HIV T によるワクチン接種

Biofilm e microbioma npj

npj Biofilms and Microbiomes volume 8、記事番号: 104 (2022) この記事を引用

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腸内微生物叢は、ワクチン反応を調節する重要な因子として浮上しつつあります。しかし、ワクチンが微生物叢を変えることができるかどうか、またそのような変化がワクチンの有効性をどの程度改善するかを調査した研究はほとんどありません。腸内マイクロバイオームに対するT細胞ワクチン接種の影響を理解するために、異種プライムブーストスキームに従ってHIV-1 T細胞免疫原（HTIアーム）またはPBS（コントロール、モックアーム）をC57Bl/6マウスに投与しました。マウスの腸内微生物叢の縦断的動態は、ケージおよび 3 つの腸切片 (盲腸、小腸、大腸) から収集した糞便サンプル中の 16 S リボソーム RNA 配列決定によって特徴付けられました。血清および脾臓細胞は、IFNγ ELISPOT およびサイトカイン Luminex® アッセイを使用して免疫相関を評価するために、研究の最後の時点で取得されました。モックと比較して、HTI ワクチン接種マウスには、短鎖脂肪酸などの抗炎症代謝産物の主な寄与者として知られるクロストリジウム属 (ユーバクテリウムキシラノフィラムグループ、ローズブリアおよびルミノコッカス) が豊富に含まれていました。このような変化は最初の HTI 投与後に観察され、研究の追跡調査 (18 週間) を通じて持続しました。しかし、濃縮されたクロストリジウム目属は、糞便と腸切片とでは異なっていました。ワクチン接種された動物に豊富な細菌の量は、HTI 特異的 T 細胞応答および IL-6 などの一連の炎症誘発性サイトカインと正の相関がありました。この縦断的解析は、マウスにおいて、T細胞ワクチン接種が抗炎症分子を産生することが知られている腸内細菌の増加を促進する可能性があり、これが炎症誘発性サイトカインと相関することを示しており、T細胞誘発性の腸内細菌環境の適応を示唆している。全身性炎症。

常在の胃腸微生物叢が、自然免疫応答と適応免疫応答の両方の発生と制御において極めて重要な役割を果たしていることが十分に確立されています1。適応免疫応答のさまざまな決定要因のうち、T 細胞応答の極性化は腸内細菌の組成によって特に影響を受ける可能性があります 2。実際、特定の細菌の欠如は、腸内の Treg 細胞の頻度の低下 3 または無菌マウスおよび抗生物質処理マウスにおける Th17 細胞応答の調節不全に関連しています 4。これらの T 細胞部分集団 (Th17 および Treg) の異常な比率は、代謝性疾患または免疫疾患と頻繁に関連しています 5。

腸内細菌叢と免疫系の緊密な相互作用と共進化6を考慮すると、特定の細菌分類群が局所的または全身的な効果を発揮することによってワクチン誘発性の免疫応答7も調節する可能性があることを示唆する証拠が増えています8。近年、いくつかの臨床研究および動物研究により、腸内微生物叢の組成と機能が、経口ワクチンおよび注射ワクチンの免疫原性と有効性の重要な決定要因であることが示されています9,10。これまでのところ、この分野における研究のほとんどは、ワクチン誘発性の抗体反応の調節における微生物叢の役割に焦点を当ててきた7。注目すべきことに、HIV-111 や SARS-CoV-212 などの病原体に対する免疫戦略を含む、いくつかの免疫戦略によって引き起こされる防御における T 細胞媒介免疫の重要性がますます認識されてきています。しかし、既存の腸内微生物叢とワクチン接種に対する T 細胞反応との関係を直接調査した研究は限られています 13。

腸内細菌叢に対するワクチン投与の影響については、さらに注目が集まっていません。 HIV-114、15 および経口チフス 16 ワクチンがヒトの腸内細菌叢に及ぼす影響を調査したこれまでの研究では、ワクチン接種によって引き起こされる微生物群集構造の認識できる混乱は報告されていませんでした。対照的に、HIV-1 DNA/タンパク質免疫化後のファーミクテス/バクテロイデス比の増加は、ヒト以外の霊長類の直腸マイクロバイオームで観察されました17。また、2 つの SARS-CoV-2 ワクチン接種戦略を比較した最近の研究では、予防接種後 1 か月後のヒトの腸内細菌叢の変化が報告されており、これはアルファ多様性の低下と、Bacteroides caccae などの特定の細菌種の存在量の増加が特徴です。総合すると、これは、ワクチン接種が常駐微生物叢に影響を与える可能性があるという少なくとも状況証拠を提供します。したがって、ワクチンがどのように宿主の腸管免疫環境の変化を促進し、微生物群集の構造を変化させるかを理解することは、この相互作用についての重要な洞察を提供し、ひいてはワクチン接種の結果を積極的に調節する特定の細菌の同定を提供する可能性がある。

本研究では、HIV-1 T 細胞免疫原 (HTI) 発現ベクター 19,20 を使用して、腸内細菌叢におけるワクチン誘発性の変化を評価し、マウスモデルにおけるワクチン接種に対する免疫応答との潜在的な相関関係を特定しました。 HTI の免疫原性は、さまざまなワクチンベクター (DNA、チンパンジーアデノウイルス、ChAdOx1、改変ワクチンウイルスアンカラ、MVA、およびカルメットゲラン桿菌、BCG など) を使用して、マウス 21、22 とヒト 23 の両方でテストされています。この以前の証拠に基づいて、最大の免疫原性を達成するために、マウス株 C57Bl/6 および 3 つの DNA プライムとそれに続く ChAdOx.1-MVA ブーストが選択されました。 16 S rRNA 遺伝子配列決定を使用して、プライム-ブースト HTI 免疫レジメンまたは PBS (対照群) を受けたマウスの縦方向の糞便マイクロバイオームおよび腸内容プロファイルを特徴付けました。完全免疫化後の腸内微生物の特徴、T細胞ワクチン反応、およびサイトカインの間の相関関係も評価されました。

腸内細菌叢に対する HTI ワクチン接種の効果を調べるために、HTI 免疫原 (免疫化、n = 20) または PBS (モック、n = 20) を投与された 2 つの実験グループを比較しました (図 1)。腸内微生物叢プロファイリングのために、ケージと 3 つの腸切片から糞便サンプルを縦方向に収集しました。研究の最後に血清と脾細胞を取得し、それぞれワクチンの免疫原性とサイトカインプロファイルを評価しました（補足図1）。ワクチン接種の 2 週間前に、補足本文および補足図 2 で詳しく説明されているように、ベースラインの変動を低減するために、抗生物質によるコンディショニングとその後のマウスからマウスへの糞便微生物叢の移入 (FMT) によってマウスの腸内細菌叢を均質化しました。動物到着時のベースラインマウスの特徴 ( -3w; 補足表 1 および 2）およびワクチン接種前（0w; 表 1 および補足表 3）が報告されています。

雌および雄のマウスを、HIV T 細胞ワクチン (3 つの DNA.HTI プライムに続いて ChAd.HTI および MVA.HTI ブースター; n = 20) またはモックワクチン (PBS; n = 20) で免疫化しました。すべての動物の腸内容物を均質化するために、ワクチン接種の前に抗生物質による調整とそれに続く糞便微生物叢の移入を実施した。便、管腔内容物、血清および脾臓を含むサンプルの収集は、示された時点で完了した。略語: FMT 糞便微生物叢転移、Atb 抗生物質、PBS リン酸緩衝生理食塩水。図の一部は、Servier が提供する Servier Medical Art を使用して生成されており、Creative Commons Attribution 3.0 非移植ライセンスに基づいてライセンスされています。

モックサンプルと免疫化縦断サンプルには、高品質のフィルター処理されたリード数に差はなく、中央値はそれぞれ52,092リードと46,584リードでした（補足図3aおよび表S4）。ネガティブ抽出（n = 12）およびテンプレートなしPCR（n = 11）コントロールは、実験グループと比較してリード数が有意に低かった（それぞれ、平均リード数5966および1444）（補足図3a）。シーケンスの深さはバッチ1の方が高かったにもかかわらず（補足図3b）、2つのバッチ間の差異を評価した後でもデータ構造への実質的な影響は観察されませんでした（補足図4）（バッチはプールされた糞便のテストの共変量として含まれていました）ケージから採取されたサンプル）。

ワクチン接種前、サンプルは同様の細菌組成を示し（0週間、補足図2）、モックグループではA2属のみが増加しました（補足図5a）。性別で分離した後、メスのマウスはワクチン接種前にラクトバチルス属とムリバキュラム属の存在量がより高かった（補足図5b）。

家族レベルでは、模擬グループと免疫グループ間の全体的な微生物群集構成は実験全体にわたって同様でした（図2a）。糞便内容物と管腔内容物の両方からのサンプルは、ムリバキュラ科（49.8% と 57.9%）、ラクノスピラ科（14.2% と 11.4%）、バクテロイダ科（9.4% と 4.8%）、ビフィズス菌科（7.1% と 6.2%）が大半を占めていました（図 2a と補足図6a）、小腸を除く（補足図6b）。この腸セクションでは、ラクノスピラ科NK4A136グループ（0.2％）とバクテロイデス属（0.05％）の減少と同時に、ラクトバチルス属（7.7％）とリギラクトバチルス属（3.7％）の全体的な増加が見られました（補足図6c、d）。ワクチン投与中の全体的な組成の類似性にもかかわらず（0週間〜15週間、図2aおよび補足図6e）、サンプルは実験グループごとに個別にクラスター化されましたが（p = 0.022）、各グループ内の時点ごとではありません（p = 0.594）（図2b）、単変量解析と多変量解析の両方で示されています（補足表5）。ケージと性別の共変量も微生物叢の組成に大きな影響を与えました (補足表 5)。私たちの評価では個体レベルの寄与が欠如しているにもかかわらず、モック群と比較して免疫化群ではブレイ・カーティスの非類似性がより高い傾向が観察され（補足図6f）、これはワクチン接種されたマウスの腸内微生物叢に強い影響を与えている可能性を示しています。また、ワクチン接種中にグループ間でアルファ多様性（シャノン指数）の差は観察されませんでした（補足図6g）。実験グループ（p = 0.021）および腸切片（p = 0.001）によるクラスター化も研究の最後の時点で観察され、盲腸および大腸からのサンプルから分離された小腸からのサンプルでした（図2c）。さらに、小腸からのサンプルは、盲腸および大腸と比較した場合、モックグループと免疫化グループの両方で低いアルファ多様性を示しましたが、2つの実験グループ間に差は検出されませんでした（図2d）。

HTI ワクチン接種 (免疫) または PBS ワクチン接種 (モック) マウスのさまざまな時点での細菌ファミリーの相対存在量 (最も多い上位 15 個) を表示する積み上げ棒グラフ。 CageID (プールされた糞便) と各ケージの個々のサンプル (腸内容物) が X 軸に表示されます。 PCoA バイプロットは、(b) ケージからの糞便サンプル (c) および腸切片 (小腸、盲腸、および大腸) の最初と 2 番目の成分 (属レベルでのブレイ - カーティス距離) に基づいています。バイプロットは、群集構成に対する上位 5 つの影響を持つ属をレポートし、ベクトルの位置が影響の方向を示します。図の解釈を容易にするために、任意の楕円が描かれています。 PERMANOVA の r 二乗値と p 値が表示されます。 d 小腸、盲腸および大腸から研究の最終時点で得られた個々の糞便サンプルのシャノンエントロピー指数（ASVレベル）に基づくアルファ多様性。箱ひげ図は実験グループごとに色分けされています。中央値と四分位範囲が箱ひげ図に表示されます。 Wilcoxon の符号付き順位検定の p 値が報告されます。

縦断的判別分析により、ワクチン接種後に特定の細菌の存在量が変化することが示されました。ベースラインではA2属のみが実験グループ間で差次的に豊富でしたが（補足図5a）、免疫グループはワクチン接種後に一連のクロストリジウム属の濃縮を示しました（図3）。最も注目に値する観察は、ケージ (3 ～ 15 週目) の糞便サンプル中のルミノコッカスと腸切片 (盲腸および大腸) のローズブリアの濃縮でしたが、3 週目以降もケージと腸切片の糞便サンプルではユーバクテリウムキシラノフィラムグループが一貫して高いままでした。また、Ligilactobacillus は小腸からのサンプルで特異的に増加しました (図 3)。このような属の存在量の縦断的評価は、免疫化グループのワクチン接種から始まる増加傾向を示しました（補足図7）。逆に、時間の経過とともにモックグループで一貫して高い値を示した特定の属はありませんでした。

ワクチン投与中（3週間、9週間、6週間、および15週間のプールされた糞便サンプル）および小腸からの個々の糞便サンプルについての研究終了15週目における免疫群とモック群の間の細菌属の相対存在量を比較するLEfSe分析、盲腸と大腸。水平バーは、各判別属の効果量を表します (p < 0.05 および LDA スコア > 2.0)。バーの長さは、垂直線で示される log10 変換された LDA スコアを表します。

HTI 免疫原性を調べるために、HTI ペプチドに対する特異的 T 細胞応答の大きさと幅を評価する IFNγ アッセイを、研究の最後の時点で収集した脾細胞で実施しました。モックマウスと免疫マウスの間でバックグラウンドのIFNγ産生脾細胞に違いは見られず、ワクチン接種計画が顕著な非特異的T細胞活性化を誘導しなかったことを示しています（補足図8a）。 HTI 配列をカバーするペプチドプールによる特異的な再刺激の後、モックグループは閾値を超える IFNγ 応答を示さなかった。対照的に、免疫化マウスは、大きさ（中央値 = 1560 IFN-γ SFC/百万脾細胞、p = 0.00031、補足図8b）と幅（中央値 = 17陽性プール中8.0、p = 0.00028、補足図8b）の両方で強い反応を示しました。図 8c) モックとの比較。

モックグループと免疫化グループの22のサイトカインの血清レベルを評価した後（補足図9a）、性別で分離した後、免疫化グループで増加傾向を示す唯一のサイトカインはIL-6でした（p = 0.052）（補足図9b）。ただし、有意性は複数の検定補正を通過しませんでした (BH 調整 p = 0.69)。具体的には、免疫化グループの女性は、免疫化グループとモックグループの両方の男性よりも低いIL-6レベルを示しました（補足図9b）。次に、HTI 特異的応答、血清サイトカインレベル、および識別可能な細菌属の間の潜在的な関連性を調べました。 3 つの腸切片からの Eubacterium xylanophilum グループおよび Roseburia は、大きさと幅として測定したワクチン誘発性 HTI 特異的 T 細胞応答と正の相関がありました (図 4)。さらに、いくつかの例外 (IL-33) はありましたが、試験したサイトカインのほとんどはユーバクテリウムキシラノフィラムグループ、ローズブリアおよびルミノコッカスと正の相関を示しました。 Ligilactobacillus では逆の傾向が観察され、全体として血清サイトカインレベルと負の相関が示されました (図 4)。注目すべきことに、IL-6 は大腸のユーバクテリウムキシラノフィラムグループ、ルミノコッカス、特にローズブリアと正の相関を示しました。さらに、ローズブリアは、GM-CSF、IL-2、IFNγ、IL-17AおよびIL-25（小腸）、IL-27（盲腸および大腸）およびIL-22（大腸）を含む他のサイトカインと正の相関を示しました。。有意な相関は、個々の散布図によって確認されました（補足図10）。さらに、3つの腸区画のユーバクテリウム・キシラノフィラム・グループ、ローズブリアおよびルミノコッカスは、階層的クラスタリングでHTI特異的応答（大きさと幅）の近くにクラスター化し、サイトカインのグループとの正の関連性も示しました（補足図11）。

細菌属（HTI免疫マウスにおいて長期的に濃縮された細菌のみを評価した）、HTI免疫原性（反応の大きさと幅）、および血清サイトカインレベル間のスピアマン順位相関。関連性は各腸セクション (小腸、盲腸、大腸) ごとに評価されます。各腸セクションのサイトカインは、教師なしの階層的クラスタリングに基づいて順序付けされます。四角形の色とサイズは相関の大きさを表します。有意性は白のアスタリスクで示されます (*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 (多重比較のための Benjamini-Hochberg 調整後))。

現在までのところ、ワクチン投与が腸内常在微生物群集をどのように変化させるかを調査した研究は限られている。ここでは、異なるワクチンベクターのHTIインサートを組み合わせたプライムブーストレジメンを使用して、強力なHTI特異的応答を誘導し、微生物叢に対するその影響を研究しました。これらの結果は、マウスにおいて、HIV T細胞免疫化後にクロストリジウム目細菌が増加し、それが炎症誘発性サイトカインと関連していることを示した。 Eubacterium xylanophilum グループを除いて、糞便中に見つかったクロストリジウム属は免疫グループの 3 つの腸切片のものとは異なっていました。このような違いは、内腔と比較して腸上皮における異なる種の存在 24 と、糞便中に存在する可能性が最も高いルミノコッカス科やラクノスピラ科などの胞子形成細菌の 50 ～ 60% の存在に関連している可能性があります 25。注目すべきことに、濃縮された細菌と血清サイトカインとの関連性は腸の 3 つのセクションにわたって異なり、これは異なる酸素要求量と、粘膜細胞と共存する微生物群集との間の異なるクロストークを表しています 26。最も顕著な違いは、以前に報告されているように、盲腸や大腸と比較して、ルミノコッカエ科やラクノスピラ科などの偏性嫌気性菌が枯渇した小腸で観察されました27。

私たちの結果を裏付けるように、アカゲザルにおける最近の研究では、3種類のHIV-1 Env発現DNAプラスミドワクチンによるワクチン接種とそれに続くgp140タンパク質ブースターが直腸微生物叢の変化を誘発し、その結果、ファーミクテス/バクテロイデス比の増加と直腸抗ウイルスの関連性が引き起こされることが示されました。 -クロストリジウム IV の増加とプレボテラの減少を伴う HIV-1 IgG ワクチン反応17。ローソニアイントラセルラリスワクチンによる予防接種後には、子豚の腸内細菌叢におけるルミノコッカスが豊富になったことも報告されています 28。並行して、マウスにおけるMtbワクチン（TLR8アゴニストをアジュバントとして添加したESAT6を含む）投与後に、バクテロイデス量の増加と微生物群集構造の変化が見出された29。同様に、Covid-19ワクチン接種者では、Bacteroides caccaeの増加と、Coprococcus Comes、Dorealongicatena、Ruminococcus obeumなどのクロストリジウム菌種の減少が報告されています18。このような一見矛盾した傾向は、異なる免疫戦略によって引き起こされる特定の微生物の変化を解読するには、より徹底的な理解が必要であることを示しています。

私たちのデータは、HTI ワクチン接種後に増加した細菌 (ユーバクテリウムキシラノフィラムグループ、ローズブリアおよびルミノコッカス) が 3 つの異なる腸セクションに存在し、HTI 特異的 T 細胞応答および血清サイトカインのグループと正の相関があることを示しました。具体的には、盲腸および大腸における酪酸生成細菌として知られるローズブリア属 30 は、脾臓細胞における HTI 特異的 T 細胞応答の大きさおよび範囲と正の相関を示しました。血清レベルでは、ローズブリアは、抗原提示細胞によって産生され、B 細胞および T 細胞を制御する IL-27 と相関していました 31。興味深いことに、エフェクター機能が異なるにもかかわらず、IL-27 は IL-632 と gp130 受容体サブユニットを共有しており、サイトカインと IL-22 の両方が大腸内のローズブリアの含有量と関連していました。小腸におけるローズブリアのレベルは、HTI 特異的 T 細胞応答と相関しませんでしたが、炎症性サイトカイン (IL-6、GM-CSF)、2 つの Th1 極性サイトカイン (IFNγ および IL-2)、および Th17 と強い相関が観察されました。極性サイトカイン (IL-17A および IL-22)。しかし、これらのサイトカインはいずれもモック群と免疫化群の間で差次的に産生されず、IL-6 のみがわずかな有意性を示し、多重比較補正を通過しませんでした。我々は、血漿中のIFNγおよびIL-2との正の相関が示すように、ローズブリアの存在量はT細胞ワクチン刺激によって増加し、Th1応答に関連している可能性があると仮説を立てていますが、最も顕著なのは脾臓細胞のHTI特異的T細胞応答との正の相関です。ローズブリアの増加は、ワクチン接種後に産生される可能性が高いIL-633や血清中のTh17（IL-17AおよびIL-22）サイトカインなどの炎症メディエーターの存在にも関連している可能性があり、腸内の粘膜免疫反応に影響を与えている可能性があります。ワクチン接種動物に濃縮された追加の酪酸産生クロストリジウム属 34 は、HTI 特異的 T 細胞応答 (小腸および盲腸のユーバクテリウムキシラノフィルムグループ) および血清 IL-6 レベル (大腸のルミノコッカスおよびユーバクテリウムキシラノフィルムグループ) と正の相関を示しました。また、Ligilactibacillus は T 細胞応答と関連しなかったが、腸炎バイオマーカー 35 として知られる Th17 および Treg 集団を代表するサイトカイン (IL-10 および IL17A) との相関は、微生物叢組成の特定の変化を示している可能性があります。 HTI 免疫化が腸内環境の変化を誘発し、特定の細菌の増加を促進する正確なメカニズムはまだ不明ですが、自然免疫後のサイトカインシグナル伝達とワクチン接種による T 細胞活性化はもっともらしい仮説です。実際、ワクチンの筋肉内投与は局所的な「デポ」効果を誘発する可能性があります。これは、注射部位での抗原放出の延長で構成され、これにより免疫系の持続的な刺激とマクロファージの動員が誘導され、次に炎症性メディエーターの活性化が引き起こされます 36。注目すべきことに、この研究で使用されている病原体関連分子パターン（PAMP）が豊富なウイルスワクチンベクターの投与は、病原体認識受容体（PRR）の活性化を引き起こし、IL-1などの炎症促進性サイトカインの産生を刺激する可能性もあります。 1 と樹状細胞およびマクロファージによる TNF-α 37。その後、炎症メディエーターは血流やリンパ管を通って移動して腸組織に到達し、免疫応答の局所的な変化を促進し、その結果、関連する微生物叢の構造を変化させることができます38。さらに、感染部位で活性化される樹状細胞や制御性 T 細胞などの免疫細胞は、腸間膜リンパ節やパイエル板などのリンパ節への炎症シグナル伝達を媒介できます 39。

注目すべきことに、我々の研究で炎症誘発性サイトカイン（IL-6、IL-27、IFNγなど）と相関する細菌（ローズブリア属、ルミノコッカス属、ユーバクテリウム属）は、主に短鎖脂肪酸（SCFA）である抗炎症性代謝産物の主要な寄与者として知られています。）、腸内40。この所見は、SCFA が炎症誘発性サイトカインの産生を阻害する炎症性腸疾患などのこれまでの証拠と矛盾しているように見えるかもしれません 41。ただし、共生細菌が炎症を起こした腸内環境に適応できるいくつかのメカニズムは他の場所で議論されています 42。例えば、腸内微生物叢の特定の成分は、IL-6 などの自然免疫細胞による多面発現性サイトカインの産生と、その後の Th17 細胞の増殖 43 に関与しており、これはワクチン誘発性記憶免疫応答に重要です 44。また、ルミノコッカス属 45 などの腸内細菌によって産生されるフラジェリンおよびペプチドグリカンは、T 細胞および B 細胞によって発現されるパターン認識受容体 (PRR) によって感知され、ワクチンに対する天然のアジュバントとして機能します7。実際、ローズブリア属やユーバクテリウム属などの酪酸生成菌を含む鞭毛や線毛を持つ細菌が豊富に存在すると、免疫調節性 TLR アゴニストを介してアジュバントとして機能するワクチンの免疫原性を高めることができます 46。

注目すべきことに、Roseburia intestinalis や Eubacterium Hallii などのこれらの細菌グループのメンバーは、国際プロバイオティクスおよびプレバイオティクス科学協会によってプロバイオティクス候補としてリストされています 47。実際、この研究で特定されたものを含む一部の酪酸生成細菌は、結腸管腔メタボロームを調節し、T 細胞応答を調節し、制御性 T 細胞機能を強化することが示されています 48。まとめると、これらのデータは、抗炎症分子を産生する細菌がワクチン接種後の局所炎症の増加に適応し、腸内環境に定着してその中で増殖し、それによって炎症過程を調節して鎮める可能性があるという仮説を引き起こした。しかし、ワクチン誘発性炎症が腸内で抗炎症性細菌の増加をどのように促進するかを理解するには、さらなる研究が必要です。これに関連して、腸組織における Th17/Treg 細胞のバランス、T 細胞の分極と活性化プロファイル、ILC 応答、および Kyn/Trp 比 49 は、将来の検証の有望な候補となります。また、代謝産物や標的SCFA測定などの追加のオミクスアプローチは、HTIワクチン接種後に誘発される潜在的な抗炎症経路を特定するのに役立つだろう。私たちは、この研究ではサンプルサイズが小さいことと個人レベルの貢献が欠けていることの限界を十分に認識しています。また、長期的なサイトカイン測定が欠如しているため、ワクチンレジメンの各段階で特定の細菌の特徴と相関する免疫の一時的な変動を特定することはできませんでした。ある細菌群が HTI 特異的 T 細胞応答と強い相関関係を示したにもかかわらず、ワクチン誘発性微生物叢の変化がベクターのアジュバント効果によるものなのか、インサート特異的なものによるものなのかを実験デザインが区別できないことがもう 1 つの限界でした。反応。空のベクターを使用したコントロールアームを含む将来の実験は、腸内細菌叢の変化に対するワクチンインサートの直接的な寄与を識別するのに役立ちます。さらに、もう 1 つの本質的な制限は、16 S rRNA 遺伝子配列決定では生きた微生物と一過性の微生物のコロニー形成を区別できないことでした 50。最後に、コア腸内細菌叢の宿主特異性により、マウスモデルからヒトへのこれらの結果の潜在的な外挿が制限される可能性があります。したがって、ヒトの腸内微生物叢におけるそのような発見を検証するには、微生物叢の特徴付けを含む臨床試験が必要です。

要約すると、私たちのデータは、腸内細菌がワクチン誘発性の炎症に適応できることを示唆しています。また、微生物のT細胞ワクチン接種への移行のダイナミクスを完全に把握するための将来の研究の枠組みを確立し、最終的にはワクチンの有効性を最適化するための新たな潜在的な標的を提供します。

同じ飼育施設で飼育された生後 6 週間の C57BL/6JOlaHsd マウス (n = 40、雌 20 匹、雄 20 匹) を Envigo から購入し、比較医学センターで特定病原体除去 (SPF) 条件下で飼育しました。スペイン、バダロナの IGTP にある Bioimage (CMCiB) 動物施設。マウスは、性別（女性/男性）と治療グループ（モック/免疫化）の組み合わせに従って、ケージあたり最大5匹のケージにランダムに割り当てられ（補足図1）、最初の投与の前に1週間順応させました。処理。

微生物叢組成における潜在的なベースラインの違いを減らすために、マウスの腸内微生物叢を抗生物質による条件付けとそれに続くマウス間FMT（到着後1週間およびワクチン接種の2週間前）によって均質化しました。抗生物質治療は、アンピシリン、アミカシン、メトロニダゾール、およびバンコマイシンの組み合わせ（各抗生物質 10 mg/ml）からなり、FMT 前の 5 日間強制経口投与（200 μl/動物）しました。 5匹の雄と5匹の雌のドナーマウス（ケージMF1およびMM1、補足図1）からの混合便を、研究のすべての動物のFMTに使用しました。簡単に説明すると、ドナーからの糞便を収集し、プールし、等分し（350 mg バイアル）、使用するまで -80 °C で保存しました。糞便移送当日、解凍した糞便を滅菌生理食塩水血清（バイアルあたり 2.3 ml）に再懸濁し、ホモジナイズし、遠心分離（500 × g、1 分間）し、上清を強制経口投与（100 μl/動物）しました。 FMT における細菌量は、LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial Viability and Counting Kit (Invitrogen、米国マサチューセッツ州カールスバッド) を使用して測定しました。

動物には、HIV 感染の T 細胞制御に関連するさまざまな HIV-1 タンパク質断片の融合として設計された合成タンパク質である HIV T 細胞免疫原 (HTI) をワクチン接種しました 20。簡単に説明すると、HTI 配列は 529 アミノ酸の免疫原をコードしており、16 クレード B コンセンサス HIV Gag、Pol、Vif、Nef タンパク質断片の連結として設計されており、これらはアラニントリプレットによって結合され、HIV 感染を自然に制御している人々によって優先的に標的とされます。。アミノ酸配列はヌクレオチドに逆翻訳され、コドンの使用がヒトでの発現に最適化され、得られたオープンリーディングフレーム (ORF) が合成されて、さまざまなベクターに挿入されます 22。具体的には、CMV プロモーターの制御下にあるプラスミド DNA (DNA.HTI、D) と 2 つのウイルスベクター、チンパンジーアデノウイルス Ox1 (ChAdOx1.HTI、C) および改変ワクシニアアンカラ (MVA.HTI、M) に挿入しました。 22. HTI ワクチンの免疫原性は、C57BL/6 マウスモデルおよび非ヒト霊長類 22、ならびにヒト 23 において以前に試験されています。この研究では、20 匹のマウス (メス 10 匹、オス 10 匹) を、HTI を発現する 3 つの異なるワクチンベクターからなる異種プライムブースト療法で筋肉内 (大腿尾筋) に免疫しました: (i) 3 つの DNA.HTI プライム (100 μg/動物) )、(ii) ChAd.HTI (1 × 109 VP/動物) による 1 回の追加免疫、(iii) MVA.HTI (1 × 106 pfu/動物) による 2 回目の追加免疫。 DNA.HTIワクチン接種は0、3、6週目に投与され、続いて6週間の間隔でChAd.HTIとMVA.HTIが投与されました（それぞれ9週目と15週目）（図1および補足図1）。。模擬グループのマウス (n = 20、メス 10 匹、オス 10 匹) には、同じ免疫スケジュールに従い、対照グループとして PBS をワクチン接種しました。

補足図に示すように、微生物叢データは 2 つのバッチ (2019 年と 2020 年に抽出および配列決定されたサンプル) で生成されました。最初の配列決定バッチには、ケージから縦方向に収集されたプールされた糞便サンプルが含まれていましたが、2 番目のバッチには、ケージからの縦方向の糞便プールと、研究の最後の時点で腸管のさまざまなセクションから得られた個々の糞便サンプルが含まれていました。動物の到着時（第 3 週）、FMT 前（第 2 週）および各ワクチン接種前（第 0、3、6、9、および 15 週）に抗生物質による前処置を行った後、縦方向の糞便サンプルを収集しました（ケージあたり 1 つのプール、n = 5）。）。ドナープールの糞便サンプル (1 週目) も収集され、バッチ 1 で配列決定されました。最後の免疫化の 3 週間後 (18 週目)、マウスを安楽死させ、3 つの腸切片 (小腸、盲腸、大腸) から管腔内容物、全血を採取しました。そして脾臓を採取した。 Serum Gel S/1.1 チューブ (Sarstedt) での遠心分離 (10,000 × g、5 分間) によって全血から血清を分離し、使用するまで -80 °C で凍結しました。脾細胞を機械的破壊によって単離し、5mlシリンジゴムプランジャーを使用してセルストレーナー(Falcon)を通して押し込んだ。赤血球溶解後、脾細胞を洗浄し、R10 (10% ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、100 U/ml ペニシリンおよび 100 μg/ml ストレプトマイシンを補充した RPMI 1640) に再懸濁し、使用するまで液体 N2 中で凍結保存しました。

糞便サンプルおよび腸内容物からのゲノム DNA は、メーカーの指示に従って QIAamp DNA Stool Kit を使用して抽出され、配列決定まで -80 °C で保存されました。 16 S rRNA 遺伝子の V3-V4 超可変領域の増幅は、標準的なフォワードアダプターとリバースアダプター (16S_F 5'-TCG TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-) が隣接するユニバーサルプライマーを使用して実行されました。 3'; 16S_R 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3'）は、Illumina MiSeq rRNA Amplicon Sequencing プロトコル（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）に記載されています。 PCR は、2.5 μL の DNA テンプレート、12.5 μL の KAPA HiFi HotStart Ready Mix (KAPA HiFi HotStart DNA ポリメラーゼ、バッファー、MgCl2、および dNTP、KAPA Biosystems Inc.、ウィルミントン、マサチューセッツ州、米国) を含む 25 μL の反応容量で実行されました。 1μMの各プライマーを5μL。サーモサイクル条件は次のとおりです: 95 °C で 3 分間の最初の変性ステップ、その後 95 °C で 30 秒間の変性、55 °C で 30 秒のアニーリング、72 °C で 30 秒の伸長の 30 サイクル。最終伸長ステップは 72 °C で 10 分間。 1.0% アガロースゲル電気泳動で予想されるアンプリコンサイズ (約 460 塩基対) が確認されたら、シーケンスライブラリーの調製まで PCR 産物を -30 °C で保存しました。ネガティブ抽出および PCR コントロール (DNA を含まない水をテンプレートとして使用するブランクコントロール) をロードして潜在的な汚染を評価し、他のサンプルと同じ条件で処理しました。増幅された DNA テンプレートは、非 DNA 分子および Illumina シーケンスアダプターについては AMPure XP 試薬 (Beckman Coulter Life Sciences、インディアナポリス、米国) でクリーンアップされ、Nextera XT インデックスキット (Illumina Inc.) を使用してデュアルインデックスが付加されました。 MiSeq 16 S rRNA Amplicon Sequencing Protocol (Illumina Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) に記載されている PCR 増幅プログラム。 2 回目のクリーンアップの後、Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA アッセイキット (Invitrogen、米国マサチューセッツ州カールスバッド) を使用してアンプリコンライブラリを定量し、さらにプールするために等モル濃度 (4 nM) に希釈しました。プールされたライブラリーは、Germans Trias i Pujol 研究キャンパス (スペイン、バダロナ) のゲノミクス中核施設にある Illumina MiSeqTM プラットフォーム (Illumina Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) で、ペアエンド 300 塩基長プロトコルを使用して配列決定されました。

生の配列決定データの品質は、FastQC51 を使用して推定され、16 S rRNA 配列の分析は DADA2 パイプライン (v1.10.1) を使用して実行されました 52。パイプラインは、フィルタリングステップで maxEE = 4.10 を使用してデフォルトパラメーターに従って実行されました。キメラリードを除去した後、固有のアンプリコン配列バリアント (ASV) に分類が割り当てられ、SILVA rRNA 遺伝子データベースと位置合わせされました 53。ダウンストリーム分析は、phyloseq (v1.26.1)55、vegan (v2.5-5)56 ade4 (v1.7-13)57 および ggplot2 (v3. 2.0)58. ASV 数は正規化され、phyloseq 関数transform_sample_counts (100 × (x/sum(x))) を使用して相対存在量に変換されました。アルファ多様性 (シャノンエントロピーインデックス) は、希少な ASV カウントのestimate_richness を使用して評価されました。ベータ多様性は、ブレイ - カーティス距離 (正規化データ) と、配位主座標分析 (PCoA) の実行に使用される距離行列に基づいて計算されました。

ELISPOT アッセイは、マウス IFNγ ELISPOT キット (ALP) (Mabtech AB、ストックホルム、SE) を使用し、製造元の使用説明書に若干の変更を加えて実行しました。簡単に説明すると、脾細胞を解凍、洗浄、計数し（NucleoCounter® NC-3000、Chemometec）、細胞密度をR10で4×105細胞/ウェルに調整し、96ウェルポリビニリデンプレート（Millipore Corp.、マサチューセッツ州ベッドフォード）にプレーティングしました。 IFNγ 捕捉抗体 (クローン AN-18) でコーティングされています。細胞を 17 種類の HTI 特異的ペプチドプール (各ペプチドの最終濃度 14 μg/ml) で 37 °C、5% CO2 で 16 時間刺激しました。 11 アミノ酸ずつ重複し、HTI 配列全体をカバーする、長さ 15 アミノ酸の重複ペプチド (OLP) 147 個のセットを、PeptGen アルゴリズム (ロスアラモス HIV データベース) を使用して設計し、合成しました (Synepeptide)。 HTI に対する応答を評価するために、OLP を 17 個の別々のペプチドプールに組み立てました。その構成は、Gag については 7 つのプール (プールあたり 8 ～ 11 ペプチド)、Pol については 7 つ (プールあたり 11 または 5 ペプチド)、Vif については 2 つ(8 および 6 ペプチド/プール) です。プール）および Nef 用に 1 つ（プールあたり 2 ペプチド）。コンカナバリン A (Sigma-Aldrich Corp.、ミズーリ州セントルイス) 5 μg/ml を陽性対照として使用し、R10 を陰性対照として 3 回使用しました。刺激後、ビオチン化 IFNγ 検出抗体 (クローン R4-6A2)、アルカリホスファターゼ (AP) と結合したストレプトアビジン、および AP 結合基質キット (Bio-Rad Laboratories, Inc.、アーバイン) を添加することにより、スポット形成細胞 (SFC) が明らかになりました。 CA）。自動ELISPOTリーダーシステム(CTL Analyzers LLC、オハイオ州クリーブランド)とImmunoSpotソフトウェアを使用してウェルあたりのSFCを計数し、応答の大きさを脾細胞106個あたりのSFCとして表した。陽性反応の閾値は、少なくとも 50 SFC/106 脾臓細胞、陰性対照ウェルの平均 SFC/106 脾臓細胞に陰性対照ウェルの 3 標準偏差を加えたもの、または陰性対照ウェルの平均の 3 倍である反応として定義されました。どちらか高い方。結果は、全体の大きさ (すべてのプールに対する累積反応、SFC/106 PBMC) および幅 (陽性プールの数) として示されました。

CD40 リガンド (CD154)、GM-CSF、IFN γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12 (p70)、IL-13、研究終了時の IL-15、IL-17A、IL-17E/IL-25、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-31、IL-33、TNFα、TNFβ (週 21 wpi) を単一バッチでマウス血清で同時に測定しました。簡単に説明すると、血清サンプルを解凍し、ボルテックスし、10000 xg で 10 分間遠心分離し、その後さらなる試験のために 25 μl の血清を収集しました。 22 種類のサイトカインの血清濃度を、カスタマイズされたマウス Th17 磁気ビーズパネルキット (Milliplex) および Luminex® 200 (Luminex Corp) リーダーのサンプルを使用して、メーカーの指示に従って同時に測定しました。

実験グループ間のアルファ多様性と分類群の存在量の違いは、Wilcoxon 符号付き順位検定と Kruskal-Wallis 検定 (両側) を使用して評価されました。ベータ多様性については、ペアワイズ順列多変量分散分析 (PERMANOVA、adonis) 検定を使用して統計的有意性を評価しました。線形判別分析効果サイズ (LEfSe)59 を実行して、モック群と免疫化グループ間の判別細菌サインを特定しました (α = 0.05 および LDA スコア > 2.0)。サイトカイン、免疫応答、細菌間の関連性は、R/hmisc パッケージ内の rcorr 関数を使用した Benjamini-Hochberg 多重検定補正と組み合わせた Spearman 相関係数に基づいて計算されました。統計分析は R 環境で実行され、特に明記しない限り、両側 5% 有意水準 (p 値 ≤ 0.05) が有意であるとみなされます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究で使用した生の 16 S rRNA シーケンシングリードは、Sequence Read Archive (SRA) リポジトリ (Bioproject No. PRJEB52963) に保管されています。

この論文に関連する R 分析スクリプトとデータは、https://doi.org/10.5281/zenodo.7017193 で入手できます。

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リファレンスをダウンロードする

このプロジェクトは、助成契約番号 847943 (MISTRAL) に基づく欧州連合の Horizon 2020 研究およびイノベーションプログラムから資金提供を受けており、一部は Grifols によって後援されました。

これらの著者は同様に貢献しました: Alessandra Borgognone、Aleix Elizalde-Torrent。

この作品は、Alex Olvera、Roger Paredes の著者が共同で監修しました。

イルシカイシャエイズ研究所、バダロナ、スペイン

アレッサンドラ・ボルゴニョーネ、アレイシ・エリザルデ＝トレント、マリア・カサデラ、ルイス・ロメロ、トゥイクセント・エスクリバ、マリオナ・パレラ、フランセスク・カタラ＝モール、マルク・ノゲラ＝ジュリアン、クリスチャン・ブランダー、アレックス・オルベラ＆ロジャー・パレデス

バルセロナ自治大学 (UAB)、バルセロナ、カタルーニャ、スペイン

ルイス・ロメロ & ロジャー・パレデス

ヴィック大学 - カタルーニャ中央大学 (UVic-UCC)、ヴィック、スペイン

マーク・ノゲラ＝ジュリアン、クリスチャン・ブランダー、アレックス・オルベラ、ロジャー・パレデス

感染症サイバーセンター CIBERINFEC、ISCIII、マドリッド、スペイン

マーク・ノゲラ＝ジュリアン、クリスチャン・ブランダー、アレックス・オルベラ、ロジャー・パレデス

カタルーニャ総合研究所 (ICREA)、バルセロナ、スペイン

クリスチャン・バーナー

AELIX Therapeutics、バルセロナ、スペイン

クリスチャン・バーナー

米国オハイオ州クリーブランド、ケースウェスタンリザーブ大学病理学部国際保健疾患センター

ロジャー・パレデス

Fight Against Infections Foundation、Germans Trias i Pujol University Hospital、バダロナ、カタルーニャ、スペイン

ロジャー・パレデス

ドイツ人トリアス・イ・プジョル大学病院感染症科、バダロナ、カタルーニャ、スペイン

ロジャー・パレデス

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MN-J.、CB、AO、RP が研究を計画し、研究を監督しました。 AB はデータを分析して原稿を書きました。 AE-T。データの解釈と原稿の編集に貢献しました。 AE-T.、MC、AO は動物実験を準備し、サンプルを収集しました。 AE-T.、MC、MP は糞便 DNA 抽出、ライブラリー調製、配列決定を行いました。 LR、TE、および AO は、サイトカインプロファイリングと免疫応答の決定を実行しました。 FC-M.、ミネソタ-J. AB はデータの処理、管理、保管に貢献しました。 ABとAE-T。はこの原稿の共同筆頭著者です。 AO と RP はこの原稿の共同連絡著者です。著者全員が草案を批判的に編集し、原稿を修正し、提出された最終版を承認しました。

アレックス・オルベラまたはロジャー・パレデスとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

動物を含むすべての実験は、ドイツ人トリアス・イ・プジョル病院 (IGTP) およびカタルーニャ自治政府の動物実験倫理委員会 (プロジェクト番号: 10559) によって承認されました。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Borgognone, A.、Elizalde-Torrent, A.、Casadellà, M. 他 HIV T 細胞免疫原によるワクチン接種は、マウスの腸内細菌叢の変化を誘発します。 npj バイオフィルムマイクロバイオーム 8、104 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41522-022-00368-y

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受信日: 2022 年 8 月 25 日

受理日: 2022 年 12 月 12 日

公開日: 2022 年 12 月 30 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-022-00368-y

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