腸内細菌叢はヒトとマウスの神経性食欲不振の発症に寄与する

Microbiologia della natura, volume 8,

Nature Microbiology volume 8、pages 787–802 (2023)この記事を引用

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367 オルトメトリック

メトリクスの詳細

神経性食欲不振（AN）は、死亡率の高い摂食障害です。症例の約95％は女性で、人口の有病率は約1％ですが、科学的根拠に基づいた治療法が不足しています。 AN の病因にはおそらく遺伝学とさまざまな環境要因が関与しており、アンプリコン配列決定と比較的小規模なコホートを使用して、AN 患者の腸内細菌叢の変化が観察されています。今回我々は、腸内微生物叢の破壊がANの発症に寄与するかどうかを調査した。ショットガンメタゲノミクスとメタボロミクスは、それぞれ、AN の女性 77 名と健康な女性 70 名のコホートからの糞便サンプルと血清サンプルに対して実行されました。複数の細菌分類群 (たとえば、クロストリジウム属の種) が AN で変化し、摂食行動および精神的健康の推定値と相関しました。 ANでは、ウイルスと細菌の相互作用の減少など、腸管バイロームも変化しました。神経伝達物質の分解に関連する細菌の機能モジュールが AN に豊富に含まれており、細菌のさまざまな構造変異体が AN の代謝特徴に関連付けられていました。血清メタボロミクスにより、食物摂取量の減少に関連する代謝産物 (たとえば、インドール-3-プロピオン酸) の増加が明らかになりました。因果関係推論分析により、血清細菌代謝産物が腸内細菌叢の変化による AN 行動への影響を媒介している可能性があることが示唆されました。さらに、ANの摂食行動を反映するために、エネルギー制限給餌下でAN症例から無菌マウスへの糞便微生物叢の移植を実行しました。私たちは、体重増加の減少と視床下部および脂肪組織の遺伝子発現の誘導が、異常なエネルギー代謝と摂食行動に関連していることを発見しました。私たちの「オミクス」とメカニズムの研究は、破壊的な腸内マイクロバイオームが AN の発症に寄与している可能性があることを示唆しています。

神経性食欲不振症（AN）は、ゆがんだ身体イメージ、食べ物に対する強迫観念、食物摂取量の減少、体重の減少、身体活動の増加、感情の硬直などの儀式的な行動パターンを特徴とする深刻な精神的健康状態および摂食障害です1。 AN は主に症例の約 95% で女性に影響を及ぼし、人口有病率は約 1% です2。それは、一般的な制限型 (AN-RS) タイプと、あまり一般的ではない過食または排出型 (AN-BP) の 2 つのサブタイプに分類できます1。治療に関する証拠は不足しており3、専門的な集学的治療により死亡率は減少しますが4、完全寛解に達するAN症例は半数未満です5。総死亡率は 10 年あたり 5.6% と推定されており、一般人口よりもはるかに高くなります6。

ANの病因を解明するための研究にもかかわらず、ANは依然として症候群、つまり明確に定義された統一的な原因のない症状の集合である。双子の研究では、遺伝率推定値が 50 ～ 60% であると報告されており 7、ゲノムワイド関連研究では、精神疾患、身体活動、代謝特性および身体測定学的特性との相関を示す 8 つのゲノム遺伝子座が特定されています。これは、BMI に関連する一般的な変異とは独立しています 8,9。病態生理学的レベルでは、AN は複数の内分泌変化 10 と、脳のさまざまな部分における神経伝達物質のシグナル伝達の混乱 11 によって特徴付けられます。

人間の消化管には、代謝産物やその他の経路を介して宿主の代謝、免疫、神経生物学に影響を与える可能性のある微生物の複雑な集合体が含まれています12。これには、腸-微生物叢-脳の軸が含まれる可能性があり、食欲、行動、感情の調節などの脳機能に影響を与える可能性があります13。たとえば、主に腸内細菌によって産生される細菌代謝産物カゼイン分解ペプチダーゼ B (ClpB) は、食欲不振効果を発揮する可能性がある α-メラノサイト刺激ホルモンの抗原模倣物です 14,15。

異常な腸内微生物叢がＡＮの病因に関与している可能性があるという仮説が立てられている。アンプリコン配列決定を使用して、AN の属レベルで腸内細菌叢を特徴付けるいくつかの小規模な研究が発表されており 16、17、18、19 、腸内細菌叢の腸内細菌叢の異常を示しています（補足注 1 を参照）。さらに、拒食症のマウスモデルでは、腸内微生物叢の変化が、摂食行動および視床下部神経ペプチドの発現の変化と関連していることが示されています20。

ここで我々は、腸管微生物叢の乱れと血清メタボロームがANの複雑な病因に寄与しているという仮説を検討した。そのために、77 人の女性 AN 症例と 70 人の年齢を一致させた女性対照からの糞便サンプルに対してショットガンメタゲノミクスを実行しました。これにより、腸内細菌と古細菌の微生物叢を分類学的、機能的、遺伝学的レベルで詳細に分析することができるほか、腸内細菌叢の分析も可能になりました。ウイルス性の腸内細菌叢。また、血清メタボロームの特徴も明らかにし、摂食行動および心理行動の個々のマーカーと関連して腸メタゲノムデータを使用して分析しました。因果機構は、双方向媒介解析を使用してインシリコで調査され、また、AN症例から雌の無菌同腹子への腸内細菌叢の糞便微生物叢移植（FMT）を通じてインビボで調査されました。我々の発見は、破壊されたAN腸内細菌叢および関連する細菌代謝産物がANの発症に寄与するという仮説を裏付けるものである（拡張データ図1）。

登録された AN 患者 77 名と、健康な体重 (HC) であると考えられる年齢を一致させた対照女性 70 名の臨床的特徴の要約統計を補足表 1 に示します。検証済みの摂食障害インベントリ 3 (EDI-3) アンケートが使用されました。特定の摂食行動のレベルを推定するための指標 21 であり、EDI-3 サブスケールの詳細な説明は補足注記 2 に示されています。予想どおり、AN の女性ははるかに痩せており、空腹時血清グルコースおよびインスリン濃度が低く、次の方法で推定されたようにインスリン感受性が高かったです。インスリン抵抗性 (HOMA-IR) および血清 C 反応性タンパク質の低下に関する恒常性モデルの評価。研究参加者の詳細なベースライン特性を補足表2に示します。さらに、AN症例の中で、AN-RS型症例は、AN-BP個体よりも高い血清インスリン値と低いインスリン感受性を特徴としました（補足表1）。 AN と HC からの便サンプルを比較すると、AN と HC の間、または AN のサブタイプ内で細菌細胞数に有意差はありませんでした (PWilcoxon > 0.05、補足表 1)。

門レベルでは、AN 微生物叢サンプルはバクテロイドータとアクチノバクテリオータの減少によって特徴づけられました (拡張データ図 2a)。家族レベルでは、バクテロイダ科が両方のグループで優勢でした（拡張データ図2b）。このコホートの新たな観察結果として、最も多い上位 20 科の中で、Christensenellales CAG-138 の存在量は AN でより高かったのに対し、Ruminococcaceae と Lachnospiraceae の存在量は HC でより高かった。 89の同定された細菌科の中で、ChristensenellaceaeはANが最も顕著に豊富でした（拡張データ図2c）。属レベルではANマイクロバイオームのより高いβ多様性が観察され（拡張データ図2d）、バクテロイデスが両方のグループで優勢な系統型でした（拡張データ図2e）。上位 30 属のうち、フェカリバクテリウム属、アガトバクター属、ゲミガー属、未分類のラクノスピラ科 G、ルミノコッカス 2、ローズブリア、ディスソスモバクター - オシリバクター、コプロコッカス、オシロスピラ目 4 CAG-103 およびアイゼンベルギエラが HC に多く含まれ、未分類のクリステンセネラ目 CAG-138 が HC に多く含まれていました。 AN (拡張データ図 2e)。さらに、同定された 225 の細菌属の中で、ラクトバチルス属の AN が最も顕著に濃縮されました (拡張データ図 2f)。 ANとHCの間の主要な属の違いにもかかわらず、メタゲノム種パンゲノム（MSP、以下種と呼びます）の豊富さは2つのグループ間で同様であることがわかりました（拡張データ図2g）。エンテロタイプ分析22では、HCと比較してANではルミノコッカセアエンテロタイプ（R-エンテロタイプ）の有病率が高く、AN-RSサブタイプよりもAN-BPの方が同じエンテロタイプの有病率が高いことがわかりました（拡張データ図2h）。。

種レベル（補足表3）では、AN腸内細菌叢がより高いβ多様性によって特徴付けられることが観察されました（図1a）。 ANサブグループ内では、AN-BPサブタイプは、AN-RSサブタイプよりも種レベルでより不均一な細菌群集を持っていました（図1b）。入院患者と外来患者の AN 症例の比較では、種レベルで入院患者の β 多様性が外来患者の β 多様性よりも高いことがわかりました（補足図 1 とデータ）。 4 週間以内の最近の体重変化は腸内細菌組成と関連していませんでした (補足表 4)。複数の薬剤（補足表2に指定されている選択的セロトニン再取り込み阻害剤、抗精神病薬およびベンゾジアゼピン）の干渉を解読した後、ANとHCの間の存在量分布が大きく異なる種を図1cに示します。 AN で減少した種の中には、植物多糖類の消化能力が高く、健康に関連する腸内微生物叢の一部であると考えられている Roseburia intestinalis と Roseburia inulinivorans が含まれていました 23。共存在無向ネットワーク解析 (拡張データ図 3) では、酪酸生成細菌 SS3/4 - (クロストリジウム) sp. であるアイゼンベルギエラからなる細菌群集を特定しました。 CAG:81、フェカリバクテリウムプラウスニッツィ 3、(オシリバクター) sp. ER4/ファーミクテス属細菌 CAG: 129_59_24、オシリバクター sp. 57_20、(クロストリジウム) sp. 2789STDY5834924、未分類のラクノスピラ科および未分類のジソスモバクター – オシリバクター。これは HC に多く含まれていました。 AN が高度に濃縮されたコミュニティには、Erysipelatoclostridium ramosum、Enteroclosterbolteae、(Clostridium) innocuum、および Blautia sp.が含まれていました。 CAG:257。

a、b AN (n = 77) および HC (n = 70) の腸内細菌叢 (a) および 2 つの腸内細菌叢の β 多様性の箱ひげ図 (線、中央値、箱、四分位範囲 (IQR)、ひげ、1.5 × IQR) AN サブタイプ (AN-RS n = 56、AN-BP n = 21) および細菌種レベル (キャンベラ距離) での HC 腸内細菌叢 (b)。 2 つのグループ間の差異の統計的有意性は、Wilcoxon 順位和検定 (両側) によって決定されました。 c、ANとHCの間で著しく対照的な細菌種。存在量の違いは、年齢、BMI、喫煙、複数の薬物摂取などの共変量が補正されたmetadeconfoundRパイプラインを使用して検出されました。クリフのデルタ値は、効果の大きさの推定値を与えます。対照的な各 MSP について、コホート全体の有病率、HC、AN、および Padj が MSP 注釈の横に表示されます。 d. 年齢、BMI、喫煙、複数の薬物摂取を共変量として定義し、調整した線形回帰モデルを使用して、腸内細菌種がAN症例の摂食障害スコアに関連していることを示すヒートマップ。特定の摂食障害スケールの変数は青でマークされ、一般的な心理スケールは赤でマークされています。ヒートマップの右側のパネルは、各変数の方向を示します。各 MSP について、AN の有病率が MSP 注釈の横に表示されます。 +、Benjamini-Hochberg 法による Padj < 0.05 (正確な P 値についてはを参照)。

ソースデータ

我々は、属および種レベルでの細菌の絶対存在量と、HCおよびANコホートを組み合わせた生物臨床変数との間の数値共変動を調査した。年齢、喫煙、複数の薬物摂取などの交絡因子を調整した線形回帰モデルを使用しました（方法と補足注記3、図2およびデータ）。

興味深いことに、年齢、体格指数（BMI）、喫煙歴、投薬などの複数の交絡因子を調整した後、一部の細菌分類群は摂食障害スコアや心理状態と関連していました。種レベルでは、クロストリジウム属の種が摂食障害スコアと正の相関があることを発見しました（図1d）。これは、摂食行動および神経精神症状の調節におけるこれらの種の潜在的な役割を示しています24。さらに、摂食障害スコアと逆相関する細菌種の中で、抑うつ症状に関連するラクトコッカス・アシドフィルス25とフェカリバクテリウム・プラウスニツィイ26の絶対量が、対人疎外のスコアと関連していることを発見しました（図1d）。。さらに、パラステレラの絶対量は体の不満と正の相関があり、ビフィズス菌の絶対量は完璧主義のマーカーと相関していました。 ANとHCにおけるブラキスピラ属の絶対量は同様であるにもかかわらず、この属はANにおける「痩せへの欲求」のマーカーと正の相関があった(拡張データ図4)。拡張データ図5に示すように、ANグループとHCグループの間で食欲不振誘発性ClpB14の循環レベルに差は見られませんでした（補足注4）。

我々は、50 種類の細菌種のピーク対トラフ比 (PTR)27 を計算することにより、メタゲノムデータから細菌の腸内細菌叢の増殖動態を推定しました。これらのうち 35 個が 20 以上のサンプルに存在していました。 PTR 中央値は、AN と HC の間で著しく異なりました (PWilcoxon = 2.0 × 10−4、拡張データ図 6)。これは、AN 患者の食物摂取量の大幅な減少に関連している可能性があります。 6 つの細菌は、AN での増殖速度が著しく低いと予測されました (PWilcoxon < 0.05、拡張データ図 6)。これらは、アッカーマンシア・ムシニフィラ、アリスティペス・ファインゴルディ、コプロコッカス・カトゥス、ユーバクテリウム・シラエウム、オドリバクター・スプランチニカス、および酪酸生成細菌SS3/4であった。

HCと比較して、ANの糞便サンプルではウイルスの豊富さ（Chao1、図2a）と多様性（シャノン、図2b）が高いことが観察されました。 4 週間以内の最近の体重変化は腸内ウイルス組成と関連していませんでした (補足表 4)。共変量（年齢、喫煙、薬物摂取）を解絡した後、ANが増加または減少している31のウイルス種を特定しました（図2c）。非常に興味深いのは、AN で増加した 30 種類のウイルス種のうち 25 種類が、発酵食品の製造に広く使用されている細菌である既知の Lactococcus lactis 宿主を持つ Lactococcus ファージであったことです。

a、b、AN（n = 77）とHC（ n = 70) ウイルス種レベルで。有意性は、両側ウィルコクソン順位和検定 (a、b) によって検査されました。 c、Benjamini-Hochberg補正によるPadj < 0.05のANとHCの間で対照された腸内ウイルス種のCliffのデルタ値（ウイルスの注釈の隣に表示）。異なる種は、年齢、喫煙、複数の薬物摂取などの補因子の影響が分解されるmetadeconfoundRパイプラインによって同定されました。 d、HC（n = 70）と比較したAN（n = 77）のウイルスおよび細菌の腸内細菌叢の間、および2つのANサブタイプ間（AN-RS n = 56、AN-BP）の王国を越えた生態学的相関の数の違いn = 21) SparCC アルゴリズムを使用します。

ソースデータ

ANおよびHCの腸内細菌叢内のウイルスと細菌の相関関係の分析により、ANにおけるウイルスと細菌の相互作用数の顕著な減少が明らかになりました（HCでは219、ANでは84、PFisherの正確検定 = 8.8×10−15、図2d）。。これは主に、ウイルス種と、Roseburia inulinivorans、Faecalibacterium prausnitzii、Roseburia hominisなどの短鎖脂肪酸細菌生産菌との間の相互作用の弱体化によって引き起こされました（補足図3およびデータ）。界を越えた分析では、ラクトコッカスファージとラクトコッカス細菌の間の相互作用は観察されませんでした（補足図3、4およびデータ）。

ANサブグループの分析では、キャンベラ距離に関する主座標分析（PCoA）では、腸内ウイルス組成に顕著な変化は示されませんでした（PPERMANOVA = 0.571、補足図5およびデータ）。しかし、AN-RS と AN-BP の腸内細菌叢におけるウイルスと細菌の相関関係の数を比較すると、AN-RS では正の相関関係の数が減少し、その比率がはるかに低いことがわかりました (AN-BP では 164 対、AN-BP では 44)。 AN-RS、PFisher の正確検定 < 2.2 × 10−16）（図 2d および補足図 4）。これは、AN-RS の腸内細菌叢が腸内ウイルスと細菌の相互作用を弱めていることを示唆しています。

腸内細菌の機能的可能性を予測するために腸代謝モジュール (GMM)28 と腸脳モジュール (GBM)29 を使用して、我々は 159 の機能モジュールを特定しました。注目すべきことに、セロトニン生合成と、気分や食欲に影響を与える代謝産物であるドーパミン、グルタミン酸、トリプトファンの分解のためのGBMがANに豊富に含まれていました（図3a）。逆に、グルタミン酸合成 II およびビタミン K2 経路の存在量は HC の方が高かった (図 3a)30。さらに、セロトニン合成およびグルタミン酸分解経路が、グルコースおよびインスリンの循環濃度、またはインスリン感受性と逆相関していることもわかりました（図3b）。 GBM の違いは観察されましたが、AN と HC の間の GMM の違いは特定されませんでした (補足表 5)。

a、年齢、BMI、喫煙、複数の薬物摂取などの共変量による干渉が補正された、metadeconfoundR パイプラインを使用した、AN (n = 77) と HC (n = 70) の間の対照的な機能モジュールのクリフのデルタ効果サイズ。金の延べ棒、AN では機能モジュールが豊富。青いバー、HC に豊富な機能モジュール。対照的なモジュールごとに、Benjamini-Hochberg 補正後の P 値がモジュールの注釈の横に表示されます。 b. 線形回帰モデルによる臨床変数と腸内細菌の機能的可能性の間の関連性のヒートマップ。年齢、喫煙、複数の薬物摂取などの共変量の影響が混同されません。 + は、Benjamini-Hochberg 補正による P < 0.05 を示します (正確な P 値についてはを参照)。

ソースデータ

細菌ゲノムには、微生物とその宿主の間の相互作用に影響を与える機能遺伝子を妨害する可能性のある構造変異体 (SV) が存在する場合があります 31。したがって、他の点では同一の細菌株間の SV の存在または存在量の違いが、重大な表現型および機能の違いの根底にある可能性があります 31,32。ここでは、すべてのサンプルのSVをプロファイリングし、56の細菌種にわたって5,056の欠失SVと2,423の可変SVを特定しました（図4a、b）。一部の種では、コピー数の変動に顕著な違いが観察されました。バクテロイデスユニフォニスでは 134 人の個体で 87 個の欠失 SV と 18 個の可変 SV、124 人でフェカリバクテリウムプラウスニッツィイでは 78 個の欠失と 15 個の可変 SV、121 人でパラバクテロイデスディスタソニスでは 110 個の欠失 SV と 55 個の可変 SV を特定しました。古細菌微生物叢については、13 人の個体で Methanobrevibacter smithii の SV のみを特定しました（図 4a、補足図 6 およびデータ）。細菌の遺伝学の潜在的な違いを調査するために、147 個のサンプルすべて間の細菌 SV プロファイルのキャンベラ距離をさらに計算しました (図 4c)。 AN サンプルと HC サンプルでは、SV 組成の β 多様性が大きく異なりました (PWilcoxon < 2.2 × 10−16)。まとめると、これらの結果は、細菌 SV の組成が 2 つのグループ間で異なることを示唆しています。

a、147名（症例77名、対照70名）の研究参加者における各細菌種または古細菌種のSVの数。種ごとに、欠失と可変 SV の数が示されています。 b. 特定された SV の合計数を示す円グラフ。 c、AN（n = 77）およびHC（n = 70）バクテリオムにおけるSVベースの遺伝子組成のβ多様性（キャンベラ距離）の箱ひげ図（線、中央値;箱、IQR;ひげ、1.5×IQR）。 P 値は、両側ウィルコクソン順位和検定によって決定されました。 d、年齢、BMI、喫煙、および複数の薬物摂取を調整した後の摂食障害スコアと細菌性SVの間の有意な関連性を示すコードダイアグラム。 e、年齢、BMI、喫煙、および複数の薬物摂取の影響を取り除いた線形回帰モデルを使用した、バクテロイデス・ユニフォームリスのSVとEDI-3スコアとの関連性を示すヒートマップ。 + は、Benjamini-Hochberg によって補正された P < 0.05 を示します (正確な P 値についてはを参照)。 d と e では、摂食障害スケールの変数は青、一般的な心理スケールは赤、細菌性 SV は黒で色付けされています。 f、ANグループのB.uniformisゲノムにおけるチアミン一リン酸キナーゼを有する10kbpの欠失SVの欠失率。 g、箱ひげ図（線、中央値;箱、IQR;ひげ、1.5×IQR）は、10 kbp欠失がある（n = 49）およびない（n = 28）拒食症個人におけるEDI-3スコアを示しています。有意性は、Wilcoxon 順位和検定 (両側) によって決定されました。

ソースデータ

腸内細菌のSVと摂食行動のマーカーとの関係を調査したところ、AN症例では、複数の共変量について脱交絡した後、細菌のSVが摂食障害スコアと有意に関連していることがわかりました（図4d）。注目すべき例として、B.uniformisゲノム内のSVと宿主摂食スコアとの関連分析では、10 kbpの欠失が過食症および自己否定のマーカーと直接関連していることがわかり、この欠失SVが関与している可能性があることが示されました。 ANにおける摂食障害と心理的特性の制御における（図4e）。実際、遺伝子分析により、B.uniformisのこの特定のゲノム領域の始まりが、チアミン（ビタミンB1）生合成経路に関与する遠位酵素であるチアミン一リン酸キナーゼをコードしていることが示されました（図4fおよび補足表6）。チアミン欠乏症は、食欲不振や胃腸の不調だけでなく、記憶喪失、不安、うつ病、過敏症、不眠症などの精神的健康にも関連しています33。 AN 症例の約 3 分の 1 はチアミン欠乏症である可能性があります 34。この細菌ゲノム領域を欠くAN症例では、過食症（AN-BPサブタイプの重要な特徴）と自己否認のスコアが高いことがわかりました（図4g）。このパターンは、相関分析によっても示唆されています（図4e）。細菌の遺伝学を代謝関連の生物臨床変数に結び付ける別の例を（拡張データ図 7）および補足注 5 に示します。

AN症例および対照からの血清の非標的メタボロミクスプロファイリングを実行しました。これにより、28の極性代謝物と35の微生物叢関連代謝物からなる血清メタボロームプロファイルが明らかになりました。これは、ANとHCの間で大きく異なり（図5a）、2つのANサブタイプ間ではわずかに変化しました（拡張データ図8a）。交絡因子を調整した後（調整後のP値（Padj）<0.05）、症例と対照の間で濃度差がある25の血清代謝物を特定しました（図5b）。

a、AN症例およびHC参加者の血清メタボロームプロファイルの主成分分析（PCA）。 b、年齢、BMI、喫煙、および複数の薬物摂取を調整した後の、AN（n = 77）とHC（n = 70）の間の対照代謝物のクリフデルタ値。ゴールドのロリポップは AN が豊富な代謝物で、青いロリポップは HC が豊富な血清代謝物を示します。 c、腸内微生物の特徴、血清代謝産物、宿主表現型の双方向媒介分析のワークフロー。 d、方向 1 の推定された因果関係ネットワークを示すサンキー図。細菌種、腸脳/代謝モジュール、および細菌の遺伝学を含む腸内微生物の特徴が原因因子として扱われ、代謝産物がメディエーターであり、EDI-3 スコアが結果です。 e. 微生物の特徴、代謝産物、および EDI-3 スコアの間の推定因果関係の例。方向 1 は、微生物の特徴→代謝産物によって媒介される摂食障害スコアを意味し、黒い線で示されています。方向 2 は微生物の特徴 → EDI-3 スコアによって媒介される代謝物を意味し、赤い破線で示されます。仲介効果の割合はリングチャートの中央に表示されます。 FFA、遊離脂肪酸。

ソースデータ

一次胆汁酸（コール酸（CA）、グリココール酸（GCA））と二次胆汁酸（グリコヒオコール酸（GHCA）、7-オキソヒオコール酸（7-オキソ-HCA）、グリコヒオデオキシコール酸（GHDCA）、7）の両方の血清濃度-オキソ-デオキシコール酸（7-オキソ-DCA）、ω/α-ムリコール酸（ω/α-MCA）、ウルソデオキシコール酸（UDCA））はANにおいて高値であり、AN関連における腸内細菌叢の潜在的な役割を示している二次胆汁酸の合成と代謝、および満腹調節の変化35。さらに、2つのトリプトファン代謝産物であるインドール-3-酢酸とインドール-3-プロピオン酸（IPA）の血清濃度は、HCと比較してANの方が高かった。興味深いことに、IPA はグルカゴン様ペプチド 1 の分泌と関連しており、満腹感を刺激し、胃内容排出を遅らせることができます 36,37。バリン、飽和および長鎖不飽和脂肪酸の調節不全も、AN グループで観察されました（図 5b および補足注 6）。

腸内微生物叢と宿主表現型の間の相互作用における血清代謝産物の役割を調査するために、我々は双方向媒介モデルを構築しました。方向 1 では、変数としての血清代謝物 (微生物叢関連代謝物を含む) が、腸内微生物の特徴 (細菌種、腸内脳モジュール、および細菌の遺伝学) が宿主の表現型に与える因果関係を媒介するという仮説を立てました (摂食障害インベントリー 3 (EDI-3) ）スコアと代謝特性）。方向2については、表現型をメディエーターとして扱い、代謝産物の変化を微生物の特徴の変化の結果として扱いました（図5c）。このインシリコ双方向解析により、仮説上のメディエーター（代謝産物）が原因（微生物の特徴）とその影響（宿主の表現型形質）の間の相互作用にどの程度関与しているかを定量化することができました。

我々は最初に、AN症例におけるEDI-3アンケートスコアに関する細菌の特徴の因果推論を実行しました（拡張データ図8b）。方向 1 で推定された因果関係は、イニシエーターとしての 13 の微生物の特徴、メディエーターとしての 11 の代謝産物、および結果としての 7 つの EDI-3 スコアで構成されていました (図 5d)。注目すべき例として、我々は、ANが豊富な細菌種C. paraputrificumの結果として「痩せへの衝動」を特定しました（図1c）。これは、同様にANグループに豊富な血清IPAレベルの変化に関連していました。 C. paraputrificum は、IPA、インドールアクリル酸、インドール酢酸、トリプタミンなどの複数のトリプトファン異化産物の生産者であり、これらはすべて食欲と精神的健康の調節に関与しています24（図5e）。

別の例では、ＡＮ患者に豊富に存在するインドキシル硫酸が、ＡＮに富む（クロストリジウム）種のメディエーターとして同定された。 CAG：体の不満のスコアの269（図5e）。インドキシル硫酸は心臓毒素および尿毒症毒素であり、ヒトおよび動物モデルにおいて不安またはうつ病のような行動を誘発することが示されています 38,39。クロストリジウム属は、トリプトファンをインドール、ピルビン酸、アンモニアに変換する重要な酵素であるトリプトファナーゼ 40 をコードできるインドール生成細菌の属です 41。

次に、コホート全体にわたる微生物の特徴と宿主の代謝形質の間の因果推論を分析しました（拡張データ図8c）。方向 1 の因果ネットワークは、それぞれ原因治療、メディエーター、結果として 14 の微生物の特徴、10 の代謝産物、および 5 つの代謝形質で構成されていました (拡張データ図 8d)。特に、セロトニン合成モジュールが、セロトニンによって上方制御される二次胆汁酸グリコールソデオキシコール酸を介して宿主のBMIに因果的に影響を与えることを発見しました42（拡張データ図8e）。最後に、我々の以前の発見と一致して、血清ロイシンはグルコース恒常性に対するB. vulgatusの影響を媒介しました43（拡張データ図8e）。摂食行動と心理状態の変化、腸内微生物の特徴と代謝物の間に一方向の因果関係は観察されませんでした（補足表7）。

ANにおける腸内微生物叢の変化と関連する表現型の間の潜在的な因果関係を調査するために、ランダムに選択した3つのAN-RS症例（AN-BPはAN-RSサブタイプよりも不均一な表現型を有するため均一性を達成するため）と3つの症例から糞便微生物叢を移植しました。雌の無菌（GF）マウスの3匹の独立した同腹仔に対する年齢を一致させたHC参加者（拡張データ図9a）。遺伝的背景の変動を最小限に抑えるために、同腹子を対照マウスとして含めました。各同腹子研究では、それぞれ 8 頭、6 頭、および 6 頭の同腹子が、AN または HC の糞便微生物叢のレシピエントとして無作為に割り当てられました。便移植後、レシピエントマウスを単独で飼育し、ヒトＡＮにおける食物摂取量の減少を模倣するために、３週間３０％カロリー制限食を与えた（拡張データ図９ｂ）。自由固形飼料の給餌は、GF マウスに表現型の変化を引き起こさなかった 44。この観察は、kwashiorkor に関する以前の報告と一致しています 45 (拡張データ図 10a)。

21日後、AN症例からの便を移植されたGFマウスは、HC FMTを受けたマウスと比較して、初期体重の減少が大きく、時間の経過とともに体重増加が遅くなりました（図6aおよび拡張データ図10b。補足注7を参照）議論）。

a、エネルギー制限食後の0日目の体重と比較した体重（BW）の変化（AN-T n = 10、HC-T、n = 10を3つの独立した実験で調べた）。有意性は、二元配置分散分析 (ANOVA) とそれに続く Benjamini-Hochberg 事後検定によって計算されました。 b、c、糞便微生物叢マウスレシピエントにおける視床下部（b）および鼠径部白色脂肪組織（c）における示されたマウス遺伝子のmRNAレベル（AN-T n = 10、HC-T、n = 10、3つの独立した検査で調べた）実験）。 2 つのグループ間の有意性は、対応のない両側スチューデント t 検定を使用して検定されました。データは平均値±標準誤差（a〜c）として表示されます。 d、ヒトドナーとGFマウスレシピエントの間で同定および移入されたASVのベン図。 e、左：ヒトドナーにおける84の保存されたASVのヒートマップ。中央: AN-T および HC-T GF マウスレシピエント間の盲腸内容に由来する 84 個の保存された ASV の違い (AN-T n = 10、HC-T、n = 10、3 回の独立した実験で調べた)。移入された微生物の変化は青色でマークされます。右: ASV の分類情報。

ソースデータ

FMT後に視床下部の遺伝子発現解析を実施しました。 AN移植レシピエントとHC移植レシピエントでは、摂食行動とエネルギー消費の制御に関与するいくつかの視床下部遺伝子の発現が異なっていました（図6b）。これには、AN FMT レシピエントにおける食欲抑制因子 Bdnf46 および Cartpt47、およびセロトニンの受容体 Htr1b (セロトニンの下流制御に関与) の発現増加が含まれます。いくつかの神経変性疾患に関連する神経タンパク質α-シヌクレインをコードするSncaの発現は、AN移植マウスでより高かった48。さらに、脂肪組織の熱産生を調節するタンパク質をコードする遺伝子のメッセンジャー RNA (mRNA) レベルを分析しました。 AN移植マウスの鼠径部脂肪ではUcp1、Elovl3、およびPgc1α mRNAの量が増加していることがわかり、このマウスグループでは脂肪組織の熱産生が強化されていることを示しています（図6c）。

ヒトドナーの便とGFマウスレシピエントの盲腸内容物の16Sリボソームリボ核酸（rRNA）遺伝子アンプリコン配列決定により、85個の重複するアンプリコン配列変異体（ASV、図6d）が同定され、そのうち45個（53％）の変化したドナーのASVがレシピエントに移入された（図6e)。血清メタボロームプロファイリングにより、ドナーとレシピエントの間で保存された31の代謝産物が検出され、そのうち19（61％）の変化がヒトからマウスに伝達されました（拡張データ図10c）。属レベルでバクテロイデスとして注釈が付けられた 3 つの ASV、ASV_021、ASV_229、ASV_002 を特定しました。これらのASVの相対的な存在量と、Ucp1を含む褐変遺伝子の発現（拡張データ図10d）は強い正の相関があり、脂肪の褐変の促進による体重減少または体重増加の低下におけるこれらのASVの潜在的な役割を示しています。アッカーマンシア属として注釈が付けられているASV_122の相対存在量と視床下部の食欲抑制遺伝子Htr1bとの間の逆相関も注目に値し、食欲制御におけるASV_122の潜在的な役割を示唆している（拡張データ図10d）。総合すると、マウスにおける視床下部および脂肪組織の遺伝子発現の変化と体重の経時的変化は、ヒトANにおける腸内微生物叢の破壊が、ANの複雑な病因の一部の要素に寄与している可能性を示唆している。

我々は、配列決定とメタボロミクスを組み合わせて、ヒトとマウスの腸内マイクロバイオームとメタボロームを特徴付けることにより、マイクロバイオームの細菌成分とウイルス成分、および血清メタボロームが、健常者と比較してAN患者では変化していることを示した。また、細菌種のSVがANと健康な対照の間で異なることもわかり、コンピュータでの因果推論分析は、細菌の代謝産物が腸内微生物叢の変化によるANの行動に対する何らかの影響を媒介していることを示唆している。最後に、エネルギー制限食で AN 便を移植された GF マウスは、健康な個体からの便を移植されたマウスと比較して、最初はより多くの体重を失い、時間の経過とともに体重増加が遅くなります。これは、AN移植マウスの視床下部における食欲抑制遺伝子のより高い発現と、脂肪組織における熱産生関連遺伝子のより高い発現と関連していた。

FMT実験とインシリコ推論解析の両方で、グリシン-ケノデオキシコール酸、インドール-3-プロピオン酸、タウリン-α-ムリコール酸、タウリン-ヒオデオキシコール酸の循環レベルの変化が観察されました。私たちは、これらの代謝産物がいくつかの AN 表現型の潜在的なメディエーターとして機能する可能性があると提案します。例えば、インドール-3-プロピオン酸はセロトニン活性に関係するトリプトファン代謝物であり49、ヒオデオキシコール酸はムリコール酸とも呼ばれる6α-ヒドロキシル化胆汁酸で、体重増加を抑制します50。この胆汁酸は満腹感の調節に関与しています51。セロトニン活性および食欲調節は、AN 症候群の発症および/または維持に関与している可能性があります。今後の研究では、エネルギー代謝に対するこれらの代謝物の個別の効果と複合的な効果を調査する必要があります。それでもなお、活動に基づく食欲不振モデルで報告されているように、さらに多くの腸内細菌種とそれに由来する代謝産物が、ヒトとマウスで観察された AN 形質を媒介している可能性があります 20,52。

腸内細菌種における欠失および可変 SV の分析により、細菌の遺伝学が AN 関連の行動形質および病態生理学に影響を与える可能性があることが示されました。特に興味深いのは、過食症と自己否定の推定値に関連する B. ユニフォームリスゲノムの 10 kbp の欠失です。我々は、この欠失によりチアミン一リン酸キナーゼをコードする遺伝子が失われ、微生物叢によって生成されるチアミンが相対的に欠乏する可能性があると予測した。さまざまな精神的および腸の健康問題がチアミン欠乏症に関連していることが知られているため、これは AN 病理学の文脈において興味深いものです 33。

AN におけるウイルス性腸内細菌叢に関する我々の研究では、脳生物学に影響を与える、ウイルス種と短鎖生成細菌種の間の生態学的相互作用が部分的に切り離されていることが示されました 53。さらに、AN サンプルには、既知の細菌 L. lactis 宿主を含む Lactococcus ファージが豊富に含まれていました。 Lactococcus ファージにおける AN 関連の濃縮は、食品発酵の破壊を引き起こす可能性があり、将来の AN の治療に発酵食品を使用できる可能性を示唆しています。ラクトコッカス・ファージがこのように濃縮される理由はまだ解明されていないが、我々の発見は、L. lactis を含む複数株のプロバイオティクスを AN 青年でテストすることを正当化する可能性がある 54。

私たちの研究には限界があります。(1) 横断的なデンマーク人 AN コホートの使用は、他の民族への所見の一般化可能性を制限します。 (2) 専門センターでの治療における AN 患者の使用にも同様の制限が当てはまります。これらの患者は、より軽度の AN を代表するものではない可能性があるからです。 (3) 複数の共変量の影響は混乱していましたが、食事や身体活動、つまり腸内細菌叢に影響を与える行動については情報がありませんでした。

結論として、今回のマルチオミクス研究は、機能的意味合いと血清代謝物の変化を伴う、AN患者における腸内微生物叢の深刻かつ複雑な破壊を明らかにした。これらの化合物は、血液循環を介して、または腸-微生物叢-脳ニューロンシグナル伝達経路を介して作用し、食欲、感情、行動の脳調節に影響を与える可能性があります。エネルギー制限給餌下でヒトANドナーからGFマウスにFMTを行ったところ、体重増加が減少し、行動とエネルギー恒常性の制御に関与する視床下部および脂肪組織遺伝子の発現に多くの変化が生じた。マルチオミックスと in vivo 実験の組み合わせは、我々の因果推論分析を補完し、ヒト宿主の AN 形質を媒介する可能性がある特定の細菌代謝産物の同定を可能にします。我々の発見は、深刻に破壊された腸内細菌叢が、AN の病因の一部の段階に寄与しているという仮説を裏付けるものである。

AN患者は全員、経験豊富なコンサルタント精神科医によって診断されており、AN1の制限または過食/排出サブタイプに関するDSM-5基準を満たしていました。 ANと診断された人の90〜95％が女性であるため、本研究には女性のみを含めることにしました。また、民族性が腸内細菌叢に影響を与える可能性があるため、デンマークの3つの専門センターから1年前に募集されたAN症例を持つデンマーク人の白人女性のみを含めました。 2014年9月12日から2016年7月31日まで。センターは、摂食障害センター（オーデンセ大学病院）、児童・青少年精神医学ユニット（オーフス大学病院）、精神医学研究ユニット（オールボー大学病院）でした。除外基準には、過去 3 か月以内の抗生物質または抗真菌治療、急性または慢性の体性疾患または感染症が含まれます。対象となった患者は全員専門のセンターで治療を受けており、治療開始時に経験豊富な専門の心理学者または精神科医による面接を受けた。検証された摂食障害目録（EDI、詳細は補足注 2 に記載）は、インタビューと、訓練を受けた医療専門家によって記入されたアンケートとして使用されました 21。年齢を一致させた健康な対照女性の除外基準は、BMIが18.5未満または25kg m-2以上、経口避妊薬以外のあらゆる種類の定期投薬、および過去3か月以内の抗生物質でした。対照参加者は、公共広告を通じて、また医療スタッフ、医学生、およびその親族との直接接触を通じて募集されました。健康な対照者のBMIおよびその他の臨床的特徴を補足表2に示します。

研究プロトコルは ClinicalTrials.gov (NCT02217384) に登録され、研究はヘルシンキ宣言に従って実施され、デンマーク南部地域科学倫理委員会によって承認されました (ファイル番号 42053 S-20140040)。この研究に参加したすべての参加者は書面によるインフォームドコンセントを提供しました。

入院患者。以下に説明するすべての測定は、重度の AN 患者の身体的および心理的安定化を目的とした専門ユニットでの日常的な治療中に実施されました。入院病棟での治療の目標は、1 週間あたり 2.0 ～ 3.0% の安全かつ効果的な体重回復です。ケアは学際的なチームによって提供され、国際ガイドラインに従って行われます。訓練を受けた看護師または栄養士の監督の下、個別にカスタマイズされた食事が予定された時間に提供されました。事前に決められた時間枠（間食は 15 分、主食は 30 分）内に食事を摂取できなかった場合は、栄養ドリンクを経口または十二指腸チューブ経由で補充しました。個人の好みを考慮して、3種類の異なる食事が提供されました。多量栄養素の含有量は一貫しており、推奨エネルギーパーセント範囲内にありました: 炭水化物 40 ～ 50% (砂糖最大 10%)、脂肪 30 ～ 40%、タンパク質 20 ～ 25%。毎日のエネルギー摂取量は体重の推移に応じて個別化されました。患者の毎週の体重増加が 2% に達しなかった場合は、毎日のメニューのエネルギー含有量が増加されました。すべての食事の後には、監視下で座った姿勢で 30 ～ 60 分間の休憩が取られました。休憩の間には、散歩などの軽い身体活動が許可されました。ただし、いかなる形式の運動トレーニングも許可されませんでした。過度の運動への衝動、またはその他の行動規則の遵守の欠如がある患者に対しては、行動の監督が必要に応じて 1 日 24 時間まで延長されました。

外来患者さん。 AN患者は定期的に外来病棟を訪れ、医師、看護師、心理学者、健康行動教育者を含む学際的なチームによってケアが提供された。

彼らには、入院患者について上述したものと同じ主要栄養素組成を有する個別の食事計画が与えられた。入院患者と同様に、すべての外来患者も認知行動療法の治療コースに登録されました。

身長は壁に取り付けられたスタディオメーターで測定され、体重は朝食前に校正された台秤で朝測定されました。 BMIは、体重を身長の二乗で割ったもの（=kg/m2）として計算されました。

一晩絶食した後の朝に血液サンプルを採取した。血液サンプルは氷上で収集され、血清と血漿を得るために処理され、その後 -80 °C で保存されました。ナトリウム、カリウム、アルブミンおよびクレアチニンの血清濃度は、Roche/Hitachi cobas c システムでの酵素アッセイによって測定されました。総コレステロール、高密度リポタンパク質コレステロール、および低密度リポタンパク質コレステロールの血清濃度は、リンタングステン酸塩化マグネシウム沈殿法を使用して測定されました。血清免疫反応性インスリンレベルは酵素免疫吸着法を使用して測定し、アラニンアミノトランスフェラーゼの血清濃度はピリドキサールリン酸活性化を含む酵素電量法で分析しました。

血漿 ClpB の分析は以前に記載されているように実行されました 55。

便は、国際ヒトマイクロバイオーム標準（IHMS）ガイドライン（SOP 03 V1）に従って、AN症例と自宅のHCによってキットに収集され、ドライアイスで輸送されるまで直ちに-20℃で凍結され、4〜24時間後に凍結されました。バイオバンクのプラスチックチューブ内では-80 °C。糞便サンプルのアリコートからの DNA 抽出は、IHMS SOP P7 V256 に従って実行されました。

細菌細胞計数（補足図7）の場合、0.08〜0.12 gの凍結（-80℃）糞便サンプルをpH 7.2のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）（Sigma-Aldrich）で15倍に希釈し、組織を使用して機械的に均質化しました。ライザー（４０分間、毎秒１２．５回撹拌；ＱＩＡＧＥＮ）で洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定した（１０分間、室温；Ｂｉｏｔｕｍ）。次いで、サンプルを濾過した染色緩衝液(1mM EDTA、0.01% Tween20、pH 7.2 DPBS、1% BSA (Sigma-Aldrich))で120倍に希釈した。凝集塊を最小限に抑えるために、サンプルを染色バッファーであらかじめ湿らせたセルストレーナー (孔径 5 μm、pluriSelect) を通して濾過しました。次に、細菌細胞懸濁液を DMSO (Sigma-Aldrich) 中の SYBR Green I (1:200,000; Thermo Fisher) で染色し、暗所で 30 分間インキュベートしました。細菌細胞数を正確に測定するために、分析前に既知濃度の 123count eBeads (Invitrogen) をサンプルに添加しました。測定は、BD Fortessa LSRII フローサイトメーター (BD Biosciences) を使用して実行され、データは BD FACSDiVaTM ソフトウェアを使用して取得されました。閾値 200 が FITC (530/30 nm) チャネルに適用されました。緑 (530/30 nm、FITC)、青 (450/50 nm、パシフィックブルー)、黄 (575/26 nm、PE)、赤 (695/40 nm、PerCP-Cy5-5) 蛍光チャネルでの蛍光強度前方散乱光および側方散乱光 (FSC および SSC) の光強度も収集されました。測定は、あらかじめ設定された流量 0.5 μl s-1 で実行されました。データは、R (v4.1.2) の flowcore パッケージ (v1.11.20)57 を使用して R で処理されました。固定ゲート戦略により、糞便サンプルのバックグラウンドから微生物の蛍光イベントが分離されました。

Qubit 蛍光定量 (Thermo Fisher) を使用して DNA を定量し、フラグメントアナライザー (Agilent) での DNA サイズプロファイリングを使用して定量しました。高分子量 DNA (>10 kbp、3 μg) を使用してライブラリを構築しました。超音波処理装置 (Covaris) を使用して DNA を約 150 bp の断片に剪断し、Ion Plus Fragment Library および Ion Xpress Barcode Adaptors キット (Thermo Fisher) を使用して DNA 断片ライブラリーの構築を実行しました。精製および増幅された DNA フラグメントライブラリーは、Ion Proton Sequencer (Thermo Fisher) を使用して配列決定され、ライブラリーあたり 150 bp (平均) の高品質リードが少なくとも 2,000 万件生成されました。

遺伝子数テーブルを構築するために、METEOR ソフトウェアを使用しました 58: まず、リードは AlienTrimmer によって低品質にフィルタリングされました 59。低品質のリードとヒト DNA リードを除去した後、Bowtie2 を使用して、糞便 DNA の 75.7% ± 2.7% の高品質メタゲノミクスシーケンスリードが、1,040 万個の遺伝子を含む Integrated Gut Catalog 2 (IGC2)60 にマッピングされました (参考文献 61)。）。カタログ内の固有の遺伝子にマッピングされたリードは、対応する遺伝子に起因すると考えられました。次に、カタログ内の複数の遺伝子に同じアライメントスコアでマッピングされたリードが、キャプチャされた遺伝子に対する固有のマッピングカウントの比率に従って帰属されました。結果として得られたカウントテーブルは、R パッケージ MetaOMineR v1.3162 を使用してさらに処理されました。サンプル間のシーケンスの深さとマッピング率の違いを考慮して、マップされたリード数 1,400 万にダウンサイズされました。次に、ダウンサイズされた行列は遺伝子の長さについて正規化され、100 万フラグメントごとの転写産物のキロベースあたりのフラグメント数によってマップされた正規化によって頻度行列に変換されました。遺伝子数は、頻度行列に存在する遺伝子の数 (存在量は厳密に正) として計算されました。

IGC2 は以前、公開されている更新された MSP データセット 64 を使用して、MSPminer63 で 1,990 の MSP に編成されました。 MSP の相対存在量は、その 100 個の「マーカー」遺伝子 (つまり、最もよく相関する遺伝子) の平均存在量として計算されました。サンプル中に見られる「マーカー」遺伝子が 10% 未満の場合、MSP の存在量は 0 に設定されました。このアプローチは、MetaHIT62 および Metacardis65 コンソーシアムで使用されました。 100 未満のコア遺伝子を持つ 4 つの MSP については、利用可能なすべてのコア遺伝子が使用されました。

より高い分類ランクでの存在量は、特定の分類群に属する MSP の合計として計算されました。 MSP 数は、サンプル中に存在する MSP の数として評価されました (つまり、その存在量は厳密に陽性です)。エンテロタイププロファイリングは、以前に実証されたように実行されました66。

IGC2 カタログの遺伝子は、ダイヤモンド 67 を使用して、KEGG データベース 68 (v8.9) の KEGG オーソログ (KO) にマッピングされました。各遺伝子は、e 値 < 10 × 10−5 およびビットスコア >60 のヒットの中で最高ランクの KO に割り当てられました。次に、前述のように R パッケージ omixerRpm (v0.3.2) に実装されたパイプラインによって、メタゲノムサンプル中の GMM28 および GBM29 の存在と存在量を評価しました 28,29。

我々は、前述のように、計算パイプラインを使用して、メタゲノムサンプルから腸内細菌の増殖ダイナミクスを推測しました27。シーケンスリードは、1,509 の微生物種に属する 2,991 株の完全なゲノム参照を含むデータベースにマッピングされました。各細菌種について、サンプル全体で 100% の蔓延率を持つ参照菌株が選択されました。次に、参照ゲノムに対するアライメントされたリードに基づいてカバレッジマップが組み立てられました。ゲノムセグメントは 10 kbp 領域にビン分けされ、結果として得られたビンのカバレッジが計算されて平滑化されました。複製の起点と終点の位置は、複数のサンプルにわたる同じ株の適合によって予測されました。最後に、PTR は、予測されたピーク位置での代表菌株の平滑化された配列カバー率を、予測されたトラフ位置でのそれで割ったものとして、すべてのサンプルの各細菌種について計算されました。

SV 分類の前に、反復カバレッジベースのリード割り当てアルゴリズムを使用したパイプラインが実行され、あいまいなリードを最も可能性の高い参照に高精度で再割り当てしました 31,32。 proGenomes データベース (http://progenomes1.embl.de/) で提供される参照ゲノムは連結され、ゲノム 1 kbp ビンに分割され、非常に多様なゲノムセグメントの検出に適用されました。 SGV-Finder パイプライン 31 は、(1) 集団全体のゲノムセグメントの欠失割合が 25% 未満 (可変 SV、vSV)、(2) 欠失割合が 25% ～ 75% のいずれかの SV を検出するために使用されました。 (欠失 SV、dSV; この特定のゲノムセグメントの有無は維持されます)、または (3) 欠失パーセンテージが 75% を超える (このゲノムセグメントは分析から除外されました)。 SV コールを持つすべての細菌種はサンプル全体の少なくとも 10% に存在し、その後の分析に使用されました。

R パッケージ「メディエーション」69 (v4.5.0) は、腸内微生物の特徴、極性および微生物叢関連代謝物、代謝形質と摂食障害スコアの間の因果関係を推論するために使用されました。テスト数を減らすために、相互に強く関連する変数で構成される候補グループのみを保持しました。つまり、候補微生物の特徴-代謝物-表現型の可変原因グループでは、腸内微生物の特徴と血清代謝物との関連が有意でした（Padj < 0.1）。代謝産物と表現型変数の間の関連性は有意でした（Padj < 0.1）。そして、微生物の特徴と表現型変数との間の関連性は有意であった(Padj < 0.1)。媒介分析を実行した後、方向 1 で有意性を持つ候補グループのみがサンキーダイアグラムの視覚化のために保持されました。

このメソッドは、バルクメタゲノミクスシーケンシングリードから直接ウイルスを呼び出し、バイロームデータセット内の相対存在量を計算するように最適化されているため、MiCoP70 を使用してウイルスの腸内微生物叢をプロファイリングしました。 MiCoP は参照データセットとして NCBI の RefSeq Viral データベースを利用します71。データセットに含まれる 147 人 (AN 77 名対 HC 70 名) について、有病率が 10% 以上、相対存在量が 0.01% 以上のウイルス種を合計 209 種特定しました。豊富さ、アルファおよびベータの多様性は、R パッケージ「fossil」72 および「vegan」73 を使用して計算されました。両側ウィルコクソン順位和検定を使用して、グループ間のリッチネスおよびアルファ多様性指数の統計的に有意な差を決定しました。 n = 999 での順列多変量分散分析 (PERMANOVA) をキャンベラ距離に対して実行しました。 AN-RS と AN-BP の両方のマイクロバイオームデータにおけるウイルスと細菌の相互作用は、組成に対するスパース相関 (SparCC)74 アルゴリズムを使用して計算されました。 SparCC 分析の前に、AN 細菌およびウイルス微生物叢データセットは AN-RS および AN-BP データセットにサブセットされ、その後、SparCC 分析のために個別に送信されました。

腸内微生物叢関連代謝物としてリストされた代謝物は、文献マイニングに基づいています75,76。血清サンプルはランダム化され、サンプルの調製は以前に記載されているように行われました 43,77。簡単に説明すると、内部標準 (ヘプタデカン酸、重水素標識 dl-バリン、重水素標識コハク酸、重水素標識グルタミン酸、1 μg ml-1) を含む 400 μl のメタノール (MeOH) を 30 μl の血清サンプルに添加しました。次いで、これらをボルテックス混合し、氷上で30分間インキュベートした。次にサンプルを遠心分離し（9,400 × g、3 分間）、遠心分離後に 350 μl の上清を収集しました。溶媒を蒸発乾固し、25μlのMOX試薬を加え、サンプルを45℃で60分間インキュベートした。 N-メチル-N-(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(25μl)を加え、45℃で60分間インキュベートした後、25μlの保持指数標準混合物(n-アルカン、10μg ml-1)を加えた。

分析は、Agilent 7200 四重極飛行時間型質量分析計に接続された Agilent 7890B ガスクロマトグラフを使用して行われました。以下のパラメータを使用しました。注入量は 1 µl で、70 °C の PTV で 100:1 に分割し、120 °C min-1 で 300 °C まで加熱しました。カラム: 長さ 20 m、内径 0.18 mm、膜厚 0.18 μm の Zebron ZB-SemiVolatiles、初期ヘリウム流量 1.2 ml min-1、16 分後に 2.4 ml min-1 に増加。オーブン温度プログラム: 50 °C (5 分)、次に 20 °C min-1 で 270 °C まで、次に 40 °C min-1 (5 分) で 300 °C まで。 EI 源: 250 °C、70 eV 電子エネルギー、35 µA 放射、溶媒遅延 3 分。質量範囲 55 ～ 650 amu、取得速度 5 スペクトル/秒、取得時間 200 ms/スペクトル。 150 °C のクワッド、1.5 ml min-1 N2 衝突流、aux-2 温度 280 °C。

検量線は、アラニン、クエン酸、フマル酸、グルタミン酸、グリシン、乳酸、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、3-ヒドロキシ酪酸、リノール酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、コレステロール、フルクトース、グルタミン、インドール-3-プロピオン酸、イソロイシン、ロイシン、プロリン、コハク酸、バリン、アスパラギン、アスパラギン酸、アラキドン酸、グリセロール-3-リン酸、リジン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、セリン、スレオニンはSigma-Aldrichから購入0.1 ～ 80 μg ml-1 の濃度範囲で。各サンプルのアリコートを収集、プールし、社内プール血清サンプルである国立標準技術研究所 (NIST) CRM1950 血清サンプルとともに品質管理サンプルとして使用しました。濃度の相対標準偏差は、プールされた品質管理サンプルでは平均 16%、NIST サンプルでは 10% でした。

サンプル調製手順は前述のように実行されました78。プレートは、100 μl のサンプルと 10 μl のポリフルオロアルキル物質 (PFAS) および胆汁酸 (BA) 内部標準混合物 (それぞれ 200 ng ml-1 および 1,000 ng ml-1) を添加する前に、450 μl のアセトニトリルで前処理しました。その後、1% ギ酸を含むアセトニトリル 450 μl を各ウェルに添加し、10 インチの真空マニホールドを使用してサンプルを抽出しました。溶出液を窒素ガス流下で蒸発乾固し、80μlのMeOH/2mMエタン酸アンモニウム水溶液に再構成した。

クロマトグラフィー分離は、C18 プレカラム (Waters) を取り付けた Acquity UPLC BEH C18 カラム (内径 100 mm × 2.1 mm、粒径 1.7 μm) を使用して実行しました。移動相 A は H2O:MeOH (v/v 70:30) と MeOH の移動相 B から構成され、両相にはイオン化剤として 2 mM 酢酸アンモニウムが含まれています。流量は次のような溶出勾配で 0.4 ml min-1 に設定しました。0 ～ 1.5 分、移動相 B を 5% から 30% に増加しました。 1.5 ～ 4.5 分、移動相 B が 70% に増加しました。 4.5 ～ 7.5 分間、移動相 B を 100% に増やし、5.5 分間保持しました。次の分析のために初期条件を回復するために、5 分間のポストタイムが使用されました。サンプルごとの合計実行時間は 18 分でした。デュアルエレクトロスプレーイオン化源の設定は次のとおりです。キャピラリー電圧は 4.5 kV、ノズル電圧は 1,500 V、ネブライザー内の N2 圧力は 21 psi、シースガスとしての N2 流量と温度は 11 l min-1、379 °C でした。それぞれ。質量分析 (MS) スキャンで正確な質量スペクトルを取得するには、負イオンモードで m/z 範囲を 100 ～ 1,700 に設定しました。すべてのデータ取得には、MassHunter B.06.01 ソフトウェア (Agilent) を使用しました。

化合物の同定は、MS (および保持時間)、タンデム質量分析情報を使用した社内スペクトルライブラリーで行われました。定量は、天然化合物を添加したマトリックスに一致する検量線に基づいて行われました。検量線は、BA の 0 ～ 1,600 ng ml-1 の範囲の濃度で構成されました。 BA の相対標準偏差は、品質管理サンプルでは平均 17.8%、NIST サンプルでは 19.4% でした。

動物プロトコルは、デンマーク、コペンハーゲン首都圏の科学倫理委員会によって承認されました。メスの無菌スイスウェブスターマウスは、コペンハーゲン大学実験医学部で実験が開始されるまで、フレキシブルフィルムノトバイオティックアイソレーター内で飼育および維持されました。マウスには、オートクレーブ処理した固形飼料（単糖 7%、脂肪 3%、多糖類 50%、タンパク質 15%（w/w）、エネルギー 3.5 kcal g-1）と水を 12 時間明所/12 時間暗所で自由に与えました。サイクル（午前 7 時 30 分に点灯）、一定の温度（21 ～ 22 °C）および湿度（55 ± 5%）。

AN 患者 3 名（BMI それぞれ 10.3、11.5 および 11.7 kg m-2 の 20、22、および 20 歳の女性）と HC 患者 3 名（BMI がそれぞれ 10.3、11.5、および 11.7 kg m-2 の 20、22、および 21 歳の女性）のランダムに選択されたサブセットからの糞便サンプル。症例と対照の代表者であるそれぞれ22.6、21.1、21.2 kg m-2）を使用して、生後6週間の雌のGF同腹子に定着させました。簡単に説明すると、250 mgの糞便サンプルを、嫌気性凍結バイアル中で20％グリセロールで希釈した5 mlのLYBHI培地（還元剤として0.05％システインおよび0.2％ヘミンを補充）（糞便20ml g-1）で懸濁した。次に、これらの接種材料サンプルを 5 分間ボルテックスし、その後 5 分間静置して粒子を沈殿させました。次に、糞便スラリーを 1 ml 凍結バイアルに移し、すぐに -80 °C で凍結しました。 1日目に、両グループのマウスをオートクレーブ処理した個別に換気されたケージに収容し、そこで最初の用量(200μl)の糞便スラリーを投与した。次いで、マウスにオートクレーブ処理した固形飼料と水を2日間自由に与え、食物摂取量を記録した。 3日目に、以前と同じ対応するANおよびHCドナーからの糞便物質の2回目の用量をマウスに強制経口投与した。その後、両群のマウスを単独で飼育し、３０％エネルギー制限加圧滅菌固形飼料（与える餌の量は各マウスの随意摂食量の７０％に設定）を３週間与え、水を随意に与えた。食欲不振移植マウス (AN-T) と正常対照移植マウス (HC-T) の両方の体重を、エネルギー制限食の開始後 5 日ごとに測定しました。

研究の最後に、マウスをイソフルランで麻酔し、大静脈からの血液をEDTAを含むチューブに採取した。血液サンプルを 4,032 g、4 °C で 6 分間遠心分離しました。血漿は分離され、その後の生化学検査のために -80 °C で保存されました。各マウスの鼠径皮下白色脂肪組織、盲腸および視床下部を正確に解剖し、定量的 PCR 分析のために収集しました。本研究から除外された動物やデータポイントはありません。

メーカーの指示に従ってTrizol試薬(Invitrogen)を使用して組織から全RNAを抽出し、濃度を測定した。逆転写システム (Promega) を使用して、1 μg の RNA を相補 DNA に転写しました。リアルタイム PCR は、LC480 検出システム (Roche Diagnostics) および SYBR Green I Supermix (Takara) を使用して実行されました。すべての qPCR は、95 °C で 10 分間の熱サイクルで実行され、その後、95 °C で 0.01 秒、および 60 °C で 20 秒のサイクルが 45 サイクル実行されました。データは、脂肪組織のハウスキーピング Rpl36 遺伝子および視床下部の Rplp0 遺伝子 79 に対して正規化され、デルタデルタ CT 法に従って分析されました。この研究で使用したオリゴヌクレオチドの配列を補足表 8 に示します。

NucleoSpin 土壌ミニキット (MACHEREY‑NAGEL) を使用して、ヒトのドナーとマウスのレシピエントの糞便サンプル (約 250 mg) から微生物 DNA を分離および精製しました。次に、Phusion High-Fidelity PCR マスターミックス (New England Biolabs) を使用して、16S rRNA 遺伝子の V3-V4 領域を標的とする PCR によって DNA を増幅しました (プライマー配列は補足表 8 に示されています)。次の PCR プログラムを使用しました:98 °C 30 秒、25 倍 (98 °C 10 秒、55 °C 20 秒、72 °C 20 秒)、72 °C 5 分間。増幅は、生成物をアガロースゲル上で泳動することによって検証された。 Illumina Nextera キットを使用した次の PCR プログラムでインデックスを追加しました: 98 °C 30 秒、8x (98 °C 10 秒、55 °C 20 秒、72 °C 20 秒)、 72℃で5分間。インデックスの付加は、製品をアガロースゲル上で実行することによって検証されました。ネステッド PCR からの産物はバンド強度に基づいてプールされ、得られたライブラリーは磁気ビーズで洗浄されました。プールされたライブラリーの DNA 濃度を蛍光分析的に測定しました。シーケンスは、2 × 300 bp ペアエンドシーケンス用の MiSeq 試薬キット V3 (Illumina) を使用して、Illumina MiSeq デスクトップシーケンサーで行われました。その後、ペアエンドリードは、DADA2 (v1.16.0) パイプラインを使用してトリミング、マージ、分析されました80。

本研究では統計分析の前にデータは除外されませんでした。この研究は観察的なものであるため、割り当てとランダム化は含まれていません。この研究には、拒食症患者と健康な個人の入手可能なすべてのサンプル (n = 147) が含まれています。サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されていませんが、サンプルサイズは以前の出版物で報告されたものと同様です 43,81。サンプルはメタゲノミクスおよびメタボロミクスのバッチ全体にランダムに分配されました。研究者らは、メタゲノム分析、生化学分析、メタボロミクス分析におけるデータ収集中にグループの割り当てを知らされていませんでした。ヒトサンプルのすべての分析は、R (v4.1.2) を使用して実行されました。動物研究のための遺伝子発現解析と体重比較は、GraphPad Prism (v9.3.0) を使用して実行されました。

微分分析

R パッケージの metadeconfoundR (v0.1.8、https://github.com/TillBirkner/metadeconfoundR または https://doi.org/10.5281/zenodo.4721078 を参照) に実装されている metadeconfoundR パイプラインを使用して差分分析を実行しました。マイクロバイオームまたはメタボローム分析で観察されたAN参加者とHC参加者間の差異が、年齢、BMI、喫煙、投薬などの共変量によってどの程度混同されるかを評価した。このパイプラインは、最初に単変量統計を使用してマイクロバイオームの特徴と病気の状態の間の関連性を見つけ、次にネストされた線形モデル比較事後テストを行って潜在的な共変量の交絡効果をチェックし、最後に状態ラベルを返しました。

関連性分析

AN グループ内のオミクス特徴と摂食行動および心理的特徴の間の関連および媒介分析のために、最初にシャピロ-ウィルク正規性検定を使用して連続変数の正規性をチェックし、ほとんどの変数が正規分布していないことを発見しました。したがって、関連性分析の前に、標準正規分布 (N ~ (0, 1)) に従うように経験的な正規分位数変換を使用して連続変数を標準化しました。次に、交絡因子を共変量として追加した次の式を使用して、オミクス特徴と摂食行動および心理的特性の間の関連性を評価する線形回帰モデルを実装しました。

薬物療法には、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、抗精神病薬、ベンゾジアゼピンが含まれます。

オミックスの特徴と宿主の代謝形質の間の関連性分析では、線形回帰分析の前に正規性チェックとデータの標準化も実行されました。線形回帰モデルでは、HC 患者と比較して AN 患者の表現型の変化としては極度に低い BMI が最も顕著であるため、BMI を除いて、上記の交絡因子が共変量として含まれました。

AN と HC の間の腸内微生物の多様性 (遺伝子の豊富さ、種数、分類学的組成) の差異は Wilcoxon 検定を使用して計算され、複数のグループ間の差異の有意性を評価するために Kruskal-Wallis 検定が使用されました。特に明記しない限り、すべての P 値は Benjamini-Hochberg 法を使用して補正され、Padj < 0.05 は統計的に有意であるとみなされます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

Odense Patient Data Explorative 経由で Sharepoint に保存されている匿名化された臨床データ (ファイル番号 OP_153) は、[email protected] に連絡することでアクセスできます。または、補足表 2 にあります。生のショットガンシーケンスデータおよび 16s rRNA 遺伝子アンプリコンシーケンスデータこの研究の結果を裏付けるものは、それぞれ受託番号 PRJEB51776 および PRJEB60103 で European Nucleotide Archive に寄託されています。メタボロミクスデータは、リンク https://doi.org/10.21228/M8KT5B の Metabolomics Workbench リポジトリから入手できます。 KEGG データベースは https://www.genome.jp/kegg/ から入手できます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

データ分析と視覚化に関連するコードは、https://github.com/fjw536/AnorexiaGutMicrobiome.git で入手できます。

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YF は、本研究に捧げられたマリー・スクウォドフスカ・キュリー個人フェローシップ (797267) を受け取りました。ノボノルディスク財団基礎代謝研究センターは、コペンハーゲン大学の独立研究機関であり、資金の一部はノボノルディスク財団からの無制限の寄付によって賄われています。 RKS はオーデンセ大学病院研究基金 (R15-A800) によって支援されました。

Yong Fan、René Støving、Samar Berreira Ibraim などの著者も同様に貢献しました。

ノボノルディスク財団基礎代謝研究センター、コペンハーゲン大学健康医科学部、コペンハーゲン、デンマーク

ヨン・ファン、トゥリカ・アローラ、リウェイ・リュー、エヴェリーナ・スタンケヴィッチ、トゥー・ハルドール・ハンセン、フレドリック・バックヘド、オルフ・ペダーセン

オーデンセ大学病院摂食障害センター、南デンマーク地域の医療内分泌学研究ユニット、精神保健サービス、オープン患者データ探索ネットワーク (OPEN) および南デンマーク大学臨床研究所 (デンマーク、オーデンセ)

René KlinkStoving により

パリ・サクレー大学、INRAE、MGP、ジュイ・アン・ジョザ、フランス

サマール・ベレイラ・イブライム、フローレンス・ティリオン、ニコラ・ポンス、ナタリー・ガレロン、ブノワ・クインクイ、フローレンス・レベネズ、ウーゴ・ロウメ、S.ダスコ・エールリッヒ

エーレブロ大学科学技術学部、エーレブロ、スウェーデン

トゥーリア・ヒュオティライネン、ティム・シニオヤ、オドニー・ラグナルスドッティル

コペンハーゲン大学医学部およびヘルレブ・ゲントフテ大学病院（デンマーク、コペンハーゲン）

リウェイ・リュー & オルフ・ペダーセン

INSERM U1073 研究ユニットおよび TargEDys、ルーアン大学、ルーアン、フランス

ピエール・デシュロット

Rega Institute Ku Leuven、ルーヴェン、ベルギーの微生物学および免疫学部、分子細菌学研究室

グウェン・ファロニー、サラ・ヴィエイラ・シルバ、ジェロン・レイス

微生物学センター、VIB、ルーヴェン、ベルギー

グウェン・ファロニー、サラ・ヴィエイラ・シルバ、ジェロン・レイス

医療微生物学および衛生研究所および免疫療法研究センター (FZI)、ヨハネス・グーテンベルク大学マインツ医療センター、マインツ、ドイツ

グウェン・ファロニー & サラ・ヴィエイラ・シルバ

分子生物学研究所 (IMB)、マインツ、ドイツ

グウェン・ファロニー & サラ・ヴィエイラ・シルバ

オーフス大学病院、児童・青年精神科、オーフス、デンマーク

ベリークラウセン

デンマーク、オーフス、オーフス大学保健学部臨床医学科

ベリークラウセン

デンマーク、オールボーのオールボー大学病院、精神医学研究ユニット

ケアルダムテレウスゲーム

デンマーク、オールボーのオールボー大学社会科学・人文科学部コミュニケーション心理学科

ケアルダムテレウスゲーム

スウェーデン、ヨーテボリ大学サールグレンスカアカデミー医学研究所分子臨床医学部ヴァレンバーグ研究室

フレドリック・ベクヘド

スウェーデン、ヨーテボリ、ヴェストラ・イェータランド地域、サールグレンスカ大学病院臨床生理学部門

フレドリック・ベクヘド

エーレブロ大学医科学部、エーレブロ、スウェーデン

マテイ・オレシッチ

トゥルクバイオサイエンスセンター、トゥルク大学およびオーボアカデミ大学、トゥルク、フィンランド

マテイ・オレシッチ

ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン、臨床・運動神経科学部門、ロンドン、英国

S.ダスコ・エールリッヒ

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OP は研究コンセプトを考案および設計し、プロトコルの詳細を作成し、論文作成を含む研究プロトコルのすべての段階を監督しました。 YF、RKS、SBI、FT はデータ分析を実行し、結果を解釈し、論文の草稿に貢献しました。 TH、TS、OR はメタボロームプロファイリングをサポートしました。 YF は TA および LLLL の支援を受けてすべての動物実験を設計および実施し、ES は細菌細胞計数を実施しました。 RKS と THH は研究参加者の表現型解析を実施しました。 PD、NP、NG、BQ、FL、HR、GF、SV-S.、JR、LC、GKT、FB、MO、SDE が技術プロジェクトの開発と監督に貢献し、論文の草稿を改訂しました。著者全員が論文のレビューと編集に貢献しました。

オルフ・ペダーセンへの通信。

FB は Implexion Pharma の株主です。他の著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Microbiology は、この研究の査読に貢献してくれた Tom Hildebrandt と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

ワークフローは BioRender.com で作成されました。

a、b、e の相対存在量の AN (金、n = 77) と HC (青、n = 70) の比較の箱ひげ図 (線、中央値、箱、四分位範囲 (IQR)、ひげ、1.5 × IQR)。少なくとも 10% の個体で検出された 12 の細菌門 (a)、最も豊富な 20 の細菌科 (b)、および上位 30 の属 (e)。特徴は、平均存在量の減少によって並べ替えられます。ゼロ値は 1e-10 に設定されます。青で着色された特徴は HC グループで濃縮され、金色で着色された特徴は AN グループで濃縮されます。有意性は、両側ウィルコクソン順位和検定によって決定され、その後、すべての特徴 (a、b、および e、正確な p 値についてはソースデータを参照) についてベンジャミニ-ホッホバーグ法による薬物解絡および多重検定補正が行われました。 c、f、薬物解絡後のANとHCの間で対比された科（c）および属（f）のクリフデルタ効果サイズの絶対値（調整されたp値≤0.1）。金色の棒グラフは、AN で特徴がより豊富であることを示しています。青い棒グラフは、HC でより豊富な特徴を示します (c、f)。 d、g、属レベルでの腸内細菌のβ多様性（キャンベラ距離）（d）およびメタゲノム種パンゲノム（MSP）の豊富さを示すボックスプロット（線、中央値、ボックス、IQR、ひげ、1.5×IQR）（ g) AN (金、n = 77) と HC (青、n = 70) の間。有意性は、両側ウィルコクソン順位和検定 (d、g) によって決定されました。 h、上のパネルは、AN (n = 77) および HC (n = 70) におけるエンテロタイプの有病率を示し、下のパネルは、AN-RS (n = 56) と AN-BP (n = 21) に分けられた HC および AN 患者におけるエンテロタイプの有病率を示しています。）グループ。

ソースデータ

ノードサイズとノードの色は、それぞれ特定の MSP の平均存在量と属を表します。 1 つの MSP のみで表される属は灰色で表示されます。赤と青の線はそれぞれ正と負の相関を示します。線の太さは絶対相関係数を表します。絶対係数が 0.4 を超える相関のみが表示されます。しきい値を超える相関がない MSP は非表示になります。

特定の摂食障害尺度の変数は青でマークされ、一般的な心理的尺度は赤でマークされます。 +、調整済み p < 0.05 (正確な p 値についてはソースデータを参照)。

ソースデータ

a、HC (n = 70) および AN (n = 77) グループにおける腸内細菌科ファミリーの相対的な存在量。 b、HC (n = 70) グループと AN (n = 77) グループ間の空腹時血漿 ClpB 濃度を対数スケールで変換した。 c、制限的AN（AN-RS n = 56）と過食除去AN（AN-BP n = 21）サブタイプ間の対数スケール変換された空腹時血漿ClpB濃度。有意性は、2 つのグループ間の両側 Wilcoxon 順位和検定によって計算されました (ac)。箱ひげ図は中央値と四分位範囲 (IQR) を示し、ひげは 1.5 × IQR (ac) を表します。

ソースデータ

箱ひげ図は中央値と四分位範囲 (IQR) を示し、ひげは 1.5× IQR を示します。有意性は、両側ウィルコクソン順位和検定によって決定されました。

ソースデータ

ａ〜ｃ、Ａ．プトレディニスゲノムに１ｋｂｐの変異を有する個人におけるＨＯＭＡ−ＩＲ、空腹時血漿インスリンおよびグルコースを示す散布図（ｎ＝１４７）。 Benjamini および Hochberg 法を使用した誤発見率によって補正された両側スピアマン相関検定によって決定された有意性。誤差帯域は、95% 信頼帯域 (ac) を持つ線形回帰直線です。 AN および HC の個人を表すドットは、それぞれ赤と青で色付けされました。 d、上のパネル、A.プトレディニスのゲノム領域(x軸)に沿った標準化された変動性(y軸)。下のパネル、目的の遺伝子の位置 (青いバー)。

ソースデータ

a、ANサブタイプ、AN-BP（過食/パージ食欲不振）、AN-RS（制限的食欲不振）の血清メタボロームの主成分分析（PCA）プロット。 b、方向 1 (腸内微生物の特徴 → 血清代謝産物によって媒介される摂食障害スコア)、方向 2 (腸内微生物の特徴 → 摂食障害スコアによって媒介される血清代謝物) の推定媒介関係の要約数。 c、コホート全体の方向1（腸内微生物の特徴→血清代謝産物によって媒介される表現型）、方向2（腸内微生物の特徴→表現型によって媒介される血清代謝物）の推定媒介関係の要約数。 d、方向 1 の推定された因果関係ネットワークを示すサンキー図。細菌種、腸脳および代謝モジュール、細菌遺伝学を含む腸内微生物の特徴が原因因子として扱われ、血清代謝産物がメディエーターであり、代謝形質が結果です。 e. 腸内微生物の特徴、代謝産物、および宿主の代謝形質の間で推定される因果関係の例。微生物の特徴→血清代謝物を介した代謝形質を意味する方向 1 は黒線で示され、微生物の特徴→血清代謝物を介した代謝形質を意味する方向 2 は規定の赤線で示されます。仲介効果の割合はリングチャートの中央に表示されます。 GDCA、グリコデオキシコール酸。 GHCA、グリコヒオコール酸。 GHDCA、グリコヒオデオキシコール酸。 GUDCA、グリクルソデオキシコール酸。 HCA、ヒオコール酸。 HOMA-IR 恒常性モデルによるインスリン抵抗性の評価。 P-、血漿。 S、血清。

ソースデータ

a、糞便微生物叢スラリーを調製するためのワークフロー。食欲不振（ＡＮ）および対照（ＨＣ）の両方からの便（２５０ｍｇ）をドライアイス上で切断し、嫌気チャンバーに移し、２０％グリセロールで希釈した５ｍｌのＬＹＢＨＩ培地で再懸濁した。再懸濁した糞便スラリーをクライオチューブに等分し、さらに使用するまで -80 °C で急速に再凍結しました。一致する AN および HC ドナーのすべての便サンプルは同日に調製され、マウスに強制経口投与するために凍結アリコートが凍結保存されました。 b、GFマウス移植研究の実験スキーム。それぞれの独立した同腹子研究では、生後 6 週目の GF 雌同腹子が繁殖隔離装置から取り出され、3 人の AN 症例または 3 人の HC 被験者からの糞便スラリー 200 μl を受け取るように無作為に割り当てられました。両方のグループのマウスを、オートクレーブ処理した個別に換気されたケージに収容し、オートクレーブ処理した固形飼料および水を自由に２日間与えた。 2日後、以前と同じ対応するANおよびHCドナーからの糞便物質の2回目の用量をマウスに強制経口投与した。その後、両方のグループのマウスを単独で飼育し、30% カロリー制限食を 3 週間与えました。この期間中、水を自由に与えた。食欲不振移植マウス (AN-T) と正常対照移植マウス (HC-T) の両方の体重を、エネルギー制限食の開始後 5 日ごとに測定しました。 Biorender.com で作成されました。

a、自由食餌を与え、拒食症患者からの微生物叢を移植した無菌（GF）マウス同腹子（n = 21）の体重変化と脂肪率。 b、3つの独立した実験におけるエネルギー制限食後の0日目の体重と比較した体重変化（独立したバッチについてそれぞれn = 8、6、および6）。データは平均値 ± sem(a,b) として表されます。有意性は、二元配置分散分析 (ANOVA) とそれに続く Benjamini-Hochberg 事後検定によって計算されました。 c、30％エネルギー制限食を与えたヒトドナーおよびGFマウスレシピエントにおける血清メタボロームプロファイル。データは、AN グループとコントロールグループ間の log2 変換後の倍率変化 (log2FC) として表されました。正の log2FC 値は AN が豊富な代謝物を示し、負の log2FC 値は HC が豊富な代謝物を示します。ヒトドナーとGFマウスレシピエントにおいてAN群とHC群の間で持続的に変化した血清代謝物は青色のバーでマークされた。 CA、コール酸。 DCA、デオキシコール酸。 FFA、遊離脂肪酸。 w/a-MCA、ω/α-ムリコール酸; HDCA、ヒオデオキシコール酸。 TaMCA、タウリン-α-ムリコール酸。 CDCA、ケノデオキシコール酸。 LCA、リトコール酸。 UDCA、ウルソデオキシコール酸。 G、グリシン結合胆汁酸。 T、タウリン結合胆汁酸。 d、左パネルのヒートマップは、視床下部または皮下白色脂肪組織におけるASVと定量化された遺伝子の間の相関を示しています。 ASV の分類学的情報は右側のパネルに示されています。 +、p < 0.05、Benjamini-Hochberg 法により補正 (正確な p 値についてはソースデータを参照)。

ソースデータ

補足説明、図。 1 ～ 7 および参考資料。

補足表 1 ～ 8。

補足図のソースデータ。 1～6。

統計ソースデータ。

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転載と許可

Fan, Y.、Støving, RK、Berreira Ibraim, S. 他腸内細菌叢は、ヒトおよびマウスにおける神経性食欲不振の病因に関与しています。 Nat Microbiol 8、787–802 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41564-023-01355-5

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受信日: 2022 年 6 月 23 日

受理日: 2023 年 3 月 3 日

公開日: 2023 年 4 月 17 日

発行日：2023年5月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01355-5

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