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BMC Medicine volume 21、記事番号: 161 (2023) この記事を引用

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3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

第一選択の抗プログラム細胞死タンパク質-1 (PD-1) 単独療法を受けたマイクロサテライト高不安定性 (MSI-H) 転移性結腸直腸がん (mCRC) 患者の客観的奏効率は、わずか 40 ～ 45% です。単一細胞 RNA シーケンス (scRNA-seq) により、腫瘍微小環境を構成するあらゆる種類の細胞の公平な分析が可能になります。したがって、我々は、scRNA-seq を使用して、MSI-H/ミスマッチ修復欠損 (dMMR) mCRC における治療抵抗性群と治療感受性群の間の微小環境成分間の差異を評価しました。この分析によって同定された耐性関連の細胞型と遺伝子は、その後臨床サンプルとマウスモデルで検証され、MSI-H または dMMR mCRC における抗 PD-1 耐性の分子機構がさらに明らかになりました。

第一選択の抗PD-1単独療法に対する原発性および転移性病変の反応は放射線科によって評価された。 MSI-H/dMMR mCRC 患者の原発巣由来の細胞を、scRNA-seq を使用して分析しました。各クラスター内のマーカー遺伝子を同定するために、個別の細胞クラスターが同定され、サブクラスター分析が行われました。次に、タンパク質間相互作用ネットワークを構築して、主要な遺伝子を特定しました。免疫組織化学と免疫蛍光を適用して、臨床サンプル中の主要な遺伝子と細胞マーカー分子を検証しました。免疫組織化学、定量的リアルタイム PCR、およびウェスタンブロッティングを実行して、IL-1β および MMP9 の発現を調べました。さらに、フローサイトメトリーを使用して、骨髄由来サプレッサー細胞 (MDSC) および CD8+ T 細胞の定量分析と選別を実行しました。

MSI-H/dMMR mCRC 患者 23 人の腫瘍反応が放射線科によって評価されました。客観的奏効率は43.48%、疾患制御率は69.57%でした。 ScRNA-seq 解析により、治療抵抗性グループと比較して、治療感受性グループではより多くの CD8+ T 細胞が蓄積していることが示されました。臨床サンプルとマウスの両方を用いた実験により、IL-1β駆動型MDSCの浸潤とCD8+ T細胞の不活化がMSI-H/dMMR CRCにおける抗PD-1耐性に寄与することが示された。

CD8+ T 細胞と IL-1β が、それぞれ抗 PD-1 耐性と最も高い相関を持つ細胞型と遺伝子として同定されました。 IL-1β駆動型MDSCの浸潤は、CRCにおける抗PD-1耐性の重要な因子であった。 IL-1βアンタゴニストは、抗PD-1阻害剤耐性に対する新たな治療法として開発されることが期待されています。

査読レポート

結腸直腸癌 (CRC) は最も一般的な悪性消化管腫瘍の 1 つであり、すべての悪性腫瘍の中で 2 番目に高い死亡率と 3 番目に発生率が高い [1]。 CRC の診断と治療戦略は近年急速に改善されていますが、多くの CRC 患者の予後は好ましくありません。多くの患者は、すでに病気が進行した段階に達するまで診断されず、これが効果的な治療の大きな障害となっています。

ミスマッチ修復欠損 (dMMR) およびマイクロサテライト高不安定性 (MSI-H) 状態に関連するタンパク質の発現は、CRC 患者における免疫療法の有効性を予測するのに有益であると広く認識されています。従来のがん治療と比較して、免疫療法は MSI-H mCRC の客観的奏効率 (ORR) をある程度改善しました [2、3]。しかし、第一選択の抗プログラム細胞死タンパク質-1 (PD-1) 単独療法を受けた MSI-H/dMMR mCRC 患者の ORR は、わずか 43.8% でした [4]。したがって、半数以上の患者は、MSI-H 表現型のため、免疫療法または化学療法±標的療法の恩恵を受けられません [5]。これを考慮して、この研究は、MSI-H mCRC 患者における抗 PD-1 耐性のメカニズムを調査することを目的としています。

ScRNA-seq は、MSI-H 患者の免疫状況の理解を深めることに貢献し、ひいては免疫療法のメカニズムに新たな洞察をもたらしました。これまでの研究は主に、マイクロサテライト安定型（MSS）mCRC における免疫抵抗性のメカニズムに焦点を当ててきました。いくつかの研究により、単細胞レベルでの CD40 および CD73 アンタゴニスト療法の分子機構が明らかになり、MSS mCRC に対する免疫チェックポイント阻害剤との併用治療の可能性のある理論的根拠が提供されました [6、7、8]。しかし、MSI-H mCRC 患者における PD-1 耐性のメカニズムはまだ不明です。したがって、scRNA-seq によって抗 PD-1 耐性グループと抗 PD-1 感受性グループの免疫微小環境を比較することは、MSI-H mCRC 患者における免疫療法耐性の根底にあるメカニズムの解明に役立つ可能性があります。

本研究では、PD-1 阻害剤 (チスレリズマブ) で治療した MSI-H mCRC の治療感受性群と治療抵抗性群から結腸内視鏡検査中に組織サンプルを収集しました。次に、scRNA-seq を使用して 2 つのグループの細胞サブタイプと主要な遺伝子を包括的に解析しました。臨床サンプルとマウスモデルを使用して追跡実験を実施し、scRNA-seq で示される主要な細胞型または遺伝子によって誘導される抗 PD-1 耐性の潜在的なメカニズムを検証しました。

23人のMSI-H/dMMR mCRC患者は、2020年8月1日から2022年5月31日まで雲南癌病院（昆明医科大学第三付属病院）で抗PD-1単剤療法で治療された。PD-1阻害薬（200 mg、ティスレリズマブ、Bei Gene Ltd.、中国）を各21日サイクルの1日目に静脈内注射した。有効性は、治療の 3 サイクルごとに放射線学的に評価されました。患者が完全奏効 (CR) または部分奏効 (PR) を示した場合、患者は抗 PD-1 治療に感受性があると見なされ、患者が進行性疾患 (PD) または安定した疾患を患っている場合、抗 PD-1 治療に耐性があると見なされました。（SD）。結腸内視鏡検査中に新鮮な腸腫瘍組織 (2 ～ 4 mm) が採取されました。合計 23 名の患者 (感受性 10 名、耐性 13 名) からの組織サンプルを免疫組織化学 (IHC) および免疫蛍光 (IF) によって分析しました。 6 人の患者 (PR 3 名と PD 3 名) が scRNA-seq のためにランダムに選択されました。すべての参加者は、研究を開始する前に書面によるインフォームドコンセントを提出しました。さらに、雲南がん病院の倫理委員会は、ヘルシンキ宣言に記載されている倫理原則に従って、ヒトを対象とするすべての研究プロトコールを承認した。包含基準は次のとおりであった：結腸内視鏡検査生検によって確認された原発性結腸直腸腺癌、およびCT/MRによって確認された遠隔転移。 MSI-H/dMMR ステータスはマルチプレックス qPCR または IHC によって確認されます。第一選択の抗PD-1単剤療法を受けている。禁忌により結腸内視鏡検査でサンプルを採取できなかった場合、または細胞の活性や量が不十分なために単一細胞シーケンシングを実行できなかった場合、患者は除外されました。

Siemens (SOMATOM Definition AS +) 128 スライススパイラル CT を単純スキャンおよび強化スキャンに使用しました。患者は絶食しており、指示に従って腸の準備を行っていました。スキャン範囲は腹腔全体をカバーしました。走査層の厚さは１．０ｍｍ、間隔は０．６ｍｍであった。イオヘキソール（３００ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｌ）を造影剤として使用した。動脈相スキャンの遅延時間は 35 ～ 40 秒、静脈相スキャンの遅延時間は 70 ～ 80 秒でした。 MRI は Philips Elision 3.0 T を使用して実行され、スキャンシーケンスには、横方向 T1WI_Tse、矢状および冠状 T2WI_Tse、高解像度 T2WI_Tse、拡散強調イメージング、および多相動的強調が含まれていました。ガドリニウムジアミンを造影剤として使用した。結腸内視鏡検査はオリンパス CV-290 を使用して実施され、組織は少なくとも 5 年の経験を持つ医師によって収集されました。

CRC患者から得た新鮮な腫瘍組織を、消化酵素とともにMACS Cチューブ(Miltenyi Biotec)に直ちに移した。次に、gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) によって消化を実行しました (37 °C で 30 分間)。メーカーのプロトコールに従って、単一細胞を Chromium Controller (10X Genomics) で処理しました。簡単に説明すると、細胞を 20 mL の RPMI 1640 (Gibco) で洗浄し、70 μm ナイロンストレーナー (BD Falcon) で濾過し、遠心分離 (330 × g、10 分間、4 °C) で収集し、塩基性溶液に再懸濁しました。 0.2% ウシ胎児血清 (FBS; Gibco) を含みます。

10 × Chromium システム (10 × Genomics) と LC Sciences によるライブラリー調製を利用して、Chromium Single Cell 30 Reagent Kit (v2 Chemistry) の推奨プロトコルに従ってシングルセルを実行しました。シーケンスには Illumina HiSeq4000 が使用され、ライブラリの後処理と品質管理には 10 × Cell Ranger パッケージ (v1.2.0; 10 × Genomics) が使用されました。

すべての単一細胞シーケンスデータは Cell Ranger V6.1.1 によって分析されました。結果は追加ファイル 1: 表 S1 に示されています。 3 人の耐性患者 (R1、R2、R3 と命名) と 3 人の感受性患者 (S1、S2、S3 と命名) からの CRC サンプルには、合計 56,092 個の細胞が含まれていました。各サンプルで検出された遺伝子の数は 17,564 ～ 18,093 の範囲でした。細胞固有の分子識別子の数の中央値は 3,403 ～ 6,915 の範囲でした。配列飽和度は 47 ～ 63% の範囲でした。これらの結果は、全体として、シーケンスの品質がその後の相関分析で使用するのに十分であることを示しています。

合計で、この分析には感受性グループと耐性グループからの 56,092 個の細胞が含まれていました。 R の Seurat パッケージ (バージョン 4.0.5) は、分析と品質管理に使用されました [9]。遺伝子が 3 個未満の細胞でのみ検出された場合、または遺伝子細胞マトリックスによって検出された遺伝子の総数が 200 個未満の場合、低品質の細胞 (n = 3,071) が除去されました。次に、グローバルスケーリング法 LogNormalize を実行して、残りの 53,021 個の細胞の遺伝子発現値を正規化しました。次に、FindVariableFeature 関数と R Studio の vst メソッドを組み合わせて、最も可変性の高い遺伝子を特定し、次元削減に使用しました。主成分分析の結果、2000 個の非常に可変性の高い遺伝子が特定されました。 Jackstraw 関数と ScoreJackStraw 関数を適用して、最も重要な主成分を決定しました。最後に、グラフベースの教師なしクラスタリングが実行され、FindNeighbors 関数と FindClusters 関数で定義された非線形 t 分布確率的近傍埋め込み (t-SNE) プロットを使用して視覚化されました。

細胞型のアイデンティティは、Celldex データベースに基づいた SingleR (V1.6.1) パッケージを使用して特徴付けられました。 R パッケージ Seurat の FindMarkers 関数を使用して、min.pct = 0.5、logfc.threshold = 1、min.diff.pct = 0.3、および P < 0.05 で各セルクラスターのマーカーをリストしました。このパイプラインで使用されるマーカーは、追加ファイル 2: 表 S2 にリストされています。

各細胞サブタイプ、生物学的プロセス (BP)、細胞組成 (CC)、および分子機能 (MF) に関与する分子機構を調査するために、R パッケージclusterProfiler (バージョン 3.14.3) を使用して GO 濃縮分析と KEGG 経路分析を実行しました。有意性の閾値は調整済み (調整) P < 0.05 に設定されます。

最初の 2,000 個の非常に可変性の高い遺伝子は、FindVariableFeature 関数と vst メソッドを組み合わせて使用してスクリーニングされました。 R パッケージ Seurat の FindMarkers 関数は、さまざまな細胞サブタイプのマーカー遺伝子を見つけるために使用されただけではありません (スクリーニングパラメーターのしきい値は min.pct = 0.5、logfc.threshold = 1、min.diff.pct = 0.3、P < 0.05) ）だけでなく、抗 PD-1 感受性サンプルと抗 PD-1 耐性サンプル間の各細胞サブタイプの DEG を識別することもできます（閾値は |avg_log2FC|≥ 0.5、P ≤ 0.05 に設定）。擬似時間関連遺伝子とPD-1耐性関連DEGの間で重複する遺伝子がキー遺伝子の候補であると考えられた。

感受性群と耐性群における免疫細胞の違いを明らかにするために、Monocle ソフトウェア (バージョン 2.20.0) [10] を使用してサンプルの軌跡を分析し、分化プロセスを調査しました。まず、Monocle のクラスターおよびカスタム発生マーカー遺伝子の基礎に基づいて、より洗練されたメソッド (dpFeature) が作成されました。 dpFeature によって選択された細胞サブタイプ間で、高度な分散 (q < 0.01) を持つシグネチャ遺伝子が同定されました。次に、DDRTree を適用して軌道に沿った細胞の次元削減と擬似時間的位置合わせを行い、最後に軌道を 2D t-SNE マップとして視覚化しました。擬似時間関連遺伝子は、上記の特徴遺伝子の q < 0.05 に基づいて同定されました。

Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes (STRING; http://string.embl.de/) を使用して、候補キー遺伝子に対してタンパク質間相互作用 (PPI) 解析を実行しました。 STRING データベースは、タンパク質の直接的 (物理的) および間接的 (機能的) な関連を評価するために使用できます [11]。 Cytoscape 3.6.1 を使用して、PPI 分析結果のネットワークモデルを確立しました。 STRING オンラインツールに基づいて、候補キー遺伝子の PPI ネットワークが中程度の信頼度 = 0.4 で構築されました。この研究では、PPI ネットワークの各ノードの接続性 (次数) に基づいて、上位 4 つの遺伝子がキー遺伝子として選択されました。

この研究には結腸直腸癌細胞株 CT26 が選択されました。細胞のトランスフェクションに使用したプラスミドは小野株式会社によって合成されました。レンチウイルス感染の 18 ～ 24 時間前に、3 × 105/ウェルの接着細胞を 6 ウェルプレートに播きました。レンチウイルスをトランスフェクトした細胞数は約 6 × 105/ウェルでした。細胞がウェルに接着し、７０％コンフルエントになったとき、元の培地を、８μｇ／ｍｌのポリゾアンおよび適量のウイルス懸濁液を含む２ｍｌの新鮮な培地と交換した。次に細胞を 37 °C で 8 時間インキュベートし、その後ウイルスを含む培地を新鮮な培地と交換しました。トランスフェクションが成功すると、48 ～ 72 時間後に蛍光タンパク質が見えるようになります。蛍光が観察されなかった場合は、感染プロトコルを繰り返しました。ピューロマイシンを追加して、レンチウイルスの過剰発現を 1 か月間スクリーニングしました。

すべての動物実験は昆明医科大学の動物倫理委員会によって承認されました。実験運用の過程では、ARRIVE ガイドラインに厳密に従います。実験全体を通して、研究者はケージから取り出された動物がどのグループに割り当てられるのかを知らず、実験を行う動物管理者と研究者は割り当て順序を知らず、実験の結果を評価、テスト、または定量化する研究者は知りませんでした。介入の手段を知っている。

BALB/c マウス（雄、生後 6 ～ 8 週齢、20 ～ 30 g）は、Beijing Sipeifu Biotechnology Co., Ltd. から購入しました。すべてのマウスは、昆明医科大学の動物飼育施設内の SPF 室で飼育されました。食料と水は自由に提供されます。実験は1週間の適応給餌後に実施されました。 Mead が提案した分散分析の自由度 (E) に基づいて、必要な実験動物のサンプルサイズを推定しました [12]。この研究におけるマウスの合計サンプルサイズは 25 匹で、各グループに 5 匹ずつランダムに 5 つのグループに分けられました。単純なランダムサンプリング法を使用して、すべてのマウスをランダムに 5 つのグループに分け、OE-NC、OE-IL-1β、OE-IL-1β + ジアセレイン、OE-IL-1β + ニボルマブ、および OE-IL-1β + として定義しました。それぞれジアセレイン + ニボルマブグループ。対照群モデル（OE-NC群）では、100μl PBS中の1×106個の空ベクター安定化細胞をマウスの脇腹に皮下注射した。治療モデルでは、100μl PBS中の1×106個の過剰発現IL-1β安定トランスフェクト細胞をマウスの同じ部位に皮下注射した。腫瘍体積が 40 mm3 に達したとき (つまり 7 日目)、OE-IL-1β + ジアセレイングループは、IL-1β アンタゴニスト (ジアセレイン、0.07 mg/kg)、OE-IL-1β + ニボルマブの腹腔内 (ip) 注射を開始しました。グループは抗PD-1抗体(ニボルマブ、2mg/kg)の腹腔内注射を受けた。 OE-IL-1β + ジアセレイン + ニボルマブ群は、ジアセレインとニボルマブの組み合わせを腹腔内投与して治療されました。 OE-NC群とOE-IL-1β群のマウスには同量のPBSを投与した。腫瘍細胞接種の7日目から3日ごとに、ジアセレインおよびニボルマブを腹腔内注射した。

マウスの体重と腫瘍の体積を、各グループの0日目、7日目、10日目、12日目、14日目、および16日目にそれぞれ測定した。腫瘍体積は 1/2 (長さ × 幅 2) として計算されました。腫瘍細胞の接種後１６日目に、ペントバルビタールナトリウム（２００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によりすべてのマウスを屠殺した。角膜反射の消失と瞳孔の発光に基づいてマウスの死を判定します。腫瘍組織を剥がして重量を測定し、その後分子生物学的実験を実施しました。実験エンドポイントとしての 16 日の選択は、実験前の結果に基づいています。実験エンドポイントとしての 16 日の選択は、実験前の結果に基づいています。実験全体を通して、腫瘍の長さは 20 mm を超えてはならず、腫瘍の重量はマウスの重量の 10% を超えてはなりません [13]。

TRIzol試薬（Ambion）を使用して培養細胞株CT26または組織から全RNAを抽出し、製造業者の指示に従ってSureScriptファーストストランドcDNA合成キット（Servicebio）によってcDNAに逆転写した。 2xUniversal Blue SYBR Green qPCR Master Mix (Servicebio) および CFX96 配列検出システム (Bio-Rad、Hercules、CA、USA) を qPCR に使用し、次のプライマーを使用しました: IL-1β (ヒト)、フォワード: 5'- AATCTCCGACCACCACTACA-3' およびその逆: 5'-GACAATCGCTTTTCCATCT-3'; MMP9 (ヒト)、順方向: 5'-ATGAGCCTCTGGCAGCCCCTGGTCC-3'、逆方向: 5'- GGACCAGGGGCTGCCAGAGGCTCAT-3'。 GAPDH (ヒト)、順方向: 5'-CCCATCACCATCTTCCAGG-3'、逆方向: 5'-CATCACGCCACAGTTTCCC-3'。 IL-1β (マウス)、順方向: 5'- CCTATGTCTTGCCCGTGG-3'、逆方向: 5'- GTGGGTGTGCCGTCTTTC-3'。 MMP9 (マウス)、順方向: 5'-GTGTGTCCCGTTCATCTTT-3'、逆方向: 5'- GCCGTCTATGTCGTCTTTAT-3'。 GAPDH (マウス)、順方向: 5'-CCTTCCGTGTTCCTACCCC-3'、逆方向: 5'-GCCCAAGATGCCCTTCAGT-3'。 GAPDHを標準化された内因性対照として使用し、2-△△CTを使用して相対的なmRNA発現を計算しました。

タンパク質サンプルは、1% プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤 (PMSF; Servicebio) を含む RIPA 溶解バッファー (Servicebio、武漢、中国) を使用して組織または細胞から単離しました。タンパク質の定量にはBCAタンパク質アッセイキット(Biyuntian Biotechnology)を使用した。ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を適用して、異なる分子量のタンパク質を分離し、タンパク質をポリフッ化ビニリデン(Servicebio)メンブレンに転写しました。メンブレンを 5% スキムミルクで室温で 90 分間ブロックし、その後一次抗体 (Proteintech; IL-1β 1:1000; MMP9 1:1000; β-actin 1:25,000) とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 HRP結合二次抗体と室温で2時間インキュベートすることによって。

組織のパラフィン切片を脱パラフィンし、再水和した。次に、クエン酸ナトリウム緩衝液を使用して検出対象の抗原を抽出し、熱誘導により抗原の回復を完了しました。切片組織を 3% H2O2 で 15 分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックし (IF はこのステップなしで続行)、その後 5% ウシ胎児血清を含む PBS で 30 分間ブロックしました。組織を一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートし、続いて暗所で結合二次抗体とともに室温でさらに2時間インキュベートしました。 DAB は IHC の核マーカーとして使用されました。 DAPI (EX:330-380 nm、Em:420 nm) を使用して細胞核 (青色) を染色し、Alexa Fluor 488 (EX:495 nm、Em:519 nm) を使用して CD11b (緑色) を染色しました。 555 (EX:555 nm、Em:565 nm) を使用して CD14、CD15、CD8 (赤色) を染色し、Alexa Fluor 594 (EX:590 nm、Em:617 nm) を使用して CD33 (オレンジ) を染色しました。

多形核 (PMN)-MDSC/単球 (M)-MDSC は、CD11b-FITC (Biolegend、101,205、米国)、Ly-6G-PE (Biolegend、127,607、米国)、および Ly-6C-APC (Biolegend、128,016) で染色されました。、ＵＳＡ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、製造業者の指示に従って、ＣＤ３−ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１００，２０３、ＵＳＡ）およびＣＤ８−ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１００，７０７、ＵＳＡ）で染色した。サンプルは、Guava easyCyte 8HT フローサイトメーター (Millipore) で実行されました。前方散乱ゲートと側方散乱ゲートは FlowJo_V10 を使用して実行されました。

バイオインフォマティクス分析は、R ソフトウェアを使用して実行されました。 varElect オンラインツールを適用して、PPI ネットワーク内の遺伝子と CRC の間の相関関係を分析しました。高いスコアは強い相関を示し、特に明記しない限り、有意性閾値は P < 0.05 でした。すべてのデータは、独立した実験の平均値 ± 標準誤差 (SE) として表示されます。多重比較事後分析を伴う両側一元配置分散分析 (ANOVA) が使用され、P 値 < 0.05 (*)、P < 0.01 (**)、P < 0.001 (***)、および P < 0.0001 (****) は有意であると示されます。統計分析は、GraphPad Prism 9.0を使用して実行されました。

2020年8月1日から2022年5月31日まで、合計23人のMSI-H/dMMR mCRC患者が第一選択の抗PD-1単剤療法で治療された。治療反応はPD-1の3サイクルごとに放射線検査によって評価された。阻害剤。 PR は 7 人の患者について記録され、CR は 3 人の患者について記録され、SD は 6 人の患者について記録され、PD は 7 人の患者について記録された。 ORR は 43.48% (10/23)、疾患制御率 (DCR) は 69.57% (16/23) でした (図 1A)。免疫療法前後の 6 人の患者における原発巣および転移病変の放射線学的所見を図 1B および C に示します。図 1B は、耐性グループ (R1、R2、および R3) の 3 人の患者における原発巣および転移病変の変化を示しています。）抗PD-1治療後。 R1 の原発病変の長さは 2.1 cm から 3.2 cm に増加し、転移病変の長さは 1.6 cm から 2.7 cm に増加しました。 R2の原発巣と転移巣はそれぞれ0.5cmから1.9cm、0.3cmから0.8cmに増加した。 R3 の原発巣の長さは 1.5 cm から 1.9 cm に増加し、転移巣の数は 3 から 20 以上に増加しました。R1、R2、および R3 の反応は PD として評価されました。同様に、図 1C は、抗 PD-1 単独療法後の感受性群の 3 人の患者 (S1、S2、および S3) における原発巣および転移巣の変化を示しています。 S1 の原発腫瘍の長さは 2.0 cm から 1.5 cm に減少し、転移腫瘍の長さは 2.1 cm から 1.2 cm に減少しました。 S2の原発巣と転移巣の長さは、それぞれ1.2cmから0.7cm、5.3cmから4.4cmに減少した。 S3の原発巣と転移巣の長さは、それぞれ1.3cmから0.8cm、2.1cmから0.5cmに減少した。 S1、S2、S3 の応答を PR として評価しました。

第一選択の PD-1 単独療法後の MSI-H mCRC の有効性評価。第一選択の PD-1 単独療法を受けている 23 人の患者をスクリーニングするためのフローチャート。免疫療法前後の原発巣および転移巣の画像を、(B) 耐性患者 3 名と (C) 感受性患者 3 名について示しています。

合計 6 人の患者 (PR 3 名と PD 3 名) が scRNA-seq のためにランダムに選択されました。 10 × ゲノミクス scRNA シーケンスデータセットは、3 人の耐性患者 (R1、R2、R3 と命名) と 3 人の感受性患者 (S1、S2、S3 と命名) から得られた新鮮な CRC 組織から得られました。 3,071 個の低品質細胞を除去した後、合計 53,021 個の細胞が最終分析に使用されました (図 2A)。具体的には、R1 から 7679 個、R2 から 10,797 個、R3 から 9020 個、S1 から 7880 個、S2 から 9369 個、S3 から 8276 個のセルがありました。図 2B は、最も変異の多い 10 個の遺伝子を標識した上位 2000 個の高度に変異のある遺伝子を示しています。 2000 個の非常に多様な遺伝子の PCA では、CRC 細胞において耐性群と感受性群の間で有意な分離は示されませんでした (図 2C)。線形次元削減分析に基づいて 20 の主成分が選択されました (図 2D)。 RunMap 関数と組み合わせた次元値 20 によるデータの非線形次元削減により、各サンプル内の細胞のより均一な分布が明らかになりました (図 2E)。その後、これらの細胞は、t-SNE による遺伝子発現レベルに基づいて 23 の細胞クラスターに分類され、これらの細胞分類群の分布は感受性グループと耐性グループ全体でほぼ同一であることがわかりました (図 2F)。

6 つの CRC サンプルの細胞クラスターが scRNA シーケンスによって同定されました。さまざまなサンプル内の細胞の数。 B 上位 2000 のバリアント遺伝子の表示。 C 上位 2000 のバリアント遺伝子の PCA。 D 主成分の線形次元削減分析。 E RunMap 関数と組み合わせた非線形次元削減によるセル分布の分析。 F t-SNEによる感受性群と耐性群の細胞塊分布の解析

R パッケージ SingleR と celldex を使用して、23 個の細胞クラスターを次の 9 つの細胞サブタイプに注釈付けしました: CD8 + T 細胞、上皮細胞、B 細胞、樹状細胞 (DC)、造血幹細胞、単球、線維芽細胞、筋細胞、および内皮細胞 (図.3A）。図 2F と組み合わせると、感受性グループの CD8+ T 細胞と単球の凝集は耐性グループよりも有意に高かった。各サンプル中の各細胞サブタイプの細胞数は、追加ファイル 3: 表 S3 に示されています。 9 つの細胞サブタイプについて合計 679 個のマーカー遺伝子が得られました (追加ファイル 2: 表 S2): 線維芽細胞用の 176 個のマーカー、内皮細胞用の 143 個のマーカー、筋細胞用の 131 個のマーカー、DC 用の 67 個のマーカー、単球用の 65 個のマーカー、造血幹細胞のマーカーは 40、上皮細胞のマーカーは 27、CD8+ T 細胞のマーカーは 17、B 細胞のマーカーは 13 です (図 3B)。各細胞サブタイプのトップ遺伝子を図 3C に示します。これらの遺伝子のヒートマップは、各クラスターが異なる遺伝子発現の特徴を示すことを示しました (図 3D)。

細胞サブタイプのアノテーションとマーカー遺伝子の機能強化分析。 R パッケージ SingleR および celldex に従ったセルサブタイプのアノテーション。 B 各細胞サブタイプのマーカー遺伝子の数。 C 各サブタイプの上位遺伝子マーカーを示す散布図。 D 各サブタイプのトップ遺伝子メーカーを示すヒートマップ

GO 分析により、これらのマーカー遺伝子は主に、リンパ球と単球の分化や白血球の正の制御などの免疫関連の生物学的プロセスに富んでいることが示されました。さらに、それらは「サイトカイン媒介シグナル伝達経路」とも有意に関連していた(追加ファイル4:図S1A-C)。 KEGG濃縮分析（追加ファイル4：図S1D）は、マーカー遺伝子が免疫/炎症反応（例：「サイトカイン - サイトカイン受容体相互作用」、「FcイプシロンRIシグナル伝達経路」、「AGE - RAGEシグナル伝達経路」）と有意に相関していることを示しました。「細胞接着分子」）。「PI3K-Aktシグナル伝達経路」や「がんにおけるプロテオグリカン」などのがん関連経路も大幅に濃縮されました。

9 つの細胞サブタイプの発生軌跡がシミュレートされ、1623 個の特徴遺伝子が細胞亜集団間で差次的に発現されることが判明しました (追加ファイル 5: 表 S4)。図 4A は、これらの特徴遺伝子の比較的高い分散を示しています。次に、R パッケージ Monocle を使用して、個々の細胞をこれらの特徴遺伝子によって分類し、分化軌跡の全スペクトルのツリー構造を構築しました (図 4B)。細胞型分類の観点から見ると、全体として、提案されている細胞サブタイプの時間的進化傾向は、上皮細胞から中間細胞（線維芽細胞、造血幹細胞、単球、B細胞など）、そして最終的にはCD8+ T細胞への緩やかな移行でした（図1）。 4C）。合計 1,454 個の擬似時間関連遺伝子が 1,623 個の特徴遺伝子から同定されました (P < 0.05; 追加ファイル 6: 表 S5)。 KEGG 分析 (追加ファイル 7: 図 S2A) により、これらの遺伝子が「サイトカイン-サイトカイン受容体相互作用」、「ウイルスタンパク質とサイトカインおよびサイトカイン受容体との相互作用」、および「細胞周期」に関与していることが明らかになりました。それらはまた、腫瘍関連経路「NF-κBシグナル伝達経路」、「p53シグナル伝達経路」、および「PPARシグナル伝達経路」とも密接に関連していた。 GO-BP分析により、これらの擬似時間関連遺伝子は、免疫応答、炎症反応、免疫細胞の分化、増殖、遊走、および走化性に関連していることが明らかになりました（追加ファイル7：図S2B）。さらに、これらの遺伝子は、「免疫グロブリン複合体」、「細胞の外側」などの細胞画分で「抗原結合」、「免疫グロブリン受容体結合」、「細胞外マトリックス構造構成要素」などの分子機能も実行しました（追加ファイル7：図S2C）。細胞膜」および「免疫グロブリン複合体、循環」(追加ファイル 7:図 S2D)。

細胞クラスターの発生軌跡の構築と重要な遺伝子の同定。特徴遺伝子の相対的分散。 B 微分軌跡スペクトルのツリー構造の構築。 C 細胞サブタイプの時間的進化傾向。 D オーバーラップ解析による共通遺伝子の同定。 130 の共通遺伝子に基づく EA PPI ネットワーク

感受性グループと耐性グループ間の各細胞サブタイプの遺伝子発現の違いを観察するために、Seurat パッケージの FindMarkers 機能を使用して差分分析を実行しました。合計 155 の DEG が得られました。 97 個は上方制御され、98 個は下方制御されました (追加ファイル 8: 表 S6)。機能強化分析により、これらの遺伝子が免疫応答および炎症応答に関連していることが示されました。 CD8+ T 細胞サブタイプの DEG は主に IFN 関連応答と酸素輸送に関与していましたが、DC および線維芽細胞サブタイプの DEG はケモカイン関連応答と好中球遊走に関連していました (追加ファイル 9: 図 S3A および B) 。 GO-CC および GO-MF の濃縮結果は、追加ファイル 9: 図 S3B および C に示されています。KEGG 濃縮分析により、B 細胞サブタイプと単球サブタイプの DEG が同様の経路に関与しており、抗原プロセシングおよび提示に濃縮されていることが示されました。 DCおよび線維芽細胞サブタイプのDEGは、ケモカインやIL-17シグナル伝達などのがん関連経路に関与していました（追加ファイル9：図S3D）。

重複分析を通じて、1454 個の擬似時間関連遺伝子と 155 個の（重複排除された）PD-1 耐性関連遺伝子の間で 130 個の共通遺伝子が同定されました（図 4D; 追加ファイル 10: 表 S7）。 109 個のノードと 435 個のエッジを含む PPI ネットワークが、STRING データベースを使用して 130 個の共通遺伝子に基づいて描画されました (図 4E)。 130 個の一般的な遺伝子の VarElect 分析により、PPI ネットワーク内で最も高い接続性を持つ 2 つの遺伝子が IL-1β (スコア = 17.72) および MMP9 (スコア = 13.45) であることが特定され、これら 2 つの遺伝子が CRC と最も密接に関連していることが示されました (追加ファイル) 11: 表 S8; 追加ファイル 12: 図 S4)。これら 2 つの重要な遺伝子の KEGG 経路濃縮分析により、これらがサイトカイン - サイトカイン受容体相互作用 (IL-1β) および MAPK および PI3K-Akt シグナル伝達経路 (IL-1β および MMP9) に関与していることが示されました。特定のシグナル伝達経路マップは追加ファイル 12: 図 S5 に示されています。

IL-1β および MMP9 は、scRNA 配列を通じて抗 PD-1 耐性と最も高い相関関係を持つ上位 2 つの遺伝子として同定されました。 IHC を使用して、MSI-H/dMMR 患者の 10 個の感受性腫瘍組織と 13 個の耐性腫瘍組織における IL-1β および MMP9 の発現を検出しました。 IL-1β陽性組織におけるIL-1βのIHCグレードは、IL-1β陰性腫瘍組織よりも有意に高かった(P<0.001;図5A)。次に、IL-1β の IHC グレードに基づいて、23 人の患者全員を IL-1β 陰性グループまたは IL-1β 陽性グループに分類しました。耐性患者の 13 組織のうち、11 組織で IL-1β の発現が高かった。感受性のある患者から採取した 10 個の組織のうち、高発現を示したのは 1 個の組織だけでした (図 5B)。同様の発現傾向が、別の重要な遺伝子であるMMP9でも観察されました（P < 0.0001;図5C）。ＭＭＰ９発現は、ＩＬ－１β発現と正の相関があった（Ｒ＝０．６９４５、Ｐ＜０．０００１；図５Ｄ）。

MSI-H/dMMR CRC患者におけるIL-1βとMDSCまたはCD8+ T細胞との関係。 CRC 組織における IL-1β の IHC 染色。 B 感受性グループと耐性グループにおける IL-1β 陽性組織と IL-1β 陰性組織の割合。 C IL-1β陽性および陰性グループにおけるMMP9のIHC染色。 D IHC スコアに基づく MMP9 と IL-1β の相関関係。 IL-1β陰性群およびIL-1β陽性群における(E)PMN-MDSC、(F)M-MDSC、および(G)CD8+T細胞のIF検査および定量化。 IL-1βと(H) PMN-MDSC、(I) M-MDSC、および(J) CD8.+ T細胞の間のIFスコアのピアソン相関分析。 ****P < 0.0001

MDSC は、CD8+ T 細胞の不活化と免疫抵抗性を引き起こす骨髄由来の不均一な細胞です。複数の研究により、IL-1β が MDSC の凝集と分化において重要な役割を果たしている可能性があることが示されています。 IFを使用して、IL-1β発現とMDSCの関係をさらに調べました。 IL-1β陽性患者の組織におけるPMN-MDSCおよびM-MDSCにおけるマーカーの蛍光強度は、IL-1β陰性患者よりも有意に高かった（P<0.0001；図5E～F）。 CD8+ T 細胞は、scRNA-seq によって感受性グループと耐性グループの間で最も大きく異なる細胞クラスターの 1 つとして同定されました。腫瘍微小環境 (TME) 内の CD8+ T 細胞は、免疫療法の抗腫瘍効果に不可欠です。我々は、IF を使用して組織内の CD8+ T 細胞マーカーの発現を検出し、IL-1β と CD8+ T 細胞の間の相関を評価しました。 IL-1β陽性組織におけるCD8の蛍光強度は、IL-1β陰性組織におけるCD8の蛍光強度よりも有意に低かった(P<0.0001;図5G)。 IL-1βとPMN-MDSC（R = 0.8168、P < 0.0001、図5H）、M-MDSC（R = 0.7604、P < 0.0001、図5I）またはCD8+ T細胞（R = 0.7684、P < 0.0001;図 5J)。

結腸直腸癌における PD-1 耐性に対する IL-1β の影響をさらに実証するために、in vivo 異種移植モデルを使用しました。 qPCR およびウェスタンブロッティングによって検証されたように、ヒト IL-1β 遺伝子は CT26 細胞株に安定してトランスフェクトされ、IL-1β の発現が増加しました (追加ファイル 12: 図 S6)。次いで、IL-1βを過剰発現するまたはトランスフェクトされていない対照CT26細胞を雄BALB/cマウスに皮下注射した(各群n=5;図6AおよびB)。腫瘍細胞接種の 7 日後、進行性の腫瘍増殖が観察されました。図6C～Dに示すように、IL-1βの上方制御により腫瘍体積が大幅に増加し、5つのグループ間でマウスの体重に有意差はありませんでした。われわれは3つのグループをジアセレイン、ニボルマブ、またはその両方で治療し、腫瘍の増殖を観察して、IL-1βアンタゴニストが免疫剤と協力して腫瘍の増殖を阻害するかどうかを判定した。 IL-1β 誘発による CRC 腫瘍体積 (745.74 ± 188.34) および重量 (0.73 ± 0.16) の増加は、ジアセレイン (619.59 ± 127.03、0.49 ± 0.09) またはニボルマブ (540.47 ± 90.92、0.49 ± 0.10、 P < 0.05 ）、両方の薬剤による治療は腫瘍増殖の最大の減衰をもたらしました（355.49 ± 39.89、0.32 ± 0.08、P < 0.001）。ジアセレインとニボルマブは顕著な相乗効果を示しました。接種されたマウスからの腫瘍切片を図６Ｅに示す。

IL-1βアンタゴニストとPD-1阻害剤は相乗的な抗腫瘍効果を持っています。実験のタイムラインを示す図。 B 空のベクターまたは IL-1β 過剰発現ベクターを含む CT26 細胞を接種して 16 日後の BALB/c マウスの異種移植腫瘍 (n = 5)。 C 腫瘍重量 (n = 5)。 D 各治療グループの BALB/c マウスの平均体重および平均腫瘍体積 (n = 5)。 E 接種した BALB/c マウスからの腫瘍のヘマトキシリン・エオシン染色 (n = 5)。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001

IL-1β誘発性ニボルマブ耐性に対するジアセレイン治療の有効性がMDSCによって媒介されるかどうかを調べるために、PMN-MDSC、M-MDSC、およびCD8+ T細胞のバイオマーカーを使用してフローサイトメトリーを実施しました。図7に示すように、IL-1βはPMN-MDSC数（17.62±5.56対4.64±0.84、P<0.0001）およびM-MDSC数（5.61±1.35対1.26±0.33、 TME における CD8+ T 細胞の割合 (2.94 ± 1.17 vs. 4.35 ± 1.37、P < 0.01) が減少し、免疫抑制が増強されました。次に、ジアセレインとニボルマブが、PMN-MDSC、M-MDSC、CD8+ T 細胞における IL-1β 媒介効果の逆転において同様の相乗効果を示すかどうかをさらに評価しました。ジアセレインまたはニボルマブのいずれかの単独療法は、PMN-MDSC (11.15 ± 2.90 vs. 17.621 ± 5.561、12.0 ± 1.88 vs. 17.621 ± 5.561、P < 0.01) および M-MDSC (3.21 ± 0.77 vs. 1.26 ± 0) の分化を抑制しました。 .33、 4.09 ± 0.90 vs. 1.26 ± 0.33、P < 0.01）、CD8+ T 細胞の数が増加しました（4.16 ± 0.76 vs. 2.94 ± 1.17、4.81 ± 1.07 vs. 2.94 ± 1.17、P < 0.01）。図 7B および C は、ニボルマブ単独と比較して、併用治療により PMN-MDSC の数（8.79 ± 2.98 対 12.0 ± 1.89、P < 0.01）および M-MDSC の数（2.26 ± 0.72 対 4.09 ± 0.90、 P < 0.001)。図７Ｄは、ニボルマブ単独療法群におけるＣＤ８＋Ｔ細胞凝集の程度（４．８１±１．０７対５．６９５±０．９０、Ｐ＜０．０５）が併用療法群と比較して実質的に減少したことを示す。

IL-1βは、MDSCの凝集を刺激し、腫瘍内のCD8+ T細胞の増殖を阻害します。フローサイトメトリーを実行して、PMN-MDSC、M-MDSC、および CD8 + T 細胞を検出しました (n = 5)。各グループにおける (B) PMN-MDSC、(C) M-MDSC、(D) CD8.+ T 細胞の発現に関する定量統計図 (n = 5)。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001

MMP9 は、単一細胞配列決定によって同定された耐性に関連する重要な遺伝子の 1 つであり、強力な抗血管作用および免疫抑制作用があると考えられています。ただし、MMP9 と IL-1β の相関関係は不明のままです。 MMP9 は、qPCR、ウェスタンブロッティング、および IHC を使用してマウス CRC 組織で検出されました。図8に示すように、qPCR（9.57±0.26対1.08±0.44、P<0.0001）およびウェスタンブロッティング（1.13±0.07対1.08±0.44）の結果に基づいて、IL-1β処理はマウス腫瘍組織におけるMMP9発現を有意に増加させた。 0.21 ± 0.04、P < 0.0001)。次に、ジアセレインがニボルマブと協力してMMP9の発現を低下させることができるかどうかを評価しました。ジアセレイン（4.21 ± 0.60 対 9.57 ± 0.26、P < 0.01）またはニボルマブ（6.36 ± 1.10 対 9.57 ± 0.26、P < 0.01）のいずれかによる単独療法は、qPCR 分析により IL-1β 誘発性の MMP9 上方制御を減弱させました。併用療法は、ジアセレイン（1.62 ± 0.59 対 4.21 ± 0.60、P < 0.0001）またはニボルマブ（1.62 ± 0.59 対 6.36 ± 1.10、P < 0.0001）による単独療法よりも強力に MMP9 発現を減少させました。腫瘍組織におけるMMP9の発現は、IL-1βの発現とほぼ正の相関があった(R2の値を図8Iに示す)。

マウス異種移植モデルにおけるIL-1βとMMP9の間の相関。各治療グループにおける (A) IL-1β および (B) MMP9 mRNA 発現の qPCR (n = 3)。 C ウェスタンブロット分析 (n = 3)。 (D) IL-1β および (E) MMP9 タンパク質のグレースケール分析 (n = 3)。 IHC 染色と (F、G) IL-1β および (H、I) MMP9 発現のスコア (n = 5)。 (J) MMP9 および IL-1β 発現のピアソン相関分析 (n = 5)。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001

従来の化学療法や標的療法と比較して、免疫療法には腫瘍を縮小させる独自の分子機構があります。一般に、免疫チェックポイント阻害剤は、T 細胞の活性化を誘導し、TME の「免疫ブレーキを解除」することにより、体の一般的な免疫を強化すると考えられています [14、15]。当センターの以前の研究では、MSI-H/dMMRの局所進行結腸直腸癌患者29名が単剤PD-1阻害剤による術前免疫療法を受け、ORRは100％（29/29）であり、以下の結果と一致した。 NICHE研究[16、17]。本研究では、MSI-H/dMMR mCRC 患者 23 人が第一選択の PD-1 阻害剤治療を受けましたが、ORR はわずか 43.5% (10/23) でした。抗PD-1単独療法に対するMSI-H mCRCのこれらの多様な反応は、TME組成の違いによって引き起こされる可能性が高い[18、19、20]。

これを考慮して、我々はscRNA-seqを通じてさまざまな細胞サブタイプを定義し、重要な遺伝子をスクリーニングし、抗PD-1治療感受性群と抗PD-1治療抵抗性群で異なるTMEシグナル伝達経路を明らかにした。総合すると、これらの結果は、感受性群における CD8+ T 細胞サブセットの割合が耐性群よりも有意に高いことを示唆しました [21、22、23、24]。 TME 内の複数の CD8+ T 細胞サブセットは、免疫系を標的とした新しい治療法の反応率に影響を与える可能性があります [21、22]。 MDSC は、血管新生と免疫抑制を促進する骨髄由来の不均一細胞です [25]。最近の研究では、TME における MDSC の凝集を減少させると、CD8+ T 細胞の浸潤が大幅に増加し、PD-1 阻害の抗腫瘍効果が増強されることが示されています [26、27]。 MDSC の免疫抑制効果は、誘導性一酸化窒素シンターゼ、アルギナーゼ 1、インターロイキン 6、トランスフォーミング成長因子 β などのさまざまなサイトカインの分泌に関連している可能性があります [28]。

この研究では、疑似時間関連遺伝子と PD-1 耐性関連遺伝子の重複における接続性の観点から、IL-1β が 1 位にランクされました。単球由来マクロファージは、病原体感染に対する免疫応答中の主要な IL-1β 産生源です [29、30]。以前の研究では、IL-1β がヒト結腸癌細胞の浸潤と増殖を促進する可能性が示唆されており [31]、IL-1β 多型は CRC 再発と関連している [32]。 IL-1β 遮断は免疫抑制を逆転させることが示されており、PD-1 阻害剤との相乗効果を示して、乳房 [32]、膵臓 [18]、腎臓 [33] 腫瘍を含むいくつかの腫瘍タイプの除去を促進することが示されています。それにもかかわらず、CRC免疫療法におけるIL-1βの正確な役割はまだ解明されていません。いくつかの研究は、IL-1βが顆粒球コロニー刺激因子、さまざまなCXCケモカイン、および血管接着分子を産生することによってMDSCの浸潤を誘導できることを示唆している[34]。しかし、CRC免疫療法におけるIL-1β媒介MDSC凝集の役割は依然として不明である。

MMP9 は、発がん時の血管新生スイッチの構成要素として同定されているマトリックスメタロプロテイナーゼです [35、36]。 MMP9 は、発癌促進性シグナル伝達経路を介して腫瘍浸潤、転移、免疫逃避を媒介し [37、38、39]、CRC 患者の再発と予後不良に関連している [40]。 MMP9 阻害と免疫チェックポイント阻害の組み合わせは、黒色腫 [41] および乳がん [42] のマウスモデルにおける免疫療法の有効性を高めました。 MMP9 はまた、肝細胞癌患者の予後および免疫チェックポイント治療反応性の層別化においても有望であることが示されている [43]。 130 個の主要な遺伝子に関する今回の KEGG 解析結果により、IL-1β および MMP9 が MAPK および PI3K-Akt シグナル伝達経路と高度に相関していることが明らかになりました。最近の研究では、IL-1β がさまざまな疾患においてさまざまなシグナル伝達経路を通じて MMP9 発現を上方制御することも示されています [44、45、46]。 MDSC の浸潤は MMP9 の分泌をさらに刺激する可能性があり [47]、IL-1β による MDSC の蓄積は MMP9 の主な供給源の 1 つである可能性があります。しかし、CRC免疫療法におけるIL-1βを介したMMP9アップレギュレーションの機能についてはさらなる研究が必要である。

本研究では、免疫療法抵抗性グループと免疫療法感受性グループの細胞状況を単細胞レベルで説明しました。感受性群における CD8+ T 細胞と単球の凝集の程度は、耐性群よりも有意に高かった。 IL-1βおよびMMP9は、抗PD-1耐性と最も高い相関関係を持つ2つの遺伝子として同定された。さらに、IL-1βによるMDSCの浸潤は、MSI-H/dMMR CRCにおける抗PD-1耐性を増強した。

本研究では、第一選択のPD-1単独療法で治療されたMSI-H/dMMR mCRCのORRとDCRは、それぞれ43.75％（7/16）と68.75％（11/16）であった。 IL-1β および CD8+ T 細胞は、それぞれ遺伝子および細胞型の中で抗 PD-1 耐性と最も高い相関関係を有することが判明しました。マウス実験では、IL-1βによるMDSC浸潤がCD8+ T細胞の蓄積を抑制し、これによりMSI-H/dMMR CRCの抗PD-1耐性が増強されることが実証された。これらの発見を総合すると、IL-1βアンタゴニストがPD-1阻害剤に対する耐性を逆転させる新薬として有望であることが判明する可能性があることが示唆される。

現在の研究中に生成および分析された scRNA-seq データセットは、NCBI リポジトリ [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA932556] で入手できます。

生物学的プロセス

細胞構成

完全な応答

結腸直腸がん

疾病制御率

樹状細胞

差次的に発現される遺伝子

不完全なミスマッチ修復

免疫組織化学

免疫蛍光

骨髄由来サプレッサー細胞

転移性結腸直腸がん

単球性骨髄由来サプレッサー細胞

超小型衛星の不安定性が高い

超小型衛星が安定

客観的な回答率

進行性疾患

プログラム細胞死タンパク質-1

多形核骨髄由来サプレッサー細胞

部分的な対応

タンパク質間相互作用を実行する

分子機能

単一細胞 RNA シーケンス

安定した病気

相互作用する遺伝子を検索するための検索ツール

腫瘍微小環境

T 分布の確率的隣接埋め込み

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適用できない。

このテーマは、雲南省イノベーションチーム技術プロジェクト（番号 2019HC009）、雲南省結腸直腸癌センター建設プロジェクト（番号 2020YZ001）、雲南省教育局の科学研究基金（番号 2022J0227）および雲南省からの助成金によって資金提供されました。雲南省科学技術計画プロジェクト (番号 202201AY070001-149)。

Tao Wu、Xuan Zhang、Xinxing Liu は共同筆頭著者であり、この作品に同様に貢献しました。

雲南がん病院結腸直腸外科、昆明医科大学第三附属病院、No. 519, Kunzhou Road, Xishan District, Kunming, 650118, China

Tao Wu、Xuan Zhang、Xinxing Liu、Xinyi Cai、Tao Shen、Dingguo Pan、Ruixi Hu、Jianhua Dong、Shilei Gen、Zhaoyu Yang、YunFeng Li

重慶大学生物工学部（中国、重慶）

梁瑞

中国昆明市、昆明医科大学第三付属病院雲南癌病院低侵襲介入部

ロン・ディン

中国昆明市、昆明医科大学第三付属病院雲南癌病院消化器内視鏡科

芙蓉・リー＆ジンシャ・リー

中国昆明市、昆明医科大学第三付属病院雲南がん病院腫瘍科

林謝

中国昆明市、昆明医科大学第三付属病院雲南癌病院放射線科

王春龍

中国昆明市、昆明小児病院皮膚科

陸興

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YLとLX2が記事をデザインしました。 TW、XZ、XL は原稿を起草し、scRNA-seq データの分析を担当しました。 XCは動物実験を担当しました。 DP と RD は患者の登録とサンプルの収集を担当しました。 RL と TS は免疫組織化学と免疫蛍光を実施しました。 RH と JD が原稿を修正しました。 FL と JL は結腸内視鏡検査を実施しました。 CWは放射線検査を実施した。 LX1 と SG は統計分析を実行しました。 ZY は qPCR とウェスタンブロッティングを完了しました。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

Lu Xing または Yun Feng Li との通信。

すべての参加者は研究前に書面によるインフォームドコンセントを得ていました。さらに、雲南がん病院の倫理委員会は、ヘルシンキ宣言（承認番号：KYLX202127）のヒト被験者を含む医学研究の倫理原則に基づいて設計された研究プロトコールを承認しました。この研究に適用されたマウスはすべて昆明医科大学実験動物学部のものであり、実験スキームは昆明医科大学実験動物倫理委員会によって承認されています（承認番号：kmmu20221065）。

適用できない。

著者らは、潜在的な利益相反がないことを宣言します。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

表S1。 MSI-H/dMMR 患者 6 名からの臨床サンプルの単一細胞配列データ。

表S2。細胞サブタイプ分析パイプラインで使用されるマーカー。

各サンプル内の 9 つの細胞サブタイプの細胞の数。

図S1。マーカー遺伝子の GO および KEGG 分析。

表S4。 9 細胞サブセットで 1623 個の遺伝子が差次的に発現されました。

表S5。 1,623 個の特徴遺伝子から 1,454 個の擬似時間関連遺伝子が同定されました。

図S2。擬似時間関連遺伝子の KEGG および GO 解析。

表S6。感受性グループと耐性グループの間の各細胞サブタイプの遺伝子発現は 155 度です。

図S3。 PD-1 耐性関連 DEG の GO および KEGG 分析。

表S7。 454 個の擬似時間関連遺伝子と 155 個の (重複排除) PD-1 耐性関連遺伝子のうちの 130 個の共通遺伝子。

表S8。 130 の一般的な遺伝子の VarElect 分析。

図S4。 454 個の擬似時間関連遺伝子および 155 個の (重複排除) PD-1 耐性関連遺伝子 DEG における 130 個の共通遺伝子の VarElect 解析結果。図S5。 (A) サイトカイン-サイトカイン受容体相互作用、および (B) IL-1β および MMP9 の MAPK および PI3K-Akt シグナル伝達経路マップ。図S6。 IL-1βを過剰発現する安定したCT26細胞株の構築。 (A) この実験で使用した結腸直腸癌細胞株 CT26。 (B) IL-1β 過剰発現ベクターのプラスミドマップ。 (C) プラスミド形質転換後のアンピシリンによる陽性コロニーのスクリーニング。 (D) プラスミド電気泳動のゲルマップ。 (E) ウェスタンブロッティングを適用して、安定に形質転換された細胞株における IL-1β の発現を検出しました。 (F) qPCR を使用して、安定に形質転換された細胞株における IL-1β の発現を検出しました。

元のブロットの画像。

オープンアクセスこの記事はクリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブコモンズライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。データのクレジットラインに別途記載がない限り、クリエイティブコモンズパブリックドメインの献身的権利放棄 (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) は、この記事で利用可能なデータに適用されます。

転載と許可

Wu, T.、Zhang, X.、Liu, X. 他。単一細胞配列決定により、マイクロサテライト不安定性の高い転移性結腸直腸癌における抗 PD-1 耐性に関連する免疫微小環境の状況が明らかになります。 BMC Med 21、161 (2023)。 https://doi.org/10.1186/s12916-023-02866-y

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受信日: 2022 年 12 月 8 日

受理日: 2023 年 4 月 14 日

公開日: 2023 年 4 月 27 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-023-02866-y

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