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May 22, 2023

素晴らしい

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 6、記事番号: 622 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

急性骨髄性白血病は成人で最も一般的な急性白血病ですが、臨床では難治性および薬剤耐性の壁がまだ克服されていません。 異常な遺伝子発現とエピジェネティックな変化は、病因と治療において重要な役割を果たします。 スーパーエンハンサーは、がん遺伝子の転写を活性化することによって前腫瘍遺伝子と薬剤耐性を促進するエピジェネティック修飾因子です。 マルチオミクス統合解析により、スーパーエンハンサー関連遺伝子 CAPG が特定され、その高い発現レベルは AML の予後不良と相関していました。 CAPG は細胞骨格タンパク質ですが、AML における機能は不明です。 今回我々は、NF-κBシグナル伝達経路の調節におけるCAPGの分子機能をプロテオミクスおよびエピゲノム解析によって示す。 AMLマウスモデルにおけるCapgのノックダウンは、AML細胞を枯渇させ、AMLマウスの生存期間を延長した。 結論として、SE 関連遺伝子 CAPG は、NF-κB を介して AML 進行に寄与する可能性があります。

急性骨髄性白血病 (AML) は、主に遺伝子変異の蓄積と造血幹細胞 (HSC) の悪性増殖によって引き起こされる進行性の血液悪性腫瘍です1、2、3、4、5。 高い薬剤耐性と再発率が臨床試験における現在の課題となっています6。 AML は、ランダムな遺伝子変異やエピジェネティックな変化の結果として発生し、進行する可能性があります 7、8、9、10。

近年、いくつかのがんの根底にある異常なエピジェネティックパターンの理解における大きな進歩が強調されています。 エピジェネティックな異常は癌原遺伝子を活性化し 11、染色体の不安定性を引き起こす 12,13 一方で、腫瘍抑制遺伝子の転写沈黙を引き起こします 14,15。 AMLの発症および進行中のエピジェネティックな分子イベントの検出は、より効果的な治療法の開発にとって価値がある可能性があります。

スーパーエンハンサー (SE) は本質的に、活性のある典型的なエンハンサー (TE) のクラスターです16。 TE と比較して、SE はサイズが大きく、転写を活性化する能力が向上しています。 発生中、SE は細胞運命の調節と遺伝子の決定において重要な役割を果たします 16。 がん細胞は、MYC、BCL2 などのがん遺伝子領域で SE を獲得し、そのがん表現型は異常な転写に依存しています 16,17。 DNA メチル化、ヒストン アセチル化などのエピジェネティックな修飾は、SE を介して下流エフェクターの異常な活性化を制御できます 18、19、20。 SE は、腫瘍関連遺伝子 21,22、免疫チェックポイント 23、炎症性サイトカイン 24 の転写を媒介することも判明しました 25,26。 これらは、SE が腫瘍および薬剤耐性の再発の発生と進行に関与していることを示唆しています。

キャッピングアクチンタンパク質、ゲルゾリン様（CAPG）は、アクチン細胞骨格の構成において重要な役割を果たすゲルゾリンスーパーファミリーのアクチン結合タンパク質です27。 ゲルゾリンスーパーファミリーに属するタンパク質が、遺伝子発現制御などの他のプロセスに関与している可能性があることを示唆する証拠がある 28,29。 他のゲルゾリン スーパーファミリーのメンバーとは異なり、CAPG は主に細胞質ではなく核に存在します 30。 これまでの研究では、CAPG が骨転移の発症と治療の乳がんバイオマーカーであることが実証されています 31。 ただし、AML における CAPG の発現パターンと機能はまだ調査されていません。

この研究では、AML 特異的なスーパーエンハンサー関連遺伝子 CAPG を特定しました。 そして、CAPG が NF-κB シグナル伝達経路を通じて AML の進行を調節できることを検証しました。

AMLの病因を深く理解し、AML治療の新たな治療標的を与えるために、我々はまずAML特異的なスーパーエンハンサーとSE関連遺伝子を同定した。 スーパーエンハンサーは、細胞特異的遺伝子の発現を制御および定義するために重要です16。 AML特異的SEおよび関連遺伝子を同定するために、AML治療の新たな標的を提供することを目的として、マルチオミクスデータを統合してAML特異的スーパーエンハンサー関連遺伝子の特徴を明らかにした。 我々は、AML H3K27ac クロマチン免疫沈降シーケンス (ChIP-seq) データを分析することにより、急性骨髄性白血病に特異的な SE および SE 関連遺伝子を同定しました。 一方、SEは、好中球（NE）、単球（MO）、造血幹細胞前駆細胞（HSPC）などの正常な血液細胞の遺伝子に関連していることが特定されました（補足図1）。 さらに、以前の研究で公開されている RNA-seq データセット (GSE128910) を分析し、医療ボランティアと AML 患者の間で差次的に発現している遺伝子を計算し、AML (RPKM > 1) で発現が正常よりも 3 倍高い遺伝子を抽出しました (図1a)32、33、34、35。

AML細胞において特異的かつ高発現しているスーパーエンハンサー関連遺伝子を探索するための実験スキーム。 好中球 (NE)、単球 (MO)、および造血幹細胞前駆細胞 (HSPC) は、正常な血液細胞を表します。 青い丸は、正常な造血細胞のスーパーエンハンサー関連遺伝子を表します。 緑色の円は、AML 患者において上方制御された遺伝子を表します。 灰色の円は、AML 細胞のスーパーエンハンサー関連遺伝子を表します。 b ChIP-seq トラックは、健康なボランティアと AML 患者における代表的な H3K27ac シグナルを示します。 スーパーエンハンサーは灰色のボックスとして表示されます。

上記の分析に従って、発現が著しく高い6つのAML特異的SE関連遺伝子（CAPG、CD207、GPR132、SLC7A11、HIPK3、およびFCER1G）をスクリーニングしました（図1b）。 これらの遺伝子領域はSEが豊富で、AMLで高度に発現しています（図2a、補足図2a）。 我々は、AMLにおいて高発現が報告されているCAPGを研究対象として選択した。

RNA-seq データ (GSE128910) は、CAPG が AML 患者で高度に発現していることを示しています。 健康なボランティア (n = 4) または AML 患者 (n = 7)。 b The Cancer Genome Atlas (TCGA)-LAML データベースの CAPG のカプラン・マイヤー生存曲線。 点線は 95% の信頼限界を表します。 c 浸潤乳癌 (BRCA)、腎乳頭細胞癌 (KIPR)、卵巣漿液性嚢胞腺癌 (OV)、膵臓腺癌 (PAAD)、直腸腺癌 (READ) および精巣胚細胞腫瘍 (TGCT) における CAPG の発現レベルを比較します。腫瘍および正常組織から。 Wilcoxon Rank Sum および Signed Rank Test を使用して、差異の重要性を分析しました。 中央値はボックス内の線で示されます。 d MLL-AF9誘発性AMLマウスの実験スキームが確立されました。 e 正常マウス骨髄細胞と比較して、初代移植マウスからのマウス白血病細胞においてCAPG発現が増加していることを示すRT-qPCR（n = 5マウス）。 各ドットはマウスを表します。 データは平均値 ± SD として表示されます。 *対照群と比較して p < 0.05。 f 正常マウス骨髄細胞と比較して、一次移植マウスからの白血病細胞においてCAPG発現が増加していることを示すウェスタンブロット。 GAPDH は等しい負荷を示すために使用されました。 各バンドは個々のマウスを表します。

我々は、Cancer Genome Atlas (TCGA) データベースを分析し、CAPG 発現レベルが AML の予後不良と正の相関があることを発見しました (図 2b)。 並行して、他のSE関連遺伝子の発現もさまざまな程度で予後と相関していました（補足図3）。 さらに、TCGAデータベースによる調査により、CAPGは正常組織と比較してさまざまな腫瘍組織で統計的に有意に高く発現していることが明らかになりました（図2c）。 これは、CAPG が腫瘍の発生と密接に関連していることを意味します。

SE関連遺伝子が疾患内で差次的に発現し、AMLの予後に影響を与えるかどうかをさらに検証するために、採取した患者の末梢血サンプルとマウスモデルの骨髄サンプルの発現レベルを比較しました（図2d）。 我々は、MLL-AF9誘導マウスAML細胞におけるCAPG発現が、正常なマウス骨髄細胞と比較して有意に上昇していることを観察した（図2e、fおよび補足図2b）。

一般に、AML のがん遺伝子はスーパーエンハンサー関連遺伝子によって正確にスクリーニングでき、スーパーエンハンサー関連遺伝子 CAPG は AML の進行に関連しています。

CAPG は、タンパク質のゲルゾリン スーパーファミリーのメンバーとして知られており、フィラメントをキャップしたり切断したりすることでアクチン フィラメントの長さを調節します 36。 CAPG は、このファミリーの他のメンバーとは異なり、細胞の細胞質および核に存在します 37。 CAPG は膵臓がん 38 および乳がん 31,39 の予後不良と関連していますが、AML に関する研究は行われていません。 AMLでは、アクチンの発現に上方制御傾向があります（補足図2c）。 CAPGがAMLの進行にどのように寄与するかを調べるために、ヒトAML細胞株THP-1のCAPGタンパク質複合体を精製および特徴付けし、質量分析による免疫沈降（IP-MS）によってCAPGインタラクトームを構築しました（図3aおよび補足データ3）。

THP-1細胞におけるCAPGインタラクトームを同定するための抗体依存性IP-MSシステムを示すスキーム。 b CAPG と複数のタンパク質複合体との接続。 CAPG インタラクトームに関連する主要なタンパク質複合体の概要 (破線の円)。 円の大きさはタンパク質間相互作用の信頼性を表し、接続線の太さは相互作用の強度を表します。 c Co-IP は、CAPG と NF-κB 関連タンパク質 (RPL4、ZFP91、CCAR2) の間の相互作用を示します。

我々は、THP-1 で 79 個の CAPG 相互作用タンパク質を同定しました (補足資料)。 さらに、細胞の生物学的機能の決定には、遺伝子オントロジーによる濃縮分析とインタラクトームのグラフベースの視覚化による結論が採用されました。 機能アノテーションクラスターの選択には、ジーンオントロジーが利用されました。 機能解析により、総タンパク質抽出物からの CAPG タンパク質パートナーは、アクチン結合タンパク質として、核酸およびアクチンフィラメントの結合と密接に関連しており、細胞分子活動にも関与していることが明らかになりました。 GO カテゴリーは、細胞の代謝、局在化、生体分子の安定性に関連するプロセスに関与していました。 また、RNA スプライシングにも関与し、クロマチンのリモデリングやヒストン修飾に関連するエピジェネティックな制御に関与し、遺伝子発現に影響を与える可能性があります。 細胞成分分析によると、CAPG はリボソーム、核、核質、特にアクチン細胞骨格で見つかりました。 CAPG はエピジェネティックな修飾複合体とも関連しています。 この結果は、ゲルゾリンタンパク質としてのCAPGが細胞骨格を構成するだけでなく、細胞成長プロセスにおいて重要な機能を果たすことを示しました（補足図4a）。

CAPGの潜在的な機能的役割をさらに解釈するために、インタラクトームの結果をタンパク質間相互作用（PPI）ネットワーク分析に供しました（図3b）。 特に、CAPGがミオシン複合体、トロポニン複合体、チューブリン複合体、アクチン複合体を含む複数の細胞骨格タンパク質複合体と物理的に相互作用することが観察されました。 この結果は、ゲルゾリンタンパク質としての CAPG の機能と一致しています。

さらに、インタラクトームの特徴を分析したところ、CAPG がこれまで報告されていなかった複数のエピジェネティックな制御複合体と関連していることが明らかになりました。 注目すべきことに、3つの相互作用タンパク質（CCAR2、RPL4、ZFP91）が核因子-κB（NF-κB）シグナル伝達経路活性化因子として報告されています40、41、42（図3c）。 さらに、SNW1複合体はNF-κB経路の新規転写調節因子として同定されています43（補足図4b）。 研究では、NF-κB 活性の不均衡ががんなどの炎症関連疾患を引き起こすことが示されているため、NF-κB はがん治療の潜在的な標的と考えられています 44。 NF-κB 経路の活性化は、いくつかの重要な発癌性キナーゼによって開始される白血病性転換に寄与します 45。 我々は、特徴付けられたCAPGがAML細胞のNF-κBシグナル伝達経路複合体と相互作用することを検出したため、CAPGがAMLの疾患プロセスを調節する標的としての可能性を有するという仮説を立てた。

AML発症時のCAPGとNF-κBの関係を解明するために、我々は正常マウスとAMLマウスから骨髄細胞を採取した。 CAPG ChIP-seqアッセイを実行して遺伝子制御ネットワークを特定し、データを評価して遺伝子領域に富むAML特異的ピークを選択しました（図4a）。

正常骨髄細胞およびAML骨髄細胞におけるCAPG結合遺伝子座のベン図。 b AML細胞のみにおけるCAPG制御遺伝子の遺伝子オントロジー用語濃縮分析、図に表示されている各結果について P < 0.05。 c コントロール、ノックダウン、および 10 ng/mL TNF-α 刺激グループにおける CAPG の mRNA レベルを比較しました。 データは平均値 ± SD として表示されます。 ***p < 0.001。 結果は 3 つの生物学的複製から得られました。 d TNF-αの添加により、THP-1細胞におけるCAPGノックダウンによって誘導されるNF-κB経路活性の阻害が逆転した。 データは平均値 ± SD として表示されます。 **p < 0.01、***p < 0.001。 結果は 3 つの生物学的複製からのものです。 e KEGG分析により、CAPG下流遺伝子は主にNF-κBシグナル伝達経路に富んでいることが明らかになり、図に表示された各結果についてP < 0.05でした。 f 対照、CAPG ノックダウングループにおける白血病誘発の mRNA レベル。 データは平均値 ± SD として表示されます。 **p < 0.01、***p < 0.001。

GO分析は、CAPG調節遺伝子が細胞成分および分子機能の点でNF-κB経路に実質的に関連していることを示した（図4b）。 また、転写因子の標的と下流遺伝子を評価し、NF-κB経路の転写活性の調節に関与する潜在的な遺伝子としてCAPGを特定しました（補足図5a、b）。 これらすべての証拠は、CAPG が NF-κB 経路の活性化に関連していることを示唆しています。

私たちの結論をさらに実証するために、THP-1 細胞のゲノムにおける CAPG の濃縮を調査しました。 ChIP-qPCR分析は、THP-1細胞のNF-κBの転写因子領域でCAPGが大幅に濃縮されていることを示しました（補足図5c）。

さらに、THP-1細胞におけるCAPG発現を下方制御し（図4cおよび補足図5d））、NF-κBの下流遺伝子の発現レベルを評価しました（図4d）。 注目すべきことに、CAPG ノックダウンは、AML 進行に関連するいくつかのアポトーシス遺伝子および免疫応答遺伝子の発現の顕著な減少につながりました (図 4d)46,47。 また、CAPGをノックダウンした後にRNA-seqデータを収集し、KEGG分析を実行したところ、下方制御された遺伝子がNF-κB経路で大幅に濃縮されていることが明らかになりました（図4eおよび補足データ4）。

CAPGによるNF-κB経路の直接制御を実証するために、THP-1細胞をTNF-αで刺激することによって経路を活性化し、下流遺伝子発現の有意なレスキューを観察しました（図4d）。 さらに、CAPGが枯渇すると、白血病誘発の発現レベルが大幅に減少します（図4f）。 これらの観察は、CAPG が NF-κB 経路を直接調節し、それが AML の進行に影響を与える可能性があることを示唆しています。

CAPG が AML 進行と関連しているかどうかを判断するために、CAPG ノックダウン実験を実施してその機能を検証しました。 CAPG をノックダウンすると、AML 細胞の増殖を阻害できます (補足図 6a)。 AMLにおけるCAPGの潜在的な前腫瘍役割をさらに調査するために、同数の対照（Ctrl）またはCapgノックダウン（shCapg）マウスAML細胞を同系野生型（WT）レシピエントに移植しました（図5a）。

in vivoでのCapgノックダウンの実験スキーム。 b AMLマウス骨髄からの選別されたAML細胞におけるCapgノックダウンを示すウェスタンブロット分析。 c 移植後45日目のスクランブルコントロール（Ctrl）およびCapgノックダウン（shCapg）AMLマウスの骨髄からの選別されたAML細胞におけるCapgノックダウンを示すRT-qPCR分析。 データは平均値 ± SD として表示されます。 **対照群と比較して p < 0.01。 結果は 3 つの生物学的複製から得られました。 d 代表的なサイトメトリーフロープロット、移植後45日目の骨髄(BM)中のGFP + AML細胞の割合(n = 5マウス)。 各ドットはマウスを表します。 ***p < 0.001 対照群と比較。 e 代表的なサイトメトリーフロープロットと統計結果は、Capgノックダウンが移植後28日目および45日目の末梢血（PB）における白血病負荷を減少させることを示しています（n = 5マウス）。 各ドットはマウスを表します。 *p < 0.05、***p < 0.001 対照群と比較。 f スクランブルコントロールおよびCapgノックダウンAMLマウス（n = 5マウス）からの脾臓（左上）、肝臓（左下）の代表的な画像、ならびに脾臓重量（中央）および肝臓重量（右）の定量分析。 各ドットはマウスを表します。 **p < 0.01、***p < 0.001 対照群と比較。 g コントロールおよび Capg ノックダウン AML マウスの血液塗抹標本のライト・ギムザ染色。 スケールバーは20μm。 h スクランブルコントロールまたはCapgノックダウンAML細胞を移植されたマウスの生存分析。 示されているデータは、2 つの独立した移植から得られたものです (n = 5 マウス)。 p = 0.0018、ログランク検定。

Capg減少の効果を評価するために、最初にVectorおよびshCapg AMLマウスから緑色蛍光タンパク質（GFP）+白血病細胞を選別し、shCapgグループの発現レベルがRT-qPCRおよびウェスタンブロットによって減少することを証明しました（図5b、c） ）。

Capgの欠乏により、末梢血（PB）中のAML細胞が著しく消耗され（図5e）、骨髄の疾患負担が軽減されることがわかりました（図5d）。

さらに、AMLマウスの脾臓と肝臓は著しく肥大していましたが、Capgノックダウンによりこれらの症状が大幅に軽減されました（図5f）。 一貫して、組織学的分析により、shCapgグループのAMLマウスでは末梢血中の白血病細胞浸潤が少ないことが示されました（図5g）。 重要なことに、CapgノックダウンはAMLマウスの生存を有意に延長し、全生存期間中央値（MOS）は、対照群の51日と比較して、shCapg群では83日でした（図5h）。 これらの結果は、Capg ノックダウンがマウスにおける MLL-AF9 誘発性 AML の進行を抑制することを示しており、これは Capg が AML において発癌性であるという我々の仮説を裏付けるものである。

さらにパターンを要約すると、CAPG はタンパク質インタラクトームによって NF-κB シグナル伝達経路に作用し、下流遺伝子の発現を活性化します。 NF-κB ファミリーの転写因子領域に直接結合し、下流の遺伝子発現の制御をオンにすることで、AML の進行を加速します。

総合すると、データは、CAPG が NF-κB シグナル伝達経路を調節することによって AML の進行において重要な役割を果たしているということを示しています。 私たちの研究により、スーパーエンハンサー関連遺伝子 CAPG が AML のがん遺伝子として同定され、これにより AML 治療の新たな治療標的が与えられました。

エピジェネティックな修飾は、さまざまな腫瘍の発生と発達において重要な役割を果たすことが多く、スーパーエンハンサー (SE) は、細胞型特異的な遺伝子発現を調節し、転写を含む細胞運命の決定において重要な役割を果たすエピジェネティック要素です。腫瘍細胞の免疫チェックポイント分子23、免疫逃避25、26、および炎症性サイトカインの発現24。 トランスクリプトーム レベルでの RNA-seq 解析では、発現の異なる多数の遺伝子が生成される可能性があるため、疾患の進行に大きな影響を与える遺伝子を特定することが困難になります。 対照的に、スーパーエンハンサーは細胞型特異性が高く、強力な遺伝子発現調節機能を備えており、細胞のアイデンティティを制御および定義する遺伝子の発現を促進することができます16。 スーパーエンハンサーデータとトランスクリプトームデータを統合することで、対象範囲を絞り込み、精度を向上させることができます。 細胞型特異的SEとトランスクリプトミクスを組み合わせることで前腫瘍遺伝子のより正確かつ効率的なスクリーニングを達成できるかどうかは、まだ検証と調査の余地がある。

この研究では、細胞特異的SEとRNA配列データを統合することによってSE関連遺伝子を同定し、急性骨髄性白血病（AML）の予後不良と相関する6つの遺伝子（CAPG、CD207、GPR132、SLC7A11、HIPK3、およびFCER1G）を発見しました。 ) TCGA-LAML データベースによる患者。 CD207 は、ランゲルハンス細胞の特異的受容体として作用し、T 細胞に提示するために抗原をプロセシングするグリコシル化受容体です48。 GPR132 は、骨髄分化を引き起こす可能性がある白血病オーファン受容体です 49。 急性骨髄性白血病患者では、SLC7A11 の高発現は予後不良と関連しています 50,51。 HIPK3 はアポトーシスのプロセスに関与しており、さまざまな種類の癌の予後不良に関連しています 52。 FCER1G は、高親和性免疫グロブリン E (IgE) 受容体の構成要素として、さまざまな種類の癌における免疫応答に関連しています 53,54。 CAPG は、AML ではプロテインチロシンキナーゼと密接に関連し、ALL では薬剤耐性に関連し 55,56、膵臓がん 38 および乳がんでは予後不良と関連していることが報告されています 31,39。 CAPG は、AML ではプロテインチロシンキナーゼと密接に関連しており、ALL では薬剤耐性と関連していることが報告されています 55,56。 次に、マウスモデルでAMLにおけるCapgの機能を検証し、Capg発現の低下がAML疾患の進行を妨げる可能性があることを発見しました。 総合すると、これらのデータは、スーパーエンハンサー関連遺伝子 CAPG が AML の潜在的な治療標的であること、またスーパーエンハンサーに基づく統合解析アプローチの信頼性、また疾患のバイオマーカーを予測するための有望なツールであることを示唆しています。

スーパーエンハンサーは腫瘍形成と腫瘍の進行において重要な役割を果たします。 本研究では、スーパーエンハンサーを介して関連遺伝子CAPGを発見し、AMLにおけるその役割を検証した。 基本的な生物学的メカニズムは、エピジェネティック要素 SE を介した下流の白血病誘発発現の活性化による AML の促進であり、動的なエピジェネティックな変化による細胞運命の移行の古典的なイベントです。 私たちの研究は、CAPGノックダウンがAML疾患の進行を妨げることをゲノムレベルで実証しています。 遺伝子編集技術により、多くの病気の治療のためにゲノムレベルでの分子の正確な変更が可能になります57。 近年、エピジェネティックな分子修飾への CRISPR 技術の応用が実を結んでいます 58。 CRISPR-dCas9 をヒストン脱アセチラーゼと組み合わせてヒストン修飾を消去し、SE 活性を低下させると、SE 関連遺伝子の発現を制限し、疾患の進行を妨げる可能性があります 59。 我々は、エピジェネティックレベルで、原癌遺伝子のCAPG発現がSEの阻害活性によって減少し、それによってAMLの進行が制限されるのではないかと推測している。

ゲノムの不安定性とエピジェネティックな異常は、病気の発生を直接促進する可能性があります。 DNA メチル化、ヒストン修飾、クロマチンへのアクセス可能性などのエピジェネティックな変化は、遺伝子発現制御において主要な役割を果たしていることが報告されています。 分子生物学の「遺伝セントラルドグマ」によれば、遺伝情報はDNA-RNA-タンパク質を介して伝達される。 このプロセスの最後のリンクとして、タンパク質は高分子複合体を形成することによって生命活動の主要な担い手として機能します。 幅広い細胞プロセスを支配するタンパク質間相互作用 (PPI) の本質性を示す証拠が増えています。

CAPG は、細胞骨格の組織化に関連するゲルゾリン スーパーファミリーのアクチン結合タンパク質であると報告されています。 CAPG 発現の増加はいくつかの転移性癌で認められており、癌細胞の浸潤と転移における CAPG の役割が示唆されています 60、61、62。 したがって、質量分析による免疫沈降 (IP-MS) によって CAPG インタラクトームを同定しました。 我々は、CAPG インタラクトームにおいて、クロマチンリモデリングタンパク質 NSL 複合体、SNW1 複合体、MLL1-WDR5 複合体、WMM 複合体が関与する修飾酵素タンパク質などの制御タンパク質複合体の構成要素を明らかにしました。 複数の独立した研究により、がんの攻撃性とこれらのエピジェネティックな制御複合体との間に物理的な関連性があることが判明しました。 NSL 複合体が癌の攻撃性 63 および生存率の低下と相関していることは十分に確立されています 64,65。 さらに、MLL1-WDR5 相互作用を破壊することは、白血病の治療法と考えられています 66。 これらのエピジェネティックな調節経路と因子がAML進行にとって重要であることを示しています。 次に、相互作用パートナーの分子機能を分析したところ、そのうちの 3 つ (CCAR2、RPL4、ZFP91) が NF-κB シグナル伝達経路の活性化因子として報告されていることがわかりました。 DBC1 として知られる CCAR2 は、NF-κB 経路を通じてアノイキスを制御できます 40,67。 CCAR2 は核 relA (RelA) のリン酸化を刺激し、NF-κB の転写活性を増強し、アノイキス耐性に関連する標的遺伝子を上方制御します 40,67。 一方、NF-κB 経路の活性化因子としての RPL4 と ZFP91 は、増殖を誘導し、癌のプロセスを促進します 41,68,69。 ZFP91 は、NF-κB68 を介して転写共調節タンパク質 HIF-1 を活性化することにより、がん細胞の増殖と発がんを促進します。 RPL4 は、CD4041 を介して NF-κB を活性化するリボソームタンパク質複合体に関与します。 SWNI も同様に CAPG インタラクトームの NF-κB 経路に関連しており、その関与には NF-κB への結合が伴い、標的遺伝子の転写伸長が促進されます 43。 上記の結果は、CAPG がこれまで報告されていない NF-κB シグナル伝達の調節に関与していることを示しています。

さらに、CAPG ChIP-seq データを利用して、前述の発見を確認しました。 分子結合および細胞骨格構造におけるよく知られた役割に加えて、GO およびモチーフ解析により、CAPG 調節遺伝子が NF-κB 経路と強く関連していることが示されました。 CAPG ノックダウンにより、NF-κB 下流遺伝子の発現が大幅に減少しました。 これらすべては、CAPG が NF-κB シグナル伝達経路の制御に関与しているという上記の主張を裏付けています。 これは、タンパク質インタラクトームの同定がタンパク質の機能を研究するための基礎を提供できることを示しており、コード化遺伝子の潜在的な機能を研究するための重要な方法および将来の傾向である。

総合すると、スーパーエンハンサー関連遺伝子 CAPG の発現は AML の進行に対応し、NF-κB 経路の活性化と関連しています。 さらに、CAPGはAMLの実行可能な治療標的である可能性があり、包括的な分析アルゴリズムの信頼性は、病状のバイオマーカーを予測するための潜在的なツールでもあるスーパーエンハンサーに依存していると仮定しました。

ヒト単球細胞株 THP-1 細胞は Solarbio (中国) から購入し、10% FBS、1% ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した RPMI 培地 (Corning、10-040-CV) で培養し、定期的にマイコプラズマ汚染が陰性であることを検査しました。 PCR。 NF-κB 経路実験の再活性化において、細胞を TNF-α (10 ng/ml) で刺激しました。

典型的なエンハンサーを特定するために、最初に公開 H3K27ac ChIP-seq データベース (NE SRR1915572、MO SRR787551、HSPC SRR2094192、AML1# SRR3503794、AML2# SRR3503797、AML2# SRR3503801) のピークを 500 bp 離れたところにステッチしましたが、ギャップ カバレッジは 0.4 を超えています。 次に、ステッチされた生のエンハンサーと、位置合わせされた H3K27ac および入力リードを使用して、ROSE アルゴリズムを実行しました。 簡単に言うと、構成エンハンサーが特定の距離内にある場合にそれらをつなぎ合わせ、入力から H3K27ac のシグナルを差し引いたものによってランク付けされました。 そして、H3K27ac シグナルの変曲点を特定することで、スーパー エンハンサーを典型的なエンハンサーから分離しました。 ここでの傾きは 1 でした。最後に、Rose GeneMapper によって遺伝子を SE 関連遺伝子として分類し、スーパーエンハンサーの 50 kb 範囲内の遺伝子に注釈を付けました。

AML データは、データベース (http://gibk21.bse.kyutech.ac.jp/PrognoScan/index.html)70 および Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA) データベース (http://gepia.cancer) を使用して検証を実行するために使用されました。 -pku.cn)71。 全生存期間 (OS) はログランク検定を使用して推定され、p 値 < 0.05 は統計的に有意なデータを示すとみなされました。

TRIzol試薬（15596026、Invitrogen）を使用して選別されたGFP+細胞から全RNAを抽出し、PrimeScript™ RT Master Mix（RR036A、Takara）を使用してcDNAを合成しました。 リアルタイム qPCR は、Applied Biosystems™ 7500 (Thermo Scientific) システム上の SYBR® Premix Ex Taq™ II (RR820A、Takara) を使用して実行されました。 表示されたデータは、実験グループと対照グループの変化倍数 (FC) を表します。 簡単に言うと、ΔCtはΔCt = Ct (試験遺伝子) - Ct (基準遺伝子)として計算されました。 ΔΔCtは、ΔΔCt = ΔCt (実験グループ) - ΔCt (対照グループ)として計算されました。 実験群と対照群の試験遺伝子の FC は、FC = 2(−ΔΔCt) として計算されました。 各遺伝子はすべての独立した実験で 3 回ずつテストされ、すべての実験は 3 回行われました。

293 T細胞を、MLL-AF9およびGFP cDNA配列を含むレトロウイルスプラスミドMSCVMLL-AF9-IRES-GFPでトランスフェクトした。 5-フルオロウラシル（5-FU）で5日間処理したC57マウスの骨髄細胞を、24時間間隔で2回レトロウイルスに感染させた。 400 K の感染細胞を 100 K の防御細胞と混合し、致死量 9 Gy を照射した WT レシピエント マウスに静脈内注射しました。 実験ごとに使用した動物の数を図の凡例に示します。 Capg ノックダウンおよびコントロール レンチ ウイルスは、psPAX2、pMD2.G パッケージング ベクターとともに pLKO.1-puro によってトランスフェクトされた HEK293T によって調製されました。 MLL-AF9-GFP+骨髄細胞は、移植後35日目にAMLマウスから採取されました。 これらの細胞をCapgノックダウンまたは対照レンチウイルスに感染させ、1 mg/mlピューロマイシンで72時間さらに選択した。 ピューロマイシンによってスクリーニングされた 200 K の GFP+ 細胞を 100 K の保護細胞と混合して、致死量未満の 4.5 Gy の線量で照射された CD45.2+ レシピエント マウスに静脈内注射しました。

ヒトAML細胞におけるCAPGパートナーを同定するために、本発明者らは、CAPG抗体(ab181092、abcam)によってTHP-1の核抽出物からCAPGタンパク質複合体をプルダウンした。 総タンパク質を調製するために、THP-1 細胞を直径 150 mm のディッシュ 10 枚に拡張しました。 タンパク質は、16 mL IP DNP バッファー（20 mM HEPES、pH 7.9、20% グリセロール、100 mM KCl、1.5 mM MgCl2、0.2 mM EDTA、 0.02% NP-40、0.5 mM DTT、0.2 mM PMSF、0.1% プロテアーゼ阻害剤カクテル) 4 °C で一晩。 同時に、25μgのCAPG抗体またはIgG(12-370、Millipore)を、IP DNP緩衝液中で4℃で一晩インキュベートすることによってプロテインGアガロースビーズを結合させた。 事前に除去した核抽出物を抗体結合ビーズと組み合わせ、4℃で5時間回転させました。 0.02% NP-40 を添加した緩衝液 D (20 mM HEPES pH = 7.6、0.2 mM EDTA、1.5 mM MgCl2、100 mM KCl、20% グリセロール) で 5 回洗浄した後、結合物質を 2xSDS で 5 分間煮沸することによって溶出しました。ローディングバッファ。 溶液を濃縮カラムに入れ、20 °C で 14,000 × g 30 分間遠心分離します。 溶液が 40 μl 近くになるまで遠心分離し、サンプルを Omni-PAGE™ Hepes-Tris ゲル (LK206、Epizyme) 上で分画し、InstantBlue Protein Stain (AQ211、Analysation Quiz) で染色しました。 1 回の精製で得られた生成物を全レーン LC-MS/MS シーケンスおよびデータ分析に供しました。 各抗体について 2 つの生物学的複製を実行しました。

生の MS ファイルは、MaxQuant (1.6.2.10)72 を使用して分析され、サンプルの種類に基づいてタンパク質データベースに対して検索されました。

サンプル中の各タンパク質の強度に従って、コントロール IgG を分母、CAPG 実験グループを分子として、倍率変化値を計算しました。 CAPG のインタラクトームとして FC > 2 を持つタンパク質を選択します。

タンパク質の相互作用と複雑なデータには、次の場所から直接アクセスできました。

STRING バージョン 11.5 (https://cn.string-db.org/)73、

CORUM バージョン 3.0 (https://mips.helmholtz-muenchen.de/corum/#)74、

UniProt (https://www.uniprot.org/)75.

最終的に確認された PPI ネットワークは STRING データベースによって評価され、認識された個人は Cytoscape バージョン 3.9.1 ソフトウェアによって対話されました。

ＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒドを使用して細胞を１０分間架橋し、その後、氷上で１２５ｍＭのグリシンでクエンチした。 細胞を収集し、液体窒素中で急速冷凍し、使用するまで -80 °C で保存しました。 凍結架橋細胞を氷​​上で解凍し、溶解バッファー I (50 mM HEPES-KOH、pH 7.5、140 mM NaCl、1 mM EDTA、10% グリセロール、0.5% NP-40、0.25% Triton X-100、プロテアーゼ) に再懸濁しました。阻害剤）。 4℃で10分間回転させた後、細胞を収集し、溶解バッファーII（10mM Tris-HCl、pH 8.0、200mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTA、プロテアーゼ阻害剤）に再懸濁しました。 4℃で10分間回転させた後、細胞を回収し、超音波処理緩衝液（20 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、2 mM EDTA pH 8.0、0.1% SDS、および1% Triton X-100）に再懸濁しました。 、プロテアーゼ阻害剤）超音波処理用。 超音波処理したライセートを、16,000 × g、4 °C で 10 分間の遠心分離によって 1 回清澄しました。 入力資料が予約されました。 残りをCAPG抗体（ab181092、abcam）と結合した磁気ビーズとともにインキュベートして、DNA断片を濃縮し、4℃で一晩培養しました。 ビーズを洗浄緩衝液（50 mM HEPES-KOH pH 7.5、500 mM LiCl、1 mM EDTA pH 8.0、0.7% デオキシコール酸ナトリウム、1% NP-40）およびTE 緩衝液（10 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM EDTA、50 mM NaCl)を順に加えます。 溶出緩衝液（50 mM Tris-HCl pH 8.0、10 mM EDTA、1% SDS）中で65℃で30分間インキュベートすることによりビーズを除去した。 架橋は 65 °C で一晩かけて元に戻りました。 溶出した DNA を精製するために、200 mL の TE を添加し、その後 8 μl の 10 mg/mL RNase A 中で 37 °C で 2 時間インキュベートすることにより RNA を分解しました。 タンパク質は、20 mg/mL プロテイナーゼ K 4 μl を添加し、55 °C で 2 時間インキュベートすることによって分解されました。 フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール抽出を行った後、エタノール沈殿を行った。 次に、DNA を 50 ml TE に再懸濁します。 ライブラリーの調製は DNA ライブラリー調製キット (Vazyme、#TD501) を使用して実行され、ライブラリーは 7 サイクル増幅され、Beckman AMPure XP ビーズでサイズ選択されました。

リードアライメントと発現定量化のために、まず低品質のリードを削除し、Trim Galore でアダプター配列をトリミングしました。 次に、ENCODE オプション バンドルを備えた STAR を使用して、残りのペアエンド リードを参照ゲノムにマッピングしました。 HTSeq-count を使用して、一意にマッピングされたリードをカウントし、M 値のトリミング平均 (TMM) によってリード カウントを正規化し、edgeR によってキロベースあたり 100 万リードあたりのリード数 (RPKM) に変換しました。 少なくとも 1 つのサンプル グループで RPKM R 1 の発現をカットオフし、存在量の少ない遺伝子を除去し、edgeR を使用して差次的に発現した遺伝子を検出しました。 全体の偽発見率 (FDR) < 0.01 および倍率変化が 2.0 を超える場合、遺伝子は差次的に発現しているとみなされました。

Fastq ファイルは TrimGalore (バージョン 0.6.4、https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore) によってアダプターをトリミングされ、Bowtie2 (バージョン 2.2.5、http://bowtie-bio.sourceforge.net) を使用して mm9 参照ゲノムにアライメントされました。 /bowtie2/) をデフォルトのパラメータで使用します。 マップ スコアが 30 未満のリードと PCR 重複は、Samtools76 (バージョン 1.9、http://samtools.sourceforge.net) を使用して除外されました。 ENCODE ブラックリスト (http://mitra.stanford.edu/kundaje/akundaje/release/blacklists/) の領域に合わせられた読み取りは、bedtools77 (バージョン 2.29.1、https://bedtools.readthedocs.io/en/) を通じて破棄されました。最新/）。 ピークは、入力をコントロールとして使用して、macs278 (バージョン 2.1.2、パラメーター: '-g mm -q 0.05 -m 5 50') で呼び出されました。 DiffBind (バージョン 2.10.0) を使用して、異なる結合部位を分析しました。

マウスの尾静脈から末梢血 20 ～ 30 μL を採取し、抗凝固チューブに加えます。 屠殺したマウスの大腿骨と脛骨から骨髄細胞を採取します。 赤血球を溶解し、100 mm セル ストレーナーを使用して骨髄細胞を濾過しました。 Mac-1 (M1/70、Biolegend)、Gr-1 (RB6-8C5、Biolegend)、c-Kit (2B8、Biolegend)、Lin mix (Gr1、CD4、CD3、CD8a、Ter119、B220、IgM) に対するモノクローナル抗体) (Biolegend)、CD34 (MEC14.7、Biolegend)、Sca1 (D7、Biolegend)、FcgRII/III (93、Biolegend)、IL-7Ra (A7R34、Biolegend) (すべて 100 万細胞あたり 50 ng を使用) を使用した場合と示されている。 抗体とインキュベートした後、Attune NxT フローサイトメーター (Thermo) を使用してサンプルを分析し、FlowJo ソフトウェアを使用して結果を分析しました。 ここでは、7-アミノアクチノマイシン D (7-AAD) (A1310、Life Technologies) を使用して死細胞を除外しました。

CAPG インタラクトーム タンパク質の強化されたオントロジー用語は、STRING を使用して特定されました。 GO Biological Process、GO Molecular Function、GO Cellular Component を参照して、調整された p 値 < 0.05 のオントロジー用語を特定しました。

データは平均値±SEMとして表されます。 生存の決定を除くすべての実験について、データはスチューデントの t 検定によって分析され、p < 0.05 の場合、差異は統計的に有意であると見なされました。 2 つのグループの生存率はログランク検定を使用して分析され、p < 0.05 の場合、差は統計的に有意であるとみなされます。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で提示されたデータセットは、オンライン リポジトリで見つけることができます。 リポジトリの名前とアクセッション番号は、NCBI BioProject PRJNA876046 で確認できます。 抗体とオリゴの情報は補足データ 1 および 2 にあります。IP-MS のソース データは補足データ 3 として提供されています。CAPG KD RNA-seq データは補足データ 4 にあります。ブロットのトリミングされていないスキャンは図に示されています。補足図 7。この研究の結果を裏付ける追加データは、要求に応じて責任著者から入手できます。

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「中央大学基礎研究基金」の支援を受けている北京大学医学若手科学者科学技術イノベーション育成基金（BMU2022PYB014）に感謝いたします。 北京大学第一病院科学研究シード基金 (2022SF09); 中国国家自然科学財団 (NSFC 81870127) (NSFC 82072369) (NSFC 82200178)。

北京大学第一医院臨床検査部（中国、北京）

チェン・マー＆ハイシア・リー

中国深セン、中山大学第 7 付属病院血液科

チャオ・ミンイー

中国広州、中山大学第三付属病院血液科

ビンロン

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QM はほとんどの実験を設計、実行し、データを分析しました。 MZ と BL はデータを分析しました。 HL がプロジェクトを監督しました。 すべての著者が記事に貢献し、提出されたバージョンを承認しました。

ハイシア・リーへの対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

サンプルの収集は、北京大学第一病院の治験審査委員会および倫理委員会から承認されました。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Rhys Morgan、Mohammad Azam、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 主な編集者: Georgios Giamas と Manuel Breuer。 査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Ma, Q.、Zhao, M.、Long, B. 他スーパーエンハンサー関連遺伝子 CAPG は AML の進行を促進します。 Commun Biol 6、622 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04973-1

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受信日: 2022 年 8 月 28 日

受理日: 2023 年 5 月 23 日

公開日: 2023 年 6 月 9 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04973-1

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