解、および感作された細胞（N3、R3、およびS3の異なる培養物）の分化した尿路上皮をRNA-seqおよび示差解析によって分析します。 a, 有意に差次的に発現された遺伝子による USC RNA-seq の PCA は、サンプルが細胞株によってクラスター化されていることを示します (以前の感染結果)。 b、40 個の発現差のある遺伝子 (DEG) が、感作 USC とナイーブ USC、および感作 USC と回復 USC の間で重複していました。重複する上位 15 個の DEG が表にリストされています。 c、分化型尿路上皮RNA配列のPCAは、細胞株（以前の感染結果）および二次感染状態によるクラスター化を示します。 d、疑似感染した感作尿路上皮と解離分化尿路上皮を比較したボルケーノプロット。 FC >0.5、Padj <0.05 の DEG は赤い点で示されます。 e. 経路解析を使用して、分離された分化した尿路上皮と比較して、偽感染した感作された尿路上皮において差次的に発現された遺伝子が豊富な生物学的経路を評価した。有意性は右尾フィッシャーの直接確率検定を使用して決定され、Padj < 0.05 は有意に濃縮された経路とみなされます。 IPA によって強化された特定の経路から、Z スコア > 2 および –log(P 値) > 4.2 を持つ選択された経路が示されています。疑似感染とＵＰＥＣ感染の分化した尿路上皮の間で重複する経路（拡張データ、図８ｄ）に下線が引かれている。 f、模擬感染したナイーブ、分解および感作された分化尿路上皮において差次的に発現されるプログラム細胞死関連遺伝子を示すヒートマップ。 DEG の有意性は、Wald 検定を使用して決定され、その後調整された P 値に対して Benjamini-Hochberg FDR を使用する複数の検定補正が続きました。

ソースデータ

感作されたUSCでは多数のエピジェネティックな変化が見られるにもかかわらず、USCを幹細胞促進条件下で培養した場合にはほんの数個のDEGしか観察されず、我々が発見したエピジェネティックな変化が細胞分化時の遺伝子発現に大きな影響を与える可能性があることを示唆している。したがって、UPEC感染の有無にかかわらず、分化した尿路上皮のRNA-seqを実行しました。すべてのDEGのPCAは、偽感染した分化尿路上皮の転写プロファイルが感染歴によって分離されていることを示し（図4c）、以前の感染歴による分化尿路上皮の本質的な違いを示しています。感染は主に各細胞株のPCAプロットに均一なシフトを引き起こし（図4c）、おそらく各回復期におけるUPEC感染に対する保存された転写応答を反映しています（拡張データ図8a）。注目すべきことに、Cox-2をコードする遺伝子であるPtgs2の発現は、最近のin vivo研究と一致して、ナイーブと比較して、感作および消失した尿路上皮の感染時により高度に誘導された(拡張データ図8b)。疑似感染した感作尿路皮と分解分化尿路皮の間の遺伝子発現の差異を火山プロットで視覚化し（図4d）、DEGの経路分析を実行しました（図4e）。感作された分化尿路上皮は、UPEC感染とは独立して、解決された分化尿路皮と比較して、PTENシグナル伝達、PPARɑ/RXRɑおよびグルタチオン媒介解毒経路の活性化を示しました（図4eおよび拡張データ図8c、d）。 DEG のいくつかは、Klf4 および Klf5 を含む TF 遺伝子であり (拡張データ図 9)、これらの遺伝子が、他の細胞型と比較して、感作尿路上皮細胞における独特のエピジェネティック変化の推進および維持に役割を果たしている可能性があることを示唆しています。

感作されたアクセス可能なDARにおけるPCD経路を示唆するGO経路解析データ（図3c）と、再構築された感作尿路上皮がUPEC感染時の重度の剥離とCox-2炎症依存性の粘膜損傷を特徴とするという生体内観察に基づいて、6 PCD 経路に関与する DEG を調べた。遺伝子発現のヒートマップは、PCD経路に関連する多くの遺伝子が、感作および解決された分化尿路上皮において相互に、また成人のナイーブ分化尿路上皮と比較して差次的に発現されたことを示しています（図4f）。 Casp1（疑似感染感作尿路上皮と消失尿路上皮を比較した場合、最も高度に上方制御された遺伝子（補足表2））および他のパイロトーシス関連遺伝子（Aim2、Gsdmc2、およびGsdmc3を含む）は、感作分化尿路上皮で上方制御されましたが、他のパイロトーシス関連遺伝子は、分解された分化した尿路上皮では、アポトーシスおよびネクロトーシスに関連する遺伝子（Naip など）およびアポトーシスおよびネクロトーシス関連遺伝子が上方制御されており、分解および感作された細胞は UPEC 感染中に異なる PCD 機構に影響されやすいことが示唆されています。

次に、プロモーター部位のDMRに焦点を当てて、USCのDNAメチル化の違いが、感作USCと消失USCの間の分化した尿路上皮のRNA配列倍数変化と相関するかどうかを調べました（図5a）。 Casp1 や Ptgs2os2 (シスでは Cox-2 発現の正の制御因子、トランスでは炎症反応促進制御因子) を含むほとんどの遺伝子は、相対的な遺伝子発現とその遺伝子のプロモーター部位での DNA メチル化レベルとの間に負の相関関係を示しました (図 1)。 5a)。 WashUエピゲノムブラウザを使用して、Casp1およびPtgs2os2遺伝子座でクロマチンアクセス可能性、DNAメチル化およびヒストン修飾マークを視覚化しました（図5b、c）。感作された USC の Casp1 および Ptgs2os2 プロモーター遺伝子座は、それぞれ比較的低メチル化されていますが、ナイーブおよび解決済み USC と比較して、活性ヒストンマークである H3K4Me3 および H3K27Ac も豊富です（図 5b、c および拡張データ図 10a）。 Sox および AP-1 ファミリーのメンバー (Klf5、ETS、および RUNX2) など、感作されたアクセス可能な DAR が豊富に含まれるいくつかの TF (拡張データ図 3a) は、エピゲノムに示されているように、Casp1 プロモーター付近に結合部位を予測しています。ブラウザマップ (拡張データ図 10b)。 RT-qPCRによるCasp1発現は、UPEC感染とは無関係に、回復またはナイーブUSCと比較して、感作分化型尿路上皮において約1,000倍高かった（図5d）。一致して、免疫ブロット染色は、回復期感作マウス尿路上皮の以前のex vivoプロテオミクスと一致して、感作された分化した尿路上皮でのみ検出可能なカスパーゼ-1を示しました（図5e）。

a、プロモーター領域の 1 kb 以内に見出されるそれらの DMR について、感染あり (y 軸、濃い紫色の点) または感染なし (y 軸、灰色の点) のいずれかの分化型尿路上皮の感作対解離を比較した RNA 配列倍率変化を DNA メチル化に対してプロットしました。感作された USC と消失した USC 間の差 (x 軸)。 b、c、異なるUSC系統のCasp1（b）およびPtgs2os2（c）遺伝子座におけるクロマチンアクセス可能性（ATAC-seq）、DNAメチル化（WGBS）、および活性ヒストン修飾（H3K4me3およびH3K27ac）の違いは、以下を使用して組み合わせたトラックとして視覚化されました。 WashU エピゲノムブラウザマップ。 WGBS データでは、Casp1 および Ptgs2os2 プロモーター部位 (赤いボックス) の平均メチル化率が示されています。カラーバーはメチル化%を表し、灰色の背景はCpGを表し、黒色の線は配列深度を示します。 Casp1 および Ptgs2os2 プロモーター領域内の CpG は、それぞれ 8 ～ 25 倍および 18 ～ 23 倍のリードカバレッジを持っています。 d、分化した尿路上皮におけるCasp1の遺伝子発現はRT-qPCRによって測定されました（n = 4、4、4、5、4、4のサンプルからのデータは、PBSまたはPBSまたはUTI89はそれぞれ、平均値±標準偏差として表されます。 e、2つの異なる細胞株（N2、R2、S2およびN3、R3、S3）を使用したカスパーゼ-1のタンパク質発現をウェスタンブロットによって評価し、N3、R3、およびS3を示します。 f、UTI89感染の4時間後の分化した尿路上皮の細胞死をLDHアッセイによって測定した。データは、条件ごとに、成人ナイーブ、分解および感作された分化尿路上皮細胞、2 ～ 3 の生物学的に独立した細胞株から生成された n = 7、10、14、8、10、4、6 サンプルから得られた平均値 ± SD です。それぞれPBSまたはUTI89のいずれかに感染。有意性は一元配置分散分析 (ANOVA) で決定されました。 g、h、ナイーブマウス、回復および感作マウスを、107 cfuのWT UTI89 (HlyA+)またはUTI89ΔhlyAでチャレンジした。データは 2 ～ 3 回の独立した実験から得られたものです。 g、6 hpiでの膀胱細菌量（UTI89またはUTI89ΔhlyAのいずれか107 cfuでチャレンジした、それぞれn = 10、7、19、8、14、11匹の成体ナイーブマウス、回復マウス、および感作マウス）を2〜3回の独立した実験にわたって調べた。バーは中央値を示し、有意性を決定するために両側マンホイットニー U 検定が使用されました。 h、28 dpi での慢性膀胱炎の発生率。両側フィッシャーの正確検定。 P 値は有意な場合に示されます。

ソースデータ

我々の以前の研究では、UPECによって一般的に産生される、分泌された孔形成細菌毒素α溶血素（HlyA）が、ヒトおよびマウスの尿路上皮においてカスパーゼ-1およびカスパーゼ-11（ヒトではカスパーゼ-4）依存性のピロトーシスを誘発することを発見した。細胞 - 感染した細胞の剥離につながる防御反応22。我々は、感作された分化尿路上皮におけるカスパーゼ-1発現の増強が、in vitroでの野生型（WT）（HlyA+）UPEC感染時のより強力なパイロトーシス性細胞死反応を引き起こすのではないかと仮説を立てた。乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）細胞毒性アッセイは、UPEC感染がナイーブ、消散、および感作された分化尿路上皮で細胞死を誘導することを実証しました（図5f）が、細胞死は感作された分化尿路上皮で有意に大きかった。ナイーブマウス、回復マウス、および感作マウスにおける WT UTI89 および UTI89ΔhlyA 株を用いた攻撃感染では、カスパーゼ 1 媒介ピロトーシス細胞死を活性化しない ΔhlyA 感染では、WT マウスと比較して感作マウスの細菌負荷が有意に増加することが観察されました。ナイーブマウスと解決マウスでは違いは観察されませんでした（図5g）。さらに、感染後28日での再発性慢性膀胱炎の発生率は、WTと比較してΔhlyAに感染した感作マウスで有意に増加しました（図5h）。これは、感作された尿路上皮細胞におけるカスパーゼ-1の過剰発現が、 UPEC 感染の課題を解決します。

これまでの研究では、UPEC 感染に反応して長期持続する膀胱組織のリモデリングが起こり、このリモデリングには、以前の感染結果に応じてその後の感染に対する感受性の変化が伴うことが示されています 5、6、7。我々は、この感受性の変化は、少なくとも部分的には、膀胱上皮粘膜における訓練された免疫の発達によって媒介されるという仮説を立てた。 T および B リンパ球による抗原特異的反応を含む適応免疫とは対照的に、「訓練された免疫」は、急性および慢性炎症、時には感染症に反応して抗原非特異的組織に適応することを特徴とし、主に専門分野で研究されています。マクロファージ、単球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞などの自然免疫細胞23、24、25。今回我々は、初代上皮細胞培養系10を用いて、以前の感染の結果としての膀胱粘膜リモデリングに対する尿路上皮固有の寄与を解明し、その後の尿路感染に対する訓練された免疫の機構としての尿路上皮幹細胞のエピジェネティックな再プログラミングの証拠を発見した。

以前に感染したマウスの膀胱尿路上皮は、同年齢のナイーブマウスと比較して細胞内定着に耐性があることが知られています6、7。ただし、この細胞内定着抵抗性のメカニズムは、回復マウスと感作マウスでは異なります。回復したマウスでは、UPEC は最初、成体ナイーブマウスと同様に表層面細胞に細胞内細菌群集を形成しますが、それらは増強された TNFα 媒介炎症により感染後最初の 6 時間以内に急速に脱落します 7。対照的に、おそらく細胞サイズが小さく、不完全に分化した表層細胞のアクチンゲーティングのため、感作された尿路上皮では in vivo で細胞内細菌群集はまったく形成されません 6,26。この研究では、感作尿路上皮における膀胱定着抵抗性の別の側面を解明しました。HlyA を介した尿路上皮細胞死と剥離により、初期の膀胱定着がさらに減少します。この効果はおそらく、カスパーゼ-1のベースライン発現の増加と、炎症性細胞溶解のターミナルエフェクターとして機能するガスダーミンC2およびC3などの他のインフラマソーム関連因子の結果であると思われます27。これらはここでin vitroで観察され、以前に説明されました。マウス尿路上皮の ex vivo プロテオミクス研究 8。カスパーゼ-1 インフラマソームを活性化できるサイトゾルの自然免疫センサーをコードする Aim2 も、感作された分化した尿路上皮でより高度に発現されました。マウスの皮膚では、イミキモドとその結果として生じる炎症により、皮膚は二次炎症性傷害に対してより迅速なAim2媒介応答を可能にする28。これは、インフラマソーム成分のエピジェネティックな再プログラミングが、二次曝露に備えて炎症センサーを刺激する共通のメカニズムである可能性があることを示唆しているバリア組織部位で。さらに、マウスでは、感染に応答して産生される母体のインターロイキン 6 (IL-6) が、子宮内の胎児の腸上皮幹細胞にエピジェネティックな変化を誘導する可能性があります 29。これらの以前の研究とは対照的に、我々の研究は、その後の感染の結果を変える粘膜上皮幹細胞への特異的なエピジェネティック変化の誘発における粘膜細菌感染の直接的な役割を実証している。

感作された膀胱におけるカスパーゼ 1 を介した防御的訓練免疫は、急性 rUTI の最初の 24 時間に大量の細菌負荷に反応して起こる Cox-2 依存性炎症によって克服されることがよくあります 6,8。 Cox-2 の発現は主に基底尿路上皮細胞レベルで起こりますが、その活性は好中球の過剰な動員を通じて粘膜の損傷を誘発する可能性があり、それによって細菌の細胞外定着と増殖に有利な方向に定着状況が変化します。したがって、感作マウスは攻撃感染に対して競合する防御反応と感作反応を示し、これは通常、感染後 24 時間までに感染負荷の極端な二峰性分布として現れます 5。治癒した膀胱と感作された膀胱は両方とも、感染後 24 時間までに in vivo での初期 Cox-2 反応を増強しましたが、膀胱炎症反応は感作マウスでのみ持続し 7、Cox-2 阻害は重篤な再発性膀胱炎から感作マウスを保護します 6,8。同様に、感染誘発性の Ptgs2 遺伝子 (Cox-2 をコードする) 発現は、ナイーブと比較して、感作および消失分化尿路上皮の両方で増強されました。しかし、Ptgs2 発現と一般的な炎症の正の調節因子である LincRNA-Cox-2 をコードする Ptgs2os2 遺伝子の発現はこれらの細胞株間で異なり、解決された分化した尿路上皮と比べて感作が増加していました。これと一致して、我々は、感作されたUSCにおけるPtgs2os2遺伝子座のアクセス可能性の増加に関連する異なるエピゲノムマークを発見し、分化した尿路上皮におけるPtgs2os2発現がUSCにおけるエピジェネティックな変化によって変化することを示唆した。したがって、Ptgs2os2 遺伝子座のエピジェネティックな変化は、感作された膀胱の持続的な炎症促進反応の促進に役割を果たし、Casp1 発現の増加による保護機能を克服する可能性があります。

DNA の CpG 部位をメチル化する DNA メチルトランスフェラーゼの発現の変化は、急性 UPEC 感染に応答してエピゲノムを再構築するメカニズムに関係していると考えられており 31、これは、自己解決的であるか慢性的であるかにかかわらず、以前の感染がどのように USC エピゲノムを変化させるかを説明する可能性があります。。しかし、慢性炎症自体もエピジェネティック記憶の強力な誘導因子でもあり、これにより消失した USC と感作された USC の間のエピジェネティックマーキングの違いを説明できる可能性があります。このエピゲノムの書き換えのモデルの 1 つは、刺激に応答してヌクレオソームに結合する「パイオニア」TF がストレス応答性遺伝子座のクロマチンを開き、エピゲノムのライターがクロマチンを改造してそれを可能にする、いわゆる「メモリードメイン」の存在です。刺激が取り除かれた後も開いたままになる32。 Klf4 は、消失した尿路上皮と比較して、感作された分化した尿路上皮で上方制御されており、既知のパイオニア TF33 です。さらに、我々のモチーフ発見分析は、USCにおけるエピジェネティックなリモデリングは、自己限定的な急性感染（解決されたアクセス可能なDAR）に応答して主にAP-1関連DARで起こるが、重度の急性感染は慢性感染と感染を引き起こすという仮説を支持している。炎症（感作されたアクセス可能なDAR）は、AP-1関連DARだけでなく、KlfおよびSoxファミリーモチーフ部位を持つものなどの追加のTF関連DARでもエピジェネティックリモデリングを誘導します。

UPEC感染時の上皮幹細胞のエピジェネティックな再プログラミングに関する我々の発見は、尿路感染症だけでなく他の種類の感染症や炎症性疾患に対する上皮固有の訓練された免疫のメカニズムを理解することに意味を持ちます。さらにメカニズムの研究が進めば、さまざまな再発性感染症や炎症性疾患に対する新たな治療法が見つかる可能性があります。たとえば、皮膚上皮がんで過剰発現しているヒストンデメチラーゼLSD1の阻害剤を治療に使用すると、細胞内のH3K4メチル化が顕著に増加し、表皮の早期分化と扁平上皮がんの抑制の両方が引き起こされます34。したがって、どのエピジェネティック因子、TF、または炎症メディエーターが生体内でこれらの特定のエピジェネティック記憶の確立と維持に直接関与しているかを特定するためのさらなる研究は、より深いメカニズムの洞察を提供し、rUTIを予防したり、rUTIのエピジェネティックインプリンティングを逆転させるための潜在的な治療標的に光を当てたりするでしょう。再発性疾患に対する感受性の増加につながります。

すべての動物実験は、実験動物の飼育と管理に関する国立衛生研究所のガイドラインに従って行われました。すべての実験は、ミズーリ州セントルイスのワシントン大学医学部の動物研究委員会による審査と承認の後、施設の規制に従って実施されました。

この研究で使用した UPEC 株は、ヒト膀胱炎分離株 UTI89 とその誘導体、UTI89 attHK022::COM-GFP (UTI89-KanR)35、UTI89 pANT4 および UTI89 hlyA::KD13 (UTI89 ΔhlyA-KanR)22 でした。マウス感染とインビトロ感染の両方について、UTI89株を溶原性ブロス（LB）中で37℃で一晩静置培養し、新鮮な培地に1:1,000で継代培養し、37℃で18時間静置培養した。

雌の C3H/HeN マウス (Envigo) は、最初の感染時に生後 7 ～ 8 週齢 (「幼若」) でした。合計 108 cfu の UTI89 が経尿道カテーテル法により C3H/HeN マウスの膀胱に接種されました 5,36。 C3H/HeN マウスは感染用量依存的に慢性膀胱炎を発症し、この接種によりマウスの約 50% で慢性膀胱炎が発症します6。感染の結果を監視するために、尿を採取した。持続性細菌尿（104 cfu ml-1）は、慢性膀胱炎を検出するための特異的かつ高感度のカットオフとして定義されています5。最初の感染時の慢性膀胱炎は、尿が採取された各時点（感染後 1、3、7、10、14、21、および 28 日）での持続的な高細菌尿（>104 cfu ml-1 尿）と定義され、一方で膀胱炎は消散しました。尿細菌力価が少なくとも 1 つの時点でこのカットオフを下回ったものとして定義されました。

感染後 4 週間で、すべてのマウスを飲料水中のトリメトプリムおよびスルファメトキサゾールで 10 日間処理しました (それぞれ、54 および 270 μg ml-1 水)6。細菌尿の除去を確認するために尿を毎週採取した。抗生物質の投与開始から 4 週間後、ナイーブマウス、回復マウス、および感作マウスを一次 USC の分離に使用するか、二次感染アッセイに使用しました。二次感染では、膀胱に接種した 107 cfu の細菌でマウスを攻撃し、感染後 6 時間で人道的に安楽死させ、細菌負荷を測定して急性転帰を評価しました。

5637 (ATCC HTB-9) 細胞と呼ばれるヒト膀胱癌上皮細胞を、10% FBS を含む RPMI-1640 培地中で 5% CO2 存在下、37 °C で培養しました。

幼若マウス、回復期未処置マウス、回復および感作マウスからの膀胱組織を単離し、二等分し、剥離液中で 4 °C で一晩インキュベートしました。尿路上皮細胞を膀胱組織から削り取り、4℃、300gで5分間遠心分離し、新鮮なコラゲナーゼIV溶液に再懸濁し、37℃で20分間振盪しながらインキュベートした。細胞を穏やかなピペッティングによって解砕し、100μmのストレーナーで濾過し、次いで洗浄媒体で洗浄した。細胞は、10 mM Y-27632 および 10 mM SB431542 (R&D System) を含む 50% L-WRN CM を含むマトリゲル (BD Biosciences) 中で培養されました9。培地は 2 日ごとに交換し、細胞は 3 日ごとに継代しました (1:2 ～ 3 に分割)。 10継代後のUSCを実験に使用して、残っている非幹尿路上皮細胞を除去しました。

USCを0.5 mM EDTAを含むPBSで洗浄し、0.05％トリプシンおよび0.5 mM EDTAで37℃で1分間トリプシン処理し、激しいピペッティングによって解離し、40μmセルストレーナーで濾過し、洗浄媒体に再懸濁しました。トランスウェル（Corning Costar、3413）を、1:40 マトリゲルを含む PBS 中で 37 °C で 30 分間コーティングしました。次に、3〜4 × 104 個の USC をトランスウェルインサートに播種し、10 mM Y-27632 を含む 50% CM 100 μl と 600 μl をトランスウェルの頂端コンパートメントと側底コンパートメントにそれぞれ添加しました。

尿路上皮多層の抵抗は、上皮ボルトオームメーター（World Precision Instruments）を使用したTER測定によって評価した。 3 回の測定の平均値にトランスウェル膜の面積 (0.33 cm2) を掛けて、最終値をオーム × cm2 で求めました (参考文献 37)。

尿路上皮が完全に分化したら（TER 値 >4,000 ohm × cm2）、培養物を温かい DMEM/F12 培地で 3 回洗浄し、感染多重度 10 で UPEC 株を感染させました。その後、トランスウェルを 37 °C で 30 分間インキュベートし、交換しました。細胞外細菌を除去するために 100 μg ml-1 ゲンタマイシンを含む培地に移し、長時間培養しました。感染後、頂端および側底培地を 2,000 g、4 °C で 5 分間遠心分離し、LDH アッセイ (TaKaRa、MK401) に使用しました。トランスウェルは滅菌 PBS で洗浄され、その後さまざまな分析に使用されました。

トランスウェル上の分化した尿路上皮を洗浄し、4%パラホルムアルデヒドを含むPBS中で15分間固定し、PBSで3回リンスした。続いて、100μlの0.2% Triton Xを10分間添加し、その後廃棄し、細胞をブロッキングのために100μlの2% BSA中で30分間インキュベートした。サンプルを一次抗体のマウスモノクローナル抗ケラチン 20 (Abcam、ab854、1:200) および二次抗体の Alexa Fluor 647 ロバ抗マウス IgG (Invitrogen、A-31571、1:1,000) で染色し、さらに染色しました。 Alexa Fluor 555 ファロイジン (ThermoFisher、A34055、1:200) および 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) (ThermoFisher、D1306、1:1,000) を使用。共焦点顕微鏡には、Airyscan を備えた ZEISS LSM880 レーザー走査型顕微鏡を使用しました。 Fiji ImageJ とマクロプログラムを使用して、Z スタック共焦点画像の尿路上皮細胞表面積を自動的に計算しました。

USC または分化した尿路上皮を 10% ホルムアルデヒド中で 4 °C で一晩固定しました。 PBSで洗浄した後、固定サンプルを2%寒天にあらかじめ包埋し、垂直に切断し、側を上にしてトランスウェルに置き、再度パラフィンブロックに包埋し、切片化した。スライドを H&E で染色し、選択した抗体で免疫染色しました。免疫蛍光染色では、スライドを脱パラフィンし、水和し、PBS 中の 10% 熱不活化馬血清 (HIHS) および 0.3% Triton X-100 でブロックし、1% HIHS および PBS 中の一次抗体および二次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 PBS 中で室温で 30 ～ 60 分間放置します6。使用した一次抗体は、マウスモノクローナル抗ケラチン 20 (Abcam、ab854、1:200)、ヤギポリクローナル抗 E-カドヘリン (R&D Systems、AF748、1:500)、ヤギポリクローナル抗ウロプラキン 3a (Santa Cruz、サウスカロライナ州) でした。 -15186、1:500)、マウスモノクローナル抗ウロプラキン 3a (Fitzgerald、10R-U103a、1:50)、ウサギポリクローナル抗 p63 (GeneTex、GTX102425、1:1,000)、ウサギモノクローナル抗 K5 (Abcam、ab150074) 、１：１００）およびマウスモノクローナル抗ケラチン１４（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ｓｃ−５３２５３、１：５０）。 Alexa Fluor 二次抗体と DAPI を 1:1,000 希釈で使用しました。さらなる抗体情報を補足表 3に示します。サンプルは Zeiss Axio Imager M2 Plus 広視野蛍光顕微鏡で視覚化しました。

分化した尿路上皮をＰＢＳで３回洗浄し、ＥＭ固定液（１×ＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒド、２．５％グルタルアルデヒド）で氷上で１時間固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、サンプルを 1.0% 四酸化オスミウムで後固定し、エタノールの濃度を増加させながら脱水し、臨界点乾燥機 6 で 31.1 °C、1,072 psi で 16 分間脱水しました。サンプルはカーボンテープでコーティングされたスタブに取り付けられ、アルゴン6下で金/パラジウムでスパッタコーティングされ、Zeiss Crossbeam 540 FIB-SEMで画像化されました。

RNAeasy Plus mini kit (Qiagen) を使用して USC または分化した尿路上皮から RNA を抽出し、iScript Reverse Transcription Supermix (BioRad) で逆転写しました。各遺伝子に特異的なイントロンスパニングプライマーを含む 1 μl 12.5 ng μl-1 の相補的 DNA を使用し、製造業者 (BioRad) の指示に従って iQ SYBR Green Supermix を使用しました。この研究で使用したプライマーの配列を補足表 4 に示します。発現値は 18S に正規化し、コントロールと比較した相対発現はサイクル閾値 (ΔΔCt) 法によって決定されました 38。各サンプルを 3 回実行し、平均 Ct 値を計算しました。

イルミナ cDNA ライブラリは、RNAtag-seq プロトコルの修正版を使用して生成されました 39。簡単に説明すると、1 μg の全 RNA を断片化し、ゲノム DNA を除去し、脱リン酸化し、5' リン酸基と 3' ブロッキング基を持つ既知の配列の 5'-AN8-3' バーコードを保持する DNA アダプターにライゲーションしました。バーコード付き RNA をプールし、Ribo-Zero rRNA 枯渇キット (Illumina) を使用してリボソーム RNA を枯渇させました。テンプレートスイッチングおよび Illumina P5 または P7 配列を含むプライマーを使用した PCR 増幅によって 2 番目のアダプターを追加することによって cDNA ライブラリーを生成し、その後ライブラリーを Illumina HiSeq 2500 で配列決定しました。プール内のペアエンドシーケンシングリードは、それらの配列に基づいて逆多重化されました。カスタムスクリプト (https://github.com/broadinstitute/split_merge_pl) を使用して、関連付けられたバーコードシーケンスを作成します。次に、cutadapt v1.6 を使用してリードをトリミングし、tophat2 v2.0.11 および bowtie2 v2.2.2 を使用して、トリミングされたリードをハツカネズミ mm10 ゲノムにアライメントしました。遺伝子カウントは HTSeq v0.6.0 によって実行され、読み取りカウントは Salmon v0.8.27 を使用して注釈付き転写産物に割り当てられました。

読み取り正規化と差次的発現は DESeq2 v1.14.040 を使用して実行されました。 DESeq 正規化リードの rlog 変換を PCA プロットに使用しました。 DEseq2 リードの 100 万マップ化リードあたりの転写産物のキロベースあたりのフラグメント (FPKM) 正規化を Z スコアヒートマップに使用しました。 TF 発現は、DESeq2 FPKM 正規化値と、検証された TF モチーフの TF データベースである HOCOMOCO v1141 のマウス TF のリスト (n = 453) を使用して決定されました。調整された P 値カットオフ 0.05 を使用し、Z スコアヒートマップを使用して TF 候補発現を視覚化しました。遺伝子発現における統計的有意差は、Wald 検定とそれに続く Benjamini-Hochberg 偽発見率 (FDR) を使用した複数の検定補正によって評価され、調整された P < 0.05 が有意であると見なされます。経路解析は、ingenuity pathway Analysis (IPA) を使用して実行されました。有意性は右尾フィッシャーの直接確率検定によって決定され、Padj < 0.05 は有意に濃縮された経路とみなされました。

ナイーブ、分離および感作された USC の単一細胞 (1 ～ 2 × 105) を核の調製に使用し、50,000 個の核を計数して 25 μl の 2× TD バッファーに移しました。 TDE1 酵素を含む Omni-ATAC-seq 反応混合物 (25 μl) を、2× TD バッファー中の 50,000 個の核 25 μl に添加し、サンプルを 37 °C で 30 分間インキュベートしました (恒温槽でのインキュベーション中は 10 分ごとに軽くたたきました)。ヒートブロック）。転置されたＤＮＡ断片は、ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して直ちに精製された。 ATAC-seq ライブラリーは、72 °C で最初の 5 分間の伸長を伴う PCR 増幅 (10 ～ 12 サイクル) によって増幅し、AMPure XP ビーズ (Beckman Coulter) を使用して精製しました。精製したライブラリーをヌクレアーゼフリーの水 20 μl で溶出し、Qubit dsDNA HS アッセイキット (ThermoFisher) を使用して定量し、4200 TapeStation (High Sensitivity D1000 ScreenTape and Reagents) でサイズ分布をチェックしました。ペアエンド ATAC-seq ライブラリーは Illumina NextSeq 500 で配列決定されました (約 3 億 5,000 万リード)。

ATAC-seq 分析 42 では、次のツールとバージョンを使用しました: Fastqc v0.11.5、Cutadapt v1.11、Samtools v1.5、Bowtie2 v2.3.0、picard v2.10.0、Macs2 v2.1.1.20160309、bedtools v2.26.0。シーケンシングリードは、サンプル固有のインデックスシーケンスを使用して多重分離され、fastqc で品質チェックされ、cutadapt を使用してトリミングされ、bowtie243 を使用して参照マウスゲノム (mm10) にアラインメントされました。次に、Picard を使用して二次アライメント、多重マッピングされたリード、および PCR 重複リードを削除し、MACS244 を使用してピークコールを実行しました。 ENCODE のガイドライン 45 に従って 2 回の反復による再現不可能発見率 (IDR) 分析が実行され、IDR < 0.05 の ATAC ピークが、さらなる分析のために再現性の高いアクセス可能なクロマチン領域として選択されました。 ATAC-seq シグナルは、MACS2 bdgcmp 関数を使用して生成された bedGraph トラックを使用して、WashU Epigenome Browser46 上でバックグラウンドに対する倍率変化 (FC) として視覚化されました。

DAR を特定するために、IDR < 0.05 ATAC ピークに対して Diffbind v2.10.0 を使用し、統計的有意性のためにカットオフ < 0.05 の Benjamini-Hochberg FDR を使用しました。火山プロットとヒートマップの生成には、有意な DAR (FDR < 0.05) が使用されました。 GREAT16 (基底プラス拡張パラメーター) を GO 経路解析に使用しました。 GREAT は、二項検定を使用して二項 P 値によって結果をランク付けします。感作された（FC > 1.5）および解決された特異的なDAR（FC < -1.5）を個別に分析し、上位15の濃縮された経路を図3e〜fに示します。

USC の単一細胞 (1 ～ 2 × 105) を DNase I で処理して、マトリゲルから微量の DNA 汚染を除去しました。 DNeasy Blood & Tissueキット（Qiagen、69504）を使用して細胞からゲノムDNA（gDNA）を調製した。 200 ng の gDNA と 0.4 ng ラムダを使用し、EZ DNA Mmethylation-Direct キット (Zymo、D5020) を使用して DNA を重亜硫酸塩処理し、xGen Mmethyl-Seq Library Prep キット (IDT、10009824) で処理して、Illumina 互換の WGBS ライブラリーを生成しました。ライブラリーは、MGI 研究所によって NovaSeq S4 300XP (約 3 億リード) で配列決定されました。

特定のパラメーターを使用した WGBS 分析コマンドについては、「コードの利用可能性」セクションで詳しく説明します。簡単に言うと、fastqQC v0.11.8 を使用して、生の読み取りの品質を評価しました。続いて、Cutadapt v1.18 を使用してペアエンドリードをトリミングしてアダプター配列と低品質リードを除去し、FastqQC を使用して再評価しました。マウス参照ゲノム mm10 は、まず Bismark v0.20.0 を使用して重亜硫酸塩変換されました。ペアエンドリードは mm10 重亜硫酸塩変換ゲノムにアラインメントされ、「deduplicate_bismark」を使用して重複が除去されました。 DNA メチル化レベルは「bismark_methylation_extractor」を使用して計算され、WashU Epigenome Browser46 に methylC 形式で表示されました。重亜硫酸塩変換は、ラムダ参照ゲノムにおけるシトシンからチミンへの変換率を使用して推定されました。

DMR は、生物学的複製の 2 グループ比較を使用して DSS v2.43.247 で特定され、「DMLtest」および「callDMR」を使用して呼び出されます。 DMR 内の CpG メチル化の PCA プロットは、Deeptools v3.3.0 を使用して生成されました。生物学的複製は、複製間で fastq ファイルをマージし、前述の手順を使用して再処理することによって結合されました。 CpG 密度は、5x カバレッジカットオフと ggplot2 v3.3.6 を使用して視覚化されました。

感作特異的DMRは、ナイーブDMRと感作DMR、および分解DMRと感作DMRの間の重複領域として定義されました。感作特異的 DMR のメチル化パーセントは、R パッケージ「ComplexHeatmap」を使用して視覚化されました。感作特異的低DMR上のDNAメチル化は、Deeptoolsを使用してプロットされ、ggplot2を使用して視覚化されました。 DMR 間の重複領域は、Intervene48 'Venn' をデフォルトのパラメーターで使用して特定され、視覚化されました。感作された低DMRに対するGREAT16分析は、ATAC分析に記載されているように実行されました。感作された低DMRは、UCSC (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables)を使用してGENCODE M25 (https://www.gencodegenes.org/mouse/release_M25.html)をダウンロードしてゲノムアノテーションについても分析されました。）。プロモーターは、転写開始部位の 1 kb 上流として定義されました。ゲノムアノテーションの優先順位は、プロモーター、コーディングエクソン、5' UTR、3' UTR、イントロン、および遺伝子間の順序で割り当てられました。 DMR が BEDTools v2.27.1 を使用してアノテーションの 20% と重複している場合に DMR をアノテーションに割り当て、交差し、感作と解像の間の関連遺伝子の log2(FC) に対して、分化尿路上皮の有無にかかわらずプロットしました。感染。

USC の単一細胞 (0.2 × 106) を 0.1% ホルムアルデヒドでわずかに架橋し、固定細胞ペレットを使用前に -80 °C で保存しました。 H3K4Me3、H3K27Ac、および H3K27Me3 CUT&RUN は、いくつかの変更を加えた CUT&RUN アッセイキット (Cell Signaling、86652) を使用して実行されました。簡単に言うと、各実験で細胞をコンカナバリン A ビーズに付着させました。スペルミジンおよびプロテアーゼ阻害剤を含む抗体結合バッファー中で細胞をジギトニンで透過処理し、H3K4Me3 (Cell Signaling、9751、1:50)、H3K27Ac (Cell Signaling、8173、1:100)、または H3K27Me3 (Cell Signaling) に対する一次抗体とともにインキュベートしました。、９７３３、１：５０）ローテーター上で４℃で一晩。ビーズと細胞の混合物をジギトニンバッファーで 3 回洗浄し、50 μl pAG-MNase に再懸濁し、ローテーター上で 4 °C で 1 時間インキュベートしました。サンプルを、150μlの冷ジギトニン緩衝液および3μlのCaCl2を含むPCRチューブ中で、サーマルサイクラー中、4℃で30分間消化した。次に、ビーズを微量遠心管に戻し、150μlの1×STOP緩衝液を加え、管を37℃で10分間インキュベートした。チューブを磁気ラック上に置き、上清を新しいチューブに集めました。 10% SDS 溶液 3 μl および 20 mg ml-1 プロテイナーゼ K 2 μl を添加することで架橋を逆転させ、サンプルを 65 °C で 2 時間インキュベートしました。濃縮されたクロマチンサンプルからの DNA は、DNA スピンカラム (Zymo、D4013) を使用して精製されました。シーケンシングライブラリーは、製造元の指示に従って Ultra II DNA Library Prep キット (NEB、E7645) を使用して調製しましたが、アダプター連結 DNA の PCR 濃縮中のアニールおよび伸長時間を 10 秒に短縮しました。

コマンドとパラメータの詳細なリストは、「コードの利用可能性」にあります。簡単に言うと、fastqQC v0.11.9 を使用して読み取り品質を評価しました。続いて、ペアエンドリードを Cutadapt v1.9 でトリミングし、fastqQC を使用して再評価しました。次に、bowtie2 v2.3.4.149 を使用して読み取りをアライメントしました。ミトコンドリアの読み取りは、samtools v1.9 を使用して削除され、Picard v2.8.1 MarkDuplicates を使用して重複排除されました。独自にマップされたリードは、samtools ビューを使用して抽出されました。ピークは、MACS2 v2.1.1.20160309 'callpeak' を使用して呼び出されました。狭いピーク H3K4Me3 および H3K27Ac の場合は '-q 0.01'、H3K27Me3 の場合は '-q 0.05 --broad' です。エンコード定義のブラックリスト領域が削除されました。各ヒストン修飾について、コンセンサスピークリストを使用して、ピーク内のリードの割合 (FRIP) を計算しました。次に、Deeptools を使用してリードを bigWig 形式に変換し、リードカバレッジと FRIP スコアを使用して正規化しました。正規化された生物学的複製は、ucsc-bigwigmerge v377 を使用して結合され、kentUCS v334 と UCSC の mm10 染色体サイズ (http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes) を使用して bedGraph から bigWigs に変換されました。）。他のエピジェネティック修飾の感作特異的 DMR 領域をプロファイリングするために、感作された低 DMR を、ATAC、H3K4Me3、および H3K27Ac の MASC2 狭いピーク、および H3K27Me3 の広いピークとオーバーラップさせました。対応するピークスコアは FRIP スコアを使用して正規化され、R パッケージ「ComplexHeatmap」を使用してプロットされました。正規化された bigWig トラックを使用し、Deeptools を使用して、ATAC、H3K4Me3、H3K27Ac、および H3K27Me3 シグナルを感作特異的低 DMR 上にプロットしました。正規化された bigWig シグナルが casp1 ヒートマップに使用されました。

製造業者の指示に従って、細胞溶解緩衝液（Cell Signaling、9803S）を用いて細胞を溶解した。 Rapid Gold BCA Protein Assay キットを使用して細胞溶解物中のタンパク質濃度を測定し、等量のタンパク質を SDS-PAGE で分離し、ニトロセルロース膜に転写しました。膜を、カスパーゼ-1 (AdipoGen、AG-20B-0042-C100、1:5,000) およびβ-アクチン (MA5-15739、Invitrogen、1:10,000) に対する一次抗体とともに一晩インキュベートしました。 HRP 結合二次抗体 (Cell Signaling、7076S、1:3,000) および ECL 試薬 (Amersham、RPN2209) を使用してタンパク質バンドを視覚化しました。

共焦点、免疫蛍光染色、および SEM の画像を表示するために、3 ～ 4 つの異なる細胞株 (J1-5、N1-4、R1-4、および S1-4 のうち) を染色して画像化しました。ウェスタンブロット画像については、2 つの異なる細胞株をテストしました。プロット/グラフの統計は、GraphPad Prism v8.4.3 で分析されました。有意な場合（P < 0.05）、正確な P 値が示されます（P < 0.0001 の場合、GraphPad Prism は正確な P 値を提供しませんでした）。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究の結果を裏付けるデータは、論文、その補足情報、またはソースデータ内で入手できます。 RNA-seq、ATAC-seq、WGBS、および CUT&RUN データは、BioProject ID 番号 2 で NCBI に寄託されています。 PRJNA705407。 ATAC-seq、WGBS-seq、CUT&RUN、および RNA-seq (順鎖: 緑色、逆鎖: オレンジ) データを視覚化する WashU エピゲノムブラウザーマップには、次のリンクからアクセスできます。

結合された複製:

https://epigenomegateway.wustl.edu/browser/?genome=mm10&noDefaultTracks=1&hub=https://wangftp.wustl.edu/~jharrison/PUBLISHED_DATAHUBS/Hultgren/Russell_Bacterial_infection_combined.json

結合された複製と個別の複製:

https://epigenomegateway.wustl.edu/browser/?genome=mm10&noDefaultTracks=1&hub=https://wangftp.wustl.edu/~jharrison/PUBLISHED_DATAHUBS/Hultgren/Russell_Bacterial_infection_all.jsonソースデータはこのペーパーで提供されます。

ATAC-seq 一般パイプライン:

https://www.encodeproject.org/documents/c008d7bd-5d60-4a23-a833-67c5dfab006a/@@download/attachment/ATACSeqPipeline.pdf

CUT&RUN の一般的なパイプライン:

https://github.com/Yonghao-Holden/tricks/blob/main/cuttag_pipe_v1.sh

WGBS 一般パイプライン:

https://github.com/hyungjoo-lee/wgbs

ATAC-seq、GUT&RUN、WGBS、および図のカスタムコード:

https://github.com/jharrison0123/Uropathogenic-Escherichia-coli-infection-production-trained-immunity-affects-urinary-tract-disease

火山プロットのコード: https://github.com/bsolson/Volcano_plot

EnhancedVolcano コード: https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano

Foxman, B. 尿路感染症の疫学: 発生率、罹患率、および経済的コスト。ディス。月 49、53–70 (2003)。

論文 PubMed Google Scholar

Foxman, B.、Barlow, R.、D'Arcy, H.、Gillespie, B. & Sobel, JD 尿路感染症：自己申告の発生率と関連費用。アン。エピデミオール。 10、509–515 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Godaly, G.、Ambite, I. & Svanborg, C. 自然免疫と尿路感染症感受性の遺伝的決定因子。カー。意見。感染する。ディス。 28、88–96 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

SA フェリー、SE ホルム、H ステンランド、R ランドホルム、TJ モンセンランダム化プラセボ対照研究によって示された女性における合併症のない下部尿路感染症の自然経過。スキャン。 J.感染する。ディス。 36、296–301 (2004)。

論文 PubMed Google Scholar

Hannan、TJ、Mysorekar、IU、Hung、CS、Isaacson-Schmid、ML、Hultgren、SJ 尿路病原性大腸菌に対する初期の重度の炎症反応は、慢性および再発性の尿路感染症を引き起こしやすくなります。 PLoS 病巣。 6、e1001042 (2010)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

オブライエン副社長ほか以前の大腸菌膀胱感染によって残された粘膜痕跡は、再発性疾患に対して感作されます。ナット。微生物。 2、16196 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu、L.ら。粘膜感染は、TNFαシグナル伝達のダイナミクスを再配線して、再発に対する感受性を歪めます。 eLife 8、e46677 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ハナン、TJ 他シクロオキシゲナーゼ-2 の阻害により、慢性および再発性の膀胱炎が予防されます。 EBioMedicine 1、46–57 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ミヨシ、H. & スタッペンベック、TS スフェロイド培養における消化管幹細胞のインビトロ増殖と遺伝子改変。ナット。プロトック。 8、2471–2482 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

VanDussen、KL et al. 患者ベースのアッセイを容易にするための強化されたヒト消化管上皮培養システムの開発。 Gut 64、911–920 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Senoo, M.、Pinto, F.、Crum, CP & McKeon, F. p63 は、重層上皮における幹細胞の増殖能に不可欠です。セル 129、523–536 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

吉田達也ほか三次元オルガノイド培養により、膀胱がん細胞の増殖における Wnt/β-カテニン経路の関与が明らかになりました。オンコターゲット 9、11060–11070 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

テイト、T. 他 Pparg シグナル伝達は膀胱がんのサブタイプと免疫排除を制御します。ナット。共通。 12、6160 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

O'Brien, VP、Dorsey, DA、Hannan, TJ & Hultgren, SJ 大腸菌再発性尿路感染症の宿主制限は細菌株特異的に起こります。 PLoS 病巣。 14、e1007457 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Corces, MR et al. 改良された ATAC-seq プロトコルによりバックグラウンドが低減され、凍結組織の検査が可能になりました。ナット。方法 14、959–962 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マクリーン、CY 他。 GREAT は、シス調節領域の機能的解釈を改善します。ナット。バイオテクノロジー。 28、495–501 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ハインツ、S.ら。系統を決定する転写因子の単純な組み合わせにより、マクロファージと B 細胞の同一性に必要なシス制御要素が刺激されます。モル。セル 38、576–589 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kernaleguen、M. et al. ゲノム全体の DNA メチル化およびヒドロキシメチル化パターンを単一ヌクレオチドの解像度で解析するための全ゲノム亜硫酸水素塩シークエンシング。方法Ｍｏｌ．バイオル。 1767、311–349 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Skene, PJ & Henikoff, S. DNA 結合部位の高解像度マッピングのための効率的な標的ヌクレアーゼ戦略。 eLife 6、e21856 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ロードマップエピゲノミクス、C. et al. 111 の参照ヒトエピゲノムの統合分析。ネイチャー 518、317–330 (2015)。

記事 Google Scholar

Li, S.、Peng, Y.、Landsman, D. & Panchenko、AR ヌクレオソームの幾何学形状、安定性、およびアンラップにおける DNA メチル化の手がかり。核酸研究所 50、1864 ～ 1874 年 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

永松和也ほか大腸菌α溶血素の発現調節異常は、急性および持続性の尿路感染症の経過を変化させます。手順国立アカデミー。科学。 USA 112、E871–E880 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

サイード、S.ら。単球からマクロファージへの分化と訓練された自然免疫のエピジェネティックなプログラミング。サイエンス 345、1251086 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ホール、CR 他インビボでの記憶様樹状細胞応答の誘導。ナット。共通。 2955 年 10 月 (2019 年)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Min-Oo, G. & Lanier, LL サイトメガロウイルスは、異種感染に対するバイスタンダー活性化が減少した、長寿命の抗原特異的 NK 細胞を生成します。 J.Exp. 医学。 211、2669–2680 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eto、DS、Sundsbak、JL、および Mulvey、MA アクチン依存性細胞内増殖と尿路病原性大腸菌の復活。細胞。微生物。 8、704–717 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Hou、J.ら。 PD-L1 を介したガスダーミン C の発現は、がん細胞のアポトーシスをパイロトーシスに切り替え、腫瘍の壊死を促進します。ナット。セルバイオル。 22、1264–1275 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Naik, S. et al. 炎症記憶は、皮膚上皮幹細胞を組織損傷に対して敏感にします。ネイチャー 550、475–480 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リム、AIら。出生前に母親が感染すると、子の組織特異的な免疫と炎症が促進されます。サイエンス 373、eabf3002 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

エリング、R.ら。遺伝子モデルは、lincRNA-Cox2 のシスおよびトランス免疫調節活性を明らかにします。 Cell Rep. 25、1511–1524.e6 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tolg, C. et al. 尿路病原性大腸菌感染は、尿路上皮細胞における CDKN2A (p16INK4A) のエピジェネティックなダウンレギュレーションを引き起こします。研究室投資する。 91、825–836 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Naik, S. & Fuchs, E. 病気と健康における炎症記憶と組織の適応。 Nature 607、249–255 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

サルディナ、JL et al. 転写因子は、Tet2 を介したエンハンサーの脱メチル化を駆動して、細胞運命を再プログラムします。 Cell Stem Cell 23、727–741.e9 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Egolf, S. et al. LSD1 阻害は、運命を決定する転写因子の抑制解除を通じて上皮分化を促進します。 Cell Rep. 28、1981–1992.e7 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wright、KJ、Seed、PC、およびHultgren、SJ 尿路病原性大腸菌鞭毛は、効率的な尿路定着を助けます。感染する。免疫。 73、7657–7668 (2005)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

チェン、SL 他ポジティブ選択により、マンノース結合に加えて、尿路感染時のFimHの生体内役割が特定される。手順国立アカデミー。科学。 USA 106、22439–22444 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moon, C.、VanDussen, KL、Mi好, H. & Stappenbeck, TS IgA トランスサイトーシスを調節する因子を評価するための初代マウス腸上皮細胞単層培養系の開発。粘膜免疫。 7、818–828 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Pfaffl, MW リアルタイム RT-PCR における相対定量のための新しい数学モデル。核酸研究所 29、e45 (2001)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

シシキン、AA 他。単一の反応で多数の RNA-seq ライブラリーを同時に生成します。ナット。方法 12、323–325 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Love, MI、Huber, W. & Anders, S. DESeq2 を使用した RNA-seq データの倍数変化と分散の適度な推定。ゲノムバイオル。 15, 550 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Kulakovskiy, IV et al. HOCOMOCO: 大規模な ChIP-seq 解析によるヒトおよびマウスの転写因子結合モデルの完全なコレクションに向けて。核酸研究所 46、D252–D259 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リー、HJら。再生中のゼブラフィッシュヒレエピゲノムは、安定した系統特異的な DNA メチル化と動的なクロマチンアクセス可能性を特徴としています。ゲノムバイオル。 21、52 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Langmead, B. & Salzberg, SL Bowtie 2 を使用した高速ギャップリードアライメント。方法 9、357–359 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang、Y.ら。 ChIP-Seq (MACS) のモデルベース解析。ゲノムバイオル。 9、R137 (2008)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Landt、SG et al. ENCODE および modENCODE コンソーシアムの ChIP-seq ガイドラインと実践。ゲノム研究所 22、1813–1831 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou、X.ら。ワシントン大学のヒトエピゲノムブラウザ。ナット。メソッド 8、989–990 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Feng, H. & Wu, H. DSS を使用した重亜硫酸塩シーケンスの示差的メチル化分析。量的。バイオル。 7、327–334 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Khan, A. & Mathelier, A. Intervene: 複数の遺伝子またはゲノム領域セットの交差および視覚化のためのツール。 BMC バイオインフォマティクス 18、287 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaya-Okur、HS 他 CUT&Tag は、少量のサンプルや単一細胞の効率的なエピゲノムプロファイリングを可能にします。ナット。共通。 1930 年 10 日 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

ワシントン大学医学部、ワシントン大学小児発見研究所およびセントルイス小児病院 (CDI-CORE-2015-505)、およびバーンズ財団の支援を受けているワシントン大学細胞画像センター (WUCCI) に感謝します。 -ユダヤ病院 (3770)、走査型電子顕微鏡サンプルの準備と画像化を行う。共焦点画像の自動細胞サイズ測定のための Fiji ImageJ マクロコードを開発してくださった M. Shih と、編集支援をしていただいた K. Dodson に感謝します。この研究は、国立衛生研究所 (SJH および MC に対して U01 AI095542、JL に対して U19AI110818) によって支援されました。国立衛生研究所粘膜免疫学研究チームコンソーシアム若手研究者賞 (U01 AI095776 から TJH)。ワシントン大学リウマチ性疾患研究リソースベースセンター (P30 AR073752、EDOR)。セントルイスのワシントン大学でマクドネル国際奨学生アカデミーフェローシップ（SKR行き）。および国立科学財団大学院研究フェローシップ (#DGE –114395 to VPO)。資金提供者は、研究の設計、データの収集と分析、出版の決定や原稿の準備には何の役割もありませんでした。

米国ミズーリ州セントルイスのワシントン大学医学部分子微生物学部門および女性感染症研究センター

ソンミ・K・ラッセル、ベンジャミン・S・オルソン、ヴァレリー・P・オブライエン、ルー・ユー、ラジディープ・ボムジャン、トーマス・J・ハンナン、スコット・J・ハルトグレン

ワシントン大学医学部遺伝学科、セントルイス、ミズーリ州、米国

ジェシカ・K・ハリソン、ヒョンジュ・リー、シャオユン・シン、エリシャ・ドー・ロバーソン、チャンシュウ・ファン、マリーナ・シャ、ティン・ワン

エジソン・ファミリー・センター・フォー・ゲノム科学およびシステム生物学、ワシントン大学医学部、セントルイス、ミズーリ州、米国

ジェシカ・K・ハリソン、ヒョンジュ・リー、シャオユン・シン、チャンシュウ・ファン、マリーナ・シャ、ティン・ワン

フレッド・ハッチンソンがんセンター、ヒューマン生物学部門、シアトル、ワシントン州、米国

ヴァレリー・P・オブライエン

感染症とマイクロバイオームプログラム、マサチューセッツ工科大学ブロード研究所およびハーバード大学、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ

ジョナサン・リヴニー

米国ミズーリ州セントルイスのワシントン大学医学部リウマチ科医学部

エリシャ・DO・ロバーソン

オハイオ州立大学感染症研究所微生物感染免疫学部（米国オハイオ州コロンバス）

シェイディ・エストファナス & アマル・O・アメール

ヘルワン大学薬学部生化学および分子生物学科、カイロ、エジプト

シェイディ・エストファノス

米国ミズーリ州セントルイスのワシントン大学医学部病理学および免疫学部

マルコ・コロンナ & トーマス・J・ハナン

炎症および免疫部門、ラーナー研究所、クリーブランドクリニック、米国オハイオ州クリーブランド

サデウス・S・スタッペンベック

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SKR、MC、TJH、SJH がプロジェクトを構想しました。 SKR、TSS、TW、TJH、SJH が方法論を開発しました。クローナ、。 HJL、VPO、XX、JL、RB、TJH が調査を実施しました。 SKR、JKH、HJL、BSO、VPO、LY、EDOR、MS が正式な分析を実施しました。 SKR が原案を書きました。 SKR、JKH、HJL、BSO、VPO、RB、SE、AOA、TW、TJH、SJH が原稿をレビューし、編集しました。 SKR、JKH、HJL、BSO、VPO、CF が可視化を実行しました。 TW、TJH、MC、SJHが資金調達を獲得した。 TW、TJH、SJH がプロジェクトを監督しました。

Ting Wang、Thomas J. Hannan、または Scott J. Hultgren との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Microbiology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

(A) 細胞増殖のために、解離した細胞凝集体を新鮮なマトリゲルに埋め込み、その後新しいスフェロイドに発展させました。尿路上皮スフェロイドは、細胞密度に応じて 1:2 ～ 1:3 の希釈を使用して 3 日ごとに継代できます。 (BD) 8 週齢の C3H/HeN マウスに由来する初代 USC を、50% CM を含むマトリゲル中で培養しました。 50% CM で 3 日間培養した後、3、5、7 日目に培地を新しい 50% CM または 5% CM に交換し、1、2、3 (黄色)、5 (緑色)、および 7 日間 (オレンジ色) (USC 培養 n = 12、9、13、12、12、11、11)。 (B) p63、(C) Wnt シグナル伝達マーカーである Axin2、および (D) 尿路上皮細胞分化マーカーである Upk3a の遺伝子発現は、qRT-PCR によって測定され、データは平均 ± SD として表されます。有意性は、対応のない (両側) t 検定によって決定されました。 (E) マトリゲルで膀胱オルガノイドを培養するために、USC を 50% CM で 3 日間前培養し、穏やかに解離させた後、50% CM または 0% CM で 5 日間培養するために新鮮なマトリゲルに継代し、培地を 1 回ごとに交換しました。 2日。 5 日間の培養後、USC スフェロイドを 10% 中性緩衝ホルムアルデヒド (NBF) で固定し、パラフィン包埋の準備をしました。パラフィン切片を含むスライドをヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) で染色し、Upk3a (赤色)、E-カドヘリン (黄色)、および DAPI (青色) または K20 (赤色)、K5 (黄色)、および DAPI (青色) で免疫染色しました。。

ソースデータ

(A) 初代 C3H/HeN 尿路上皮細胞と 5637 細胞をトランスウェルで 2 ～ 3 週間培養し、培地交換前にトランスウェルの経上皮電気抵抗 (TER) を 2 日ごとに測定しました。各細胞株から収集されたデータ (各 n = 3) は平均 ± SD として表されます。 (B) 両方の細胞型の尿路上皮全体を固定し、共焦点顕微鏡分析のために染色しました。 F-アクチン (緑) と DAPI (青)。 (C) 初代 C3H/HeN 尿路上皮細胞および 5637 細胞の表面細胞サイズを、共焦点画像を使用して測定しました (それぞれ n = 10)。データは平均±SDとして表され、有意性は対応のない（両側）t検定によって決定されました（p値<0.001）。 (D) C3H/HeN 細胞と 5637 細胞の両方のトランスウェル培養物を固定し、スライスに切断し、パラフィン包埋のために処理しました。組織切片を切断し、H&E で染色するか、Upk3a、K20、Ecad、K5、p63、および DAPI について免疫染色しました。

ソースデータ

（AB）USC ATAC-seqデータを使用したHOMERモチーフ分析（図4a）により、感作されたアクセス可能なDAR（A）および解決されたアクセス可能なDAR（B）の濃縮されたTF結合モチーフとそのp値のリストが生成されました。 HOMER は、既知のモチーフの DAR 配列をスキャンし、二項検定を使用して濃縮スコア p 値を計算します。 HOMER はまた、DAR の既知のモチーフに最もよく一致する de novo モチーフも発見しました。感作済み USC (A) および解決済み USC (B) が豊富な上位 10 個の既知および新規モチーフのそれぞれが、配列ロゴと p 値とともに示されています。

(A) すべての DMR 比較と各比較の数値のベン図。感作特異的 DMR は、ナイーブ DMR と感作された DMR の比較、および感作された DMR と回復した DMR の比較の間で重複して表示されます。 (B) CpG メチル化の密度は、3 つのグループ (ナイーブ、解決済み、および感作 USC) 間で DNA メチル化に大域的な差異がない二峰性分布を示します。ここで、CpG メチル化は、CpG 部位ごとにメチル化されている総リードの割合を表します。

ソースデータ

(A) ナイーブ USC、解決済み USC、および感作 USC 間の感作特異的 DMR は、DNA メチル化、ATAC、およびヒストン修飾を表示する一連のヒートマップとして視覚化されます: H3K27Ac (活性プロモーター/エンハンサー)、HeK4Me3 (プロモーター)、および H3K27Me3 (ポリコーム抑制) ）。 (B) H3K27Me3 (ポリコーム抑制) の感作特異的低 DMR の上流 5 kb と下流 5 kb の平均シグナルを各細胞株で視覚化します。

RNA はナイーブ USC、解決済み USC、および感作 USC から単離され、RNA-seq によって分析され、差分分析が実行されました。有意性は、Wald 検定とそれに続く、調整された p 値に対する Benjamini-Hochberg FDR を使用した複数の検定補正によって決定されました。108 および 73 の遺伝子は、(A) 未処理 USC および (B) 解決済み USC と比較して、感作 USC で有意に差次的に発現されました (P-adj < 0.05）。 (C) 未処理 USC および (D) 解決済み USC と比較した、感作 USC の強化された経路をここに示します。両方の分析で重複する経路には下線が引かれています。 IPA は、右尾フィッシャーの直接確率検定を使用して有意性を決定し、P 調整 <0.05 で有意に濃縮された経路とみなします。

ソースデータ

RNA は、若年ナイーブ、成人ナイーブ、分解および感作 USC (14 匹のマウスからの n = 3、n = 4、n = 4、n = 3 の細胞株) から単離されました。次に、図 4a に示すように RNA-seq 解析を実行しました。有意性は、Wald 検定とそれに続く調整された p 値の Benjamini-Hochberg FDR を使用した複数の検定補正によって決定されました。 (A) 若年ナイーブ USC と成人ナイーブ USC を比較した差次的発現遺伝子 (DEG) のボルケーノプロットでは、8 つの有意な DEG (FDR カットオフ 0.1) が特定されます。 (B) 図 4a に示す PCA の PCA バイプロットは、各遺伝子が主成分 (PC) にどれだけ強く影響するかを示しています。 Znfx1 および Ly6e を含む遺伝子は PC1 (Dim1) に強く影響し、Kank1 および Krt1 を含む遺伝子は PC2 (Dim2) に強く影響します。

ソースデータ

UTI89感染および疑似感染した分化尿路上皮のRNA-seqデータ（図4c）を使用して、鑑別分析を実行しました。 (A) UPEC 感染対模擬感染のナイーブ、解決、および感作された分化型尿路上皮 (UPEC 感染反応) を比較したボルケーノプロット。 (B) UTI89 感染の有無にかかわらず、ナイーブ、解決、および感作された分化尿路上皮間の Ptgs2 の差次的な遺伝子発現がヒートマップとして視覚化されます。 (C) UTI89 感染した感作分化尿路上皮と消失分化尿路上皮を比較する火山プロットを実行しました。 (D) 経路解析を使用して、UPEC 感染した分化型尿路上皮と比較して、感作された分化型尿路上皮において差次的に発現された遺伝子が豊富な生物学的経路を評価し、右尾フィッシャーの直接確率検定によって有意性を決定し、P 調整 <0.05 を有意とみなしました。充実した通路。 IPA によって強化された特定の経路から、z スコア > 2 および –log(p 値) > 2 を持つ選択された経路が示されています。

ソースデータ

(AB) 図 4 の ATAC-seq データの HOMER モチーフ分析を実行して、感作および消失 USC で見出される DAR における TF 結合モチーフの富化の差を示しました。感作されたアクセス可能な DAR (A) および解決されたアクセス可能な DAR (B) の各トップ 10 の既知および de novo モチーフのリストを使用して (拡張データ図 3a、b)、ナイーブ、解決済みにおけるこれらのモチーフ結合 TF の遺伝子発現の差、および感作された分化型尿路上皮がヒートマップとして視覚化されます。 RNA-seq データに見つからない遺伝子はヒートマップから除外されます。 (C) 感作された分化尿路上皮と解決された分化尿路上皮の間で発現の異なる上位 10 の TF が、Log2(FC) および P-adj を示すヒートマップとして視覚化されます。 DEG の有意性は、Wald 検定とそれに続く調整された p 値の Benjamini-Hochberg FDR を使用した複数の検定補正によって決定されました。

(A) 異なる USC におけるクロマチンアクセシビリティ、DNA メチル化、ヒストン修飾 H3K4Me3 と H3K27Ac の違いを、ATAC-seq、全ゲノム重亜硫酸塩シーケンス (WGBS)、および CUT&RUN によって評価しました。ナイーブ USC、分解 USC、および感作 USC を比較した相対的な DNA メチル化、クロマチンアクセシビリティ、および Casp1 プロモーター部位のヒストン修飾が、リードカバレッジとコンセンサスピーク下のリードの割合を使用して正規化されたシグナルを表示することにより、ヒートマップとして表示されます。 (B) Casp1 プロモーター付近の潜在的な TF 結合部位がエピゲノムブラウザマップ上で視覚化されます。

表 1. 図 3a、b を裏付ける、感作 USC と解決 USC の間の 2,880 の有意に差次的にアクセス可能な領域 (DAR) とその近位遺伝子名のリスト。表 2. 偽感染感作尿路上皮と解離分化尿路上皮を比較した IPA の上位発現差遺伝子 (DEG)。「Exp log Ratio」は、式の log2 倍の変化を示します。表 3. 抗体情報。表 4. qRT-PCR プライマーのリスト。

タブ 1 (図 1b)。トランスウェルにおける #1 ～ 5 の独立した幼若 C3H/HeN の 21 日間の培養/分化中の、指定された日の TER の測定。

タブ 1 (図 2b)。 8週間の雌C3H/HeNマウスにおける108 cfu UTI89 KanRによる初回感染中の4wpiにわたる尿細菌力価の経時変化。タブ 2 (図 2f)。トランスウェルあたりの平均細胞サイズは、95% CI の中央値として表されます。タブ 3 (図 3g)。個々の細胞サイズは 95% CI の中央値として表されます。

タブ 1 (図 3c)。 GREAT GO 用語の分析に使用される、増感されたアクセス可能な DAR (増感された DAR と解決された DAR の比較、n = 747 DAR、倍率変化 > 1.5、FDR < 0.05)。タブ 2 (図 3d–h)。ナイーブ対感作、および分解対感作の比較から得られた、189 の感作特異的メチル化領域 (DMR) のリスト。

タブ 1 (図 4b-1)。感作 USC と分解 USC の DEG 比較。これも ED を裏付けています。図 6b。タブ 2 (図 4b-2)。感作 USC とナイーブ USC 間の DEG 比較。これも ED を裏付けています。図 6a。タブ 3 (図 4d)。火山プロットに使用した、疑似感染した感作と解離した分化した尿路上皮の DEG 比較。タブ 4 (図 4e)。疑似感染した感作された尿路上皮と解離した分化した尿路上皮の IPA 経路分析。タブ 5 (図 4f)。感染の有無にかかわらず、ナイーブ、分解および感作された分化尿路上皮における差次的遺伝子発現のヒートマップ視覚化。拡張データ図もサポートします。 8bと9。

タブ 1 (図 5d)。 UTI89感染の有無にかかわらず、ナイーブ、分解および感作された分化型尿路上皮におけるCasp1の遺伝子発現をqRT-PCRによって測定した（n = 4、4、4、5、4、4）。タブ 2 (図 5f)。 4 hpi での UTI89 感染時のナイーブ、消散、および感作された分化した尿路上皮の LDH 測定。データは n = 7、10、14、8、10、4、6 から得られました。タブ 3 (図 5g)。ナイーブマウス、回復マウス、感作マウスに、107 c f u の WT UTI89 (HlyA+) または UTI89ΔhlyA を投与しました。データは 2 ～ 3 つの独立した実験から結合されました。それぞれ n = 10、7、19、8、14、11 匹のマウスから測定した 6 hpi での膀胱細菌量を 2 ～ 3 回の独立した実験で調べました。タブ 4 (図 5h)。チャレンジ感染時のナイーブマウス、回復マウス、および感作マウスの慢性膀胱炎の発生率と 28 dpi での回復。

図5e。 N3、R3、および S3 分化尿路上皮のトリミングされていないゲルおよびブロット画像。 a、Tris-グリシン 4 ～ 20% ローディング色素を使用した 2 セットの 6 サンプル (PBS 疑似感染 N3、R3、および S3 尿路上皮細胞、および UTI89 感染 N3、R3、および S3 尿路上皮細胞) をロードしたゲル全体。未感染および感染した感作尿路上皮細胞の両方にカスパーゼ-1 染色が見られました。感作細胞は感染条件に関係なくカスパーゼ-1を発現するため、偽感染したN3、R3、およびS3データのみを論文に使用しました。 b、膜画像（1〜6レーンのカットはβ-アクチン染色に使用され、7〜14レーンのカットはカスパーゼ-1染色に使用されました）。 c. β-アクチンとカスパーゼ-1の染色には異なる露光時間（それぞれ1分と3分）が必要であるため、フィルム現像は別々に行われました。 β-アクチン (約 48 kDa) の発現はすべてのサンプルで同様でしたが、感作細胞のみ P45 プロカスパーゼ-1 (約 45 kDa) および P35 カスパーゼ-1 (約 35 kDa) の位置で染色されました。原稿の図5eでは、(d) よりきれいなバンド分離のために、β-アクチンの1分間の露光の代わりに20秒の露光画像が使用されました。

タブ 1 (ED 図 1b)。 EDに示された条件で培養されたC3H / HeN初代細胞からqRT-PCRによって測定されたp63発現。図1b-d。測定時点の各条件は、それぞれ n = 12、9、13、12、12、11、11 です。タブ 2 (ED 図 1c)。同じサンプルセットを使用した Axin2 発現の測定。タブ 3 (ED 図 1d)。同じサンプルセットを使用した Upk3a 発現の測定。

タブ 1 (ED 図 2a)。分化条件で 2 ～ 3 週間培養した初代 C3H/HeN USC と 5637 細胞の間の経上皮電気抵抗 (TER) の比較。タブ 2 (ED 図 2b)。初代 C3H/HeN 尿路上皮細胞と 5637 細胞の間の表面細胞サイズの比較 (それぞれ n = 10)。

タブ 1 (ED 図 4a-1)。ナイーブDMRと感作DMR。タブ 2 (ED 図 4a-2)。ナイーブ DMR と解決済み DMR。タブ 3 (ED 図 4a-3)。解決した DMR と感作した DMR の比較。

タブ 1 (ED 図 6c)。感作 USC と未処理 USC の IPA 経路分析。タブ 2 (ED 図 6d)。感作された USC と回復した USC の IPA 経路分析。

タブ 1 (ED 図 7a)。火山プロットに使用された、幼若ナイーブ USC と成人ナイーブ USC を比較する DEG。

タブ 1 (ED 図 8a-1)。火山プロットに使用された、UTI89感染対模擬感染ナイーブ分化型尿路上皮のDEG比較。タブ 2 (ED 図 8a-2)。火山プロットに使用される、UTI89 感染と疑似感染の解決された分化した尿路上皮の間の DEG 比較。タブ 3 (ED 図 8a-3)。火山プロットに使用された、UTI89感染対疑似感染感作分化尿路皮細胞間のDEG比較。タブ 4 (ED 図 8b)。火山プロットに使用された、UTI89 感染感作尿路上皮と解離分化尿路上皮の DEG 比較。タブ 5 (ED 図 8c)。 UTI89に感染した感作型尿路上皮と消失した分化型尿路上皮のIPA経路解析。

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転載と許可

ラッセル、SK、ハリソン、JK、オルソン、BS 他尿路病原性大腸菌感染によって誘発される上皮の訓練された免疫は、尿路疾患の転帰に影響を与えます。 Nat Microbiol 8、875–888 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41564-023-01346-6

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受信日: 2022 年 12 月 23 日

受理日: 2023 年 2 月 20 日

公開日: 2023 年 4 月 10 日

発行日：2023年5月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01346-6

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